一種γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶與伴侶蛋白共表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于構(gòu)建一株具有極高谷氨酰轉(zhuǎn)肽 酶轉(zhuǎn)移酶活性的大腸桿菌基因工程菌，通過(guò)酶轉(zhuǎn)化合成茶氨酸的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-茶氨酸（N-乙基-γ谷氨酰胺，theanine)是一種天然的氨基酸，是茶葉中的特 征氨基酸，也是茶葉中有效的呈味物質(zhì)。L-茶氨酸主要用于：（1)作為一種新興的食品添 加劑，可用作為茶飲料的品質(zhì)改良劑、改善食品風(fēng)味的添加劑、功能食品的添加劑、"情緒食 品"的添加劑等；已在歐美、日本、中國(guó)臺(tái)灣等國(guó)家、地區(qū)廣泛使用。如日本已開(kāi)發(fā)出添加茶 氨酸的巧克力、果凍、布丁、口香糖、保健茶和各種清涼飲料。（2)作為醫(yī)藥中間體領(lǐng)域，茶氨 酸可以用作抗腫瘤、降血壓、安神鎮(zhèn)靜、抗疲勞等藥物中。此外L-茶氨酸現(xiàn)已作為鎮(zhèn)靜劑中 的有效成分，對(duì)帕金森氏癥、老年性癡呆、傳導(dǎo)神經(jīng)功能紊亂等疾病起預(yù)防效果。
[0003] L-茶氨酸的生產(chǎn)方法主要有茶葉提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵酶轉(zhuǎn)化法。（1) 茶葉提取法由于茶葉中茶氨酸的含量不高，從茶葉提取茶氨酸無(wú)實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。所以植物 提取法實(shí)際上是從提取茶多酚后的殘留液中用離子交換樹(shù)脂法提取茶氨酸。缺點(diǎn)是生產(chǎn)工 序復(fù)雜、產(chǎn)品純度低、產(chǎn)量小、價(jià)格高。（2)化學(xué)合成L-茶氨酸需要高溫、高壓及化學(xué)催化 劑等條件，反應(yīng)條件要求比較高，副產(chǎn)物多，且產(chǎn)生的都是DL-型消旋體，還需要進(jìn)行拆分 才能得到L-型產(chǎn)品。因此會(huì)使成本提高以及質(zhì)量難以控制，且易混雜有毒物質(zhì)，產(chǎn)品不宜 用于食品行業(yè)應(yīng)用，同時(shí)生產(chǎn)工藝復(fù)雜，且易造成環(huán)境污染。（3)微生物發(fā)酵酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn) 的L-茶氨酸都是L型的，且生產(chǎn)成本低，可大量生產(chǎn)，由于生物酶法合成具有高度的專一 性，所以在產(chǎn)品質(zhì)量方面更接近天然的L-茶氨酸，其發(fā)展前景非常廣闊。此外酶轉(zhuǎn)化法生 產(chǎn)L-茶氨酸還具有純度高、副產(chǎn)物少、純化步驟少、生產(chǎn)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此微生物發(fā)酵酶 轉(zhuǎn)化法是目前國(guó)內(nèi)外研宄人員公認(rèn)的最直接、最經(jīng)濟(jì)的L-茶氨酸生產(chǎn)方法。
[0004] 利用微生物發(fā)酵酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-茶氨酸的酶主要有谷氨酰胺酶和γ -谷氨酰轉(zhuǎn) 肽酶（γ-GGT)，本實(shí)驗(yàn)是研宄利用大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，該大腸桿菌高產(chǎn)高 酶活的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，能高效轉(zhuǎn)化谷氨酰胺和乙胺為L(zhǎng)-茶氨酸；近些年來(lái)，盡管有研宄 把大腸桿菌Κ-12來(lái)源的γ-ggt基因（全長(zhǎng)序列或突變?nèi)笔蛄校?dǎo)入到大腸桿菌中表達(dá)， 通過(guò)采用不同的融合標(biāo)簽的載體或大小亞基的共表達(dá)，但重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶常常以沒(méi)有活 性的包涵體或沒(méi)有活性的酶原形式被表達(dá)出來(lái)。宄其原因，主要是谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶復(fù)雜的翻 譯后加工過(guò)程，造成表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)后的大小亞基不能正確折疊并且不能有效地相互作用，因 此不能形成天然的成熟酶。這樣的事實(shí)使得高效過(guò)表達(dá)具有生物活性的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶成為 一個(gè)難題。因而，尋求新的方法改進(jìn)基因工程菌株以從根本上提高茶氨酸的合成量顯得尤 為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的是提供一種伴侶蛋白或伴侶蛋白組合分別與谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶共 表達(dá)的系統(tǒng)，用于構(gòu)建高效表達(dá)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的菌株，以便于酶轉(zhuǎn)化合成茶氨酸。
[0006] -種具有谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶活的大腸桿菌基因工程菌，該基因工程菌是以大腸桿菌 BL21 (DE3)為宿主菌，宿主菌中共轉(zhuǎn)化有伴侶蛋白表達(dá)質(zhì)粒pG-Tf2與谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)質(zhì) 粒。
[0007] 本發(fā)明還公開(kāi)了所述大腸桿菌基因工程菌在生產(chǎn)茶氨酸中的應(yīng)用。
[0008] 一種利用谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶重組質(zhì)粒生產(chǎn)茶氨酸的方法，是用伴侶蛋白表達(dá)質(zhì)粒 pG-Tf2與谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到共轉(zhuǎn)化子，誘導(dǎo)培養(yǎng)該共轉(zhuǎn)化子；以 經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的共轉(zhuǎn)化子為酶源，谷氨酰胺和乙胺為轉(zhuǎn)化底物，酶促合成茶氨酸。
[0009] 上述方法中，誘導(dǎo)培養(yǎng)條件優(yōu)選如下：將共轉(zhuǎn)化子菌液接入含有氨芐青霉素和氯 霉素抗性液體TB培養(yǎng)基中，其中，TB培養(yǎng)基中加有l(wèi)Ong/ml四環(huán)素作為伴侶蛋白的誘導(dǎo)劑； 振蕩培養(yǎng)至0D600值為1. 2后，加入終濃度為0. 5mM的IPTG，20°C下誘導(dǎo)16h。
[0010] 本發(fā)明提供的利用谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶重組質(zhì)粒生產(chǎn)茶氨酸的技術(shù)方案是在以下大量 實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上獲得的。：
[0011] (1)將5種伴侶蛋白表達(dá)質(zhì)粒分別與谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)；
[0012] (2)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和伴侶蛋白在五種共表達(dá)體系中的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)；
[0013] (3)五種共表達(dá)體系中，通過(guò)檢測(cè)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的表達(dá)量及酶活，篩選出
[0014] pG_Tf2伴侶蛋白表達(dá)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出最佳的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶活；
[0015] (4)pG_Tf2伴侶蛋白表達(dá)質(zhì)粒與谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶最佳共表達(dá)條件的優(yōu)化；
[0016] (5)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)極高谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶活的基因工程菌，以谷氨酰胺和乙胺為底 物，高效酶促合成茶氨酸。
[0017] 步驟（1)中，所選擇的5種伴侶蛋白表達(dá)質(zhì)粒見(jiàn)附表1，均帶有氯霉素抗性；另外 谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保留的名稱為Pgex-4t-l/g St-ggt(參考：胥俊峰，單 建華，趙寧偉，殷志敏.大腸桿菌γ 2ggt原核表達(dá)載體pGEX-4T-l/ γ -ggt的構(gòu)建及其蛋 白表達(dá).安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007, 35 (30) : 9467 - 9469)，帶有氨芐青霉素抗性；雙抗性方便篩 選共轉(zhuǎn)化子。
[0018] 表1. 5種大腸桿菌伴侶蛋白質(zhì)粒簡(jiǎn)介
[0019]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶活的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于：該基因工程菌是 以大腸桿菌BL21 (DE3)為宿主菌，宿主菌中共轉(zhuǎn)化有伴侶蛋白表達(dá)質(zhì)粒pG-Tf2與谷氨酰轉(zhuǎn) 肽酶表達(dá)質(zhì)粒。
2. 權(quán)利要求1所述大腸桿菌基因工程菌BL21/C4在生產(chǎn)茶氨酸中的應(yīng)用。
3. -種利用谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶重組質(zhì)粒生產(chǎn)茶氨酸的方法，其特征在于：是用伴侶蛋白表 達(dá)質(zhì)粒pG-Tf2與谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到共轉(zhuǎn)化子，誘導(dǎo)培養(yǎng)該共轉(zhuǎn) 化子；以經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的共轉(zhuǎn)化子為酶源，谷氨酰胺和乙胺為轉(zhuǎn)化底物，酶促合成茶氨酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件如下：將共轉(zhuǎn)化子菌 液接入含有氨芐青霉素和氯霉素抗性液體TB培養(yǎng)基中，其中，TB培養(yǎng)基中加有l(wèi)Ong/ml四 環(huán)素作為伴侶蛋白的誘導(dǎo)劑；振蕩培養(yǎng)至OD600值為1. 2后，加入終濃度為0. 5mM的IPTG， 20°C下誘導(dǎo)16h。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法和應(yīng)用、一種高效累積茶氨酸的方法。本發(fā)明通過(guò)伴侶蛋白與帶有GST標(biāo)簽的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的共表達(dá)，成功構(gòu)建了一株具有極高谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶活的大腸桿菌基因工程菌BL21/C4，共表達(dá)后最佳酶活達(dá)到15500U/L。使用本發(fā)明方法可以明顯的提高酶的表達(dá)量及酶活，促進(jìn)底物的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而提高茶氨酸的生產(chǎn)量。同時(shí)，縮短了工藝周期(酶活性好)，降低了生產(chǎn)成本(降低酶促反應(yīng)中酶耗成本)，易操作，易放大，穩(wěn)定性好，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，為生物酶法生產(chǎn)其它有價(jià)值的產(chǎn)品提供了新的思路。
【IPC分類(lèi)】C12P13-04, C12N15-70, C12R1-19, C12N1-21
【公開(kāi)號(hào)】CN104560849
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410812443
【發(fā)明人】殷志敏, 王期, 蔣毅, 蘭蕾
【申請(qǐng)人】南京師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月23日