一種谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒是通過(guò)將谷氨酸脫羧酶基因gadB與麥芽糖啟動(dòng)子pamyE拼接后，插入到穿梭表達(dá)載體pEKEx2中形成的重組質(zhì)粒pEKEx2-pamyE-gadB。本發(fā)明還提供了該重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法以及其應(yīng)用。本發(fā)明的重組質(zhì)粒，大大提高了重組谷氨酸脫羧酶的表達(dá)量，促進(jìn)谷氨酸的脫羧，由此進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了提高γ-氨基丁酸的產(chǎn)量，也縮短了生產(chǎn)周期，更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，并且安全性較高，避免了因安全性問(wèn)題對(duì)產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域的限制，在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域均可應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] Y -氨基丁酸（Y-aminobutyric acid，GABA)是一種以自由態(tài)形式存在的非蛋白 質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性傳遞物質(zhì)。GABA具有多種生理功能，如降血 壓、預(yù)防癲癇、改善睡眠、抗抑郁、鎮(zhèn)靜安神、促進(jìn)激素分泌和保肝利腎等功效，因此，受到了 人們的廣泛關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)GABA進(jìn)行制備，主要采用化學(xué)合成法或微生物發(fā)酵法。 由于采用化學(xué)合成法制備GABA時(shí)，需從產(chǎn)品中脫除的有毒成分復(fù)雜且產(chǎn)品的安全性差，因 此，相較于化學(xué)合成法，微生物發(fā)酵法具有更為良好的發(fā)展前景。
[0003] 微生物發(fā)酵法制備GABA，主要是利用谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase, GAD ;EC 4. 1. 1. 15)催化L-谷氨酸脫羧，從而生成GABA的。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的能夠積累GABA 的微生物主要有大腸桿菌和乳酸菌，其中，乳酸菌為益生菌，所以在生產(chǎn)GABA時(shí)乳酸菌更 為常用。但是，GAD是生物催化谷氨酸脫羧生成GABA的限速酶，微生物積累GABA速度較慢， 因此，導(dǎo)致GABA的產(chǎn)量較低，難以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004] 為提高GABA的產(chǎn)量，出現(xiàn)了利用微生物的基因工程酶法合成技術(shù)，通過(guò)過(guò)量表達(dá) 菌株中的高活性谷氨酸脫羧酶基因，來(lái)進(jìn)一步提高GABA的產(chǎn)量。在此研究中，采用的方法 主要是將來(lái)源于可積累GABA的菌株中的谷氨酸脫羧酶基因?qū)氲骄哂谢钚暂^低的內(nèi)源谷 氨酸脫羧酶編碼基因的大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的某個(gè)野生型菌株中，并使谷氨酸脫羧酶 在宿主菌中得到高效表達(dá)，從而增強(qiáng)宿主菌生產(chǎn)GABA的能力。上述方法雖在一定程度上 提高了 GABA的產(chǎn)量，但是，在利用上述宿主菌進(jìn)行GABA的生產(chǎn)過(guò)程中，均需在發(fā)酵時(shí)添加 L-谷氨酸或L-谷氨酸鹽作為前體物質(zhì)，使之脫羧為GABA，加之有些宿主菌的安全性仍受到 人們的質(zhì)疑，在一定程度上制約了 GABA產(chǎn)品的應(yīng)用。因此，近些年來(lái)又出現(xiàn)了把乳酸菌或 大腸桿菌來(lái)源的GAD基因?qū)氲焦劝彼岚魲U菌ATCC13032中，利用重組谷氨酸棒桿菌生產(chǎn) GABA的研究。重組谷氨酸棒狀菌可在發(fā)酵過(guò)程中積累產(chǎn)生谷氨酸，與此同時(shí)表達(dá)GAD基因 合成GAD，對(duì)積累的谷氨酸進(jìn)行脫羧，可實(shí)現(xiàn)無(wú)需添加底物L(fēng)-谷氨酸及L-谷氨酸鹽即可一 步合成GABA，同時(shí)，谷氨酸棒桿菌為食品微生物，安全性較高，可應(yīng)用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域。然 而，目前的重組谷氨酸棒狀菌表達(dá)GAD催化轉(zhuǎn)化的產(chǎn)量仍維持在較低水平，究其原因，主要 是將原菌體中的GAD基因?qū)胨拗骶鷷r(shí)，采用的穿梭表達(dá)載體的啟動(dòng)子強(qiáng)度差，導(dǎo)致重組 谷氨酸脫羧酶表達(dá)量少、活性低，進(jìn)而導(dǎo)致GABA收率不高，并且，即使分批添加足夠的底物 (谷氨酸），在重組谷氨酸脫羧酶表達(dá)量少、活性低的情況下，也無(wú)法獲得較多的產(chǎn)物。因 此，目前亟待尋求一種新的方法從根本上解決采用重組谷氨酸棒狀菌生產(chǎn)GABA產(chǎn)量較低 的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中的重組谷氨酸脫羧酶在宿主菌 谷氨酸棒狀菌中表達(dá)量少、活性低的問(wèn)題，進(jìn)而提供一種可實(shí)現(xiàn)GAD的高效表達(dá)的谷氨酸 脫羧酶重組質(zhì)粒以及該重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中的重組谷氨酸棒狀菌生產(chǎn)GABA產(chǎn) 量較低的問(wèn)題，提供一種采用重組谷氨酸棒狀菌高效生產(chǎn)GABA的方法。
[0007] 本發(fā)明的谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒是通過(guò)將谷氨酸脫羧酶基因 gadB與麥芽糖啟動(dòng)子pamyE拼接后，插入到穿梭表達(dá)載體pEKEx2中形成的重組質(zhì)粒 pEKEx2-pamyE-gadB ;所述麥芽糖啟動(dòng)子pamyE具有SEQ ID No. 1所示的序列結(jié)構(gòu)。
[0008] 所述麥芽糖啟動(dòng)子的基因序列為，SEQ ID No. 1 :CCTCTCGCGTGCCCCAACGGCTCCTACG ATCAAAAATCCTCCCTGCTTCCCTCAACTGTTTTTATATGTATTTGTATGTTTTAGGCCCGATTACTTGTGAATATG TGGAATACCTCACTAAGGTGGAAGGAAGGCTAACCAGTTCATAGTCGGACTGCAATCCGCTATGAAGTACTTGGTGG CGCTGGGAAGAAGCCTTCGTTATGGGAGGTCTCCCAGACACAATCGAATACGGGCCGGATATCCATCTCGGCTCATC ACCCCGCTTTTTATCAAGAAAGATGAGGACCTC〇
[0009] 所述穿梭表達(dá)載體pEKEx2為大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭表達(dá)載體。
[0010] 所述谷氨酸脫羧酶基因 gadB的序列結(jié)構(gòu)見(jiàn)NCBI中GenelD為12931794的序列。
[0011] 構(gòu)建上述谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒的方法，包括以下步驟：
[0012] (1)取穿梭表達(dá)載體pEKEx2,根據(jù)其多克隆位點(diǎn)及Ptac啟動(dòng)子的序列，將pEKEx2 載體用PvuII限制性內(nèi)切酶單切，改造獲得不含Ptac啟動(dòng)子的pEKEx2載體；
[0013] (2)取谷氨酸脫羧酶的全長(zhǎng)基因序列g(shù)adB與谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組麥芽 糖啟動(dòng)子pamyE序列，利用Overlap-PCR技術(shù)進(jìn)行拼接得到pamyE-gadB基因；
[0014] (3)將拼接后的pamyE-gadB基因插入到步驟1)中得到的不含Ptac啟動(dòng)子的穿梭 表達(dá)載體pEKEx2中，構(gòu)建得到谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒pEKEx2-pamyE-gadB。
[0015] 進(jìn)一步的，所述步驟（2)具體為：
[0016] 根據(jù)大腸桿菌來(lái)源谷氨酸脫羧酶gadB氨基酸序列和谷氨酸棒桿菌ATCC13032基 因組麥芽糖啟動(dòng)子pamyE序列，以及pEKEx2的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成如下四條引物：
[0017] YW3:5 ' -GAACCCGGGATCCGAGCTC CCTCTCGCGTGCCCCAACGGCTC-3 '
[0018] Sma I
[0019] YW4:5 ' -CGTTACTTGCTTCTTATCCATGAGGTCCTCATCTTTCTTGATAAAAAG-3 '
[0020] YW5:5, -ATGGATAAGA AGCAAGTAAC G-3，
[0021] YW6:5，-GGACCCGGGTACCGTCGAC TCAGGTATGTTTAAAGCTGTTC-3，
[0022] Sma I
[0023] 分別以谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組和E. coli K-12基因組DNA做為模板，YW3、 YW4的pamyE PCR產(chǎn)物和YW5、YW6的gadB PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行overlap-PCR擴(kuò)增。
[0024] 進(jìn)一步的，所述步驟（3)具體為：
[0025] 取步驟⑵的PCR產(chǎn)物pamyE-gadB進(jìn)行Sma I單酶切，并與步驟⑴中改 造后的pEKEx2載體進(jìn)行PvuII單酶切，回收酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒 pEKEx2-pamyE_gadB 〇
[0026] 包含有上述谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒的重組菌，所述重組菌為生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的 谷氨酸棒桿菌。
[0027] 構(gòu)建所述的重組菌的方法，包括將所述的重組質(zhì)粒pEKEx2-pamyE_gadB，導(dǎo)入所述 谷氨酸棒狀菌ATCC13032的感受態(tài)細(xì)胞中的步驟，以使所述重組質(zhì)粒高效表達(dá)，構(gòu)建得到 所述重組菌。
[0028] 所述重組菌在發(fā)酵制備Y -氨基丁酸領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0029] 所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)Y -氨基丁酸的方法，包括將權(quán)利要求7所述的重組菌進(jìn)行 擴(kuò)大培養(yǎng)以誘導(dǎo)其大量表達(dá)谷氨酸脫羧酶的步驟，以及以谷氨酸為底物，在適宜條件下進(jìn) 行發(fā)酵產(chǎn)氨基丁酸的步驟。
[0030] 所述重組菌的擴(kuò)大培養(yǎng)步驟中，還包括向發(fā)酵液中加入麥芽糖和/或IPTG作為誘 導(dǎo)劑的步驟。
[0031] 所述重組菌的擴(kuò)大培養(yǎng)步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分如下：40g/l葡萄糖，50g/l硫 酸銨，lg/Ι磷酸氫二鉀，3g/l尿素，0.4g/l硫酸鎂，50g/l大豆蛋白棟，0.01g/l硫酸鐵， 〇· 〇lg/l硫酸錳，200 μ g/Ι硫胺素，0· 5mg/l生物素，0· 265g/l磷酸吡哆醛，5g/l吐溫-40， pH值為7. 5。
[0032] 優(yōu)選的，在所述發(fā)酵谷氨酸底物產(chǎn)氨基丁酸的步驟中，采用分批添加底物的 方式進(jìn)行。
[0033] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案，相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0034] (1)本發(fā)明將麥芽糖啟動(dòng)子pamyE作為谷氨酸脫羧酶gadB的啟動(dòng)子，使得表達(dá)載 體pEKE X2-pamyE-gadB具有強(qiáng)啟動(dòng)子，大大提高了重組谷氨酸脫羧酶的表達(dá)量，促進(jìn)谷氨 酸的脫羧，由此進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了提高Y -氨基丁酸的產(chǎn)量，也縮短了生產(chǎn)周期，更適于大規(guī)模 工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，麥芽糖啟動(dòng)子pamyE為碳源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可采用無(wú)毒的麥芽糖作為誘 導(dǎo)劑誘導(dǎo)GAD表達(dá)，使最終的產(chǎn)品更為安全；
[0035] 另外，表達(dá)載體pEKEx2為大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體，自身帶有一段 卡那霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，可方便重組菌的篩選。
[0036] (2)本發(fā)明的重組菌，采用谷氨酸棒狀菌作為宿主菌，可在發(fā)酵過(guò)程中積累產(chǎn)生谷 氨酸，從而在一定程度上減少底物谷氨酸的添加，甚至于無(wú)需再添加外源的底物谷氨酸。重 組菌表達(dá)的GAD，可對(duì)積累的谷氨酸直接進(jìn)行脫羧，一步合成GABA，降低了生產(chǎn)成本。同時(shí)， 谷氨酸棒狀菌本身是食品微生物，安全性較高，結(jié)合發(fā)酵過(guò)程中使用安全的麥芽糖作為誘 導(dǎo)劑，可保證合成的GABA的安全性，避免了因安全性問(wèn)題對(duì)產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域的限制，在食品 及醫(yī)藥領(lǐng)域均可應(yīng)用。
[0037] (3)采用本發(fā)明的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基丁酸，包括將所述重組菌進(jìn)行擴(kuò)大培 養(yǎng)以誘導(dǎo)其大量表達(dá)谷氨酸脫羧酶的步驟，以及以谷氨酸為底物，在適宜條件下進(jìn)行發(fā)酵 產(chǎn)氨基丁酸的步驟。上述方法生產(chǎn)易操作，易放大，穩(wěn)定性好，適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合 附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中
[0039] 圖1為gadB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳分析圖；其中，Μ為DL2000DNA Marker ; 1 為 gadB PCR 產(chǎn)物；
[0040] 圖2為pamyE-gadB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳分析圖；其中，Μ為 DL2000DNA Marker ;1 為 pamyE-gadB 基因 overlap-PCR 產(chǎn)物；
[0041] 圖3為不同重組表達(dá)菌酶法合成γ-氨基丁酸的紙層析圖，其中，
[0042] 1、2為標(biāo)準(zhǔn)品，
[0043] 3 為 pEKEx2/ATCC13032 菌種發(fā)酵 lllh 的產(chǎn)物，
[0044] 4 為 pEKEx2-gadB/ATCC13032 菌種發(fā)酵 lllh 的產(chǎn)物，
[0045] 5 為 pEKEx2-pamyE-gadB/ATCC13032 菌種發(fā)酵 lllh 的產(chǎn)物。

【具體實(shí)施方式】
[0046] 實(shí)施例1重組pEKEx2_gadB表達(dá)載體的構(gòu)建
[0047] 本實(shí)施例構(gòu)建的重組PEKEx2-gadB表達(dá)載體具有Ptac啟動(dòng)子，為IPTG誘導(dǎo)型表 達(dá)載體。其構(gòu)建方法為：根據(jù)大腸桿菌來(lái)源谷氨酸脫羧酶gadB氨基酸序列以及穿梭表達(dá)載 體pEKEx2的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成如下二條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中以E. coli K-12基因 組DNA做為模板。
[0048] Yffl ：5, -GGA GTCGAC AAGGAGATATAGAT ATGGATAAGA AGCAAGTAAC G
[0049] Sal I
[0050] YW2:
[0051] 5' -5' -GGAGAGCTC TCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGTATGTTTAAAGCTGTTC-3'
[0052] SacI
[0053] 在50 μ 1的PCR反應(yīng)管中建立如下反應(yīng)體系：
[0054]
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒是通過(guò)將谷氨酸脫羧酶基 因gadB與麥芽糖啟動(dòng)子pamyE拼接后，插入到穿梭表達(dá)載體pEKEx2中形成的重組質(zhì)粒 pEKEx2-pamyE-gadB ;所述麥芽糖啟動(dòng)子pamyE具有SEQ ID No. 1所示的序列結(jié)構(gòu)。
2. -種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒的方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 取穿梭表達(dá)載體pEKEx2,根據(jù)其多克隆位點(diǎn)及Ptac啟動(dòng)子的序列，將pEKEx2載體 用PvuII限制性內(nèi)切酶單切，改造獲得不含Ptac啟動(dòng)子的pEKEx2載體； (2) 取谷氨酸脫羧酶的全長(zhǎng)基因序列g(shù)adB與谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組麥芽糖啟 動(dòng)子pamyE序列，利用Overlap-PCR技術(shù)進(jìn)行拼接得到pamyE-gadB基因； (3) 將拼接后的pamyE-gadB基因插入到步驟1)中得到的不含Ptac啟動(dòng)子的穿梭表達(dá) 載體pEKEx2中，構(gòu)建得到谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒pEKEx2-pamyE-gadB。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒的方法，其特 征在于，所述步驟（2)具體為： 根據(jù)大腸桿菌來(lái)源谷氨酸脫羧酶gadB氨基酸序列和谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組 麥芽糖啟動(dòng)子pamyE序列，以及pEKEx2的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成如下四條引物： YW3:5, -GAACCCGGGATCCGAGCTC CCTCTCGCGTGCCCCAACGGCTC-3' Sma I YW4:5 ' -CGTTACTTGCTTCTTATCCATGAGGTCCTCATCTTTCTTGATAAAAAG-3 ' YW5:5, -ATGGATAAGA AGCAAGTAAC G-3， YW6:5, -GGACCCGGGTACCGTCGAC TCAGGTATGTTTAAAGCTGTTC-3， Sma I 分別以谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組和E. coli K-12基因組DNA做為模板，YW3、YW4 的pamyE PCR產(chǎn)物和YW5、YW6的gadB PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行overlap-PCR擴(kuò)增。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒的方法， 其特征在于，所述步驟（3)具體為： 取步驟⑵的PCR產(chǎn)物pamyE-gadB進(jìn)行Sma I單酶切，并與步驟⑴中改造 后的pEKEx2載體進(jìn)行PvuII單酶切，回收酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒 pEKEx2-pamyE_gadB 〇
5. -種包含有權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫羧酶重組質(zhì)粒的重組菌，其特征在于，所述 重組菌為生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的谷氨酸棒桿菌。
6. -種構(gòu)建權(quán)利要求5所述的重組菌的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求1所述的重 組質(zhì)粒pEKEx2-pamyE-gadB，導(dǎo)入所述谷氨酸棒狀菌ATCC13032的感受態(tài)細(xì)胞中的步驟，以 使所述重組質(zhì)粒高效表達(dá)，構(gòu)建得到所述重組菌。
7. 權(quán)利要求6所述的重組菌在發(fā)酵制備γ-氨基丁酸領(lǐng)域中的應(yīng)用。
8. -種發(fā)酵生產(chǎn)氨基丁酸的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求7所述的重組菌進(jìn) 行擴(kuò)大培養(yǎng)以誘導(dǎo)其大量表達(dá)谷氨酸脫羧酶的步驟，以及以谷氨酸為底物，在適宜條件下 進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氨基丁酸的步驟。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述重組菌的擴(kuò) 大培養(yǎng)步驟中，還包括向發(fā)酵液中加入麥芽糖和/或IPTG作為誘導(dǎo)劑的步驟。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的發(fā)酵生產(chǎn)氨基丁酸的方法，其特征在于，所述重組菌的 擴(kuò)大培養(yǎng)步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分如下：40g/l葡萄糖，50g/l硫酸銨，lg/Ι磷酸氫二鉀， 3g/l尿素，0. 4g/l硫酸鎂，50g/l大豆蛋白棟，0. Olg/Ι硫酸鐵，0. Olg/Ι硫酸錳，200μ g/1 硫胺素，〇· 5mg/l生物素，0· 265g/l磷酸吡哆醛，5g/l吐溫-40, pH值為7· 5。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8-10任一所述的發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，在所述 發(fā)酵谷氨酸底物產(chǎn)Υ -氨基丁酸的步驟中，采用分批添加底物的方式進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C12P13/00GK104099366SQ201410332098
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月11日
【發(fā)明者】殷志敏, 王期, 趙嬌嬌, 溫堯林 申請(qǐng)人:蘇州凱祥生物科技有限公司