專利名稱：一種提高谷氨酸脫羧酶活性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物工程領域，特別涉及一種在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)細胞壁外表面展露表達谷氨酸脫羧酶以提高該酶活性的方法。
背景技術：
Y-氨基丁酸是一種天然健康因子，具有明顯降血壓作用。谷氨酸經(jīng)產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的微生物細胞轉化可一步生成Y-氨基丁酸。但目前應用的谷氨酸脫羧酶主要存在以下問題酶的重組表達方式一般是細胞內(nèi)表達和分泌表達。細胞內(nèi)表達時由于酶不能與細胞外底物接觸，從而極大地影響酶的催化效率，而且酶分子集聚在細胞內(nèi)形成反饋抑制，也影響表達效率。分泌表達的主要缺點是表達效率不高，而且也不能實現(xiàn)完全分泌表達，總有相當一部分表達產(chǎn)物滯留于細胞內(nèi)，從而也不能實現(xiàn)酶與細胞外底物的完全接觸。這兩種表達方式都導致酶的催化效率不高。本發(fā)明開發(fā)一種將谷氨酸脫羧酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面的技術，實現(xiàn)酶與細胞外底物的完全接觸，從而顯著提高谷氨酸脫羧酶活性。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有的谷氨酸脫羧酶催化效率低的問題，本發(fā)明提供一種將谷氨酸脫羧酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面的技術，實現(xiàn)酶與細胞外底物完全接觸，從而顯著提高谷氨酸脫羧酶活性。本發(fā)明的一種提高谷氨酸脫羧酶活性的方法，包括以下步驟將谷氨酸脫羧酶基因(Genbank號NM_168056)連接在釀酒酵母細胞壁成份α凝集素序列(Genbank號 Μ28164)的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GALl啟動子(Genbank號ΑΥ428072)下游MF α 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端GAL1 啟動子+MF α 1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+ α凝集素序列；將包含該表達框的酵母質(zhì)粒轉化入釀酒酵母細胞。將包含上述表達框的釀酒酵母細胞培養(yǎng)于添加有8. 5% (重量百分比)半乳糖和 5-8. 5%乳糖(重量百分比)的YPD培養(yǎng)基中。本發(fā)明的優(yōu)點將谷氨酸脫羧酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面，實現(xiàn)酶與細胞外底物的完全接觸，從而顯著提高谷氨酸脫羧酶活性。


圖1為三種酶分子表達方式，分別為細胞內(nèi)表達、分泌表達和展露表達。
具體實施方式
以下通過實施例進一步對本發(fā)明進行描述本發(fā)明開發(fā)一種將谷氨酸脫羧酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面的技術，實現(xiàn)酶與細胞外底物的完全接觸，從而顯著提高谷氨酸脫羧酶活性。圖1實施例1谷氨酸脫羧酶展露表達實施例1谷氨酸脫羧酶展露表達將谷氨酸脫羧酶基因(來自Drosophila melanogaster, Genbank 號NM_168056) 連接在釀酒酵母細胞壁成份α凝集素(來自釀酒酵母Mccharomyces cerevisiae, Genbank號164)序列的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GALl啟動子(來自釀酒酵母表達載體PYES263，Genbank號AY42807》下游MF α 1信號肽序列(來自釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，Genbank 號Μ17301)的 C 端，構建成表達框(從 N端到 C 端) GALl啟動子+MF α 信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+α凝集素。將包含該表達框的酵母質(zhì)粒轉化入釀酒酵母細胞(Saccharomyces cerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司)， 則MF α 信號肽將引導谷氨酸脫羧酶向釀酒酵母細胞外分泌，而谷氨酸脫羧酶下游的α 凝集素則錨定在釀酒酵母細胞壁中，從而使谷氨酸脫羧酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面。實施例2谷氨酸脫羧酶展露表達的誘導在培養(yǎng)釀酒酵母的YPD培養(yǎng)基中，添加8. 5 %半乳糖(購自上海生工生物工禾呈有 P艮公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo.， Ltd.)和5-8. 5%乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&Services Co.，Ltd.)，則表達框“GAL1 啟動子+MF α 1 信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+ α凝集素”中的GALl啟動子就會活化，誘導谷氨酸脫羧酶在釀酒酵母細胞壁外表面展露表達。實施例3半乳糖和乳糖對谷氨酸脫羧酶展露表達的作用在培養(yǎng)釀酒酵母的YPD培養(yǎng)基中，如果不含半乳糖和乳糖，則未檢測到谷氨酸脫羧酶活性，這是因為表達框“GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+FLO序列”中的GALl啟動子無法保持活化狀態(tài)。實施例4谷氨酸脫羧酶展露表達后活性的提高按照實施例1和實施例2所示步驟進行展露表達的谷氨酸脫羧酶活性為
mL (8. 5 %半乳糖和5 %乳糖)和2747U/mL (8. 5 %半乳糖和8. 5 %乳糖)，而如果在實施例1 和實施例2所示的展露表達表達框“GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因 + α凝集素”中去除α凝集素序列，則谷氨酸脫羧酶進行分泌表達，活性為1195U/mL (8. 5% 半乳糖和5%乳糖)和1202U/mL(8. 5%半乳糖和8. 5%乳糖)。因此，在表達系統(tǒng)與基本表達元件一樣的情況下，增加α凝集素這一展露表達元件可使谷氨酸脫羧酶活性提高數(shù)倍。谷氨酸脫羧酶活性單位U定義為在0. 05mol/L谷氨酸(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo. , Ltd.) 中，每分鐘催化生成lymol Y-氨基丁酸(標準品購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo. ,Ltd.)所需的酶量為一個活力單位(U)。 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種提高谷氨酸脫羧酶活性的方法，其特征在于包括以下步驟將谷氨酸脫羧酶基因連接在釀酒酵母細胞壁成份α凝集素序列的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GALl 啟動子下游MF α 1信號肽序列的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端GAL1啟動子 +MFa 1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+ α凝集素序列；將包含該表達框的酵母質(zhì)粒轉化入釀酒酵母細胞。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于將包含“權利要求1”所述表達框的釀酒酵母細胞培養(yǎng)于添加有重量百分比8. 5%半乳糖和重量百分比5-8. 5%乳糖的YPD培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明的一種提高谷氨酸脫羧酶活性的方法，包括以下步驟將谷氨酸脫羧酶基因(Genbank號NM_168056)連接在釀酒酵母細胞壁成份α凝集素序列(Genbank號M28164)的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GAL1啟動子(Genbank號AY428072)下游MFα1信號肽序列(Genbank號M17301)的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端GAL1啟動子+MFα1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+α凝集素序列；將包含該表達框的酵母質(zhì)粒轉化入釀酒酵母細胞。本發(fā)明的優(yōu)點將谷氨酸脫羧酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面，實現(xiàn)酶與細胞外底物的完全接觸，從而顯著提高谷氨酸脫羧酶活性。
文檔編號C12N15/81GK102242105SQ20101017177
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權日2010年5月14日
發(fā)明者何國慶, 周陳偉, 廖文艷, 徐娟, 王睿之, 阮暉, 陳美齡, 陳赟, 馬風蘭 申請人:浙江大學