專利名稱：：谷氨酸脫羧酶抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及免疫分析領域，具體地，本發(fā)明公開了一種谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：谷氨酸脫羧酶(gad)是合成y氨基丁酸(gaba)的限速酶，在胰島p細胞中與胰島素同處存在，同時分泌，具有自分泌和旁分泌信號調節(jié)e細胞合成及分泌胰島素的功能。谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)陽性患者中，一方面由于體內存在GAD-Ab，GAD-Ab與GAD結合后影響了GABA的合成速度，干擾了胰島素合成及分泌的調節(jié)，使胰島e細胞的胰島素合成受到影響，導致體內循環(huán)中的胰島素不足，從而引起胰島素依賴的糖尿病。另一方面，機體產生的GAD-Ab激發(fā)了T淋巴細胞而引起e細胞的破壞。絕大多數(shù)l型糖尿病是由免疫介導的胰島0細胞破壞造成的。這種選擇性破壞與細胞免疫和體液免疫有關。除巨噬細胞、淋巴細胞浸潤外，胰島細胞抗體(ICA)、谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)、胰島素自身抗體(IAA)可以預報1型糖尿病的發(fā)病。在諸多自身抗體中，GAD-Ab出現(xiàn)早、持續(xù)時間長。在l型糖尿病診斷后3-5年，ICA抗體滴度和檢出率顯著下降，10年后僅20%的病人陽性。相反，GAD-Ab下降幅度小，1型糖尿病診斷10年后54%的病人中仍能檢出GAD-Ab。同時，與ICA相比，GAD-Ab測定簡單，費用低，易于標準化。因此，采用靈敏度髙的GAD-Ab檢測，可以盡可能多的從高危人群中診斷出l型糖尿病患者。成人晚發(fā)自身免疫性糖尿病(LADA)發(fā)病初期，臨床特點與2型糖尿病很相似，但短短的數(shù)年內就依賴于胰島素治療，實質上為1型糖尿病。表現(xiàn)為低體重指數(shù)，ICA及其他一些自身抗體陽性。GAD-Ab作為LADA診斷的免疫學指標，要優(yōu)于ICA。GAD-Ab檢查有利于早期發(fā)現(xiàn)LADA病人，加強隨診，早期予以胰島素治療，可以保護殘存的胰島P細胞功能，減少近期和遠期并發(fā)癥。2型糖尿病是由胰島素抵抗和(或)相對缺乏造成的，并非免疫介導的胰島炎所致。故2型糖尿病患者GAD-Ab陽性率低于l型糖尿病患者。在2型糖尿病中，最初即應用胰島素的病人及GAD-Ab陰性的病人，其胰島e細胞功能衰減幅度要低的多，高滴度的GAD-Ab預示著更快的胰島e細胞功能衰竭。因此，糖尿病發(fā)病時GAD-Ab的狀態(tài)是預測其臨床過程的理想指標，它可以將LADA與2型糖尿病區(qū)分開來。綜上GAD-Ab的檢測在糖尿病的預測、診斷及正確分型方面均具有重要價值。目前用于檢測GAD-Ab的免疫分析方法主要有放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。根據大量的試驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及發(fā)展前景來看，化學發(fā)光免疫分析(CLIA)要大大優(yōu)于酶免疫分析、放射免疫分析。放射免疫分析技術因其使用放射性元素作為標記物，因此對環(huán)境有放射性污染，并存在操作復雜，試劑保存時間短等不足；酶免疫分析法存在靈敏度低，信噪比不高，灰區(qū)附近難以判定等方法學制約因素；化學發(fā)光免疫分析法是一種較先進而有效的方法，可使檢測靈敏度達到10—"摩爾水平，而且檢測范圍可達6個數(shù)量級，其酶標記物穩(wěn)定，可長期使用。較RIA和ELISA優(yōu)勢明顯。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。根據本發(fā)明谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其中，所述試劑盒包括l)GAD-Ab陰性對照品；2)GAD-Ab陽性對照品；3)谷氨酸脫羧酶(GAD)抗原包被的微孔板；4)用于稀釋血清樣本的樣本稀釋液；5)辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體；6)洗滌液；7)化學發(fā)光底物液。根據本發(fā)明的試劑盒，其中，所述微孔板為48孔、96孔微孔板。根據本發(fā)明的試劑盒，其中，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中化學發(fā)光底物A液，包括1.7716g/L魯米諾、0.051g/L4-羥基聯(lián)苯、0.012g/L4-碘苯硼酸、11.4g/L硼酸、4.9g/L硼砂，其pH值為8.0~8.5;化學發(fā)光底物B液，包括0.329g/L過氧化脲、0.01訂ween20、51.58g/LNa2HP0412H20、8.74g/LNaH2PO,2H20，其pH值為7.0~7.5?；瘜W發(fā)光底物液包含A液和B液使用方法A、B液雙組分試劑，在使用前根據使用量計算完畢后A:B為l:1混合，應保證在6h內使用。谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制備方法，包括A:制備GAD-Ab陰性對照品根據本發(fā)明試劑盒制備方法中，所述制備GAD-Ab陰性對照品、陽性對照品，其基質配方為含2g/LBSA,lg/L水解明膠，0.l°/。Proclin300,0.05mol/LPH7.8Tris-HCL。配制基質液后，用此基質液做為陰性對照品，分裝成2ml/瓶后-20t:保存。B:制備GAD-Ab陽性對照品配制基質液后，將GAD-Ab純品稀釋成適當濃度陽性對照，再加入0.001%食品紅后分裝成2ml/瓶，做為陽性對照品，-20X:保存。C:制備谷氨酸脫羧酶(GAD)抗原包被的微孔板根據本發(fā)明試劑盒制備方法中，所述制備谷氨酸脫羧酶(GAD)抗原包被的微孔板，其包被緩沖液為0.05m磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液。包被濃度1~3mg/ml谷氨酸脫羧酶，4'C24h后，去離子水洗滌2次，2y。BSA室溫封閉3h后，在溫度20-28'C及濕度小于或等于3(W條件下干燥12h，裝袋封裝。D:配制用于稀釋血清樣本的樣本稀釋液根據本發(fā)明試劑盒制備方法中，所述配制用于稀釋血清樣本的樣本稀釋液，其配方為0.05MpH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，10g/LBSA，0.3%TritonXIOO。E:制備辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體根據本發(fā)明試劑盒制備方法中，所述制備辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體，標記方法采用過碘酸鈉法。其具體方法為稱5mgHRP溶于lml雙蒸水中，加入0.2ml新配的0.1MNal04溶液，室溫避光20min。lmMpH4.4醋酸鈉緩沖液透析，4'C過夜。加入20m10.2MpH9.6碳酸鹽緩沖液，加入lml0.OIM碳酸鹽緩沖液含5mg抗體，室溫2h。再加0.lml新配4g/LNaBH4，混勻，4。C2h。0.15MpH7.4PBS透析4'C過夜。攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4匸lh。3000rpm離心0.5h,棄上清。沉淀物溶于lm10.15MpH7.4PBS。0.15MpH7.4的PBS透析4。C4h,10，OOOrpm離心30min,上清液即為酶結合物，加入等量丙三醇，-20。C保存。根據本發(fā)明試劑盒制備方法中，所述制備辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體，其稀釋液配方為0.05MpH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，15%新生牛血清。配制完成后，應混勻，放置30分鐘后用肉眼觀察無晶體或沉淀析出，應釆用電子pH計或中性pH試紙進行檢驗pH應控制在7.0-7.5之間，最佳pH為7.2。然后分裝到適當體積的聚乙烯塑料瓶中。將上述標記完成的辣根過氧化物酶標記抗人IgG抗體，用標記物稀釋液進行1:1000-1:70，000之間的一個適當稀釋比例進行稀釋。根據本發(fā)明試劑盒制備方法中，所述制備辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體為羊抗體或兔抗體。F:配制洗滌液根據本發(fā)明試劑盒制備方法中洗滌液的配方為0.01MpH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，0.01%Tween20,2g/LKC1。G:配制化學發(fā)光底物液化學發(fā)光底物液A液配方硼酸11.4g硼砂4.9g魯米諾1.7716g4-羥基聯(lián)苯0.G51gg4-碘苯硼酸0.012g雙蒸水定容1000ml化學發(fā)光底物液B液配方磷酸二氫鈉(NaH2P04*2H20)8.74g磷酸氫二鈉(Na2HP04'12H20)51.58g過氧化脲(CH6N203)0.329gTween200.1ml雙蒸水定容1000ml最后組裝上述各組份成為成品試劑盒。綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進行了篩選實驗和質量檢定，包括抗原的純度、標記抗體的活性、微孔板的吸附性能和變異大小、辣根過氧化物酶的活性、化學發(fā)光底物的發(fā)光強度及發(fā)光持續(xù)時間等。對于辣根過氧化物酶的標記可以有不同的方法，通過反復探索和對比實驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可靠的標記方法。本發(fā)明公開了基于上述摸索試驗得到的各種試劑配方，包括化學發(fā)光底物液配方、陰性對照品和陽性對照品的基質配方、樣本稀釋液配方、洗滌液的配方、辣根過氧化物酶標記物的稀釋液配方。利用本發(fā)明方法進行檢測，靈敏度高，特異性強，操作簡單，無放射性污染,試劑盒成本低，臨床適用性強，可廣泛應用于我國臨床檢測。具體實施例方式實施例1谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒發(fā)光底物液的制備按照化學發(fā)光底物液A液配方硼酸11.4g硼砂4.9g魯米諾1.7716g4-羥基聯(lián)苯Q.Q51gg4-碘苯硼酸0.012g雙蒸水定容1000ml配制完成后用聚乙烯塑料瓶，每瓶分裝10m1.按照化學發(fā)光底物液B液配方磷酸二氫鈉(NaH2P04*2H20)磷酸氫二鈉(Na2HP04*12H20)過氧化脲(CH6N203)Tween208.74g51.58g0.329g0.lml1000ml雙蒸水定容配制完成后用聚乙烯塑料瓶，每瓶分裝lOml.實施例2谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒陰性對照品的制備根據本發(fā)明陰性對照品的配方三羥甲基氨基甲烷(Tris)牛血清白蛋白(BSA)水解明膠(HG)0.lmol/L鹽酸(HCL)Proclin300雙蒸水定容6.06g2glg3.45mllml1000ml配制完畢后，使用3ml容積的西林瓶，每瓶分裝2ml，貼簽后，-20'C冷凍保存.實施例3谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒陽性對照品的制備根據本發(fā)明陽性對照品的配方三羥甲基氨基甲烷(Tris)牛血清白蛋白(BSA)水解明膠(HG)0.lmol/L鹽酸(HCL)谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)Proclin300食品紅雙蒸水定容6.06g2glg3.45ml15mglml0.Olml1000ml配制完畢后，使用3ml容積的西林瓶，每瓶分裝2ml，貼簽后，-20'C冷凍保存'實施例4谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒包被微孔板的制備取谷氨酸脫羧酶(GAD)濃原料10mg,使用0.05M磷酸二氫鈉-磷酸氯二鈉緩沖液將原料稀釋到包被濃度2pg/ml,搖勻，取96孔微孔板，每微孔中加入120jaL，4'C2化后，去離子水洗滌2次，2y。BSA室溫封閉3h,在溫度20-28。C及濕度小于或等于30y。條件下12h后，用鋁箔袋熱封口封裝。實施例5谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒樣本稀釋液的制備配制用于稀釋血清樣本的樣本稀釋液，其配方為磷酸二氫鈉(NaH2P(V2H20)2.19g磷酸氫二鈉(Na2HP04*12H20)12.9g牛血清白蛋白(BSA)10gTritonX1003ml去離子水定容1000ml配制完畢后，使用lOml容積的聚乙烯塑料瓶，每瓶分裝lOml,貼簽后，-20'C冷凍保存。實施例6谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒酶標記物稀釋液的制備辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體稀釋液配方為磷酸二氫鈉(NaH2P04*2H20)2.19g磷酸氫二鈉(Na2HP04M2H20)12.9g新生牛血清150ml去離子水定容1000ml配制完成后，應混勻，放置30分鐘后用肉眼觀察無晶體或沉淀析出，應采用電子pH計或中性pH試紙進行檢驗pH應控制在7.0-7.5之間，最佳pH為7.2。實施例7辣根過氧酶標記物最佳稀釋比例的選擇采用平行試驗法將辣根過氧化物酶標記抗體以不同稀釋度進行對比，以最高信噪比大于150，最低信噪比大于5為基準，優(yōu)化選擇成本最低的稀釋比例。將辣根過氧化物酶標記抗體以1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000、1/32000、1/6400'0的不同稀釋度，進行條件對比實驗，發(fā)現(xiàn)滿足最高信噪比大于150,最低信噪比大于5的比例中，將辣根過氧化物酶標記抗體1/32000的比例所用成本最低。故選擇這個稀釋比例。實施例8谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒洗滌液的制備根據洗滌液的配方進行配制磷酸二氫鈉(NaH2P04*2H20)1g磷酸氫二鈉(Na2HP04*12H20)1.28g氯化鉀(KCL)2gTween200.lml去離子水定容1000ml配制完成后，應混勻，放置30分鐘后用肉眼觀察無晶體或沉淀析出，應釆用電子pH計或中性pH試紙進行檢驗pH應控制在7.0-7.5之間，最佳pH為7.2。實施例9谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒半成品及成品組成上述實施例18所得產品分裝即為半成品。將半成品在組裝前抽檢經過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，按照標準操作規(guī)程進行組裝成品，并經過質量人員復核后記錄、入庫。實施例10本發(fā)明的試劑盒的使用方法一、實驗前準備1、蒸餾水或去離子水；2、吸水紙用于板條沖洗后的拍干；3、封口膜在反應過程中覆蓋板條；4、用于血清稀釋的試管；5、微量加樣器，帶有10iul-200Ml吸液Tip頭；6、微孔板沖洗機或沖洗瓶；7、化學發(fā)光測量儀二、標本采集病人標本無需特殊處理，采用常規(guī)醫(yī)用技術收集全血標本，離心分離后吸取血清用于檢測。待測血清如在24小時之內使用，可于2-8。C保存，若需長期存放應保存在-2(TC以下，并避免反復凍溶。三、使用本試劑盒實驗的具體操作步驟如下1、首先，根據試驗需求設計好分布圖，然后將所需的微孔條固定于板架上，編好順序。2、分別加入lOOnil陰性對照品、陽性對照品和已稀釋的血清樣品于相應的孔中，空白孔除外。3、用封口膜將板條封好，置37'C溫育1小時。4、每孔加入配制好的洗滌液200-300iul，停留30秒，甩干，重復洗滌五次，在吸水紙上輕拍數(shù)下。在洗滌過程中應避免產生氣泡。5、每孔加入酶結合物IOOmI,空白孔除外。6、用封口膜或塑料膠條將板封好，置37C溫育1小時。7、反應后，再次洗滌(同4)，拍干。8、加發(fā)光底物A及B各50jal，混勻，室溫(20-25。C)避光反應5分鐘。立即在化學發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強度(RLU)，測量時間l秒/孔。四、結果分析從陰性、陽性對照品和樣品孔的發(fā)光度值中減去空白孔發(fā)光度值。在陽性對照品/陰性對照品發(fā)光強度比值大于等于10時，將陰性對照品的發(fā)光強度2.1倍定為CUTOFF值。在CUTOFF值以上的樣本即為陽性樣本。實施例11本發(fā)明的試劑盒的方法學檢定按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對通過實施例1~8中制備成的試劑盒進行檢定1)精密性CV(W應小于15.0'"n=10)2)靈敏度將已知濃度為1500ng/ml的標準品稀釋到20ng/ml，所測發(fā)光強度值應高于CUTOFF值。3)特異性與IAA的交叉反應濃度為300U/ml的IAA標準品，在本發(fā)明試劑盒中所測發(fā)光強度值應低于CUTOFF值。與ICA的交叉反應濃度為100U/ml的ICA標準品，在本發(fā)明試劑盒中所測發(fā)光強度值應低于CUTOFF值。4)穩(wěn)定性將試劑盒37。C放置7天，測定結果應符合上述1)3)項要求。實施例12本發(fā)明的試劑盒同國外ELISA試劑盒臨床血樣測值對比使用本發(fā)明的試劑盒與國外GAD-Ab酶聯(lián)免疫檢測試劑盒同時檢測47份I型糖尿病、29份n型糖尿病人標本，兩種試劑盒的比較結果見下表l、表2:表l本試劑盒與國外試劑盒I型糖尿病測值對比結果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2本試劑盒與國外試劑盒II型糖尿病測值對比結果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從兩表所列檢測結果數(shù)據分析，本發(fā)明試劑盒在47份I型糖尿病標本中檢出30份陽性，陽性率為63.8%;29份II型糖尿病人檢出5份陽性，陽性率為17.2%。與國外ELISA試劑盒能夠較好符合。權利要求1.谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)GAD-Ab陰性對照品；2)GAD-Ab陽性對照品；3)谷氨酸脫羧酶(GAD)包被的微孔板；4)樣本稀釋液；5)辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體；6)洗滌液；7)化學發(fā)光底物液。2、如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述微孔板為48孔、96孔微孔板。3、如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，化學發(fā)光底物A液，包括1.7716g/L魯米諾、0.051g/L4-羥基聯(lián)苯、0.012g/L4-碘苯硼酸、11.4g/L硼酸、4.9g/L硼砂，其pH值為8.0~8.5;化學發(fā)光底物B液，包括0.329g/L過氧化脲、0.01%Tween20、51.58g/LNa2HP04.12H20、8.74g/LNaH2P04.2H20,其pH值為7.0~7.5。4、根據權利要求l所述的試劑盒的一種制備方法，其特征在于，包括以下步驟制備GAD-Ab陰性對照品；制備GAD-Ab陽性對照品；制備谷氨酸脫羧酶(GAD)抗原包被的微孔板；配制用于稀釋血清樣本的樣本稀釋液;制備辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體；配制洗滌液；配制化學發(fā)光底物液；及組裝各半成品為成品試劑盒。5、如權利要求4所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述制備GAD-Ab陰性對照品、陽性對照品，其基質配方為含2g/LBSA,lg/L水解明膠，0.l°/。Proclin300，0.05mol/LPH7.8Tris-HCL。6、如權利要求4所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述制備谷氨酸脫羧酶(GAD)抗原包被的微孔板，其包被緩沖液為0.05M磷酸二氫鈉-磷酸氬二鈉緩沖液。7、如權利要求4所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述血清樣本的樣本稀釋液，其配方為0.05MpH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，10g/LBSA，0.3%TritonXIOO。8、如權利要求4所述試劑盒的制備方法，其特征在于，所述制備辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體，標記方法采用過碘酸鈉法，采用酶標記物稀釋液將酶標記物稀釋成工作濃度。9、如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述酶標記物稀釋液，其配方為0.05MpH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，15%新生牛血清。10、如權利要求4所述的試劑盒制備方法，其特征在于，所述配制洗滌液，配方為0.01MpH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，0.01%Tween20,2g/LKC1。全文摘要本發(fā)明公開了一種谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。本發(fā)明試劑盒包括GAD-Ab陰性、陽性對照品；包被微孔板；樣本稀釋液；辣根過氧化物酶標記物；洗滌液；化學發(fā)光底物液。根據本發(fā)明制備上述試劑盒的制備方法包括制備GAD-Ab陰性、陽性對照品；制備谷氨酸脫羧酶(GAD)抗原包被的微孔板；配制樣本稀釋液；制備辣根過氧化物酶標記物；配制洗滌液、配制化學發(fā)光底物液等步驟。本發(fā)明試劑盒操作簡單，無放射性污染，可廣泛應用于臨床檢測。文檔編號G01N33/573GK101368957SQ20081010541公開日2009年2月18日申請日期2008年4月29日優(yōu)先權日2008年4月29日發(fā)明者于尚永,唐寶軍,應希堂,王宏銳,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術有限公司