專利名稱：電極催化劑和酶電極的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及電極催化劑和酶電極，更詳細(xì)地說，涉及作為生物傳感器、 燃料電池等各種電化學(xué)器件的電極使用的酶電極，以及在酶電極中使用的 電極催化劑。
背景技術(shù)：
酶是使生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)(代謝)進(jìn)行的生物體催化劑，以蛋白質(zhì)為 基本結(jié)構(gòu)。酶也有的僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成，但大多數(shù)酶為了發(fā)揮酶活性或者提 高酶活性，需要除蛋白質(zhì)之外的成分(輔因子)。
酶有下述(l)、 (2)等特征
(1) 在接近常溫、常壓的溫和條件下顯示催化作用；
(2) 同時具有只對特定的底物(通過酶而受到作用的物質(zhì))發(fā)揮作用的 "底物特異性"，以及對特定的化學(xué)反應(yīng)顯示催化作用、并不引起副反應(yīng)的 "反應(yīng)特異性"。
在酶中，將催化生物體內(nèi)的氧化還原的酶稱為"氧化還原酶 (oxidoreductase)"。另外，將以氧作為電子受體而使底物氧化的酶特別地 稱為"氧化酶(oxidase)",將使底物還原的酶特別地稱為"還原酶 (reductase)"。如果在電>^面固定某種氧化還原酶，則可以通過酶的催化 作用而在電極上選擇性地只進(jìn)行特定的氧化還原反應(yīng)，從而通過電極將氧 化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的物質(zhì)轉(zhuǎn)換成電信號。將這樣的電極稱為"酶電極"，可 以在各種生物傳感器、燃料電池等的電極中使用。
為了使用酶作為電極催化劑，必須將酶固定在適當(dāng)?shù)妮d體表面。但是, 因為酶一般是水溶性的，所以在使用中存在酶容易流出等問題。另外，酶具有與底物特異性地結(jié)合、接受催化作用的部位(活性中心)。 因為很多時候活性中心被埋在具有復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的內(nèi)部深處， 所以難以與電極之間直接進(jìn)行電子授受。在這樣的情況下，通常要并用侵 入到酶的活性部位、與酶進(jìn)行電子遷移、再將電子運(yùn)送到電極的低分子物 質(zhì)。這樣的低分子物質(zhì)被稱為"介體"。但是，因為酶/介體之間的電子移動 速度依賴于各自的分子運(yùn)動，所以未必充分，有可能成為限制酶電極的電 流密度的主要原因。
因此，為了解決該問題， 一直以來人們提出了各種方案。 例如，專利文獻(xiàn)l公開了一種含氮碳系復(fù)合材料，該復(fù)合材料具有多 孔體，所述多孔體含有由碳原子和氮原子形成骨架的含氮碳系材料，并且 該復(fù)合材料還具有擔(dān)載在上述多孔體上的氧化還原酶。
上述文獻(xiàn)中還記載了下述要點(l)、和(2):
要點(l)因為含氮碳系材料在細(xì)孔表面存在極性位點，所以如果在其 上擔(dān)栽氧化還原酶，則會與蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)之間生成氬鍵等新的結(jié) 合，從而蛋白質(zhì)與載體的結(jié)合^^口強(qiáng)；
要點(2)作為擔(dān)載在載體上的氧化還原酶，可列舉漆酶、心肌黃酶、 脂肪氧合酰胺脫氫酶(Lipoxyamide dehydrogenase)、醇脫氫酶、葡萄糖氧 化酶(包括以其它糖為底物的氧化酶)、葡萄糖脫氫酶(包括以其它糖為底物 的脫氫酶)。
另外，專利文獻(xiàn)2公開了一種酶電極，該酶電極具有導(dǎo)電性部件、酶、 第1和第2介體，第1介體和第2介體通過載體固定在導(dǎo)電性部件上，并 且第l介體與第2介體氧化還原電位彼此不同。
上述文獻(xiàn)中還記載了下述要點(l)、 (2)和(3):
要點(l)通過采用這樣的構(gòu)成，可以提高導(dǎo)電性部件的單位實效表面 積的酶擔(dān)載密度；
要點(2)除可以進(jìn)行與酶之間的高速的電子移動的第1介體之外，可 以通過進(jìn)一步使用在第l介體與導(dǎo)電性部件之間進(jìn)行電荷傳遞的第2介體， 從而與酶進(jìn)行高速電子移動；要點(3)作為酶，可列舉葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、膽紅素氧化 酶、丙酮酸氧化酶、D-或L-氨基酸氧化酶、胺氧化酶、膽固醇氧化酶、抗 壞血酸氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、醇脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、膽固醇脫氫 酶、醛脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、果糖脫氫酶、山梨糖醇脫氫酶、乳酸脫氫 酶、蘋果酸脫氫酶、甘油脫氫酶、17B羥基類固醇脫氫酶、雌二醇17B脫 氫酶、氨基酸脫氫酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、3-羥基類固醇脫氫酶、心肌 黃酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、NADH-細(xì)胞色素b5 還原酶、NADPH-皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶、細(xì)胞色素b5還原酶、皮質(zhì)鐵氧 還蛋白還原酶、硝酸還原酶。
專利文獻(xiàn)l:特開2005-343775號7>才艮
專利文獻(xiàn)2:特開2006-058289號公報

發(fā)明內(nèi)容
氧化還原酶一般除了與底物結(jié)合的活性中心之外，具有用于進(jìn)行與活 性中心之間的電子授受的部位(電子傳遞門)。因為在生物體內(nèi)對酶的電子 傳遞通常是介由介體來進(jìn)行的，所以酶的電子傳遞門多埋在蛋白質(zhì)的口袋 內(nèi)部。如果將這種狀態(tài)的酶固定在電極表面，則電子傳遞門與電;^面的 距離無論如何也會增大。由于電子移動速度的常用對數(shù)與距離成比例地減 慢，故而現(xiàn)有已知的酶得不到高電子傳遞效率。
為了解決該問題，正如專利文獻(xiàn)2所公開的那樣，人們考慮了并用介 體。但是，僅僅通過并用介體的方法，電子傳遞效率的提高有限。另外， 目前沒有報道適用于能夠得到充分量的電流密度的酶電極的酶的例子。
本發(fā)明要解決的課題是，提供含有電子傳導(dǎo)效率高的氧化酶的新型電 極催化劑、以及使用該電極催化劑的酶電極。
為了解決上述課題，本發(fā)明所涉及的電極催化劑含有CueO。
另外，本發(fā)明所涉及的酶電極具有碳多孔體；以及擔(dān)載在上述碳多 孔體表面的、含有CueO的電極催化劑。
當(dāng)將作為多銅氧化酶的的一種的CueO作為酶電極用的催化劑使用時，則可得到高于以往的氧化還原酶的電流密度。
i人為這是由于以下原因。
(1) 因為CueO的酶分子中，催化氧化反應(yīng)的活性中心與電子傳遞門分 傳遞。、 、 - 、 s 、， '
(2) 因為CueO中電子傳遞門更接近分子表面，所以在固定于固體表面 的狀態(tài)下，電子傳遞門與電極的距離減小，故而電子移動的效率提高。
由于以上那樣的原因，本發(fā)明的電極催化劑電子傳遞效率優(yōu)異，并可
以得到高于以往的氧化還原酶的電流密度。即，固定了本發(fā)明的電極催化 劑的酶電極，電極催化劑的單位固定化量所得的電流值較大，即使在有限 的面積上固定電極催化劑的情況下，也可以得到高電流值。具體地說，可 以得到與使用鉑催化劑的電極同等的電流密度。而且，因為固定了本發(fā)明 的電極催化劑的酶電極即使固定少量的電極催化劑，也可得到高電流值， 所以可以降〗氐成本。
進(jìn)而，因為本發(fā)明的電極催化劑的電子傳遞效率高，即，電極-電極催 化劑之間的電子移動速度非?？?，所以即使為了提高酶電極中的電極反應(yīng) 速度而不使用介體，也可以得到高電流值。
另外，因為本發(fā)明的電極催化劑電子傳遞效率高、電極-電極催化劑之 間的電子移動速度非?？?，所以在固定了本發(fā)明的電極催化劑的酶電極中 所得的催化電流與其說是受該電極催化劑的酶活性限制，不如說是受對電 極的氧供給速度限制。即，固定了本發(fā)明的電極催化劑的酶電極可以顯示 穩(wěn)定的電極活性，從而得到穩(wěn)定的輸出功率。因此，可以通過使用固定了 本發(fā)明的電極催化劑的酶電極，實現(xiàn)提高燃料電池的輸出功率、使得氧檢 測型傳感器高靈敏度化。


圖l是一種作為多銅氧化酶的來自大腸桿菌的CueO的分子結(jié)構(gòu)。 圖2是含有各種多銅氧化酶的酶溶液的循環(huán)伏安圖。圖3是含有擔(dān)載在各種碳載體上的各種多銅氧化酶的酶電極的循環(huán)伏 安圖。
具體實施例方式
以下，對于本發(fā)明的一種實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。 本發(fā)明所涉及的電極催化劑含有CueO。
氧化還原酶是催化氧化還原反應(yīng)的酶，蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中具有活性 中心和電子傳遞門。所謂"活性中心"是指底物與之特異性地結(jié)合、接受催 化作用的部位。所謂"電子傳遞門"是指用于進(jìn)行與活性中心之間的電子授 受的部位。
氧化還原酶大致分為使底物氧化的氧化酶、和使底物還原的還原酶。 使用哪一種作為電極催化劑用酶根據(jù)電極極性不同而不同。即，在使用酶 作為正極側(cè)的材料時，使用能夠通過反應(yīng)接受電子(換而言之，能夠催化以 質(zhì)子和氧為底物生成水的反應(yīng))的氧化酶。另一方面，在使用酶作為負(fù)極側(cè) 的材料時，使用通過反應(yīng)釋放電子的還原酶。
另外，氧化還原酶是具有固有的三維結(jié)構(gòu)的巨大分子，活性中心、電 子傳遞門通常處于埋在三維結(jié)構(gòu)的開口部分(凹陷、裂縫)的深處的狀態(tài)。 這時，活性中心和電子傳遞門可以位于同一開口部，或者可以位于不同的 開口部。
其中，就具有含有電子傳遞門的第1開口部和含有活性中心的第2開 口部的氧化還原酶而言，在酶催化底物時，底物移動與電子移動不相干擾。 因此，與在同一開口部含有活性中心和電子傳遞門的酶相比，酶/電極間的 電子傳遞效率提高。
特別是，就含有電子傳遞門的第1開口部位于含有活性中心的第2開 口部對面的氧化還原酶而言，可以通過使第1開口部接近電極表面從而極 為順利地進(jìn)行電^l/電子傳遞門之間的電子傳遞。因此，酶/電極間的電子傳 遞效率進(jìn)一步提高。
這里，所謂"第1開口部位于第2開口部的對面"是指第1開口部所處的面的法線方向與第2開口部所處的面的法線方向所成的角大于卯°。優(yōu) 選2條法線所成的角較大，越接近180。越好。
在氧化還原酶中，多銅氧化酶催化下述反應(yīng)，即使用從底物取出的 電子將分子態(tài)氧進(jìn)行4電子還原，從而生成水的反應(yīng)。多銅氧化酶有作為 電子傳遞門的單核藍(lán)銅(I型Cu)、和作為活性中心的三核銅簇(II型Cu、 III型Cu),單核藍(lán)銅與三核銅蔟分別位于不同開口部的內(nèi)部。而且，2個 開口部分別在由蛋白質(zhì)形成的立體結(jié)構(gòu)的表面和里面。因此，多銅氧化酶 或者將其通過基因操作進(jìn)行了變化的修飾酶特別適合作為在生物傳感器、 燃料電池等各種電化學(xué)器件中使用的酶電極的正極用催化劑。
作為多銅氧化酶，具體地說有漆酶、膽紅素氧化酶、抗壞血酸氧化酶、 血漿銅藍(lán)蛋白、CueO、芽孢桿菌屬細(xì)菌的內(nèi)生孢子外殼蛋白CotA等。其 中，在使用CueO (特別是大腸桿菌的銅代謝相關(guān)氧化酶CueO (來自大腸 桿菌的CueO))作為酶電極用電極催化劑時，得到了高于以往的氧化還原酶 的電流密度。
所謂"CueO"是指從各種菌林采集的一種多銅氧化酶。另外，所謂"來 自大腸桿菌的CueO"是指從大腸桿菌采集的CueO。序列表的第1序列示 出了天然型成熟CueO的C&紗列(swissprot登記號Q8X947)。
CueO可以是從菌林直接采集的天然型CueO，或者可以是在不使催化 活性和電子傳遞能力消失的范圍內(nèi)，通過基因操作改變、刪除天然型CueO 的一部分氨基酸序列而得的修飾型CueO。
接著，對于本發(fā)明所涉及的酶電極進(jìn)行說明。
本發(fā)明所涉及的酶電極具有碳多孔體、以及擔(dān)載在碳多孔體表面的含 有CueO的電極催化劑。CueO特別優(yōu)選來自大腸桿菌的CueO。其中，因 為關(guān)于CueO和來自大腸桿菌的CueO如上所述，所以省略說明。
擔(dān)載酶的載體使用碳多孔體。因為碳多孔體不僅可以順利地進(jìn)行酶/ 電極間的電子傳遞，而且在細(xì)孔徑適當(dāng)?shù)那闆r下，可以將酶物理性地?fù)?dān)載 在細(xì)孔內(nèi)，并且可以抑制酶失活，所以特別適合作為載體。
為了充分提高作為載體成分的酶的穩(wěn)定性和活性，碳多孔體優(yōu)選具備以下[l.~ [4.的4壬1個以上的條件。 [1.平均細(xì)孔徑
碳多孔體優(yōu)選平均細(xì)孔徑為2~50nm。平均細(xì)孔徑進(jìn)而優(yōu)選為2~ 20nm。如果平均細(xì)孔徑不足2nm，則細(xì)孔的尺寸小于酶的尺寸的情況增多， 吸附性降低。另一方面，如果平均細(xì)孔徑超過50nm，則引起比表面積降 低，從而吸附性降低。另外，如果平均細(xì)孔徑超過20nm,則有可能在擔(dān) 載一部分酶時容易產(chǎn)生不適合。
另外，碳多孔體的平均細(xì)孔徑優(yōu)選為酶的分子直徑以上。平均細(xì)孔徑 更優(yōu)選為酶的分子直徑的1~1.25倍。如果碳多孔體的平均細(xì)孔徑為上述 范圍，則酶容易固定在細(xì)孔內(nèi)。因為酶一被固定在細(xì)孔內(nèi)，細(xì)孔外壁就會 抑制熱造成的酶結(jié)構(gòu)變化，所以能夠抑制熱造成的酶失活，故而熱穩(wěn)定性 提咼。
此外，所謂平均細(xì)孔徑，是指在由后述的由氮吸附等溫線求得的細(xì)孔 徑分布中，分布峰頂?shù)募?xì)孔徑值。 [2.細(xì)孔徑分布
以細(xì)孔徑分布區(qū)域在2~100nm范圍的所有細(xì)孔容積為基準(zhǔn)，碳多孔 體優(yōu)選在平均細(xì)孔徑的±25 %的范圍內(nèi)的細(xì)孔容量為60 %以上的碳多孔 體。如果細(xì)孔徑的均勻性t匕這差，則可能除了細(xì)孔徑最適合擔(dān)載酶的細(xì)孔 之外的細(xì)孔變多，酶的穩(wěn)定性和活性不充分。
對中孔碳粒子的制造方法不特別限制，例如，可以通過以下的方法制 造。即，對中孔規(guī)則排列的二氧化硅、二氧化鈦等多孔粒子(鑄型)，吸附、 浸漬蔗糖、糠醇等有機(jī)分子，然后在惰性氣氛下進(jìn)行碳化。然后，通過氬 氟酸、NaOH/EtOH等溶解、除去鑄型，結(jié)果得到中孔碳粒子。作為鑄型， 例如，可以使用二氧化硅中孔多孔體MCM-48。
對制造含氮炭黑凝膠的方法不特別限制，例如，可以通過以下那樣的 方法制造。
(A)使用一氧化氮在炭黑凝膠中導(dǎo)入N原子的方法。 要在炭黑凝膠中導(dǎo)入N原子，例如，可以依據(jù)文獻(xiàn)(P.Chambrkm等，Energy&Fuels， 11巻,681-685頁(1997))所記載的方法來實施。即，在石 英反應(yīng)管中配置炭黑凝膠，在氦氣流下加熱到950。C左右。然后將用氦氣 稀釋的NO(濃度1000ppm左右)導(dǎo)入反應(yīng)管，在600 ~卯0。左右的反應(yīng)溫度 下進(jìn)行反應(yīng)。對該反應(yīng)所需要的反應(yīng)時間不特別限制，但如果延長反應(yīng)時 間則i^V碳骨架中的氮量增加。
(B)通過熱CVD法在炭黑凝膠表面析出含氮碳的方法。 該方法是在炭黑凝膠的細(xì)孔內(nèi)導(dǎo)入含氮有機(jī)化合物，通過使該含氮有 機(jī)化合物熱分解來在炭黑凝膠表面析出含氮碳的方法。即，首先，在反應(yīng) 管中設(shè)置炭黑凝膠， 一邊將氮氣、氬氣等惰性氣體導(dǎo)入反應(yīng)管， 一邊加熱 到規(guī)定溫度。接著，維持加熱狀態(tài)不變，通過將氣態(tài)的含氮有機(jī)化合物導(dǎo) 入反應(yīng)管，從而在炭黑凝膠的細(xì)孔內(nèi)導(dǎo)入含氮有機(jī)化合物，同時進(jìn)行規(guī)定 時間的CVD反應(yīng)。由此，可以在炭黑凝膠的細(xì)孔內(nèi)析出由C原子和N原 子形成骨架的含氮碳。利用熱CVD法進(jìn)行的析出工序，因為在反應(yīng)氣氛 為氧化氣氛的情況下發(fā)生碳燃燒，所以通常在氮氣、氬氣等惰性氣氛下進(jìn) 行。
作為這里所使用的含氮有機(jī)化合物，只要是含有N原子的有機(jī)化合物 即可，不特別限制，可列舉例如，含氮雜環(huán)式化合物、胺類、亞胺類、腈 類等。作為含氮雜環(huán)式化合物，可列舉含氮單環(huán)化合物和含氮稠環(huán)化合物。
作為含氮單環(huán)化合物，可列舉作為5元環(huán)化合物的吡咯及其衍生物， 吡唑、咪唑等二唑類及其衍生物；以及作為6元環(huán)化合物的吡咬及其f;t生 物，喊溱、嘧啶、吡嗪等二嗪類及其衍生物，三嗪類以及三聚氰胺、氰尿 酸等三溱類衍生物等。
另外，作為含氮稠環(huán)化合物，可列舉壹啉、菲咯啉、噤呤等。
作為胺類，可列舉伯~叔胺、二胺類、三胺類、多胺類和氨基化合物等。
作為伯 叔胺，可列舉甲胺、乙胺、二曱胺和三曱胺等脂肪族胺；以 及苯胺等芳香族胺及其衍生物等。
作為氨基化合物，可列舉乙醇胺等氨基醇等。作為亞胺類，可列舉吡咯烷和氮丙啶等。
作為腈類，可列舉乙腈等脂肪族腈和節(jié)腈等芳香族腈等。 作為其它含氮有機(jī)化合物，可列舉尼龍等聚酰胺類、半乳糖胺等M 糖、聚丙烯腈糖的含氮高分子化合物、氨基酸和聚酰亞胺類等。
在利用熱CVD法進(jìn)行的析出工序中，當(dāng)含氮有機(jī)化合物在常溫下為 液態(tài)時，可以使用擴(kuò)散器、質(zhì)量流泵等，通過蒸氣蒸發(fā)將含氮有機(jī)化合物 制成氣態(tài)而導(dǎo)入反應(yīng)管內(nèi)。另外，這時優(yōu)選使用氮氣、氬氣等作為載氣來 導(dǎo)入氣態(tài)的含氮有機(jī)化合物。進(jìn)而，優(yōu)選通過在反應(yīng)管出口側(cè)設(shè)置加入了 液體石蠟等的擴(kuò)散器等來防止逆流，使得曾在反應(yīng)管內(nèi)流通的氣體不從反 應(yīng)管的出口側(cè)逆流。
當(dāng)含氮有機(jī)化合物在常溫下為固態(tài)時，可以在反應(yīng)管入口側(cè)設(shè)置加熱 蒸發(fā)(升華)器，從而通過加熱將含氮有機(jī)化合物制成氣態(tài)導(dǎo)入反應(yīng)管。另 外，這時必須將蒸發(fā)器的溫度調(diào)整到含氮有機(jī)化合物不熱分解的溫度。
在含氮有機(jī)化合物具有聚合性的情況下，可以采取預(yù)先使之在炭黑凝 膠的細(xì)孔內(nèi)聚合，然后在反應(yīng)管中、在惰性氣氛下進(jìn)行熱分解的方法。
進(jìn)而，在含氮有機(jī)化合物不因加熱而氣化的情況下，可以通過溶液吸 附法、蒸發(fā)干固法等預(yù)先在炭黑凝膠的細(xì)孔內(nèi)導(dǎo)入含氮有機(jī)化合物，通過 將它們在惰性氣氛下進(jìn)行熱分解，從而使炭黑凝膠的細(xì)孔內(nèi)析出含氮碳。
利用熱CVD法進(jìn)行的析出工序中的反應(yīng)溫度，只要是含氮有機(jī)化合 物熱分解和碳化的溫度即可，不特別限制，優(yōu)選為300~ 1000°C。反應(yīng)溫 度更優(yōu)選為500~700°C。當(dāng)反應(yīng)溫度不足30(TC時，由于含氮有機(jī)化合物 難以發(fā)生熱分解，故而有含氮碳的析出速度減慢，反應(yīng)時間和能量消耗增 大的傾向。另一方面，當(dāng)溫度超過1000。C時，由于碳骨架中難以殘留碳， 故而N/C比降低。
在析出工序中，對在炭黑凝膠的細(xì)孔內(nèi)析出的含氮碳的析出量不特別 限制，優(yōu)選在以每克炭黑嶷膠的比表面積為Yn^的情況下，為(0.0001xY)g 以上。在含氮有機(jī)化合物的析出量不足(0.0001xY)的情況下，由于析出量 較少，故而有可能不能通過N原子提高吸附性。析出量與CVD反應(yīng)時間是相關(guān)關(guān)系，可以通過調(diào)整CVD反應(yīng)時間來 控制析出量。進(jìn)而，析出量根據(jù)CVD反應(yīng)溫度、炭黑凝膠的種類、含氮 有機(jī)化合物的種類和導(dǎo)入含氮有機(jī)化合物時的流量等不同而變化，但在各 種情況下可以通過適當(dāng)調(diào)整CVD反應(yīng)時間來調(diào)整析出量。
接著，對本發(fā)明所涉友的酶電極的制造方法進(jìn)行說明。
首先，在碳多孔體的表面擔(dān)載酶。對酶的擔(dān)載方法不特別限制，可以 1吏用升華法、浸漬法等各種方法，但優(yōu)選浸漬法。
通過浸漬法來擔(dān)載酶如下地進(jìn)行。即，首先，^使酶溶解到水或緩沖液 中l(wèi)吏得其為不生成沉淀的濃度(優(yōu)選為0.1 ~ 1000mg/ml)。然后，在該溶液 不凍結(jié)、并且酶不變性的溫度(優(yōu)選為0 50。C)下，在其中懸浮粉末狀的栽 體，或使其浸漬片狀的載體中，從而使酶與載體接觸。接觸時間優(yōu)選為至 少5分鐘以上，更優(yōu)選為30分鐘以上。從而在栽體的表面或細(xì)孔內(nèi)固定酶。
對在溶液中懸浮載體時的濃度不特別限制，優(yōu)選為0.1 ~ 1000mg/ml 左右。另外，在擔(dān)載工序之后，可以進(jìn)一步有通過進(jìn)行離心分離等來將載 體與溶液分離而取出的工序?；蛘撸梢酝ㄟ^進(jìn)行干燥等來除去液體成分。
對在載體上擔(dān)載介體的方法，可以使用與在載體上擔(dān)載酶的方法相同 的方法。還可以在載體上同時擔(dān)載酶與電子移動介體。
接著，對本發(fā)明所涉及的電極催化劑和酶電極的作用進(jìn)行說明。
圖1顯示一種作為多銅氧化酶的來自大腸桿菌的CueO的分子結(jié)構(gòu) (Sue A. Roberts等，PNAS， 99巻(2002年)，2766-2771頁)。如圖1所示， 蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中，具有作為電子傳遞門而發(fā)揮作用的單核藍(lán)銅(I型 Cu)、和作為活性中心的三核銅簇(II型Cu、 III型Cu)，單核藍(lán)銅與三核 銅簇分別處于不同開口部的內(nèi)部(片岡邦重，生化學(xué)，第77巻(2005年)， 第148頁~第153頁)。并且，2個開口部分別處于由蛋白質(zhì)形成的立體結(jié) 構(gòu)的表面和里面。而且，天然型CueO，其單核藍(lán)銅的上部被稱為螺4t 5 的螺旋狀分子覆蓋。
如果使用這樣的CueO作為酶電極用的電極催化劑，則可得到高于現(xiàn) 有的氧化還原酶的電流密度。其詳細(xì)原因不清楚，但i^為由于以下原因。
(1) 由于CueO的酶分子中，催化氧化反應(yīng)的活性中心與電子傳遞門分 離，故而即使將酶固定在電極固體表面也能同時完成催化反應(yīng)和電子傳遞。
(2) 因為CueO中電子傳遞門更接近分子表面，所以在固定于固體表面 的狀態(tài)下，電子傳遞門與電極之間的距離減小，故而電子移動效率提高。
另外，在將CueO固定在載體上的情況下，如果使用具有規(guī)定的細(xì)孔 徑、細(xì)孔分布和比表面積的碳多孔體，則可得到高電流密度。 認(rèn)為這是由于下述原因(l)和原因(2):
原因(l)因為可以將大多數(shù)酶固定在碳多孔體的細(xì)孔內(nèi)，所以載體/酶 之間的電子移動變得容易；以及，
原因(2)因為蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的變化被細(xì)孔壁抑制，所以減輕了熱造 成的失活，提高了熱穩(wěn)定性。
另外，如果使用炭黑凝膠作為碳多孔體，則可得到高電子傳遞效率。 i人為這是由于，具有大量適合擔(dān)載酶的細(xì)孔、細(xì)孔相互連接而形成了三維 的網(wǎng)絡(luò)等原因。
進(jìn)而，如果使用含氮炭黑凝膠作為碳多孔體，則可以長時間地維持高 電子傳遞效率。認(rèn)為這是囟為，通過在炭黑凝膠中導(dǎo)入氮而在細(xì)孔內(nèi)壁導(dǎo) 入了極性基團(tuán)，在與蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)之間生成了氬鍵等新的結(jié)合的 緣故。 實施例
(實施例1、比較例1、 2) [1.試驗方法]
將來自大腸桿菌的CueO(實施例1)、來自漆樹的漆酶(比較例1)、或來 自漆斑菌屬(Myrotheciumu sp.)的膽紅素氧化酶(BOD)(比較例2)溶解在磷 酸緩沖液(0.05M， pH7.0)中，調(diào)制8fiM的酶溶液。
使用預(yù)先飽和了氧的上述酶溶液，以HOPG(高定向熱解石墨)電極作 為作用極，通過循環(huán)伏安圖法(電位-50~650mV，掃描速度20mV/秒)， 來評價酶與電極之間的直#電子移動特性。對峙電極使用鉑電極，參考電極使用銀/氯化銀電極。
使5.5g間苯二酚(和光純藥)和26.5mg碳酸鈉(和光純藥)溶解在16.9g 蒸餾水中，然后加入8.1g的37%曱醛溶液(和光純藥)攪拌混合?；旌先芤?為淡黃色透明。此外，各成分的摩爾比為間苯二酚碳酸鈉甲醛-200:1:400。
接著，在得到的原液中加入水，以體積比計稀釋到2倍。將稀釋的溶 液裝入管形瓶中密封，在室溫靜置24小時，在50。C靜置24小時，進(jìn)而在 卯。C靜置72小時，從而得到水合的有機(jī)凝膠。
接著，為了除去有機(jī)凝膠中的水分，將有機(jī)凝膠浸漬在作為交換溶劑 的丙酮(和光純藥)中。 一將有機(jī)凝膠浸漬在丙酮中，有機(jī)凝膠中的水分就 擴(kuò)散到丙酮中，從而可以將凝膠中的水分置換成丙酮。7JC分?jǐn)U散飽和之后， 將丙酮換成新品，將操作重復(fù)幾次，從而將凝膠中的水分完全置換成丙酮。 接著，將浸漬溶劑換成正戊烷(和光純藥)，反復(fù)進(jìn)行溶劑交換-浸漬，直至 有機(jī)凝膠中的丙酮完全被正戊烷替換。進(jìn)而，使溶劑置換成正戊烷的有機(jī) 凝膠風(fēng)干，從而得到干燥有機(jī)凝膠。
將得到的干燥有機(jī)^i^在氮氣流下(流量300ml/min)、在1000'C進(jìn)行 加熱，使有機(jī)凝膠碳化。加熱時間為6小時。 [2.酶電極的制作]
在含有5 % PDVF(聚偏氟乙烯)的NMP(N-曱基吡咯烷酮)溶液中懸浮其 量為6/7 %的炭黑凝膠(實施例Q或科琴導(dǎo)電碳黑(Ketjen Black)(實施例3)， 從而調(diào)制漿料，在直徑6mm的玻璃碳電極(BAS公司制造，型號002012) 表面上添加上述漿料，通過旋涂(3000rpm)將炭黑載體涂布在電極表面上。通過將得到的碳修飾電極在來自大腸桿菌的CueO水溶液(12.5mg/ml)中在 4。C下浸漬l夜，從而將酶固定在碳修飾電極上。
另夕卜，按照同樣的順序，將來自漆樹的漆酶固定在炭黑凝膠(比較例3) 或科琴導(dǎo)電碳黑(比較例4)修飾電極上。 [3.試驗方法
將[2.]所得各種酶電極作為作用電極，利用循環(huán)伏安圖法(在電位為 200 ~ 500mV之間進(jìn)行電流掃描，掃描速度20mV/秒)來評價電極的電特性。 對峙電極使用柏，參考電極使用銀/氯化銀電極。電解質(zhì)使用飽和了氧的 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)。進(jìn)而，在使電解液和酶電極兩者都靜止的狀 態(tài)下進(jìn)行電特性評價。 [4.結(jié)果
圖3顯示循環(huán)伏安圖。根據(jù)圖3可知，與科琴導(dǎo)電碳黑相比，在使用 炭黑凝膠的情況下，漆酶、CueO的電流量均增加。特別是，CueO/CG的 組合在200mV下的電流密度與漆酶/KB相比，增加到約7倍。
以上，對于本發(fā)明的實施方式進(jìn)行了詳細(xì)說明，但本發(fā)明不受上述實 施方式任何限制，可以在不脫離本發(fā)明的宗旨的范圍內(nèi)進(jìn)行各種改變。
工業(yè)可利用性
本發(fā)明所涉及的電極催化劑可以作為生物傳感器、燃料電池等各種電 化學(xué)器件、太陽能電池等的電極催化劑使用。
另外，本發(fā)明所涉及的酶電極可以作為生物傳感器、燃料電池等各種 電化學(xué)器件、太陽能電池等的電極使用。
權(quán)利要求
1.一種含有CueO的電極催化劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電極催化劑，所述CueO是來自大腸桿菌的 CueO。
3. —種酶電極，具有 碳多孔體；以及擔(dān)載在所述碳多孔體表面的、含有CueO的電極催化劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶電極，所述CueO是來自大腸桿菌的 CueO。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶電極,所述碳多孔體是滿足以下的(i)和(n)的條件的炭黑凝膠(I) 在掃描區(qū)域29 = 0.5 ~ 10。(CuKa線)中未看到X射線衍射峰；(II) 在由吸附脫附等溫線計算出的細(xì)孔徑分布中，在分布峰頂?shù)募?xì)孔徑值(d)處于2nm以上且不足10nm的范圍的情況 下，在相對于上述細(xì)孔徑值(d)為d士2nm的細(xì)孔徑區(qū)域中，含有總細(xì)孔容 量的60%以上，在分布峰頂?shù)募?xì)孔徑值(D)處于10nm 50nm的范圍的情況下，在相 對于上述細(xì)孔徑值(D)為(0.75xD) ~ (1.25xD)nm的細(xì)孔徑區(qū)域中，含有總細(xì) 孑L容量的60%以上。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3~5的任一項所述的酶電極，還具有促進(jìn)所述碳多 孔體-所述CueO之間的電子授受的介體。
全文摘要
本發(fā)明提供含有電子傳遞效率高的氧化酶的新型電極催化劑，以及使用該電極催化劑的酶電極。電極催化劑含有CueO。酶電極具有碳多孔體、以及擔(dān)載在上述碳多孔體表面的含有CueO的電極催化劑。CueO優(yōu)選是來自大腸桿菌的CueO。構(gòu)成酶電極的碳多孔體優(yōu)選是炭黑凝膠。另外，酶電極還可以具有促進(jìn)上述碳多孔體-上述CeuO之間的電子授受的介體。
文檔編號G01N27/327GK101529234SQ20078003274
公開日2009年9月9日 申請日期2007年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月5日
發(fā)明者上村惠子, 加納健司, 加藤久雄, 梶野勉, 櫻井武, 瀨戶山德彥, 片岡邦重, 辻村清也 申請人:豐田自動車株式會社;國立大學(xué)法人京都大學(xué);國立大學(xué)法人金澤大學(xué)