一種重組大腸桿菌利用甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)將參與2,3-丁二醇生物合成的三個(gè) 基因克隆并與大腸桿菌高拷貝載體PUC19連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，使用氨芐青 霉素作為篩選標(biāo)記，以加強(qiáng)這三個(gè)基因在大腸桿菌中的表達(dá)量，使2,3_ 丁二醇可以在大腸 桿菌中大量合成。
【背景技術(shù)】：
[0002] 2,3_ 丁二醇是重要的化工原料和液體燃料，廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料及航空航 天等領(lǐng)域，可以用于生產(chǎn)塑膠，制備防凍劑，并且是一種很好的溶劑，易于轉(zhuǎn)化為各種化合 物生產(chǎn)橡膠，調(diào)味品以及化妝品（Syu M J. 2001)。常溫下是一種無(wú)色無(wú)味的透明液體，相對(duì) 分子量為90. 12g/mol，其分子式如下所示。上世紀(jì)中期，2, 3-丁二醇的生物技術(shù)生產(chǎn)得到 了迅速的發(fā)展，由于更為廉價(jià)的化學(xué)合成法的出現(xiàn)，使得生物技術(shù)生產(chǎn)2, 3-丁二醇陷入困 境。但是化學(xué)合成法使用石油作為原料生產(chǎn)2, 3-丁二醇。最近二十年來(lái)，上升的石油價(jià)格 導(dǎo)致化學(xué)合成法失去了優(yōu)勢(shì)，在能源需求不斷擴(kuò)大、化石能源日益短缺、石油資源供應(yīng)不穩(wěn) 定的情況下，以可再生的生物質(zhì)資源為原料，經(jīng)過(guò)生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)各種化學(xué)品、功能材 料和能源物質(zhì)的生物技術(shù)方法獲得了人們的青睞。目前，研究熱點(diǎn)都在于以糖質(zhì)作為原料 生產(chǎn)2, 3- 丁二醇，但是，糧食資源日益緊張的今天，開(kāi)發(fā)以廉價(jià)的非糧糖質(zhì)為原料發(fā)酵生 產(chǎn)2,3_ 丁二醇具有很好的發(fā)展前景·（Xiu and Zeng2008)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株可利用甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇的大腸桿菌8125141，質(zhì)粒？800，基因工程菌 BD016156和2, 3- 丁二醇合成相關(guān)酶的基因 alsS，alsD和bdh。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中，利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)大腸桿菌的方法，包括培養(yǎng)所需條件和培養(yǎng) 基配方。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)2, 3- 丁二醇的大腸桿菌基因工程菌的制備方 法，包括： a. 利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增得到三個(gè)相關(guān)合成酶的基因片段 b. 利用熱擊法將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的方法 c. 用氨芐青霉素篩選陽(yáng)性克隆并用于生產(chǎn)的方法。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1中三個(gè)2, 3-丁二醇合成酶的相關(guān)基因設(shè)計(jì)的引物為：引物序列1， 2, 3,4, 5,6
5. 根據(jù)權(quán)利要求1中利用基因工程菌生產(chǎn)2, 3- 丁二醇的發(fā)酵方法及培養(yǎng)基： LB 培養(yǎng)基（IL) :Tryptone (胰蛋白胨）：10g，Yeast Extract (酵母提取物）：5g， NaCl (氯化鈉）：10g。若配制固體培養(yǎng)基，則再加入15g Agar (瓊脂）。 M9培養(yǎng)基（IL) :Na2HP04,7H20(七水合磷酸氫二鈉）：12.8g，KH 2P04(磷酸二氫鉀）：3g， NaCl (氯化鈉）：0.5g，NH4Cl (氯化銨）：lg，Glycerol (甘油）：20g。Yeast Extract (酵母 提取物）：5g，IM MgSO4 · 7H20(七水合硫酸鎂）1ML，0. IM CaCl (氯化鈣）：1ML。 將所得基因工程菌在3ML含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C，250rpm培養(yǎng)12小時(shí)， 轉(zhuǎn)入M9培養(yǎng)基，M9培養(yǎng)基在使用前加入氨芐青霉素，37°C培養(yǎng)3小時(shí)，加入4 μ L濃度為 0. 5mM的IPTG誘導(dǎo)，并轉(zhuǎn)入30°C，250rpm培養(yǎng)24-48小時(shí)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5中，利用基因工程菌大量發(fā)酵生產(chǎn)2, 3-丁二醇的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，包 括分批補(bǔ)料，流加等發(fā)酵方法。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用重組大腸桿菌利用甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法。具有如下步驟：1)克隆參與2,3-丁二醇生物合成的基因alsS，alsD和bdh，2)將這些基因與大腸桿菌高拷貝載體pUC19連接以構(gòu)建含有2,3-丁二醇生物合成所需蛋白的編碼基因的重組載體，3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW25141中，通過(guò)氨芐青霉素的篩選標(biāo)記，從而獲得了大腸桿菌高產(chǎn)2,3-丁二醇的菌株，4)通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇，并從發(fā)酵液中回收2,3-丁二醇。該方法具有環(huán)保，高效，穩(wěn)定，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12N1-21, C12P7-18, C12N15-70, C12R1-19
【公開(kāi)號(hào)】CN104560843
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310488514
【發(fā)明人】劉立棟
【申請(qǐng)人】常州邱鴻生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月18日