本發(fā)明涉及酶的基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母及構(gòu)建與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

白色污染是全球所有城市都存在的一種環(huán)境污染，主要是指人們在日常生活中隨意丟棄的塑料垃圾對環(huán)境造成的破壞，包括常見的塑料杯、一次性飯盒、塑料袋等。而白色污染物的很大一部分是PET(聚對苯二甲酸乙二醇酯)制品。目前，世界上PET的年產(chǎn)量達到了2700多萬噸，雖然PET不會直接對環(huán)境造成危害，但其廢棄物對大氣和微生物的抵抗性很強，在自然環(huán)境中的存在周期為16-48年，而且隨著PET產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，其廢棄物的數(shù)量極其巨大，從環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)考慮，PET廢棄物已成為全球性的環(huán)境污染有機物。

目前降解PET的方法主要有化學(xué)降解和生物降解兩大類，在實際應(yīng)用中PET的化學(xué)分解法主要有水解法和醇解法，此外還有氨解、胺解和熱解等。但是這些方法通常成本較高、效率較低并且不環(huán)保，避免不了降解PET后給環(huán)境帶來二次污染；而生物降解方法相對化學(xué)降解工藝更簡單、更節(jié)能環(huán)保、且不會造成二次污染。因此生物降解將是從根本上解決廢棄PET污染的最好方法。

PET分解酶是目前發(fā)現(xiàn)的唯一在細菌中發(fā)現(xiàn)的能降解PET的酶，分子量約為32KD，能將PET降解為單(2-羥乙基)對苯二甲酸或?qū)Ρ蕉姿幔渥畲蟮膬?yōu)勢是，與其他能降解PET的真菌中的酶LCC、TfH、FsC相比，其在低溫段(20～40℃)的酶活顯著高于其他酶，這意味著在實際應(yīng)用中較容易達到適宜的反應(yīng)條件，工業(yè)應(yīng)用前景較好。但是該PET分解酶對PET的分解效率不高，分離純化困難，不利用其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。

參考文獻：

[1]Shosuke Yoshida,Kazumi Hiraga,Toshihiko Takehana,Ikuo Taniguchi，Hironao Yamaji,Yasuhito Maeda,Kiyotsuna Toyohara,Kenji Miyamoto,Yoshiharu Kimura,Kohei Oda.A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate)[J].science，2016(351)：1196-1199.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有PET分解酶對PET的分解效率不高，分離純化困難，不利用其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的不足，提供一種分解效率高，分離容易的細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母的用途。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建，包括如下步驟：

(1)化學(xué)合成SEQ ID No.1所示的改良過的PET分解酶的核苷酸序列；從畢赤酵母GS115基因組中克隆出錨定蛋白基因的核苷酸序列；

(2)利用OverlapPCR將錨定蛋白基因的核苷酸序列和改良過的PET分解酶基因的核苷酸序列連接得到融合序列；

(3)將融合序列連接到畢赤酵母表達載體上，得到重組表達載體；

(4)將重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主畢赤酵母中，得到細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母。

所述錨定蛋白基因為SEQ ID NO.2所述的GCW21、SEQ ID No.3所示的GCW51或SEQ ID No.4所述GCW61。

所述畢赤酵母表達載體為pPIC9。

上述構(gòu)建構(gòu)建的細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母。

上述細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母在全細胞催化分解PET的用途。

有益效果

野生菌株產(chǎn)酶能力有限、生長周期長、蛋白純化過程復(fù)雜、易變性不易保存、生產(chǎn)成本高，限制了其推廣應(yīng)用。而畢赤酵母細胞表面展示技術(shù)可以將PET分解酶錨定到細胞表面，固定化后的酶可做全細胞催化劑，相比于野生型穩(wěn)定性高、回收方便、易控制、可反復(fù)利用，適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。

附圖說明

圖1為重組畢赤酵母PETase-GCW21、PETase-GCW51、PETase-GCW51全細胞催化酶活測定與野生型比較結(jié)果

圖2為重組畢赤酵母細胞的免疫熒光顯微照片；

圖2-1為重組畢赤酵母PETase-GCW21免疫熒光結(jié)果；

圖2-2為重組畢赤酵母PETase-GCW51免疫熒光結(jié)果；

圖2-3為重組畢赤酵母PETase-GCW61免疫熒光結(jié)果。

具體實施方式

原PET分解酶基因Genbank登錄號為NZ_BBYR01000074.1。

pPIC9質(zhì)粒市售。

下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學(xué)公司購買。

實施例1細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建及應(yīng)用，包括如下步驟：

化學(xué)合成SEQ ID No.1所示的改良過的PET分解酶的核苷酸序列；

根據(jù)SEQ ID No.1序列設(shè)計上游引物P-F和下游引物P-R；

P-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R：5’-3’ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

進行PCR,PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得PET分解酶基因。

根據(jù)GCW21(NCBI Reference Sequence:XM_002491407)，預(yù)測其信號肽后，設(shè)計上游引物21-F和下游引物21-R；

21-F：5’-3’GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGACCAGCGAATCTCTGTCAC

21-R：5’-3’CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCGGCGGCAATT

以畢赤酵母GS115菌株基因組DNA為模板，進行PCR，擴增得到錨定蛋白基因GCW21的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示擴增目的基因片段呈現(xiàn)亮帶，回收目的基因片段，得GCW21基因。

利用OverlapPCR將錨定蛋白GCW21基因和改良過的PET分解酶基因的核苷酸序列通過SEQ ID No.5所示的linker連接得到融合序列；

根據(jù)錨定蛋白GCW21基因和改良過的PET分解酶基因，設(shè)計上游引物P-21/51/61-F和下游引物P-21-R；

P-21/51/61-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGG

P-21-R：5’-3’CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCG

進行PCR，擴增序列如SEQ ID NO.6的PETase-linker-GCW21。

將PETase-linker-GCW21基因和pPIC9載體同時用Xho I和EcoR I雙酶切后，將得到的PETase-linker-GCW21酶切基因片段連接到雙酶切后的pPIC9載體上；將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coli DH5α中，并挑取陽性克隆，在LB液體培養(yǎng)基上擴增后提取質(zhì)粒，得到重組表達載體p9P21。

在上述步驟中，所述的目的基因片段與載體的連接采用thermo公司的T4DNA連接酶進行連接。

將獲得的重組表達載體p9P21轉(zhuǎn)入表達宿主大腸桿菌DH5α中，擴增重組質(zhì)粒。

在上述步驟中，所述的連接產(chǎn)物的大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，按如下方法進行：

1)取一管感受態(tài)細胞E.coli DH5α于冰上緩慢溶解，加入要轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物(10μL)，輕混后冰浴30min；

2)42℃熱激90s后，迅速冰浴5min；

3)加入900μL，37℃溫浴的LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h；

4)取200微升涂布于含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB選擇平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h；

5)挑取單克隆，進行后續(xù)質(zhì)粒提取以及驗證實驗。

在上述步驟中，所述的連接產(chǎn)物陽性克隆驗證，按如下方法進行：

1)從篩選平板上挑取p9P21轉(zhuǎn)化子，接入5mL LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/mL氨芐青霉素)，

37℃搖床培養(yǎng)12-16h；

2)取5mL菌液，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒；

3)取1μL質(zhì)粒提取液進行Nanodrop檢測，檢測提取的質(zhì)粒濃度；

4)將提取的質(zhì)粒進行雙酶切，驗證基因片段與載體的連接效果；

5)將酶切驗證正確的重組質(zhì)粒進行測序或者進行其他實驗，測序委托金唯智生物公司完成。

將擴增得到的質(zhì)粒經(jīng)過線性化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株基因組中，得到細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21。

電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株細胞感受態(tài)制備

1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜；

2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至OD600約為1.3-1.5；

3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物，4℃，1500g離心5分鐘以收集細胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液，再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細胞，30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘；從搖床上取下細胞，冰浴半小時；

4)從搖床上取下細胞，冰浴半小時；4℃，1500g離心5分鐘以收集細胞，再用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細胞；

5)如上離心，再用20ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細胞；

6)如上離心，用1ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細胞，至終體積約1.5ml；如上離心，用500μL冷超純水重新懸浮細胞，冰浴中備用。

電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

1)取80μL上述細胞與5-20ug線性化的p9P21載體，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，在冰上放置5min；

2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴，放在電轉(zhuǎn)儀上；

3)設(shè)置酵母參數(shù)“fungi”，“pic”，點擊Pulse；

4)取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入600微升L冰預(yù)冷1mol/L山梨醇，用槍輕輕吹打，在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份，涂于MD平板上(設(shè)置感受態(tài)中不加入載體的對照組)；30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進行篩選；

5)提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，進行PCR驗證，比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同，PCR采用的引物為AOX上下游引物、目的基因擴增產(chǎn)物；

6)對細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21進行甘油保菌。

將細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21接種于BMM培養(yǎng)基中經(jīng)甲醇誘導(dǎo)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)24～120小時后離心收集菌體，用于PET降解，進行酶活測定。

進行重組酵母的誘導(dǎo)表達實驗。

1)挑選細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21陽性轉(zhuǎn)化子一個，從保存的甘油菌中挑取30uL置于5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃/260～280rpm培養(yǎng)至OD600＝2-6。

2)轉(zhuǎn)接入裝有MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的搖瓶中，于30℃/260～280rpm培養(yǎng)至OD600＝2-6(～16-18h)。

3)離心以收集菌體(或者室溫放置沉淀以防止離心操作過程增加染菌幾率)；用BMM培養(yǎng)基重懸菌體，使OD600＝1.0左右；將上步所得的菌液置于搖瓶中，用封口膜封口，放置于30℃/260～280rpm的搖床上繼續(xù)生長.

4)每24h向培養(yǎng)基中添加1％甲醇,按時間點分別取菌液樣品，取至120小時。

實施高效液相色譜儀(HPLC)檢測酶活實驗。

配置酶活反應(yīng)所用到的一系列緩沖液。

1)PBS緩沖液：

用800ml雙蒸水溶解8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4

用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L，抽濾除菌。

2)甘氨酸/氫氧化鈉緩沖液

3)磷酸磷酸二氫鈉緩沖液pH＝2.50：配制0.02M H3PO4 1L，0.02M NaH2PO4，1L，大約1：3混合至pH＝2.50，抽濾。

4)甲醇：將甲醇用有機濾紙抽濾到絲口瓶中

5)終止液：90mL PBS中加入10mL DMSO。

制取進行測量酶活的樣品。

1)取適量菌液于EP管，離心去上清。

2)加入適量甘氨酸/氫氧化鈉緩沖液(pH＝9.0)重懸菌液，離心去上清，重復(fù)一次。

3)在恒溫搖床里孵育反應(yīng)。

4)反應(yīng)結(jié)束后，離心，取上清，加入終止液。

5)加熱滅活適宜時間。

6)實施HPLC測試酶活，從圖1即可看到關(guān)于細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21降解PET的酶活數(shù)據(jù)。

將所述的細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21進行免疫熒光檢測。

1)取反應(yīng)液于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

2)PBS緩沖液對重組酵母細胞進行重懸，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

3)利用BSA的PBS緩沖液重懸菌體，于室溫下反應(yīng)1h，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

4)利用含F(xiàn)lag一抗的200uL的含BSA的PBS緩沖液重懸菌體，于4℃過夜處理，期間應(yīng)使菌體上下混勻。次日于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

5)PBS緩沖液對重組酵母細胞進行重懸，室溫處理10min，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

6)步驟(5)重復(fù)兩次。

7)利用含1uLFlag二抗的200uL的PBS緩沖液重懸菌體，避光室溫處理1h，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

8)PBS緩沖液對重組酵母細胞進行重懸，避光室溫處理5min，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

9)步驟(8)重復(fù)一次。

10)用PBS緩沖液重懸，每次取10uL于潔靜載玻片制片，圖2-1即可得到關(guān)于PETase-linker-GCW21序列在畢赤酵母中的表達情況。

實施例2細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建及應(yīng)用，包括如下步驟：

化學(xué)合成SEQ ID No.1所示的改良過的PET分解酶的核苷酸序列；

根據(jù)SEQ ID No.1序列設(shè)計上游引物P-F和下游引物P-R；

P-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R：5’-3’ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

進行PCR,PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得PET分解酶基因。

根據(jù)GCW51(NCBI Reference Sequence:XP_002493782)，預(yù)測其信號肽后，設(shè)計上游引物51-F和下游引物51-R；

51-F：5’-3’GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGATGACGATGACTCATTAC

51-R：5’-3’CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

以畢赤酵母GS115菌株基因組DNA為模板，進行PCR，擴增得到錨定蛋白基因GCW51的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示擴增目的基因片段呈現(xiàn)亮帶，回收目的基因片段，得GCW51基因。

利用OverlapPCR將錨定蛋白GCW51基因和改良過的PET分解酶基因的核苷酸序列通過SEQ ID No.5所示的linker連接得到融合序列；

根據(jù)錨定蛋白GCW51基因和改良過的PET分解酶基因，設(shè)計上游引物P-21/51/61-F和下游引物51-R；

P-21/51/61-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGG

51-R：5’-3’CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

進行PCR，擴增序列如SEQ ID NO.7的PETase-linker-GCW51。

將PETase-linker-GCW51基因和pPIC9載體同時用Xho I和EcoR I雙酶切后，將得到的PETase-linker-GCW51酶切基因片段連接到雙酶切后的pPIC9載體上；將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coli DH5α中，并挑取陽性克隆，在LB液體培養(yǎng)基上擴增后提取質(zhì)粒，得到重組表達載體p9P51。

在上述步驟中，所述的目的基因片段與載體的連接采用thermo公司的T4DNA連接酶進行連接。

將獲得的重組表達載體p9P51轉(zhuǎn)入表達宿主大腸桿菌DH5α中，擴增重組質(zhì)粒。

在上述步驟中，所述的連接產(chǎn)物的大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，按如下方法進行：

1)取一管感受態(tài)細胞E.coli DH5α于冰上緩慢溶解，加入要轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物(10μL)，輕混后冰浴30min；

2)42℃熱激90s后，迅速冰浴5min；

3)加入900μL，37℃溫浴的LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h；

4)取200微升涂布于含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB選擇平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h；

5)挑取單克隆，進行后續(xù)質(zhì)粒提取以及驗證實驗。

在上述步驟中，所述的連接產(chǎn)物陽性克隆驗證，按如下方法進行：

1)從篩選平板上挑取p9P51轉(zhuǎn)化子，接入5mL LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/mL氨芐青霉素)，37℃搖床培養(yǎng)12-16h；

2)取5mL菌液，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒；

3)取1μL質(zhì)粒提取液進行Nanodrop檢測，檢測提取的質(zhì)粒濃度；

4)將提取的質(zhì)粒進行雙酶切，驗證基因片段與載體的連接效果；

5)將酶切驗證正確的重組質(zhì)粒進行測序或者進行其他實驗，測序委托金唯智生物公司完成。

將擴增得到的質(zhì)粒經(jīng)過線性化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株基因組中，得到細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51。

電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株細胞感受態(tài)制備

1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜；

2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至OD600約為1.3-1.5；

3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物，4℃，1500g離心5分鐘以收集細胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液，再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細胞，30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘；從搖床上取下細胞，冰浴半小時；

4)從搖床上取下細胞，冰浴半小時；4℃，1500g離心5分鐘以收集細胞，再用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細胞；

5)如上離心，再用20ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細胞；

6)如上離心，用1ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細胞，至終體積約1.5ml；如上離心，用500μL冷超純水重新懸浮細胞，冰浴中備用。

電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

1)取80μL上述細胞與5-20ug線性化的p9P51載體，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，在冰上放置5min；

2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴，放在電轉(zhuǎn)儀上；

3)設(shè)置酵母參數(shù)“fungi”，“pic”，點擊Pulse；

4)取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入600微升L冰預(yù)冷1mol/L山梨醇，用槍輕輕吹打，在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份，涂于MD平板上(設(shè)置感受態(tài)中不加入載體的對照組)；30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進行篩選；

5)提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，進行PCR驗證，比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同，PCR采用的引物為AOX上下游引物、目的基因擴增產(chǎn)物；

6)對細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51進行甘油保菌。

將細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51接種于BMM培養(yǎng)基中經(jīng)甲醇誘導(dǎo)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)24～120小時后離心收集菌體，用于PET降解，進行酶活測定。

進行重組酵母的誘導(dǎo)表達實驗。

1)挑選細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51陽性轉(zhuǎn)化子一個，從保存的甘油菌中挑取30uL置于5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃/260～280rpm培養(yǎng)至OD600＝2-6。

2)轉(zhuǎn)接入裝有MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的搖瓶中，于30℃/260～280rpm培養(yǎng)至OD600＝2-6(16-18h)。

3)離心以收集菌體(或者室溫放置沉淀以防止離心操作過程增加染菌幾率)；用BMM培養(yǎng)基重懸菌體，使OD600＝1.0左右；將上步所得的菌液置于搖瓶中，用封口膜封口，放置于30℃/260～280rpm的搖床上繼續(xù)生長.

4)每24h向培養(yǎng)基中添加1％甲醇,按時間點分別取菌液樣品，取至120小時。

實施高效液相色譜儀(HPLC)檢測酶活實驗。

配置酶活反應(yīng)所用到的一系列緩沖液。

1)PBS緩沖液：

用800ml雙蒸水溶解8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4

用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L，抽濾除菌。

2)甘氨酸/氫氧化鈉緩沖液

3)磷酸磷酸二氫鈉緩沖液pH＝2.50：配制0.02M H3PO4 1L，0.02M NaH2PO4，1L，大約1：3混合至pH＝2.50，抽濾。

4)甲醇：將甲醇用有機濾紙抽濾到絲口瓶中

5)終止液：90mL PBS中加入10mL DMSO。

制取進行測量酶活的樣品。

1)取適量菌液于EP管，離心去上清。

2)加入適量甘氨酸/氫氧化鈉緩沖液(pH＝9.0)重懸菌液，離心去上清，重復(fù)一次。

3)在恒溫搖床里孵育反應(yīng)。

4)反應(yīng)結(jié)束后，離心，取上清，加入終止液。

5)加熱滅活適宜時間。

6)實施HPLC測試酶活，從圖1即可看到關(guān)于細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51降解PET的酶活數(shù)據(jù)。

將所述的細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51進行免疫熒光檢測。

1)取反應(yīng)液于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

2)PBS緩沖液對重組酵母細胞進行重懸，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

3)利用BSA的PBS緩沖液重懸菌體，于室溫下反應(yīng)1h，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

4)利用含F(xiàn)lag一抗的200uL的含BSA的PBS緩沖液重懸菌體，于4℃過夜處理，期間應(yīng)使菌體上下混勻。次日于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

5)PBS緩沖液對重組酵母細胞進行重懸，室溫處理10min，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

6)步驟(5)重復(fù)兩次。

7)利用含1uLFlag二抗的200uL的PBS緩沖液重懸菌體，避光室溫處理1h，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

8)PBS緩沖液對重組酵母細胞進行重懸，避光室溫處理5min，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

9)步驟(8)重復(fù)一次。

10)用PBS緩沖液重懸，每次取10uL于潔靜載玻片制片，圖2-2即可得到關(guān)于PETase-linker-GCW51序列在畢赤酵母中的表達情況。

實施例3細胞表面展示PET分解酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建及應(yīng)用，包括如下步驟：

化學(xué)合成SEQ ID No.1所示的改良過的PET分解酶的核苷酸序列；

根據(jù)SEQ ID No.1序列設(shè)計上游引物P-F和下游引物P-R；

P-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R：5’-3’ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

進行PCR,PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得PET分解酶基因。

根據(jù)GCW61(NCBI Reference Sequence:XP_002494322)，預(yù)測其信號肽后，設(shè)計上游引物61-F和下游引物61-R；

61-F：5’-3’GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT

61-R：5’-3’ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

以畢赤酵母GS115菌株基因組DNA為模板，進行PCR，擴增得到錨定蛋白基因GCW61的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示擴增目的基因片段呈現(xiàn)亮帶，回收目的基因片段，得GCW61基因。

利用OverlapPCR將錨定蛋白GCW61基因和改良過的PET分解酶基因的核苷酸序列通過SEQ ID No.5所示的linker連接得到融合序列；

根據(jù)錨定蛋白GCW21基因和改良過的PET分解酶基因，設(shè)計上游引物P-21/51/61-F和下游引物61-R；

P-21/51/61-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGG

61-R：5’-3’ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

進行PCR，擴增序列如SEQ ID NO.8的PETase-linker-GCW61。

將PETase-linker-GCW61基因和pPIC9載體同時用Xho I和EcoR I雙酶切后，將得到的PETase-linker-GCW61酶切基因片段連接到雙酶切后的pPIC9載體上；將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coli DH5α中，并挑取陽性克隆，在LB液體培養(yǎng)基上擴增后提取質(zhì)粒，得到重組表達載體p9P61。

在上述步驟中，所述的目的基因片段與載體的連接采用thermo公司的T4DNA連接酶進行連接。

將獲得的重組表達載體p9P61轉(zhuǎn)入表達宿主大腸桿菌DH5α中，擴增重組質(zhì)粒。

在上述步驟中，所述的連接產(chǎn)物的大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，按如下方法進行：

1)取一管感受態(tài)細胞E.coli DH5α于冰上緩慢溶解，加入要轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物(10μL)，輕混后冰浴30min；

2)42℃熱激90s后，迅速冰浴5min；

3)加入900μL，37℃溫浴的LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h；

4)取200微升涂布于含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB選擇平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h；

5)挑取單克隆，進行后續(xù)質(zhì)粒提取以及驗證實驗。

在上述步驟中，所述的連接產(chǎn)物陽性克隆驗證，按如下方法進行：

1)從篩選平板上挑取p9P61轉(zhuǎn)化子，接入5mL LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/mL氨芐青霉素)，37℃搖床培養(yǎng)12-16h；

2)取5mL菌液，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒；

3)取1μL質(zhì)粒提取液進行Nanodrop檢測，檢測提取的質(zhì)粒濃度；

4)將提取的質(zhì)粒進行雙酶切，驗證基因片段與載體的連接效果；

5)將酶切驗證正確的重組質(zhì)粒進行測序或者進行其他實驗，測序委托金唯智生物公司完成。

將擴增得到的質(zhì)粒經(jīng)過線性化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株基因組中，得到細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61。

電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株細胞感受態(tài)制備

1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜；

2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至OD600約為1.3-1.5；

3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物，4℃，1500g離心5分鐘以收集細胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液，再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細胞，30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘；從搖床上取下細胞，冰浴半小時；

4)從搖床上取下細胞，冰浴半小時；4℃，1500g離心5分鐘以收集細胞，再用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細胞；

5)如上離心，再用20ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細胞；

6)如上離心，用1ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細胞，至終體積約1.5ml；如上離心，用500μL冷超純水重新懸浮細胞，冰浴中備用。

電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

1)取80μL上述細胞與5-20ug線性化的p9P61載體，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，在冰上放置5min；

2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴，放在電轉(zhuǎn)儀上；

3)設(shè)置酵母參數(shù)“fungi”，“pic”，點擊Pulse；

4)取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入600微升L冰預(yù)冷1mol/L山梨醇，用槍輕輕吹打，在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份，涂于MD平板上(設(shè)置感受態(tài)中不加入載體的對照組)；30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進行篩選；

5)提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，進行PCR驗證，比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同，PCR采用的引物為AOX上下游引物、目的基因擴增產(chǎn)物；

6)對細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61進行甘油保菌。

將細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61接種于BMM培養(yǎng)基中經(jīng)甲醇誘導(dǎo)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)24～120小時后離心收集菌體，用于PET降解，進行酶活測定。

進行重組酵母的誘導(dǎo)表達實驗。

1)挑選細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61陽性轉(zhuǎn)化子一個，從保存的甘油菌中挑取30uL置于5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃/260～280rpm培養(yǎng)至OD600＝2-6。

2)轉(zhuǎn)接入裝有MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的搖瓶中，于30℃/260～280rpm培養(yǎng)至OD600＝2-6(～16-18h)。

3)離心以收集菌體(或者室溫放置沉淀以防止離心操作過程增加染菌幾率)；用BMM培養(yǎng)基重懸菌體，使OD600＝1.0左右；將上步所得的菌液置于搖瓶中，用封口膜封口，放置于30℃/260～280rpm的搖床上繼續(xù)生長.

4)每24h向培養(yǎng)基中添加1％甲醇,按時間點分別取菌液樣品，取至120小時。

實施高效液相色譜儀(HPLC)檢測酶活實驗。

配置酶活反應(yīng)所用到的一系列緩沖液。

1)PBS緩沖液：

用800ml雙蒸水溶解8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4

用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L，抽濾除菌。

2)甘氨酸/氫氧化鈉緩沖液

3)磷酸磷酸二氫鈉緩沖液pH＝2.50：配制0.02M H3PO4 1L，0.02M NaH2PO4，1L，大約1：3混合至pH＝2.50，抽濾。

4)甲醇：將甲醇用有機濾紙抽濾到絲口瓶中

5)終止液：90mL PBS中加入10mL DMSO。

制取進行測量酶活的樣品。

1)取適量菌液于EP管，離心去上清。

2)加入適量甘氨酸/氫氧化鈉緩沖液(pH＝9.0)重懸菌液，離心去上清，重復(fù)一次。

3)在恒溫搖床里孵育反應(yīng)。

4)反應(yīng)結(jié)束后，離心，取上清，加入終止液。

5)加熱滅活適宜時間。

6)實施HPLC測試酶活，從圖1即可看到關(guān)于細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris

PETase-GCW61降解PET的酶活數(shù)據(jù)。

將所述的細胞表面展示重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61進行免疫熒光檢測。

1)取反應(yīng)液于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

2)PBS緩沖液對重組酵母細胞進行重懸，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

3)利用BSA的PBS緩沖液重懸菌體，于室溫下反應(yīng)1h，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

4)利用含F(xiàn)lag一抗的200uL的含BSA的PBS緩沖液重懸菌體，于4℃過夜處理，期間應(yīng)使菌體上下混勻。次日于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

5)PBS緩沖液對重組酵母細胞進行重懸，室溫處理10min，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

6)步驟(5)重復(fù)兩次。

7)利用含1uLFlag二抗的200uL的PBS緩沖液重懸菌體，避光室溫處理1h，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

8)PBS緩沖液對重組酵母細胞進行重懸，避光室溫處理5min，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

9)步驟(8)重復(fù)一次。

10)用PBS緩沖液重懸，每次取10uL于潔靜載玻片制片，圖2-3即可得到關(guān)于PETase-linker-GCW61序列在畢赤酵母中的表達情況。

表1.基因以及其核苷酸序列