表達(dá)aa9家族多糖單加氧酶基因tlaa9?2的畢赤酵母工程菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種表達(dá)AA9家族多糖單加氧酶基因TLAA9?2的畢赤酵母工程菌株，是通過RT?PCR方法從疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus獲得糖苷水解酶基因TLAA9?2，將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達(dá)載體pPICZαA中，然后將得到的糖苷水解酶基因TLAA9?2表達(dá)載體pPICZαA/TLAA9?2導(dǎo)入到畢赤酵母GS115中，再從中篩選出一種表達(dá)糖苷水解酶基因TLAA9?2的酵母工程菌GS?CT?9?1。該工程菌表達(dá)的糖苷水解酶TLAA9?2對內(nèi)切纖維素酶的活性具有明顯的促進(jìn)作用，混合酶比原始內(nèi)切酶N24的降解纖維素的活性提高1.2倍。CGMCC No.1238420160421
【專利說明】表達(dá)AA9家族多糖單加氧酶基因 TLAA9-2的畢赤酵母工程菌株 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明設(shè)及生物工程，具體地說是一種表達(dá)是疏綿狀嗜熱絲抱菌化ermomyces lanuginosusAA9家族多糖單加氧酶基因化449-2的畢赤酵母工程菌株P(guān)ichia pastoris GS-CT-9-2。 (二)【背景技術(shù)】
[0002] 多糖單加氧酶（英語：Polysaccha;ride monooxygenases)，又稱多糖單氧酶）是一 種?？谘趸呀馓乔涉I，并產(chǎn)生多個纖維寡糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。 運(yùn)類蛋白質(zhì)在人類的產(chǎn)業(yè)上也有所應(yīng)用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質(zhì)能降解成 可用的小分子。多糖單加氧酶具有多個家族。疏綿狀嗜熱絲抱菌化ermomyces lanuginosus 是一種廣泛分布于堆肥中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中50°C條件 下可W產(chǎn)生熱穩(wěn)定的纖維素酶和AA9家族多糖單加氧酶。
[0003] 疏綿狀嗜熱絲抱菌產(chǎn)生的AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2具有氧化裂解纖維素的 作用，并且對該菌株產(chǎn)生的內(nèi)切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進(jìn)作用，可使其活性提 高1.2倍。多糖單加氧酶發(fā)揮其活性需要供電子體（抗壞血酸或CDH)的存在，經(jīng)薄層層析 (化C)檢測產(chǎn)生多種纖維寡糖。該酶在缺乏底物的情況下可W產(chǎn)生過氧化氨，并且經(jīng)飛行質(zhì) 譜鑒定該酶氧化裂解打斷纖維素長鏈主要產(chǎn)物為纖維寡糖。 (H)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明從疏綿狀嗜熱絲抱菌化ermomyces lanuginosus獲得多糖單加氧酶cDNA序 列全長，命名為TLAA9-2，TLAA9-2基因 DNA全長82化P，包括信號膚序列，起始密碼子和終止 密碼子，無內(nèi)含子，編碼252個氨基酸。具有信號膚序列（l-22aaMKGSTTA化化化LASVTRTSA) 及30個0糖基化位點(diǎn)，有一個潛在的N糖基化位點(diǎn)。將TLAA9-2編碼的氨基酸序列在國際基因 庫中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)屬于多糖單加氧酶第AA9家族。
[000引構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pPICZaA/TLAA9-2，利用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化 Pichiapastoris GS115,在Zeocin培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，高濃度博來 霉素篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，然后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，獲得畢赤酵母工程菌株GS-CT-9-2。該工 程菌株接種于含BMGY培養(yǎng)基中，在28°C20化pm/min搖床培養(yǎng)6d后，多糖單加氧酶的表達(dá)量 為3.21mg/ml，分子量為45kDa，TLAA9-2最適溫度為50-55°C，在60 °C下是穩(wěn)定的，處理60min 后仍有90%W上的酶活性；70°C處理30min后仍保持68%的活性；80°C處理30min后保持 23 %的活性;90°C處理30min活性幾乎完全喪失。
[0006] AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2在供電子體(抗壞血酸和CDH)和銅離子存在下能將 纖維素長鏈氧化裂解為不同的纖維寡糖，并且在缺乏底物的情況下可W產(chǎn)生過氧化氨，對 內(nèi)切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進(jìn)作用，混合酶比原始酶N24的降解纖維素的能力 提高1.2倍。多糖單加氧酶第一個組氨酸具有重要作用，前端連有其他氨基酸會影響其活 性。不同的多糖單加氧酶氧化裂解纖維素長鏈發(fā)生在不同的連鍵位置，經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定 TLAA9-2氧化裂解纖維素長鏈主要產(chǎn)物為纖維寡糖。 (四）
【附圖說明】：
[0007] 圖1 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2的SDS-PAGE分析 [000引泳道1:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)
[0009] 泳道2:純化的AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2
[0010] 圖2 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2的最適溫度
[0011] 圖3 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2對內(nèi)切纖維素酶N24活性的促進(jìn)作用
[0012] 圖4 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-1氧化裂解纖維素薄層層析檢測及供電子體(抗 壞血酸)對AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-1活性的影響
[0013] 泳道1:標(biāo)準(zhǔn)纖維寡糖分子(M)
[0014] 泳道2:未加抗壞血酸的多糖單加氧酶TLAA9-UE)
[0015] 泳道3:添加抗壞血酸的多糖單加氧酶TLAA9-1化+Vc)
[0016] 圖5 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-1酶解產(chǎn)物飛行質(zhì)譜分析 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1:疏綿狀嗜熱絲抱菌化ermomyces lanuginosusermophil皿的分離鑒定
[0018] (1)標(biāo)本采集:從堆肥中采集。
[0019] (2)分離培養(yǎng):將采集標(biāo)本取0.5克放置在PDA平板上5(TC培養(yǎng)3天后，進(jìn)行分離純 化。操作步驟參考Cooney and血erson( 1964)文獻(xiàn)。
[0020] (3)鑒定：參考Coon巧 and 血erson(1964)和LaTouche(1950)文獻(xiàn)。
[0021 ] 實(shí)施例2:多糖單加氧酶基因 TLAA9-2的克隆
[0022] (1)疏綿狀嗜熱絲抱菌I'hermomyces lanuginosusermo地ilum總RNA的提?。簠⒄?Trizol試劑盒說明。
[0023] (2)cDNA第一條鏈的合成：按照hkara公司的IMaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0試 劑盒說明書進(jìn)行：取1~化g總RNA，加腳ase Free d加 2〇至9 .扣L，將RNA樣品在75 °C變性 5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離屯、一下，在冰浴中依次加入W下各種成分： lOmmol/L dNTP MixUire 2化，10XRT Buffer(Mg2+)化L，25mmol/L MgCb化L，01igo d(T)- Adaptor Primer luL^RNase Inhibiter 0.5jiL，AMV Reverse Transcriptase ljiL(Final Volume 20化），將反應(yīng)液混合后，室溫下放lOmin，然后42°C溫育60min，再煮沸5minW滅活 反轉(zhuǎn)錄酶。加入18化L DEPC處理的dd出0,稀釋至20化L，混勻，稍微離屯、，保存于-20°C，備 用。
[0024] (3)PCR反應(yīng)（2 化L):cDNA化L，10XBuffer 2.扣L，10mmol/L dNTP 化L，25mmol/ LMgCl2化L，上、下游引物各化L，hq DNA聚合酶0.扣L(抓/化），d地20 1化L。反應(yīng)條件為94 1：5111111預(yù)變性;941：4〇3,561：4〇3,72°(：1111111，共32個循環(huán)，72°(：延伸1〇111111，4°(：保存。
[00 巧]上游引物：5 ' -AGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACACGGGTTTGTCTCCAACCT-3 '
[00%]下游引物：5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGACCCGCCGCCGCCGGCGTCG-3 '
[0027] (4)基因克隆：取0.扣1 PCR產(chǎn)物與PMD18-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按照TAKARA公 司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a菌株，在表面涂有氨卞青霉素（lOOiig/ mU的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
[002引 （5)質(zhì)粒DNA的提取:堿法提取質(zhì)粒DNA。
[0029] (6)序列測定:DNA雙脫氧法測定核巧酸序列，在上海生物工程有限公司進(jìn)行。序列 引物為M13啟動子引物。疏綿狀嗜熱絲抱菌TLAA9-2基因 cDNA全長82化P，包含起始密碼子和 終止密碼子，無內(nèi)含子，編碼252個氨基酸。將此氨基酸序列在國際基因庫中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn) 屬于多糖單加氧酶第AA9家族。該序列如下：
[0030] (A)沈Q ID NO 1 的信息
[0031] (a)序列特征:*長度:825堿基對;*類型：核酸;*鏈型:雙鏈;*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0032] (b)分子類型：DNA
[003；3] (C)假設(shè)：否
[0034] (d)反義：否
[0(X3日](e)最初來源:疏綿狀嗜熱絲抱菌化ermomyces lanuginosus [0036] (f)序列描述：
[003引 （B)沈Q ID NO 2的信息
[0039] (a)序列特征:*長度:252氨基酸;*類型:氨基酸;*鏈型:單鏈;*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0040] (b)分子類型：蛋白質(zhì)
[OOW (C)序列描述：
[00421
[0043] 實(shí)施方式3:表達(dá)載體的構(gòu)建
[0044] (1)將目的基因 CDS序列進(jìn)行信號膚分析預(yù)測，去除信號膚，根據(jù)載體信息設(shè)計(jì)引 物，引入化oil和Xbal酶切位點(diǎn)，并補(bǔ)全序列至化iczaA載體的Kex2蛋白信號切割位點(diǎn)，反向 引物3'端去除終止密碼子并添加兩個堿基W保證序列正常翻譯至6X化S標(biāo)簽。
[0045] 上游引物：5 ' -AGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACACGGGTTTGTCTCCAACCT-3 '
[0046] 下游引物：5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGACCCGCCGCCGCCGGCGTCG-3 '
[0047] (2)疏綿狀嗜熱絲抱菌總RNA的提取:利用Trizol試劑提取。
[004引 （3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈:取化g總RNA，加入5X反應(yīng)緩沖液化L，10mM dNTP 2 化，核糖核酸酶抑制劑(40-200uAiL)0.扣L引物oligodT(化g/化）化L，反轉(zhuǎn)錄酶（1011/化)2 化，42 °C反應(yīng)60min，然后85 °C lOmin終止反應(yīng)，稀釋至200化。
[0049] (4)PCR 反應(yīng)（2 化L):cDNA 化L，10XBuffer 2.化L，10mmol/L dNTP 化L，25mmol/ LMgCl2化L，上、下游引物各化L，化q DM聚合酶0.扣L(抓/化），dd出0 1化L。反應(yīng)條件為94°C 5min 預(yù)變性;941：4〇3,561：4〇3,72°(：1111111，共32個循環(huán)，72°(：延伸1〇111111，4°(：保存。
[0050] (5)基因克?。喝』疞 PCR產(chǎn)物與PMD18-T載體進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒PMD18T/ TLAA9-2操作步驟按TAKARA公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a，在涂有 AMP的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
[0051 ] (6)質(zhì)粒DNA提取:堿法提取質(zhì)粒DNA。
[0化2] (7)用化oil和Xbal對重組質(zhì)粒PMD18-T/TLAA9-2產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，同時用化oil和 Xbal雙酶切酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA，DNA膠回收試劑盒回收純化TLAA9-2基因及載體pPICZa A片斷。然后進(jìn)行體外連接，獲得重組質(zhì)粒pPICZaA/TLAA9-2，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109， 在含Amp的LB轉(zhuǎn)化平板上挑選單菌落，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR和酶切鑒定，測序確認(rèn)重組質(zhì) 粒的讀碼框正確。
[0053]實(shí)施例4.表達(dá)多糖單加氧酶基因 TLAA9-2的酵母工程菌株的構(gòu)建及篩選 [0化4] (1)重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化：將重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA/化AA9-2用限制性內(nèi)切酶 Sac I線性化。
[0化5] (2)轉(zhuǎn)化：電擊轉(zhuǎn)化酵母菌株P(guān)ichia pastoris GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法 參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。
[0056] (3)篩選：用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化子對應(yīng)點(diǎn)種在Zeocin平板上，28°C培養(yǎng)2-4d，挑取 在Zeocin平板上均生長良好的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)種于高濃度博 來霉素平板上篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。
[0化7] 實(shí)施方式5:畢赤酵母Pichia pastoris GS115的誘導(dǎo)表達(dá)和活性檢測 [0化引 （1)將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含25mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C20化pm/min搖床培養(yǎng)24h (0060(値達(dá)到1.8)，離屯、收集菌體，將細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的BMMY培養(yǎng)基中，至OD600值為1.0， 28°C200rpm/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24h補(bǔ)充甲醇至終濃度為0.5 %，每24h取樣，室溫10，OOOg離屯、 5min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0059] (2)酶活性檢測：酶活性測定采用酶解產(chǎn)物薄層層析法，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為 100化的酶液，加入20化L的0.5%憐酸膨脹纖維素，100化的醋酸緩沖液(0.2mol/L、抑5.0) 50°C反應(yīng)48h，離屯、后取上清3ul到層析板上，展層后噴灑顯色液，85度20min觀察結(jié)果。蛋白 含量測定采用化a壯ord法。
[0060] (3)重組多糖單加氧酶TLAA9-2的最適反應(yīng)溫度:誘導(dǎo)表達(dá)的重組多糖單加氧酶經(jīng) 過GE公司的化sTrap FF crude金屬配體親和層析柱純化帶有組氨酸標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)，獲 得電泳均一的純化蛋白，用純化的重組多糖單加氧酶測定其性質(zhì)。在相同PH(K1 = 5)不同 的溫度條件下（30°C，40°C，50°C，60°C，70°C，80°C，90°C)多糖單加氧酶反應(yīng)36h，然后分別 加入纖維素酶，50 °C下反應(yīng)半小時，DNS法測量產(chǎn)生的還原糖的量。數(shù)值測量S次求平均值， 將最高的酶活力定義為100%。
[0061] 實(shí)施方式6:AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2對內(nèi)切纖維素酶N24活性的促進(jìn)作用
[0062] (1 )AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2對內(nèi)切纖維素酶N24活性的促進(jìn)作用
[0063] 采用DNS法，多糖單加氧酶在PH = 5,溫度50°C，200RPM的條件下，設(shè)置兩組多糖單 加氧酶與纖維素反應(yīng)36h，一組加入纖維素酶，一組不加纖維素酶，50°C下反應(yīng)30min，反應(yīng) 體系為：TLAA9-250化，N2450化，200化的0.5%憐酸膨脹纖維素，100化的醋酸緩沖液 (0.2mol/L、pH 5.0)，加入400化DNS試劑，煮沸l(wèi)Omin，在540nm波長下測定光吸收值。W不 加多糖單加氧酶化AA9-2的反應(yīng)體系中的酶活性定義為100%，分別計(jì)算多糖單加氧酶 TLAA9-2、內(nèi)切纖維素酶N24W及混合酶的相對酶活性。重復(fù)S次，取平均值。
[0064] (2)供電子體(抗壞血酸)對多糖單加氧酶TLAA9-2纖維素酶活性的影響
[00化]設(shè)置兩組反應(yīng)體系，一組加入抗壞血酸，使其終濃度為lOmM，另一組不加抗壞血 酸，在多糖單加氧酶TLAA9-2最適反應(yīng)條件下測定其氧化裂解纖維素酶活性，反應(yīng)4她后，娃 膠薄層層析分析產(chǎn)物，測定活性。
[0066] 實(shí)施方式7: AA9家族多糖單加氧酶酶解產(chǎn)物飛行質(zhì)譜分析
[0067] 將AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2與憐酸膨脹纖維素混合在PH = 5的醋酸安緩沖液 中，在最適溫度條件下反應(yīng)4她，取上清做飛行質(zhì)譜。AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2氧化裂 解產(chǎn)生的多糖有多種形式，主要有C1和C4氧化，還可能有C6氧化。C1氧化C6氧化C4水和產(chǎn)物 的分子量均增加16,而C4氧化分子量變化為2。飛行質(zhì)譜測的的分子量減去對應(yīng)寡糖的分子 量再減去氧化減少的碳原子的數(shù)量和結(jié)合鋼離子的數(shù)量為氧化后的產(chǎn)物分子量。
[0068] 實(shí)施方式8:表達(dá)TLAA9-2基因的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9-2的保藏
[0069] 表達(dá)TLAA9-2基因的畢赤酵母工程菌株GS-CT-TLAA9-2的保藏單位：中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC);地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國 科學(xué)院微生物研究所;保藏日期：2016年4月21日；酵母工程菌株編號為:CGMCC No . 12384; 畢赤酵母工程菌株的分類命名為:己氏畢赤酵母Pichiapastoris。





【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種表達(dá)疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosusAA9家族多糖單加氧酶基因 TLAA9-2的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR方法從疏綿狀嗜熱 絲孢菌Thermomyces lanuginosus獲得熱穩(wěn)定AA9家族糖苷水解酶基因 TLAA9-2，將該基因 克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZaA，獲得表達(dá)重組質(zhì)粒pPICZaA/TLAA9_2,轉(zhuǎn)化畢赤 酵母GS115,從中篩選出表達(dá)熱穩(wěn)定多糖單加氧酶基因 TLAA9-2的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9-2，該糖苷水解酶TLAA9-2對內(nèi)切纖維素酶的活性具有明顯的促進(jìn)作用，并且能夠?qū)⒘姿?膨脹纖維素氧化裂解為纖維寡糖，飛行質(zhì)譜結(jié)果鑒定裂解纖維素長鏈主要產(chǎn)物為纖維寡 糖。
【文檔編號】C12N1/19GK106047737SQ201610366951
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】李多川, 耿志剛, 陳銘
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)