專利名稱：：用于酮基化合物的立體選擇還原的氧化還原酶的制作方法用于酮基化合物的立體選擇還原的氧化還原酶本發(fā)明涉及用于通過對(duì)映體選擇性酶促還原將酮基化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的手性羥基化合物的方法，其中所述酮基化合物用氧化還原酶還4奪性還原的新的氧化還原酶。光學(xué)活性化合物是對(duì)于藥學(xué)活性化合物、芳香物質(zhì)、信息素、農(nóng)業(yè)藥品和酶抑制物的合成具有廣泛應(yīng)用性的有價(jià)值的手性子(chiron)。因而，手性化合物以及手性合成技術(shù)的提高的需求是在藥物工業(yè)中特別受注意的，因?yàn)樵趯恚庀衔镫y以用作藥物制品。原手性酮基化合物的不對(duì)稱還原是立體選擇性催化的一部分，其中生物催化構(gòu)成了對(duì)化學(xué)催化的強(qiáng)有力的竟?fàn)幖夹g(shù)?；瘜W(xué)的不對(duì)稱氫化作用需要使用高度毒性和環(huán)境有害的重金屬催化劑，使用極端的因而耗能的反應(yīng)條件以及大量的有機(jī)溶劑。此外，這些方法通常特征是副反應(yīng)和不充分的只于映體過量(enantiomericexcesse)。在自然中，原手性酮基化合物向羥基化合物的還原和相反的過程在許多生物化學(xué)途徑中發(fā)生，在初級(jí)新陳代謝和在次級(jí)新陳代謝中，在每個(gè)器官中，并且被不同種類的仲醇脫氫酶和氧化還原酶催化。通常地，這些酶是輔因子依賴性的。基礎(chǔ)可能性過:i模型系:的基礎(chǔ)i被反復(fù)展現(xiàn),'、其中分離的氧化還原酶和各種全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)被用于該任務(wù)。從而，對(duì)于適度的反應(yīng)條件、沒有副產(chǎn)物和通常顯著更可實(shí)現(xiàn)的對(duì)映體過量，生物催化方法成為非常有利的。對(duì)于可實(shí)現(xiàn)的對(duì)映體過量、降解產(chǎn)物和副產(chǎn)物的形成、以及對(duì)于產(chǎn)物分離，相對(duì)于涉及全細(xì)胞的方法，使用分離的酶是有益的。此外，使用全細(xì)胞處理不可能用于每一個(gè)化學(xué)公司，因?yàn)闉榇诵枰囟ㄔO(shè)備和知識(shí)。近來，可能展現(xiàn)的是，在具有有機(jī)溶劑的水性/有機(jī)兩相系統(tǒng)中使用分離的氧化還原酶是極度有效的、經(jīng)濟(jì)的以及在高濃度(>5%)也是可行的。在所描述的系統(tǒng)中，通常在水中難溶的要還原的酮基化合物從而形成與有機(jī)溶劑在一起的有機(jī)相。并且，有機(jī)溶劑本身可能部分地被一起分配。在這種情況下，有機(jī)相從要還原的酮基化合物形成(DE10119274、DE10327454.4、DE10337401.9、DE10300335.5)。輔酶再生因而通過仲醇的同時(shí)發(fā)生的氧還而實(shí)現(xiàn)，為此，在大多數(shù)情況下，使用便宜的水可混合的2-丙醇。高對(duì)映體選擇性的適合的R-和S-特異性氧化還原酶和脫氪酶的實(shí)例有來自Cam/Wa;Mra戶"ows的羰基還原酶(CPCR)(US5,523,223和US5,763,236(EnzymeMicrobTechnol.1993Nov;15(11):950-8"和來自尸,c/zz^c"/ww/"to(DE10327454.4)的羰基還原酶。來自紅串紅球菌(i^ot/ococc^eo^ro尸o/^)的羰基還原酶(RECR)(US5,523,223)、來自jVo/raWa/ksc(3(Biosci.Biotechnol.Biochem.,63(10)(1999)，pp.l721-1729)、(ApplMicrobiolBiotechnol.2003Sep;62(4):380-6.Epub2003Apr26)和赤紅球菌(脇c/ococ，(JOrgChem.2003Jan24;68(2):402-6)的羰基還原酶。來自享L^干菌屬(Z^"c^a"〃w力(Lactobacilluskefir(US5200335)、Lactobacillusbrevis(DE19610984Al)(ActaCrystallogrDBiolCrystallogr.2000Dec;56Pt12:1696-8)、Lactobacillusminor(DE10119274)或假單胞菌屬(尸化w允mo憩力(US05385833)(ApplMicrobiolBiotechnol.2002Aug;59(4-5):483-7.Epub2002Jim26.,J.Org.Chem.1992,57,1532)的R-特異性仲醇脫氬酶。然而，迄今已知的酶還不足夠用于開發(fā)酮基化合物的立體選擇性還原的完整市場(chǎng)潛力。一個(gè)方面，這可以由工業(yè)酶對(duì)于底物譜、最適pH值以及溫度和溶劑穩(wěn)定性具有非常不同的性質(zhì)的事實(shí)來解釋，所述性質(zhì)通常是相互補(bǔ)充的。因而，甚至相對(duì)類似的同源酶可能對(duì)于一種特定的底物展現(xiàn)完全不同的轉(zhuǎn)化行為。另一方面，不是幾乎所有的所描述的酶都被克隆和可過量表達(dá)到足夠的數(shù)量，這意味著這些酶對(duì)以工業(yè)使用是不可獲得的。為了盡可能廣泛地發(fā)揮酶學(xué)不對(duì)稱氫化作用的合成潛力，因而必需的是擁有一包盡可能地廣泛的、不同的工業(yè)可接受的氧化還原酶，所述氧化還原酶進(jìn)一步適合于在具有有機(jī)溶劑的水性/有才幾兩相系統(tǒng)中使用?，F(xiàn)在本發(fā)明的主題是多種新的、對(duì)映體選擇性R-和S-特異性氧化還原酶，特征在于在水性/有機(jī)兩相系統(tǒng)中良好的穩(wěn)定性以及在大腸桿菌Escherichiacoli中良好的表達(dá)能力(>500單位/gE.coli濕重),以及程:5土。、'、'土、、'-'、、、根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的特征在于它們具有氨基酸序列，在所述氨基序列中(a)至少70%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8之一的氨基酸，或(b)至少55%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸，或(c)至少65。/。的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:3的氨基酸，或(d)至少75%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸，或(e)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:5的氨基酸，或(f)至少50%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:7的氨基酸，或(g)至少72%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:129的氨基酸。根據(jù)SEQIDNO:1的多肽可以從酵母、特別是從紅酵母屬(Rhodotorula)的酵母、特別是從粘質(zhì)紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)獲得。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是核酸序列SEQIDNO:9，其編碼具有氨基酸序列SEQIDNO:l的蛋白。來自粘質(zhì)紅酵母的氧化還原酶促還原，例如，2-辛酮為S-2-辛醇，并且優(yōu)選地氧化2-辛醇的兩種對(duì)映體中的S-2-辛醇。來自粘質(zhì)紅酵母的氧化還原酶是，例如，具有SDS-凝膠中測(cè)定的分子量30土2kDa的同型二聚體。所述氧化還原酶的還原反應(yīng)的最佳pH值范圍從7.0到8.0,氧化反應(yīng)的最佳pH值在8.5-10的范圍內(nèi)。來自粘質(zhì)紅酵母的氧化還原酶展現(xiàn)了良好的溫度和pH值穩(wěn)定性，并在5.5到10的pH值范圍中和最高達(dá)35。C的溫度下、甚至數(shù)小時(shí)的孵育時(shí)間，僅顯示了微小的活性損失。此外，來自粘質(zhì)紅酵母的氧化還原酶展現(xiàn)了有機(jī)溶劑中的高穩(wěn)定性。根據(jù)SEQIDNO:2或SEQIDNO:8的多肽可以從酵母、特別是,人畢赤酵母屬CP/'c/n'")、念珠菌屬(C""c^/")、尸"c/z;Ayo/e"、DeZ"rom少ces或/M""c/7e"/h'a屬的酵母、特別是從粉狀畢赤酵母(尸Zc/n"/"n"we)DSMZ3316或CandidanemodendraDSMZ70647獲得。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是核酸序列SEQIDNO:10和核酸序列SEQIDNO:16,其分別編碼氨基酸序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:8。所述氧化還原酶優(yōu)選地還原2-丁酮成R-2-丁醇，并優(yōu)選地氧化2-丁醇的兩種對(duì)映體中的R-2-丁醇。來自粉狀畢赤酵母(尸,c/n'a/an"ora)的氧化還原酶展現(xiàn)了與針對(duì)R-2-辛醇相比顯著更高的針對(duì)R-2-丁醇和2-丙醇的活性,此外，該酶展現(xiàn)了與針對(duì)2-辛酮相比顯著更高的針對(duì)丙酮和2-丁酮的活性。然而，來自Candidanemodendra的氧化還原酶展現(xiàn)了針對(duì)R-2-丁醇、2-丙醇和R-2-辛醇的相似的活性，此外，該酶還展現(xiàn)了針對(duì)2-辛酮的大約相似的活性。來自粉狀畢赤酵母的氧化還原酶是具有SDS-凝膠中測(cè)定的分子量27±2kDa的同型二聚體。所述氧化還原酶的還原反應(yīng)的最佳pH值范圍從5.0到6.0，氧化反應(yīng)的最佳pH值在7.5-10的范圍內(nèi)。來自粉狀畢赤酵母的氧化還原酶展現(xiàn)了良好的pH值和溶劑穩(wěn)定性，并在5.5到10的pH值范圍中、甚至數(shù)小時(shí)的孵育時(shí)間，僅顯示了微小的活性損失。來自Candidanemodendra的氧化還原酶是具有SDS-凝膠中測(cè)定的分子量27±2kDa的homomer。所述氧化還原酶的還原反應(yīng)的最佳pH值是pH6,氧化反應(yīng)的最佳pH值范圍從10到11。來自Candidanemodendra的氧化還原酶展現(xiàn)了良好的pH值和溶劑穩(wěn)定性，并在6.5到9.5的pH值范圍中、甚至數(shù)小時(shí)的孵育時(shí)間，僅顯示了微小的活性損失。根據(jù)SEQIDNO:3或SEQIDNO:7的多肽可以從酵母、特別是從畢赤酵母屬和念珠菌屬的酵母、特別是從樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)DSMZ3651和PichiatrehalophilaDSMZ70391獲得。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是核酸序列SEQIDNO:11和核酸序列SEQIDNO:15,其分別編碼SEQIDNO:3和SEQIDNO:7的多肽。來自畢赤酵母屬和念珠菌屬的酵母的羰基還原酶，其具有與氨基酸序列SEQIDNO:3的至少65°/。同一性，或與氨基酸序列SEQIDNO:7的至少50%同一性，優(yōu)選地還原2-辛酮成S-2-辛酮，并優(yōu)選地氧化2-辛醇的兩種對(duì)映體中的S-2-辛醇。它們還特別適合于4-卣代乙酰乙酸酯還原成R-4-囟代-3-羥基丁酸酯。來自樹干畢赤酵母的氧化還原酶是具有SDS-凝膠中測(cè)定的分子量36±2kDa的同型二聚體。所述氧化還原酶的還原反應(yīng)的最佳pH值范圍從5.5到6.5，氧化反應(yīng)的最佳pH值范圍是6.5-8.0。來自樹干畢赤酵母的氧化還原酶展現(xiàn)了良好的pH值和溶劑穩(wěn)定性，并在5.5到10的pH值范圍中、甚至數(shù)小時(shí)的孵育時(shí)間，僅顯示了微小的活性損失。來自Pichiatrehal叩hila的氧化還原酶是具有SDS-凝膠中測(cè)定的分子量36±2kDa的homomer。所述氧化還原酶的還原反應(yīng)的最佳pH值范圍是7-7.5,氧化反應(yīng)的最佳pH值范圍是7-8。根據(jù)SEQIDNO:4的多肽可以從明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌、特別是從肉色明串珠菌(Leuconostoccar簡(jiǎn)um)DSMZ5576獲得。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是核酸序列SEQIDNO:12,其編碼具有氨基酸序列SEQIDNO:4的蛋白。所述多肽特別適合于2-辛酮向R-2-辛醇的還原，以及適合于R-2-辛醇的氧化。它還非常適合于4-卣代乙酰乙酸酯向S-4-囟代-3-羥基丁酸酯的還原。來自肉色明串珠菌的氧化還原酶是具有SDS-凝膠中測(cè)定的分子量27±2kDa的同型二聚體。所述氧化還原酶的還原反應(yīng)的最佳pH值范圍是5.0到6.0，氧化反應(yīng)的最佳pH值范圍是6.0-9.0。來自肉色明串珠菌的氧化還原酶展現(xiàn)了良好的溫度、pH值和溶劑穩(wěn)定性，并在4.5到10的pH值范圍中以及在最高達(dá)35。C的溫度下、甚至數(shù)小時(shí)的孵育時(shí)間，僅顯示了微小的活性損失。根據(jù)SEQIDNO:5的多肽可以從放線細(xì)菌(Actinobactena)綱的細(xì)菌、特別是從微桿菌屬(Microbacterium)的細(xì)菌、特別是從微桿菌屬細(xì)菌DSMZ20028獲得。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是核酸序列SEQIDNO:13，其編碼具有氨基酸序列SEQIDNO:5的蛋白。所述多肽非常適合于2-辛酮向S-2-辛醇的還原，并且優(yōu)選地氧化2-辛醇的兩種對(duì)映體中的S-2-辛醇。它還非常適合于4-鹵代乙酰乙酸酯向R-4-鹵代-3-羥基丁酸酯的還原。來自微桿菌屬細(xì)菌DSMZ20028的氧化還原酶是，例如，具有SDS-凝膠中測(cè)定的分子量35±2kDa的同型四聚體。所述氧化還原酶的還原反應(yīng)的最佳pH值范圍是6.0到7.5,氧化反應(yīng)的最佳pH值范圍是7.5-9.5。來自微桿菌屬細(xì)菌的氧化還原酶展現(xiàn)了良好的溫度、pH值和溶劑穩(wěn)定性，并在4.5到10的pH值范圍中以及在最高達(dá)5(TC的溫度下、甚至數(shù)小時(shí)的孵育時(shí)間，僅顯示了微小的活性損失。根據(jù)SEQIDNO:6的多肽可以從放線細(xì)菌(Actinobacteria)綱的細(xì)菌、特別是從戈登氏菌屬(Gordona)的細(xì)菌、特別是從深紅戈登氏菌(Gordonarubripertincta)DSMZ43570獲得。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是核酸序列SEQIDNO:14,其編碼具有氨基酸序列SEQIDNO:6的蛋白。所述多肽非常適合于2-辛酮向S-2-辛醇的還原，并且優(yōu)選地氧化2-辛醇的兩種對(duì)映體中的S-2-辛醇。它還非常適合于4-卣代乙酰乙酸酯向R-4-卣代-3-羥基丁酸酯的還原。來自深紅戈登氏菌DSMZ43570的氧化還原酶是具有SDS-凝膠中測(cè)定的分子量41±3kDa的homomer。所述氧化還原酶的還原反應(yīng)的最佳pH值范圍是4.5到5.5,氧化反應(yīng)的最佳pH值范圍是7.5到9.5。來自深紅戈登氏菌DSMZ43570的氧化還原酶展現(xiàn)了良好的溫度、pH值和溶劑穩(wěn)定性，并在4.5-10的pH值范圍中以及在最高達(dá)55。C的溫度下、甚至數(shù)小時(shí)的孵育時(shí)間，僅顯示了微小的活性損失。根據(jù)SEQIDNO:129的多肽可以從酵母、特別是從路德酵母屬(Lodderomyces)、4+另'J是乂人LodderomyceselongisporusDSMZ70320獲得。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是核酸序列SEQIDNO:130,其編碼具有氨基酸序列SEQIDNO:129的蛋白。所述多肽非常適合于2-辛酮向S-2-辛醇的還原，并且優(yōu)選地氧化2-辛醇的兩種對(duì)映體中的S-2-辛醇。它還非常適合于4-卣代乙酰乙酸酯向R-4-囟代-3-羥基丁酸酯的還原。此外，本發(fā)明涉及融合蛋白，其特征在于它們代表具有氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的氧化還原酶或其同源物，其在N-末端或羧基末端肽鍵地連接到進(jìn)一步的多肽。融合蛋白可以，例如，更容易地從其他蛋白分離，或可以以更大的數(shù)量重組表達(dá)。此外，本發(fā)明涉及抗體，所述抗體特異性地結(jié)合根據(jù)SEQIDNO.-1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO.6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的氧化還原酶或結(jié)合其同源物。這些抗體的產(chǎn)生根據(jù)已知的方法通過免疫適合的動(dòng)物和隨后回收抗體來進(jìn)行。所述抗體可以是單克隆的或多克隆的。氨基酸序列的比較可以，例如，在互聯(lián)網(wǎng)上在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫例如SWISS-PROT、PIR以及在DNA數(shù)據(jù)庫例如EMBL、GeneBank等等中使用FASTA程序或BLAST程序進(jìn)行。在這樣做時(shí)，通過BLAST算法(BasicLocalAlignementSearchTool)(幽c'/m/"/，，尸rac.淑/.Jcc/.園.S7,"(5dS)的方式確定最佳比對(duì)。作為基礎(chǔ)，使用PAM30矩陣作為評(píng)估序列相似性的計(jì)分矩陣。(Da>^o#/Sc/zvrac兄M，Ocw",S.C./97&,5廣3>Z)aj^of廣edJ345-352,iV""owa/S/omed/ca/Ae化0Tc//ow<ia/7o)。此外，本發(fā)明涉及蛋白片段，其特征在于它們代表氨基酸序列SEQIDNO:l的片段，每個(gè)片段具有數(shù)量超過26個(gè)的氨基酸。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是微生物羰基脫氫酶，其包含N-末端氨基酸序列MPATLRLDK(SEQIDNO:17)和/或C-末端氨基酸序列QALAAPSNLAPKA(SEQIDNO:18)和/或內(nèi)部部分序列VEIIKTQVQD(SEQIDNO:19)、KVAIITGGASGIGL(SEQIDNO:20)、SCYVTPEG(SEQIDNO:21)、TDFKVDGG(SEQIDNO:20)、VMFNNAGIMH(SEQIDNO:23)或VHAREGIRIN(SEQIDNO:24)之一。此外，本發(fā)明還涉及蛋白片段，其特征在于它們代表氨基酸序列SEQIDNO:2的片段，每個(gè)片段具有數(shù)量超過15個(gè)的氨基酸。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是微生物羰基脫氫酶，其包含N-末端氨基酸序列MAYNFTNKVA(SEQIDNO:25)和/或C-末端氨基酸序列TTLLVDGGYTAQ(SEQIDNO:26)和/或內(nèi)部部分序列EYKEAAFTN(SEQIDNO:27)、NKVAIITGGISGIGLA(SEQIDNO:28)、DVNLNGVFS(SEQIDNO:29)、HYCASKGGV(SEQIDNO:30)、NCINPGYI(SEQIDNO:31)或LHPMGRLGE(SEQIDNO:32)之此外，本發(fā)明涉及蛋白片段，其特征在于它們代表氨基酸序列SEQIDNO:3的片段，每個(gè)片段具有數(shù)量超過15個(gè)的氨基酸。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是微生物羰基脫氫酶，其包含N-末端氨基酸序列MSIPATQYGFV(SEQIDNO:33)和/或C-末端氨基酸序列SAYEGRVVFKP(SEQIDNO:34)和/或內(nèi)部部分序列CHSDLHAIY(SEQIDNO:35)、GYQQYLLVE(SEQIDNO:36)、TFDTCQKYV(SEQIDNO:37)、LLTPYHAM(SEQIDNO:38)、LVSKGKVKP(SEQIDNO:39)、GAGGLGVNG(SEQIDNO:40)、IQIAKAFGAT(SEQIDNO:41)或LGSFWGTS(SEQIDNO:42)之一。此外，本發(fā)明涉及蛋白片段，其特征在于它們代表氨基酸序列SEQIDNO:4的片段，每個(gè)片段具有數(shù)量超過18個(gè)的氨基酸。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是微生物羰基脫氬酶，其包含N-末端氨基酸序列MTDRLKNKVA(SEQIDNO:43)和/或C-末端氨基酸序列AEFVVDGGYLAQ(SEQIDNO:44)和/或內(nèi)部部分序列VVITGRRAN(SEQIDNO:45)、GGASII麗S(SEQIDNO:46)、TQTPMGHI(SEQIDNO:47)或GYIKTPLVDG(SEQIDNO:48)之一。此外，本發(fā)明涉及蛋白片段，其特征在于它們代表氨基酸序列SEQIDNO:5的片段，每個(gè)片段具有數(shù)量超過18個(gè)的氨基酸。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是微生物羰基脫氫酶，其包含N-末端氨基酸序列MKALQYTKIGS(SEQIDNO:49)和/或C-末端氨基酸序列LAAGTVRGRAVIVP(SEQIDNO:50)和/或內(nèi)部部分序列CHSDEFVMSLSE(SEQIDNO:51)、VYGPWGCGRC(SEQIDNO:52)、VSLTDAGLTPYHA(SEQIDNO:53)、LRAVSAATVIAL(SEQIDNO:54)或DFVGADPTI(SEQIDNO:55)之一。此外，本發(fā)明涉及蛋白片段，其特征在于它們代表氨基酸序列SEQIDNO:6的片段，每個(gè)片段具有數(shù)量超過26個(gè)的氨基酸。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是微生物羰基脫氫酶，其包含N-末端氨基酸序列MKAIQIIQ(SEQIDNO:56)和/或C-末端氨基酸序列DLRGRAVVVP(SEQIDNO:57)和/或內(nèi)部部分序列TAAGACHSD(SEQIDNO:58)、TPYHAIKPSLP(SEQIDNO:59)、DFVGLQPT(SEQIDNO:60)、VYGAWGCG(SEQIDNO:61)、DDARHLVP(SEQIDNO:62)、MTLGHEGA(SEQIDNO:63)或GGLGHVGIQLLRHL(SEQIDNO:64)之一。此外，本發(fā)明涉及包含一個(gè)或幾個(gè)核酸序列的克隆載體，所述核酸序列編碼根據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的羰基還原酶或其同源物。此外，本發(fā)明包含克隆載體，其除了羰基還原酶之外包括用于NAD(P)的再生的適合的酶，例如，曱酸脫氫酶、醇脫氬酶或葡萄糖脫氫酶。此外，本發(fā)明涉及位于細(xì)菌、昆蟲、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的、包含核酸序列的表達(dá)載體，所述核酸序列編碼根據(jù)SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的羰基還原酶或其同源物，并以適合的方式連接到表達(dá)控制序列。此外，本發(fā)明涉及重組宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌、酵母、昆蟲、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且用這樣的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，還涉及根據(jù)培養(yǎng)這種重組宿主細(xì)胞獲得羰基還原酶的生產(chǎn)方法。適合的克隆載體是，例如，ppCR-Scrip、pCMV-Script、pBluescript(Stratagene)、pDrive克隆載體(Quiagen,Hilden，Germany)、pSBlue、pETBlue、pETLIC載體(Novagen，Madison,USA)和TA-PCR克隆載體(Invitrogen，Karlsruhe,Germany)。適合的表達(dá)載體是，例如，pKK223-3、pTrc99a、pUC、pTZ、pSK、pBluescript、pGEM、pQE、pET、PHUB、pPLc、pKC30、pRMl/pRM9、pTrxFus、pASl、pGEx、pMAL或pTrx。適合的表達(dá)控制序列是，例如，trp-lac(tac)啟動(dòng)子、trp-lac(trc)啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子或入pL啟動(dòng)子。根據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的氧化還原酶或其同源物可以以這樣的方式獲得，其中培養(yǎng)上述重組E.coli細(xì)胞，誘導(dǎo)相應(yīng)的氧化還原酶的表達(dá)，隨后在約10到18小時(shí)之后，通過超聲波處理、在球形磨(Retsch，GmbH,HaanGermany10分鐘，24Hz)中用玻璃珠濕磨或使用高壓勻化器來消化細(xì)胞。獲得的細(xì)胞提取物可以直接使用或進(jìn)一步純化。為此，例如，細(xì)胞提取物被離心，獲得的上清液進(jìn)行離子交換層析，例如，通過在Q-SepharoseFastFlow(Pharmacia)上離子交4灸層才斤。此外，本發(fā)明涉及用于通過對(duì)映體選擇性酶促還原將酮基化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的手性羥基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在輔因子的情況下使用氧化還原酶來還原，其特征在于使用具有氨基酸序列的氧化還原酶，在所述氨基酸序列中(a)至少70%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8之一的氨基酸，或(b)至少55%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸，或(c)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:3的氨基酸，或(d)至少75%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸，或(e)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:5的氨基酸，或(f)至少50%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:7的氨基酸，或(g)至少72%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:129的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的所述方法的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式在于所述酮基化合物具有通式IR廣C(0)-R2(I)其中所迷R1代表以下部分之一1)-(d-C20)-烷基，其中所述烷基是直鏈或支鏈的，2)-(C2-C20)-烯基，其中所述烯基是直鏈或支鏈的，并任選含有最多達(dá)四個(gè)雙鍵，3)-(C2-C2Q)-炔基，其中所述炔基是直鏈或支鏈的，并任選含有最多達(dá)四個(gè)三鍵，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(d-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基6)-(C5-C14)-雜環(huán)，其是未取代的或被-OH、卣素、-N02和/或-NH2取代一次、兩次或三次，或7)-(C3-C7)-環(huán)烷基，其中在1)到7)中的上述部分是未取代的或相互獨(dú)立地被-OH、鹵素、-N02和/或-NH2取代一次、兩次或三次，R2代表以下部分之一8)-(01-05)-烷基，其中所述烷基是直鏈或支鏈的，9)-(02-00-烯基，其中所述烯基是直鏈或支鏈的，并任選含有最多達(dá)三個(gè)雙鍵，10)-(。2-(:6)-炔基，其中所述炔基是直鏈或支鏈的，并任選含有兩個(gè)三鍵，或11)-(d-do)-烷基-C(O)-O-(C廣C6)-烷基，其中所述烷基是直鏈或支鏈的，并且是未取代的或被-OH、囟素、-^102和/或-^^2取代一次、兩次或三次，其中在8)到11)中的上述部分是未取代的或相互獨(dú)立地被-OH、卣素、"^〇2和/或-^02取代一次、兩次或三次。此外，本發(fā)明涉及用于通過對(duì)映體選擇性酶促還原將酮基化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的手性羥基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在輔因子的情況下使用氧化還原酶來還原，所述方法特征在于使用的氧化還原酶(a)由來自SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:130的組的核酸序列編碼，或(b)由核酸序列編碼，該核酸序列的互補(bǔ)鏈在高度嚴(yán)格條件下與(a)中所述核酸序列之一雜交。術(shù)語"芳基"被理解為在環(huán)內(nèi)包含6到14個(gè)碳原子的芳香碳部分。-(C6-C14)-芳基部分是，例如，苯基、萘基，例如，l-萘基、2-萘基、聯(lián)苯基，例如，2-聯(lián)苯基、3-聯(lián)苯基和4-聯(lián)苯基，蒽基或芴基。聯(lián)苯基部分、萘基部分以及特別是苯基部分是優(yōu)選的芳基部分。術(shù)語"卣素"，被理解為來自氟、氯、溴、碘家族的元素。術(shù)語"-(d-C2Q)-烷基"被理解為烴部分，它的碳鏈?zhǔn)蔷€性鏈或是分支的，并且包含1到20個(gè)碳原子，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或葵基。術(shù)語"-Co-烷基"被理解為共價(jià)鍵。術(shù)語"-(C3-C7)-環(huán)烷基"被理解為環(huán)烴部分，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基。術(shù)語"-(C5-C14)-雜環(huán)"代表單環(huán)或雙環(huán)的5成員到14成員的雜環(huán)形環(huán)，其是部分地或完全地飽和的。N、O和S是雜原子的實(shí)例。衍生自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、唑、噻唑、異p塞唑、四唑、1,2,3,5-卩惡p塞二唑-2-氧化物、三唑酮、f感二唑酮、異卩惡唑酮、ff惡二唑啉硫酮、—皮F、-CN、-CF3或-C(O)-O-(Cl-C4)烷基取代的三唑、3-羥基吡咯-2，4-二酮、5-氧代-l，2,4-噻二唑、吡啶、吡。秦、嘧啶、口引哚、異吲咮、吲唑、2.3-二氮雜萘、喹啉、異喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、咔啉的部分，所迷雜環(huán)的苯并稠合的，環(huán)戊二烯并、環(huán)己二烯并或環(huán)庚三烯并稠合的的衍生物。所述部分特別優(yōu)選的是2-或3-吡咯基、苯基吡咯基，例如4-或5-苯基吡咯基、2-呋喃基、2-噻吩基、4-咪唑基、曱基咪唑基，例如l-甲基-2-、-4-或-5-咪唑基，1,3-漆哇-2-基、2-他咬基、3-吡啶基、4-吡啶基，2-、3-或4-吡啶-N-氧化物、2-吡。秦基，2-、4-或5-嘧啶基，2-、3-或5-吲哚基，取代的2-吲哚基，例如l-甲基、5-曱基、5-甲氧基、5-千氧基-、5-氯-或4,5-二甲基-2-吲哚基，l-芐基-2-或-3-口引哚基,4,5,6,7-四氫-2-吲哚基，環(huán)庚三烯并[b]-5-吡咯基，2-、3-或4-喹啉基，1_、3-或4-異喹啉基，l-氧代-l,2-二氫-3-異喹啉基，2-喹喔啉基，2-苯并呋喃基，2-苯并噻吩基，2-苯并P惡唑基或苯并噻唑基或二氫吡啶基，吡咯烷基，例如2-或3-(N-甲基吡咯烷基)，哌。秦基，嗎啉基，硫代嗎啉基，四氫噻吩基或苯并二氧雜環(huán)戊烷基。優(yōu)選的具有式I的化合物是，例如，4-氯-乙酰乙酸乙酯，乙酰乙酸甲酯，8-氯-6-氧代辛酸乙酯，3-氧代戊酸乙酯，4-雍基-2-丁酮，2-氧代戊酸乙酯，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，丙酮酸乙酯，乙醛酸乙基苯基酯，l-苯基-2-丙酮，2-氯-l-(3-氯苯基)乙烷習(xí)l-酮,苯乙酮，2-辛酮,3-辛酮，2-丁酮，l-[3,5-二(三氟曱基)苯基]乙烷-l-酮，2,5-己二酮，1.4-二氯-2-丁酮，乙酸基丙酮，苯酰曱基氯，4-溴乙酰乙酸乙酯，1,1-二氯丙酮，1,1,3-三氯丙酮或l-氯丙酮。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，氧化還原酶可以以完全純化的或部分純化的狀態(tài)使用，或者所述方法可以用含有根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的細(xì)胞來進(jìn)行。在這樣做時(shí)，使用的細(xì)胞可以以天然的、滲透化的或裂解的狀態(tài)來提供。優(yōu)選的相應(yīng)地使用根據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的氧化還原酶或其同源物。每kg要轉(zhuǎn)化的式I的化合物使用5.000到10MioU的氧化還原酶(沒有上限)。酶單位1U相應(yīng)于每分鐘(min)轉(zhuǎn)化1)umol式I化合物所需的酶數(shù)量。酶促還原本身在溫和條件下進(jìn)行，從而產(chǎn)生的醇不進(jìn)一步反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的方法展現(xiàn)了高殘留時(shí)間、和產(chǎn)生的手性醇的一般超過95%的對(duì)映異構(gòu)純度、和高產(chǎn)率，相對(duì)于所采用的酮基化合物的量。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，基于總體積，以3%到50%的數(shù)量、優(yōu)選的5%到40%、特別是10%-30%來使用羰基化合物。此外，本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式的特征在于在還原期間形成的NAD或NADP被分別持續(xù)地還原成NADH或NADPH,使用共底物。所述共底物分別與相應(yīng)的醛或酮以及NADH或NADPH反應(yīng)，分別借助于氧化還原酶和NAD或NADP。這分別導(dǎo)致NADH和NADPH的再生?；诳傮w積，用于借此再生的共底物的比例從按體積的5%到95%。對(duì)于輔因子的再生，可以添加另外的醇脫氫酶。適合的NADH依賴性醇脫氬酶是可獲得的，例如，來自面包酵母、來自Candidaboidinii、Candidaparapsilosis或Pichiacapsulata。此夕卜，適合的NADPH依賴性醇脫氫酶在短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)(DE19610984Al)、稍小乳桿菌(Lactobacillusminor)(DE10119274)、假單胞菌(Pseudomonas)(US5,385,833)中或在布氏熱厭氧桿菌(Thermoanaerobiumbrockii)中存在。這些醇脫氫酶的適合的共底物是已經(jīng)提及的仲醇，例如乙醇、2-丙醇(異丙醇)、2-丁醇、2-戊醇、4-曱基-2-戊醇、2-辛醇或環(huán)己醇。此外，輔因子再生也可以^_用例如NAD-或NADP-依賴性加酸脫氬酶來實(shí)現(xiàn)(Tichkov等人，J.Biotechnol.Bioeng.[1999]64,187-193,Pilot-scaleproductionandisolationofrecombinantNADandNADPspecificFormatedehydrogenase)。曱酸脫氫酶的適合的共底物是，例如，甲酸的鹽，如曱酸銨、甲酸鈉或曱酸釣。然而，根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選地沒有這種額外的脫氫酶來進(jìn)行，即，發(fā)生底物聯(lián)結(jié)的輔酶再生。酶促還原進(jìn)行的反應(yīng)混合物的水性部分優(yōu)選的含有緩沖液，例如，磷酸鉀、tris/HCl或三乙醇胺緩沖液，具有5到10的pH值，優(yōu)選的6到9的pH值。此外，所述緩沖液可以包含離子用于穩(wěn)定或活化所述酶，例如鋅離子或鎂離子。當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明的方法時(shí)，溫度適合地在約l(TC到7(TC的范圍內(nèi)，優(yōu)選的20。C到40°C。在根據(jù)本發(fā)明的方法的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，在存在有機(jī)溶劑的情況下實(shí)現(xiàn)所述酶學(xué)轉(zhuǎn)化，所述溶劑是與水不可混溶的，或與水可混溶的僅到有限的程度。例如，所述溶劑是對(duì)稱的或不對(duì)稱的二可溶的仲醇。例如，優(yōu)選的有機(jī)溶劑是乙醚、叔丁基曱基醚、二異丙基醚、二丁基醚、乙酸丁酯、庚烷、己烷、2-辛醇、2-庚醇、4-甲基-2-戊醇或環(huán)己烷。同時(shí)，所述溶劑也可以充當(dāng)輔因子再生的共底物。如果分別使用水可溶的溶劑和共底物，反應(yīng)批次由水性和有機(jī)相構(gòu)成。底物根據(jù)它的溶解度分布在有機(jī)相和水相中?；诳偡磻?yīng)體積，有沖幾相一般具有5到95%的比例，優(yōu)選的10%到90%。優(yōu)選的枳^戒地混合兩種液相從而在它之間產(chǎn)生大的表面。同樣在這個(gè)實(shí)施方式中，在酶促還原期間分別形成的NAD或NADP被分別還原回NADH或NADPH，使用如上描述的共底物。NADH或NADPH分別在水相中的濃度一般從0.001mM到1mM，特別是從0.01mM到0.1mM。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，氧化還原酶/脫氫酶的穩(wěn)定劑可以另外使用。適合的穩(wěn)定劑是，例如，甘油、山梨醇、1,4-DL-二硫蘇糖醇、二曱亞石風(fēng)(DMSO)。例如，在由玻璃或金屬制成的封閉反應(yīng)容器中進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法。為此，成分被單獨(dú)地轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中并在氣體，例如氮?dú)饣蚩諝獾那闆r下攪動(dòng)。反應(yīng)時(shí)間從1小時(shí)到48小時(shí)，特別是從2小時(shí)到24小時(shí)。隨后，加工反應(yīng)混合物。為此，分離水相，過濾有才幾相。所述水相可以任選的提取一次或多次并可以如有機(jī)相一樣進(jìn)一步處理。隨即，任選的從過濾的有機(jī)相蒸發(fā)溶劑。此外，本發(fā)明涉及獲得式II的手性羥基化合物的方法，(d-C6)烷基酯、Rl國C(OH)-R2(II)其中Rl和R2如以上定義的，其特征在于a)在存在根據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的本發(fā)明的氧化還原酶或其同源物之一、NAD(P)和水的情況下孵育含有式n的外消旋化合物的混合物，從而式II的羥基化合物的對(duì)映體被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酮化合物和NAD(P)H,以及b)分離式II的羥基化合物的剩余的對(duì)映體。如果使用根據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:129的羰基還原酶，優(yōu)選的獲得相應(yīng)的手性R-羥基化合物。如果使用根據(jù)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:8的羰基還原酶，優(yōu)選的獲得相應(yīng)的S-輕基化合物。反應(yīng)混合物基本上與上述的式I的酮基化合物的對(duì)映異構(gòu)特異性還原方法的相同。然而，式I的酮基化合物的對(duì)映異構(gòu)特異性還原和式II化合物的外消旋混合物不同，式II的羥基化合物的僅一種對(duì)映體被對(duì)映異構(gòu)地氧化成相應(yīng)的酮基化合物。因而，式II的羥基化合物的相對(duì)的對(duì)映體保留下來并可以被分離。此外，除了用作共底物的醇，例如乙醇、2-丙醇(異丙醇)、2-丁醇、2-戊醇或2-辛醇，在NAD的再生的過程中使用其相應(yīng)的酮例如丙酮。例如，通過根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶或其他脫氫酶，丙醇和NAD(P)H纟皮轉(zhuǎn)化成NAD和異丙醇。通過以下的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式。f農(nóng)糸的潛#和蔬差還#躇話^W謬逸為了篩選，在以下培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母菌林粘質(zhì)紅酵母DSMZ70825、粉狀畢赤酵母DSMZ3316、CandidanemodendraDSMZ70647、樹干畢赤酵母DSMZ3651和PichiatrehalophilaDSMZ70391、LodderomyceselongisporusDSMZ70320:酵母提取物(3)、麥芽提取物(3)、蛋白胨(5)和葡萄糖(10)(在每種情況下，括號(hào)中的數(shù)字單位g/1)。培養(yǎng)基在121。C滅菌，酵母在25。C沒有進(jìn)一步pH調(diào)節(jié)的、在160轉(zhuǎn)每分鐘(rpm)的搖動(dòng)器上培養(yǎng)。菌抹LeuconostoccarnosuDSMZ5576在以下培養(yǎng)基中培養(yǎng)葡萄糖(20)、酵母提取物(5)、麥芽提取物(10)、檸檬酸氫二銨(2)、醋酸鈉(5)、硫酸鎂(0.2)、硫酸錳(0.05)、磷酸氫二鉀(2)。培養(yǎng)基在12rC滅菌，在3(TC培養(yǎng)有機(jī)體，沒有進(jìn)一步的pH調(diào)節(jié)或氧供應(yīng)。菌株Microbacteriumspec.DSMZ20028在酵母提取物(3)和胰酶大豆粉(30)的培養(yǎng)基上在3(TC用160轉(zhuǎn)每分鐘(rpm)培養(yǎng)。菌林深紅戈登氏菌DSMZ43570在酵母提取物(4)、葡萄糖(4)、麥芽提取物(10)和CaC03(2)的培養(yǎng)基上在37。C用160轉(zhuǎn)每分鐘(rpm)培養(yǎng)。隨后使用800^1消化緩沖液(100mM三乙醇胺(TEA),pH=7.0)重懸浮125mg細(xì)胞，與1g玻璃珠混合，在球磨(Retsch)中在4。C消化10分鐘。在12.000rpm離心2分鐘后獲得的上清液(溶胞產(chǎn)物)在隨后的活性篩選中使用，并用于測(cè)定對(duì)映體過量(ee-值)。使用不同的酮，例如2-丁酮、2-辛酮、4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮或2-氧代-4-苯基丁酸乙酯作為底物?；钚院Y選的批次860|ul0.1MKH2P04/K2P04pH=7.0lmMMgCl220|ulNADPH或NADH(10mM)20|ul溶胞產(chǎn)物100pi底物(100mM)在340nm跟蹤反應(yīng)1分鐘。用于ee-值測(cè)定的批次20|iil溶胞產(chǎn)物100)ulNADH或NADPH(50mM)60^1底物(100mM)在24小時(shí)(h)之后，使用例如氯仿提取用于ee測(cè)定的批次，經(jīng)由氣相色譜(GC)測(cè)定對(duì)映體過量。對(duì)映體過量如下計(jì)算ee(%)=((R-醇-S-醇)/(R-醇+S-醇)x100表1DSMZNo.微生物活性，U/g宿主有一幾體細(xì)胞2-丁酮2陽辛酮NADHNADPHNADHNADPH70825粘質(zhì)紅酵母<1<13316粉狀畢赤酵母12<170647Candidanemodendra45123651樹干畢赤酵母106.470391Pichiatrehalophila85455576肉色明串珠菌777720028微桿菌屬92643570深鄉(xiāng)工戈登氏菌7.71370320Lodderomyceselogisporus4034----DSMZ代表DeutscheSammlungfiirMikroorganismenundZellkulturen,MascheroderWeglb,38124Braunschweig。酶單位的定義1U相應(yīng)于每分鐘轉(zhuǎn)化l|umol底物所需的酶數(shù)量。A^D「尸」//汆^'^凝^#真^還/^躇^為、庠^遂^為了分離NAD(P)H依賴性微生物氧化還原酶，如實(shí)施例1中描述培養(yǎng)微生物體。在達(dá)到穩(wěn)定階段時(shí)，通過離心從培養(yǎng)基收獲和分離細(xì)胞。通過使用玻璃珠濕磨實(shí)現(xiàn)酶釋放，但也可以通過其他消化方法實(shí)現(xiàn)。為此，例如，100g的濕細(xì)胞團(tuán)用400ml消化緩沖液(100mM三乙醇胺，lmMMgCl2,pHH7.0)懸浮，通過French壓力的方法勻質(zhì)化。在離心(7000rpm)后獲得的粗提取物然后經(jīng)由FPLC(快速蛋白液相層析)來純化。根據(jù)本發(fā)明的所有氧化還原酶可以通過不同組合的離子交換層析例如,在Q-SepharseFastFlow(Pharmacia)或UnoQ(Biorad,Munich,Germany)上、疏7K相互作用層析，例如在Octyl-SepharoseFastFlow或Butyl-SepharoseFastFlow(Pharmacia)上、陶資輕石辟灰石層析和湊是膠滲透來純化。4《為、炎^^發(fā)孕AS"MZ的A^4D//^謝^真必還^雄的遂必對(duì)于蛋白質(zhì)分離，在離心后獲得的來自為V乂'^^,母DSMZ3316的溶胞產(chǎn)物直接施加到用100mM三乙醇胺緩沖液pH=7.01M(NH4)S04平衡的Butyl-SepharoseFF柱上，用降低的線性鹽梯度洗脫。組合含有氧化還原酶的級(jí)分并通過超濾(排阻限制10kDa)的方式濃縮到適合的體積。隨后，氧化還原酶的濃縮的級(jí)分進(jìn)一步通過Uno.Q純化。為此，氧化還原酶直接施加到用50mM磷酸鉀緩沖液pFN7.0平衡的UnoQ柱(Biomd)上并用提高的線性鹽梯度洗滌，借此氧化還原酶在0MNaCl洗脫而沒有結(jié)合，而混雜物的主要部分是結(jié)合的并在更高的鹽濃度下洗脫。第三個(gè)純化步驟在陶乾羥磷灰石柱(Pharmacia)上進(jìn)行，其中氧化還原酶被施加到用10mM磷酸鉀緩沖液、lmMMgCl2pH=6.8平衡的柱上，使用提高的緩沖液濃度洗脫(400mM磷酸鉀緩沖液lmMMgCl2pH=6.8)。在80-100mM磷酸鉀緩沖液處洗脫氧化還原酶。由此，獲得的純化氧化還原酶的分子量經(jīng)由凝膠滲透來測(cè)定(Superdex200HR;Pharmacia,100mM三乙醇胺，pH=7,0.15MNaCl)。過氧化氫酶(232kDa)、醛縮酶(158kDa)、白蛋白(69.8kDa)和卵清蛋白(49.4kDa)被用作分子量標(biāo)準(zhǔn)。以下的表2概括了獲得的結(jié)果。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在根據(jù)實(shí)施例1(分批活性篩選)的測(cè)試系統(tǒng)中測(cè)定氧化還原酶的酶活性，蛋白質(zhì)數(shù)量的測(cè)定根據(jù)Lowryetal.,JournalofBiologicalChemistry,193(1951):265-275或Petersonetal.,AnalyticalBiochemicstry,100(1979):201-220)進(jìn)行。酶活性比蛋白質(zhì)數(shù)量的商產(chǎn)生比活性，其中1pmol每分鐘的轉(zhuǎn)化相應(yīng)于1單位(U)。4《凝^霧4AStUZ的^謝^真必還^箱的^^對(duì)于蛋白質(zhì)分離，在離心后獲得的來自A^'cra^"en'ww2W2S的溶胞產(chǎn)物直接施加到用50mM磷酸鉀緩沖液pH=7.0平衡的Q-SepharoseFF柱上，用提高的線性鹽梯度洗脫。從而，氧化還原酶在0.6到0.8MNaCl處洗脫。組合含有氧化還原酶的級(jí)分并通過超濾(排阻限制10kDa)的方式濃縮到適合的體積。隨后，氧化還原酶的濃縮的級(jí)分進(jìn)一步通過Uno.Q純化。為此，氧化還原酶直接施加到用50mM磷酸鉀緩沖液pH=7.0平衡的UnoQ柱(Biorad)上并用提高的線性鹽梯度洗滌，借此氧化還原酶在0.2-0.25MNaCl洗脫。第三個(gè)純化步驟在陶資羥磷灰石柱(Pharmacia)上進(jìn)行，其中來自微7f萄^4ASA/Z2⑧2S的氧化還原酶被施加到用10mM磷酸鉀緩沖液、lmMMgCl2pH=6.8平衡的柱上，使用提高的緩沖液濃度洗脫(400mM磷酸鉀緩沖液lmMMgCl2pH=6.8)。在80-100mM磷酸鉀緩沖液處洗脫氧化還原酶。由此，獲得的純化氧化還原酶的分子量如2a所描述的測(cè)定。以下的表3概括了獲得的結(jié)果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>橫孩本發(fā)'效^真必還f滲^在10%十二烷基石克酸鈉(SDS)凝膠中凝膠滲透之后，根據(jù)實(shí)施例2的酶制品被分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上。顯著的條帶進(jìn)行經(jīng)由Edman降解的N-末端測(cè)序(Procise492(PE-Biosystems))。從庠的/,鍵辱應(yīng)產(chǎn)齊的一處^;發(fā)衷^才艮據(jù)Manniatis&Sambrook的"Molecularcloning"中描述的方法才是取染色體DNA。產(chǎn)生的核酸充當(dāng)使用簡(jiǎn)并引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板。在這樣做時(shí)，5'引物來自氨基酸序列(SEQIDNO:66、72、80),3，引物來自氨基酸序列(SEQIDNO:67、73、81),涉及特異于有機(jī)體的遺傳編碼(SEQIDNO:68、68、74、75、82、83)。在PCR緩沖液[67mMTris-HCl(pH8.3),16mM(NH4)2S04，115mMMgCl2,0.01%Tween20]、0.2mM脫氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、40pMol每種引物和2.5UBioThermStar聚合酶(Genecraft,Liidingshausen,Germany)]中進(jìn)行擴(kuò)增。在BioThermStar聚合酶活化(95°C8分鐘)和隨后45-50個(gè)循環(huán)的Touch-DownPCR之后，反應(yīng)冷卻到4°C,整個(gè)PCR批次施加到1%瓊脂糖凝膠上用于分析。來自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性片段被連接到TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中，并使用引物M13rev(SEQIDNO:65)和M13uni(SEQIDNO:128)借助ABIDNA測(cè)序儀來測(cè)序?；蚓幋a序列的5，和3，末端區(qū)域使用RACE方法(cDNA末端的快速擴(kuò)增)來測(cè)定。根據(jù)特異性片段的核酸序列，構(gòu)建3，-RACE和5，-RACE的寡核苷酸。從細(xì)胞制備的總RNA充當(dāng)模板用于利用3，-RACE系統(tǒng)(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)的第一cDNA鏈的合成。這隨后是借助3，-RACE寡核苷酸(SEQIDNO:76、77、84、85)的特異性cDNA的擴(kuò)增和再擴(kuò)增。隨后，批次施加到1%瓊脂糖凝膠上用于分析。攜帶缺失3'-側(cè)翼序列信息的特定片段被分離，連接到TA克隆載體pCR2.1并測(cè)序。序列的編碼和非編碼5'末端序列使用5'-RACE系統(tǒng)(Invitrogen)來測(cè)定。為此，來自早先獲得的總RNA的mRNA借助OligodT-纖維素(NEB，Beverly,USA)來富集，并用于利用基因特異性寡核苷酸(SEQIDNO:70;71;78;79;86;87)的第一cDNA鏈的合成。特異性cDNA的隨后的擴(kuò)增和再擴(kuò)增產(chǎn)生片段，其被連接到TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen)用于分析。借助ABIDNA測(cè)序儀分析含有片段的質(zhì)粒。因而，獲得關(guān)于基因的5'末端的缺失序列信息。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>根據(jù)編碼全長基因(SEQIDNO:9;10;11)的序列，構(gòu)建了用于隨后將所述DNA片段克隆到適合的表達(dá)系統(tǒng)中的特異性引物。為此，例如，分別具有NdeI的識(shí)別序列、或具有SphI的識(shí)別序列、或BamHI的識(shí)別序列的5'引物，以及具有HindIII的識(shí)別序列的3，引物被修飾(SEQIDNO:89;90;91;92;93;94;95;96)。在隨后的PCR中，染色體DNA充當(dāng);^莫板。編碼相應(yīng)的氧化還原酶的DNA片段借助尸/W,wwwp/jc聚合酶(Invitrogen)來擴(kuò)增。在1%瓊脂糖凝膠上純化之后，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用適合的DNA內(nèi)切酶處理，并分別連接到pET21載體(Novagen，Madison,USA)的主干中、或pQE70載體(Qiagen，Hilden,Germany)的主干中，所述主干用相同的核酸內(nèi)切酶處理。在測(cè)序之后，形成表達(dá)構(gòu)建體被分別帶入表達(dá)菌林BL21Star(Invitrogen)或RB791(E.coli遺傳庫，Yale,USA)。敘^《###炎^^##^#鍵傳這#^真^還^癡時(shí)^發(fā)對(duì)于從粉狀畢赤酵母克隆氧化還原酶，例如，根據(jù)Manniatis&Sambrook的"Molecularcloning"中描述的方法從粉狀畢赤酵母的新鮮細(xì)胞提取染色體DNA。產(chǎn)生的核酸充當(dāng)利用寡核苷酸SEQIDNO:74、75的Touch-DownPCR的模板。在PCR循環(huán)儀(BioRad,Hercule，USA)中活化BiothermStar聚合酶8分鐘之后，編程以下30個(gè)循環(huán)用于特異性DNA片段的鑒定94°C45秒60。C-0.5。C/循環(huán)45秒68°C2分鐘隨后，通過另外20個(gè)循環(huán)提高擴(kuò)增信號(hào)94。C40秒52°C40秒72°Cl分鐘。在1%瓊脂糖凝膠中整個(gè)反應(yīng)批次的分級(jí)之后，檢測(cè)到具有550bp大小的特定片段。所述片段從凝膠上脫除并連接到pCR2.1TA載體(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中。形成的質(zhì)粒pCR2.1-PF550進(jìn)行測(cè)序。具有550bp長度的基因片段的序列分析顯示了174個(gè)氨基酸殘基的開放閱讀框，其中還發(fā)現(xiàn)了N-末端和內(nèi)部肽的兩個(gè)序列片段。根據(jù)具有521bp長度的片段的核苷酸序列，構(gòu)建了3，-RACE(SEQIDNO:76、77)和5，-RACE(SEQIDNO:78、79、88)的寡核苷酸。對(duì)于cDNA合成反應(yīng)，如下制備來自粉狀畢赤酵母的細(xì)胞的總RNA。600mg新鮮細(xì)胞重懸浮在2.5ml水冷的LETS緩沖液中。在硝酸中洗滌并用3ml苯酚平tf的5ml(約20g)玻璃珠添加到所述細(xì)胞懸浮液中。在每種情況下整個(gè)批次渦旋30秒，總共10分鐘，在冰上冷卻30秒。隨后，添加5ml冰冷的LETS緩沖液，再次充分地渦旋。所述細(xì)胞懸浮液在4'C以11000g離心5分鐘?；厥账嗖⒂玫润w積的苯酚氯仿異戊醇(24:24:l)提取兩次。這隨后是用氯仿提取。在最后的4是取之后，通過添加1/10體積的5MLiCl2在-20。C4h沉淀總RNA。第一cDNA鏈的合成使用3'RACE系統(tǒng)(Invitrogen，Karlsruhe,Germany)進(jìn)行。隨后，使用寡核苷酸SEQIDNO:76和AUAP(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)在反應(yīng)67mMTris-HCl(pH8.3),16mM(NH4)2S04,115mMMgCl2，0.01%Tween20]、0.2mM脫氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、10pMol每種引物和2.5UBioThermStar聚合酶(Genecmft,Liidingshausen,Germany)]中控制特異性cDNA,使用以下30個(gè)溫度循環(huán)94°C40秒，55°C40秒，72°C1分鐘。使用引物SEQIDNO:77和引物UAP(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)使用30個(gè)溫度循環(huán)94°C40秒，55°C40秒，72°C50秒通過嵌套PCR來提高PCR信號(hào)。結(jié)果是具有約400bp大小的特異性DNA片段，其在從1%瓊脂糖凝膠分離之后連接到載體pCR2.1(Invitrogen)。具有382bp長度的DNA片段序列分析產(chǎn)生了序列信息，關(guān)于編碼來自粉狀畢赤酵母的氣化還原酶的cDNA的3，-延伸直到終止密碼子和ploy-A環(huán)。對(duì)于5，RACE反應(yīng)，使用從粉狀畢赤酵母的細(xì)胞制備的5|ig總RNA?；蛱禺愋詂DNA的合成使用5，RACE系統(tǒng)(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)和寡核香酸SEQIDNO:78進(jìn)行。產(chǎn)生的基因特異性cDNA進(jìn)行同多聚化dCTP添加反應(yīng)。這之后是在PCR[67mMTris-HCKpH8.3),16mM(NH4)2S04,115mMMgCl2，0.01%Tween20〗、0.2mM脫氧核苦三磷酸混合物(dNTP)、20pMol引物SEQIDNO:79和引物AAP(Invitrogen)、2.5UBioThermStar聚合酶(Genecraft,Liidingshausen,Germany)]中的cDNA擴(kuò)增，使用以下35個(gè)溫度循環(huán)94°C45秒、54°C45秒、72°C1分30秒。通過使用嵌套PCR用引物SEQIDNO:88和引物UAP(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)4吏用30個(gè)溫度循環(huán)94°C40秒、55°C40秒、72°Cl分鐘來提高PCR信號(hào)。結(jié)果是具有約350bp大小的特異性DNA片段，其在從1%瓊脂糖凝膠分離之后連接到載體pCR2.1(Invitrogen)。具有352bp長度的DNA片段序列分析產(chǎn)生了序列信息，關(guān)于編碼醇脫氫酶/還原酶的cDNA的5,-末端。編碼蛋白質(zhì)的DNA片段具有765bp(SEQIDNO:10)的總長度和254個(gè)氨基酸的開放閱讀框(SEQIDNO:2)。粉狀畢赤酵母細(xì)胞的染色體DNA用作模板用于在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生全長DNA[IOmMTris-HCl,(pH8.0);50mMKC1;10mMMgS04;0.2mMdNTPMix;20pMol引物SEQIDNO:91,或，分別地，20pMol引物SEQIDNO:92、20pMol引物SEQIDNO:93和2U尸/a""ww聚合酶(Invitrogen)],使用溫度循環(huán)循環(huán)194°C,2分鐘循環(huán)2x3094°C,15秒56°C,20秒68°C,1分15秒在1%瓊脂糖凝膠上純化之后，用NdeI和HindIII、或用SphI和HindIII處理產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，分別連接到載體pET21a(Novagen，Madison,USA)或pQE70(Qiagen，Hilden,Germany)的主干中，所述主干用相同的核酸內(nèi)切酶處理。在將2|ul的連接批次轉(zhuǎn)化到E.coliToplOF，細(xì)胞中之后，檢查氨千青霉素抗性克隆的質(zhì)粒DNA中連接的正確性，所述連接通過分別使用內(nèi)切酶NdeI或SphI和HindIII的限制性分析的方式進(jìn)行。對(duì)于插入為陽性的載體的DNA分別轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21Star(Invitrogen)和RB79(E.coli遺傳庫，Yale,USA)中。勿,為、庠凈^真必還^癉w—廢^;發(fā)衷略才艮據(jù)Manniatis&Sambrook的"Molecularcloning"中描述的方法才是取基因組DNA。產(chǎn)生的核酸充當(dāng)使用簡(jiǎn)并引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板。在這樣做時(shí)，5，-引物來自氨基酸序列(SEQIDNO:104;112)，3，-引物來自氨基酸序列(SEQIDNO:105;113),涉及特異于有機(jī)體的遺傳編碼(SEQIDNO:106;107;114;115)。在PCR緩沖液[67mMTris-HCl(pH8.3),16mM(NH4)2S04,115mMMgCl2，0.01%Tween20]、0.2mM脫氧核苷三石粦酸混合物(dNTP)、40pMol每種引物和2.5UBioThermStar聚合酶(Genecraft,Liidingshausen,Germany)]中進(jìn)行擴(kuò)增。在BioThermStar聚合酶活化(95°C8分鐘)和隨后45-50個(gè)循環(huán)的Touch-DownPCR之后，反應(yīng)冷卻到4°C,整個(gè)PCR批次施加到1%瓊脂糖凝膠上用于分析。來自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性片段被連接到TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中，并使用引物M13rev(SEQIDNO:65)和M13uni(SEQIDNO:128)借助ABIDNA測(cè)序儀來測(cè)序。基因編碼序列的5'和3'末端區(qū)域使用反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(iPCR)來測(cè)定。根據(jù)內(nèi)部特異性片段的核酸序列，構(gòu)建寡核香酸SEQIDNO:100;101;102;103;108;109;110;111;116;117;118;119。通過限制性內(nèi)切酶的方式消化基因組DNA并用于連接，從而可以環(huán)化小的DNA片段。所述然后使用所述連接化合物作為iPCR的模板，引物SEQIDNO:100;102;108;119;116;118信號(hào)通過隨后的嵌套PCR用引物SEQIDNO:101;103;109;111;117;119來提高。產(chǎn)生的特異性片段從1%瓊脂糖凝膠洗脫之后連接到載體pCR2.1(Invitrogen)中。因而，含有片段的載體pCR2.1的序列分析產(chǎn)生了關(guān)于醇脫氫酶/還原酶基因的3，-和5，-編碼區(qū)的缺失序列信息。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>根據(jù)編碼全長基因的序列(SEQIDNO:12;13;14),構(gòu)建了特異性引物，用于隨后克隆所述DNA片段到適合的表達(dá)系統(tǒng)中。在這樣做時(shí)，分別用NdeI的識(shí)別序列或用SphI的識(shí)別序列或BamHI的識(shí)別序列修飾5，-引物，用HindIII的識(shí)別序列修飾3'-引物(SEQIDNO:120;121;122;123;124;125;126;127)。如實(shí)施例3中描述的進(jìn)行，編碼蛋白質(zhì)的全長DNA從基因組的擴(kuò)增，隨后限制性酶切并連接到表達(dá)載體中。表達(dá)菌抹BL21Star(Invitrogen)或RB791(E.coli遺傳庫,Yale，USA)分別用形成的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。5a^《微^參凝^,虞^#鍵^這脊^辱應(yīng)產(chǎn)躇/還#^^^發(fā)對(duì)于從微桿菌屬克隆氧化還原酶，例如，根據(jù)Manniatis&Sambrook的"Molecularcloning"中描述的方法從微桿菌屬的新鮮細(xì)胞提取基因組DNA。產(chǎn)生的核酸充當(dāng)利用30pMol每種寡核苷酸SEQIDNO:106;107的PCR的模板。在PCR循環(huán)儀(BioRad,Hercule,USA)中活化BiothermStar聚合酶10分鐘之后，編程以下30個(gè)循環(huán)用于特異性DNA片段的鑒定94°C50秒60°C1分鐘72°C1分鐘在1%瓊脂糖凝膠中整個(gè)反應(yīng)批次的分級(jí)之后，檢測(cè)到具有1000bp大小的特定片段。所述片段從凝膠上脫除并連接到pCR2.1TA載體(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中。形成的質(zhì)粒pCR2.1-MslOOO進(jìn)行測(cè)序。具有1002bp長度的基因片段的序列分析顯示了334個(gè)氨基酸殘基的開放閱讀框，其中還發(fā)現(xiàn)了N-末端和內(nèi)部肽的兩個(gè)序列片段。根據(jù)具有1002bp長度的片段的核苷酸序列，構(gòu)建了用于反向PCR(iPCR)的寡核芬酸(SEQIDNO:108;109;110;111)。來自微桿菌屬的基因組DNA(2.5ug)以50^1批次用20U限制性內(nèi)切酶SacI處理25分鐘。在整個(gè)批次的苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)提取和用1/10體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積乙醇沉淀之后，由此消化的DNA轉(zhuǎn)移到25|tilH20中。其中的5|til(200ng)用于在總體積40^1和2UT4連接酶(Fermentas)中的連接反應(yīng)。重新連接的基因組DNA(2^1=200ng)然后用于iPCR[67mMTris-HCl(pH8.3),16mM(NH4)2S04,115mMMgCl2,0.01%Tween20]、0.2mM脫氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、30pMol每種引物(SEQIDNO:108、110)和2.5UBioThermStar聚合酶(Genecraft,Liidingshausen,Germany)]]。使用以下循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)195°C,10分鐘循環(huán)2x3095°C,1分鐘56°C,1分鐘72°C,2分鐘在嵌套PCR中使用寡核苷酸SEQIDNO:109和IIO提高擴(kuò)增信隨后擴(kuò)增反應(yīng)冷卻到4。C并作為整體施加到1%瓊脂糖凝膠上。結(jié)果是約1000bp大小的特異性片段。在從凝膠洗脫之后，片段連接到pCR2.1載體(Invitrogen，Karlsruhe,Germany)中。含有所述片段的質(zhì)粒的序列分析產(chǎn)生了信息，關(guān)于5'-和3，-側(cè)翼序列。因而，編碼蛋白質(zhì)的DNA片段具有1044bp的總長度，以終止密碼子結(jié)束(SEQIDNO:13),展現(xiàn)了347個(gè)氨基酸的開放閱讀框(SEQIDNO:5)。使用微桿菌屬細(xì)胞的基因組DNA作為模板用于在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生編碼蛋白的全長DNA,使用GC-RichPCR系統(tǒng)(Roche,Mannhein,Germany)和分別30pMol的寡核苷酸SEQIDNO:123或SEQIDNO:124，和30pMol寡核苷酸SEQIDNO:125以及溫度循環(huán)循環(huán)195°C,3分鐘循環(huán)2x3095°C,30秒59°C,30秒72°C,45秒在1%瓊脂糖凝膠上純化之后，用NdeI和HindIII、或用SphI和HindIII處理產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，分別連接到載體pET21a(Novagen,Madison,USA)或pQE32(Qiagen，Hilden,Germany)的主干中，所述主干用相同的核酸內(nèi)切酶處理。在將2|Lll的連接批次轉(zhuǎn)化到E.coliToplOF，細(xì)胞中之后，檢查氨節(jié)青霉素抗性克隆的質(zhì)粒DNA中連接的正確性，所述連接通過分別使用內(nèi)切酶NdeI或SphI和HindIII的限制性分析的方式進(jìn)行。對(duì)于插入為陽性的載體的DNA分別轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌林BL21Star(Invitrogen)和RB791(E.coli遺傳庫，Yale,USA)中。f逸趁應(yīng)產(chǎn)箱/還^雜^Eco//哞的《這用表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的Escherichiacoli菌林BL21Star(Invitrogen)和RB79(E.coli遺傳庫，Yale,USA)分別在具有氨節(jié)青霉素(50jug/ml)和羧千青霉素(50|ug/ml)的200mlLB培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物，P/。NaCl)中培養(yǎng)，直到達(dá)到在550nm測(cè)量的0.5光密度。重組蛋白的表達(dá)通過添加濃度0.1mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)來誘導(dǎo)。在25。C和220rpm分別誘導(dǎo)8小時(shí)或16小時(shí)之后，收獲細(xì)胞并在-2(TC冷凍。對(duì)于活性測(cè)試，10mg細(xì)胞與500jull00mMTEA緩沖液pH7.0以及500卩il玻璃珠混合，使用球磨消化10分鐘。獲得的溶胞產(chǎn)物然后用于在稀釋狀態(tài)的相應(yīng)測(cè)量?；钚詼y(cè)試包括以下的870|ul100mMTEA緩沖液pH7.0，160貼NAD(P)H,lOpl稀釋的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。向反應(yīng)混合物添加100pi100mM底物溶液來開始反應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>產(chǎn)生表4中所列的緩沖液。相應(yīng)緩沖液成分的濃度在每種情況下數(shù)量為50mM。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>測(cè)量批次(30°C)—最佳pH還原870pi表3中所述每種緩沖系統(tǒng)20孵育進(jìn)行約2到3分鐘，隨后100|ul底物溶液(100mM)纟皮添加。根據(jù)氧化還原酶，使用2-丁酮或2-辛酮作為底物。反應(yīng)在340nm監(jiān)視1分鐘。為了測(cè)量最佳pH值，分析了表4所列各種緩沖液中的酶反應(yīng)。為了確定氧還反應(yīng)的最佳pH值，使用NAD(P)作為輔因子，2-丙醇或2-辛醇用作底物。根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的結(jié)果在表5中綜合。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>-9.5通過將重組氧化還原酶保存在表4所提及的緩沖系統(tǒng)中來檢查重組氧化還原酶活性的測(cè)定。為此，在pH4到11的范圍內(nèi)制備不同的緩沖液(50mM)，用來稀釋根據(jù)實(shí)施例4產(chǎn)生的氧化還原酶。在孵育30、60和120分鐘之后，在批次中取出10|ul并用于根據(jù)實(shí)施例1的活性測(cè)試。初始值是在磷酸鉀緩沖液50mMpH=7.0中稀釋(1:20)酶之后立即獲得的測(cè)量值。在給定的條件下，所述值相應(yīng)于約0.70/分鐘的消光改變(extinctionchange),并被設(shè)置為100%值，所有隨后測(cè)量的值與該值相關(guān)聯(lián)。在表6中，綜合了對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶，在持續(xù)120々鐘的孵育中酶展現(xiàn)了不低于初始活性的50%的pH范圍。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>7c,'產(chǎn)佳溫^為了確定最佳測(cè)試溫度，在15。C到70。C的溫度范圍內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量批次中測(cè)量根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的酶活性。測(cè)定的最佳溫度在表7中綜合表7<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>7丄-溫產(chǎn)璁定遂按照如實(shí)施例5c描述的類似的方式，在15。C到7(TC的范圍測(cè)定溫度穩(wěn)定性。維持，根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的稀釋物在每種情況下在相應(yīng)的溫度孵育60分鐘和180分鐘，隨后使用上述的測(cè)量批次在30。C測(cè)量。在表8中，綜合了對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶，在持續(xù)120分鐘的孵育中酶展現(xiàn)了不低于初始活性的50%的溫度范圍。表8DSMZNo.微生物pH范圍穩(wěn)定性70825粘質(zhì)紅酵母15-35°C3316粉狀畢赤酵母15-25。C70647Candidanemodendra15-35。C3651樹干畢赤酵母15-350C70391Pichiatrehalophila15-35°C5576肉色明串珠菌15-35。C20028微桿菌屬15-60。C43570深紅戈登氏菌15曙55。C7e,4參滲通過用許多酮類和醇類測(cè)試酶的氧還和還原活性，測(cè)定了根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的底物語。為此，用不同的引物使用根據(jù)實(shí)施例1的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量批次。對(duì)于所有的酶，對(duì)乙酰乙酸甲酯的活性被設(shè)置為100%,所有其他的底物與之相關(guān)聯(lián)。表9:底物i普還原底物粘質(zhì)紅酵母SEGIDNOl粉狀畢赤酵母SEQIDN02樹干畢赤酵母SE(3IDN03肉色明串珠菌SEGIDN04微桿菌屬SEQIDN05深紅戈登氏菌SEQIDN06l-苯基-2-丙酮66%10%30%13%80%82%苯曱酰曱基氯36%130%9%37%<2%70/0苯乙酮12%1950/。32%28%52%23%萘乙酮n.b.25%84%n.b.125%68%丙基笨基酮0%0%0%0%0%0%2-辛酮71%20%27%28%227%75%3-辛酮29%10%40%18%470/052%2-丁酮190%65%49%36%4%14%2-氧代戊酸乙酯4%85%60%25%<2%23%2-氧代-4-苯基丁酸乙酯4%35%16%10%<2%18%丙酮酸乙酯60%560%148%122%480%160%乙菘酸乙基笨基酯8%35%3%4%<2%11%4-氯乙酰乙酸乙酯79%70%100%80%110%110%乙酰乙酸曱酯100%100%100%100%100%100%3-氧代戊酸乙酯60%45%73%30%<2%56%丙酮82%55%100%28%<2%7%7/;哞的」體;t'/i通過在適合于相應(yīng)的氧化還原酶的水性緩沖液中稀釋實(shí)施例6中獲得的(來自重組表達(dá))溶胞產(chǎn)物(約10單位/ml緩沖液)，檢查了在水性/有機(jī)兩相系統(tǒng)中新的氧化還原酶的穩(wěn)定性。然后，與水不可混溶的相同體積的有機(jī)溶劑被添加到所述緩沖液中稀釋的氧化還原酶中，在恒定的整體混合(170rpm的熱混合器)下在室溫下孵育批次。在24h的孵育之后，從水相中各采集10用于在標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試批次(磷酸鉀緩沖液(KPP)100mM,pH=7.0，0.2mMNAD(P)H,10mM底物)中確定酶活性。同樣在這種情況中，在緩沖液中稀釋之后即刻的初始值:故設(shè)為100%,所有進(jìn)一步的值與之相關(guān)聯(lián)。表9:在水性/有機(jī)兩相系統(tǒng)中孵育24小時(shí)之后的酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>MTBE-甲基叔丁基醚表10:底物語氧化<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>^r滋辦s.'豫務(wù)^存化炎^7^《祐IJr發(fā)母^歲必還^^^^差-GS」-J-在差/j'^的合4對(duì)于預(yù)備性批次，25mL緩沖液(100mMTEA,pH=7,1mMZnCl2,10%甘油)、375mL4-曱基-2-戊醇、100mL甲基-3-氧戊酸、100mgNAD和37kU來自RhodotorulamucillaginosaDSMZ70825的重組氧化還原酶的混合物在室溫下恒定完全混合地孵育24h。在24h之后，所使用的97%的甲基-3-氧戊酸被還原成甲基-(3S)-3-羥基戊酸。隨后，含有產(chǎn)物的4-甲基-2-戊醇相從水相中分離、過濾，通過蒸餾獲得產(chǎn)物曱基-(3S)-3-羥基戊酸。按照這種方式，產(chǎn)物曱基-(3S)-3-羥基戊酸以高產(chǎn)量獲得，純度〉99%,對(duì)映體過量>99.5%。8b使用來自粉狀畢赤酵母的氧化還原酶的(2R)-1-氯丙烷-2-醇的合成為了轉(zhuǎn)化，80mL緩沖液(lOOmMTEA,pH=7,lmMMgCl2,10%甘油)、15ml2-丙醇、5ml氯丙酮、10mgNAD和2kU來自粉狀畢赤酵母DSMZ3316的重組氧化還原酶的混合物在室溫下恒定完全混合地孵育24h。24h之后，所使用的氯丙酮被完全還原成(2R)-l-氯丙烷-2-醇。隨后，用乙酸乙酯提取反應(yīng)化合物，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，獲得粗產(chǎn)物。按這種方式產(chǎn)生的(2R)-1-氯丙烷-2-醇具有〉99%的對(duì)映體過量。8c使用來自樹干畢赤酵母的氧化還原酶的(2R)-1-氯-1-2-醇的合成為了轉(zhuǎn)化，20mL緩沖液(100mM磷酸鉀，pH=8.5,lmMMgCl2，10%甘油)、溶解在80ml4-甲基-2-戊醇中的20g2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-l-酮、10mgNAD和2kU來自樹干畢赤酵母DSMZ3651的重組氧化還原酶的混合物在室溫下恒定完全混合地孵育24h。24h之后，所使用的超過99%的2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-l-酮被還原。隨后，含有產(chǎn)物的4-曱基-2-戊醇相從水相中分離，過濾，通過蒸餾獲得產(chǎn)物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-l-醇。按照這種方式，產(chǎn)物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-l-醇以高產(chǎn)量獲得，純度>98%,對(duì)映體過量>99.9%。曱基-2-戊醇相從水相中分離，過濾，通過蒸餾獲得產(chǎn)物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-l-醇。為了轉(zhuǎn)化，8mL緩沖液(100mMTEA,pH=7，1mMMgCl2)、24ml異丙醇、8ml4-氯乙酰乙酸乙酯、2mgNADP和6.7kU(=6ml)來自肉色明串珠菌DSMZ5576的重組氧化還原酶的混合物在室溫下恒定完全混合地孵育24h。24h之后，所使用的超過99%的4-氯乙酰乙酸乙酯被還原成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。通過使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器首先除去2-丙醇來重新處理反應(yīng)混合物。隨后，用乙酸乙酯提取反應(yīng)混合物，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，獲得粗產(chǎn)物。按這種方式產(chǎn)生的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯具有>99.5%的對(duì)映體過量。^^^《凝樸霧^^歲化還^凝W(^S,-/-AJ,5-二差J哀差/乙處-/-^的合成為了轉(zhuǎn)化，1mL緩沖液(100mMTEA,pH=7,10%甘油，1mMZnCl2)、3ml4-曱基-2-戊醇、1mll-[3,5-(三氟曱基)苯基]乙烷-l-酮、2mgNAD和0.7kU來自微桿菌屬DSMZ20028的重組氧化還原酶的混合物在室溫下恒定完全混合地孵育24h。在24h之后，所使用的超過90%的l-[3,5-(三氟曱基)苯基]乙烷-l-酮被還原成(IS)-1-[3,5-二(三氟曱基)苯基]乙烷-l-醇。隨后，含有產(chǎn)物的4-甲基-2-戊醇相從水相中分離，過濾、通過蒸餾獲得產(chǎn)物(IS)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙烷-l-醇。照這樣獲得的粗產(chǎn)物(IS)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙烷-1-醇展現(xiàn)了〉99.5%的對(duì)映體過量。權(quán)利要求1.用于通過對(duì)映體選擇性酶促還原將酮基化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的手性羥基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在輔因子的情況下用氧化還原酶還原，其特征在于使用具有氨基酸序列的氧化還原酶，在所述氨基酸序列中(a)至少70％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO6和SEQIDNO8之一的氨基酸，或(b)至少55％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO2的氨基酸，或(c)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO3的氨基酸，或(d)至少75％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO4的氨基酸，或(e)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO5的氨基酸，或(f)至少50％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO7的氨基酸，或(g)至少72％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO129的氨基酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述酮基化合物具有通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>R廣C(0)-R2(I)其中所述R1代表以下部分之一1)-(C廣C20)-烷基，其中所述烷基是直鏈或支鏈的，2)-(C2-C2Q)-烯基，其中所述烯基是直鏈或支鏈的，并任選含有最多達(dá)四個(gè)雙鍵，3)-(C2-C20)-炔基，其中所述炔基是直鏈或支鏈的，并任選含有最多達(dá)四個(gè)三鍵，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(Q-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基，6)-(C5-C14)-雜環(huán)，其是未取代的或被-OH、鹵素、-N02和/或-NH2取代一次、兩次或三次，或7)-(C3-C7)-環(huán)烷基，其中在1)到7)中的上述部分是未取代的或相互獨(dú)立地被-OH、卣素、-:^02和/或^&取代一次、兩次或三次，R2代表以下部分之一8)-(d-C6)-烷基，其中所述烷基是直鏈或支鏈的，9)-(C2-C6)-烯基，其中所述烯基是直鏈或支鏈的，并任選含有最多達(dá)三個(gè)雙鍵，10)-((:2-。6)-炔基，其中所述炔基是直鏈或支鏈的，并任選含有兩個(gè)三鍵，或11)-(C廣CQ)-烷基-C(O)-O-(C廣C6)-烷基，其中所述烷基是直鏈或支鏈的，并且是未取代的或被-oh、卣素、-:^〇2和/或-^^2取代一次、兩次或三次，其中在8)到11)中的上述部分是未取代的或相互獨(dú)立地被-oh、卣素、-:^02和/或^1"12取代一次、兩次或三次。3.用于通過對(duì)映體選擇性酶促還原將酮基化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的手性羥基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在輔因子的情況下用氧化還原酶還原，其特征在于使用的氧化還原酶(a)由選自SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:130的核酸序列編碼，或(b)由核酸序列編碼，該核酸序列的互補(bǔ)鏈在高度嚴(yán)格條件下與(a)中所述核酸序列之一雜交。4.用于根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的方法的氧化還原酶，其特征在于它具有氨基酸序列，在所述氨基酸序列中(a)至少70%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8之一的氨基酸，或(b)至少55%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸，或(c)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:3的氨基酸，或(d)至少75%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸，或(e)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:5的氨基酸，或(f)至少50%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:7的氨基酸5或(g)至少72%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:129的氨基酸。全文摘要本發(fā)明涉及用于通過對(duì)映體選擇性酶促還原將酮基化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的手性羥基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在輔因子的情況下用氧化還原酶還原，其特征在于使用具有氨基酸序列的氧化還原酶，在所述氨基酸序列中(a)至少70％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO6和SEQIDNO8之一的氨基酸，或(b)至少55％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO2的氨基酸，或(c)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO3的氨基酸，或(d)至少75％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO4的氨基酸，或(e)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO5的氨基酸，或(f)至少50％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO7的氨基酸，或(g)至少72％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO129的氨基酸。文檔編號(hào)C12N9/02GK101273137SQ200680035680公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2006年7月20日優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日發(fā)明者A·古普塔,A·特申謝,M·博布科瓦申請(qǐng)人:Iep有限責(zé)任公司