專利名稱：：丙酮酸氧化酶及其核苷酸序列、重組載體、重組宿主細(xì)胞和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種氧化酶，編碼該酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細(xì)胞，以及包括上述氧化酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細(xì)胞中的至少一種的試劑盒。更具體地，本發(fā)明涉及一種丙酮酸氧化酶，編碼該丙酮酸氧化酶的核香酸序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細(xì)胞，以及包括上述丙酮酸氧化酶、核普酸序列、重組載體和重組宿主細(xì)^;中的至少一種的試劑盒。
背景技術(shù)：
：丙酮酸氧化酶(Pyruvateoxidase,EC1.2.3.3)是一種用途廣泛的臨床診斷用酶制劑。它主要應(yīng)用于血液丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活力測(cè)定，還可以用于丙酮酸激酶活性測(cè)定等。因而可以制備成包括丙酮酸氧化酶的相應(yīng)試劑盒。例如，具體反應(yīng)原理可以如以下的式一和式二所示丙酮酸氧化酶丙酮酸鹽+Pi+02+H20-乙酰磷酸+C〇2+H202TPP、FAD,Mg2+(式一)過(guò)氧化物酶2H202+4-氨基安替比林+EHSPT-^醌亞胺染料+41120(式二)由以上反應(yīng)式可知，可以通過(guò)在550nm波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)醌亞胺染料的濃度變化來(lái)測(cè)定丙酮酸氧化酶的酶活。但是目前的試劑盒所用的丙酮酸氧化酶存在著耐熱性差的缺點(diǎn)，使試劑盒的運(yùn)輸、保存和使用過(guò)程對(duì)環(huán)境溫度要求較高，容易由于丙酮酸氧化酶的變性而影響到試劑盒測(cè)定的有效性和準(zhǔn)確性。例如，EP0257986A2^^開了一種丙酮酸氧化酶，其在最高達(dá)45。C的溫度下在pH為7.0時(shí)能保持10分鐘的穩(wěn)定性(參見該專利的圖2)。此外，目前的試劑盒所用的丙酮酸氧化酶只能在窄的pH值范圍內(nèi)保持較高的穩(wěn)定性和活性(參見專利EP0257986A2的圖1),大大局限了試劑盒能夠測(cè)定的被測(cè)標(biāo)本的范圍，對(duì)測(cè)定的pH條件要求較高，從而對(duì)使用試劑盒的人員的搡作技術(shù)水平要求也很高。本發(fā)明的一個(gè)目的是克服現(xiàn)有的丙酮酸氧化酶耐熱性差、僅能在窄的pH值范圍內(nèi)保持較高的穩(wěn)定性和活性的缺點(diǎn)，提供一種耐熱性好、能在寬的pH值范圍內(nèi)保持較高的穩(wěn)定性和活性，并且具有反復(fù)凍融后殘留酶活性高的丙酮酸氧化酶。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述丙酮酸氧化酶的核苷酸序列。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供包括所述核香酸序列的重組載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供包括所述重組載體的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供包括上述丙酮酸氧化酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細(xì)胞中的至少一種的試劑盒。本發(fā)明的發(fā)明人付出了大量地創(chuàng)造性勞動(dòng)，利用隨機(jī)突變的方法，從文獻(xiàn)["編碼植物乳桿菌中丙酮酸氧化酶的poxB基因的特征和功能分析(CharacterizationandFunctionalAnalysisofthepoxBGene，WhichEncodesPyruvateOxidaseinZ><2cto6ac///ws//awtorww)，，,Fr6d6riqueLorquet等人，纟田菌學(xué)雜志(JournalofBacteriology)，第186巻，第12期，第3749-3759頁(yè)，2004年6月]報(bào)道的植物乳桿菌(￡acto6ac///wsp/a"farwm)丙酮酸氧化酶序列得到本發(fā)明具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。并且本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，所得丙酮酸氧化酶、能在寬的pH值范圍內(nèi)保持較高的穩(wěn)定性，并且具有反復(fù)凍融后殘留酶活性高的丙酮酸氧化酶。本發(fā)明提供了一種丙酮酸氧化酶，其中，所述丙酮酸氧化酶的氨基酸序列為(1)SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，或者(2)對(duì)(1)所述的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸氧化酶的功能不變的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明所述丙酮酸氧化酶的核苷酸序列
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述核苷S臾序列的重組載體。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述重組載體的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所迷的丙酮酸氧化酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細(xì)"包中的至少一種的試劑盒。本發(fā)明提供的丙酮酸氧化酶具有如下優(yōu)點(diǎn)第一，耐熱性好。參見圖3可知，本發(fā)明的丙酮酸氧化酶在55。C下于pH6.0的緩沖液中靜置15分鐘后仍具有50%的相對(duì)活性，明顯高于在相同條件下的對(duì)比例1的丙酮酸氧化酶的相對(duì)活性(不到30%)。第二，在寬的pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定性很高。參見圖4可知，本發(fā)明的丙酮酸氧化酶在pH5.0-pH9.0的緩沖液中于25。C;汰置20小時(shí)后仍具有60%以上的相對(duì)活性，明顯高于在相同條件下的對(duì)比例1的丙酮酸氧化酶的相對(duì)活性(不到20%)。第三，反復(fù)凍融后殘留酶活性高。參見圖5可知，本發(fā)明的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在-20。C和室溫之間反復(fù)凍融5次的條件下反復(fù)凍融后殘留酶活性仍達(dá)90%,而在相同條件下對(duì)比例1的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶反復(fù)凍融后殘留酶活性僅為75%。圖1實(shí)施例1的poxB基因純化的瓊脂糖凝膠鑒定照片；圖2實(shí)施例1的poxB誘導(dǎo)表達(dá)與純化的SDS-PAGE鑒定照片；圖3實(shí)施例1和對(duì)比例1的丙酮酸氧化酶熱穩(wěn)定性對(duì)比圖；圖4實(shí)施例1和對(duì)比例1的丙酮酸氧化酶pH穩(wěn)定性對(duì)比圖；圖5實(shí)施例1和對(duì)比例1的丙酮酸氧化酶反復(fù)凍融后殘留酶活性對(duì)比圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種丙酮酸氧化酶，其中，所述丙酮酸氧化酶的氨基酸序列為(1)SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，或者(2)對(duì)(1)所述的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸氧化酶的功能不變的氨基酸序列。本領(lǐng)域人員公知，組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸殘基，按照側(cè)鏈極性可以分成四類1、非極性的氨基酸丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、曱硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro);2、極性不帶電荷的氨基酸甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gin)和酪氨酸(Tyr);3、帶正電荷的氨基酸精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His);4、帶負(fù)電荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(參見"生物化學(xué)"(第二版)上冊(cè)，沈同、王鏡巖，第82-83頁(yè)，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白質(zhì)中如果發(fā)生同屬一個(gè)類別的氨基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile,所述殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中所起的作用(比如提供正電荷或形成疏水嚢袋結(jié)構(gòu)的作用)沒(méi)有改變，因此對(duì)蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)并不會(huì)產(chǎn)生影響，因此仍然可以實(shí)現(xiàn)蛋白的功能。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和Pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly,兩兩之間相互取代，不會(huì)影響蛋白的立體結(jié)構(gòu)和功能。所述同屬一個(gè)類別的氨基酸殘基取代可以發(fā)生在丙酮酸氧化酶上的任意一個(gè)氨基酸殘基位置上。相反，不同類別的氨基酸殘基發(fā)生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列舉的取代規(guī)律，很可能會(huì)使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，功能出現(xiàn)差異。本發(fā)明提供的丙酮酸氧化酶還可以進(jìn)行修飾或突變，得到衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述"衍生的蛋白質(zhì)"指與具有上述氨基S吏序列的丙酮酸氧化酶存在氨基酸序列上的差異，或者有不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。所述誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如輻射或誘變劑等產(chǎn)生的隨機(jī)突變，也可以通過(guò)如定點(diǎn)突變法或其他己知分子生物學(xué)的技術(shù)獲得。所述"衍生的蛋白質(zhì)"還包括具有天然L型氨基酸的殘基的類似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如卩-氨基酸、Y-氨基酸等)的類似物。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的蛋白的化學(xué)衍生形式，如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的蛋白。這種修飾可以通過(guò)將蛋白暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。優(yōu)選情況下，所述丙酮酸氧化酶的氨基酸序列為SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明所述丙酮酸氧化酶的核苷酸序列。本領(lǐng)域7>知，組成蛋白質(zhì)的20種不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種氨基酸分別由2-6個(gè)密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國(guó)，第二版，1989,見950頁(yè)附錄D)。即由于遺傳密碼子的筒并性，決定一個(gè)氨基酸的密碼子大多不止一個(gè)，三聯(lián)體密碼子中第三個(gè)核苷酸的置換，往往不會(huì)改變氨基酸的組成，因此編碼相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本領(lǐng)域人員根據(jù)公知的密碼子表，從本發(fā)明公開的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的丙酮酸氧化酶活性不變的氨基酸序列，完全可以推導(dǎo)出能夠編碼它們的基因的核香酸序列，通過(guò)生物學(xué)方法(如PCR方法、突變方法)或化學(xué)合成方法得到所述核苷酸序列，因此該部分核芬酸序列都應(yīng)該包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。相反，利用本文公開的DNA序列，也可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國(guó)，第二版，1989)進(jìn)行，通過(guò)修改本發(fā)明提供的核酸序列，得到與本發(fā)明所述丙酮酸酶活性一致的氨基酸序列。優(yōu)選情況下，本發(fā)明所述核苷酸序列為(1)SEQIDNO:2所示的核苦酸序列；或者(2)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；或者(3)對(duì)SEQIDNO:2或者SEQIDNO:3所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苦酸序列，該核苷酸序列編碼的丙酮酸氧化酶功能不變。所述核普酸序列更優(yōu)選為SEQIDNO:2或者SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。所述核苷酸序列最優(yōu)選為SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)最終確定的SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，由于可能更符合例如大腸桿菌的基因工程菌的密碼子偏好性，因而更有利于基因工程菌表達(dá)蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明提供的核苷酸序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法、或人工合成的方法獲得。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所提供的核苷酸序列和重組工程菌，可以很容易獲得模板和引物，利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增獲得有關(guān)序列。序列較長(zhǎng)時(shí)，可以進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后將所得片段按正確次序拼接。一旦獲得了有關(guān)核苷S吏序列，就可以用重組法大批量的獲得有關(guān)氨基酸序列。通常將所得核苷酸序列克隆入載體，再轉(zhuǎn)入基因工程菌中，然后通過(guò)常規(guī)的方法從增殖后的宿主細(xì)胞分離得到有關(guān)核苷酸序列。此外，還可用公知的人工化學(xué)合成的方法來(lái)合成有關(guān)核苷酸序列。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述核苷酸序列的重組載體。本領(lǐng)域公知，所述重組載體一般包括空載體和插入該空載體的目的基因，所述目的基因?yàn)楸景l(fā)明所述的丙酮酸氧化酶的核苦酸序列。在本發(fā)明中，所述"空載體"(或稱"載體")可選用本領(lǐng)域己知的各種載體，如市售的各種質(zhì)粒、粘粒、噬菌體及反轉(zhuǎn)錄病毒等，本發(fā)明優(yōu)選pET28a(+)質(zhì)粒、pET30a(+)或pET32a(+)。所述空載體可以包括多種常用的檢測(cè)標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記、抗生素標(biāo)記等報(bào)告基因)和酶切位點(diǎn)。重組載體構(gòu)建可采用空載體本身多克隆位點(diǎn)的各種核酸內(nèi)切酶(如對(duì)于pUC18,可用SalI、BamHI、EcoRI等,對(duì)于pET28a，可用Ndel、Xhol、Nhel、EcoRI、BamH、HindIII等，對(duì)于pET28b可用EcoRI、Ndel、BamH、HindIII等)進(jìn)行酶切獲得線性質(zhì)粒，與采用相同核酸內(nèi)切酶切割的基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒。優(yōu)選所述重組載體為pET28a-poxB、pET30a-poxB或pET32a-poxB。本發(fā)明優(yōu)選采用Ndel和Xhol雙酶切pET28a及與其連接的PCR產(chǎn)物片,殳，經(jīng)連接酶連接，構(gòu)建本發(fā)明的重組載體pET2Sa-poxB。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述重組載體的重組宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的方法將所述重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，如氯化鈣法化學(xué)轉(zhuǎn)化、高壓電擊轉(zhuǎn)化，優(yōu)選電擊轉(zhuǎn)化；所述宿主細(xì)胞可以為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，優(yōu)選為大腸桿菌、枯草桿菌、酵母(如畢赤酵母)或各種動(dòng)植物細(xì)胞，更優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域常用的基因工程菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或畢赤酵母。最優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌bl21(de3)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域常用的方法從重組宿主細(xì)胞中分離和純化丙酮酸氧化酶。例如，離心分離培養(yǎng)基和重組宿主細(xì)胞，高壓勻漿破碎細(xì)胞、離心過(guò)濾去除細(xì)胞碎片，親和層析純化丙酮酸氧化酶。對(duì)于分離純化所得的丙酮酸氧化酶的產(chǎn)物，可以使用本領(lǐng)域常用的方法進(jìn)行純度鑒定。例如，考馬斯亮藍(lán)法、凱氏定氮法、雙縮脲法、lowry法、紫外吸收法、親和層析、酶活性、抗原抗體法、電泳分析(例如十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)、沉降分析、擴(kuò)散分析、恒溶度法、蛋白質(zhì)譜等。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述的丙酮酸氧化酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細(xì)胞中的至少一種的試劑盒。優(yōu)選情況下，本發(fā)明的試劑盒包括丙酮酸氧化酶，而不包括核普酸序列、重組載體和重組宿主細(xì)胞。更優(yōu)選本發(fā)明的試劑盒包括丙酮酸氧化酶的干粉，而不包括核苷酸序列、重組載體和重組宿主細(xì)胞?？梢杂帽绢I(lǐng)域常用的方法制備丙酮酸氧化酶的干粉，只要該方法能夠得到丙酮酸氧化酶的千粉，并且不破壞丙酮酸氧化酶的干粉的活性即可。例如使用真空減壓濃縮器得到濃縮的酶液，然后使用冷凍干燥機(jī)干燥濃縮的酶液；或者使用真空減壓干燥器等設(shè)備。由于本發(fā)明的丙酮酸氧化酶耐熱性好，還可以使用噴霧干燥的技術(shù)得到該酶的干粉。丙酮酸脫氯酶的干粉在使用時(shí)可以通過(guò)溶解于pH5.0-8.0的緩沖液體系(例如醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選pH為5.5-7.0)中而轉(zhuǎn)化為液體形式。本發(fā)明的試劑盒還可以包括本領(lǐng)域常用于測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的試劑盒的成分。對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的試劑盒中的丙酮酸氧化酶可以是液體形式或固體千粉形式，本發(fā)明的試劑盒中的其他成分也可以是液體形式和/或固體干粉形式。例如，當(dāng)本發(fā)明的試劑盒為液體形式時(shí)，一般可以含有0.01-0.5mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液、1000-10000U/L的丙酮酸氧化酶、1000-1OOOOU/L的過(guò)氧化物酶、500-5000U/L的抗壞血酸氧化酶、100-1000mmol/L的L-丙氨酸、5-50mmol/L的a-酮戊二酸、5-50|amol/L的亞鐵氰化鉀、5-50nmol/L的黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)、5-50mmol/L的焦磷酸硫胺素(tpp)和5-50mmol/l的N-乙醛-N-3-曱基苯胺(EHSPT)。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選含有0.05-0.2mol/LpH7.4的磷酸鹽緩沖液、3000-5000U/L的丙酮酸氧化酶、3000-5000U/L的過(guò)氧化物酶、1000-3000U/L的抗壞血酸氧化酶、300-500mmol/L的L-丙氨酸、10-30mmol/L的a-酮戊二酸、15-30|amol/L的亞鐵氰化鉀、10-30|amol/L的FAD、15-45mol/L的TPP和10-45jumol/L的EHSPT。本發(fā)明液體形式的試劑盒組分可以通過(guò)冷凍干燥技術(shù)，結(jié)合減壓蒸餾技術(shù)、反滲透技術(shù)及超濾技術(shù)等，制備成試劑干粉。所述干粉可以在檢測(cè)待測(cè)標(biāo)本前用選自去離子水、蒸餾水和雙蒸水的溶劑復(fù)溶至所述試劑的原有體積。本發(fā)明的試劑盒可以包括記載有上述各種組分使用方法和用量的說(shuō)明書。因此，所述溶液也可以由使用者在使用前按照試劑盒說(shuō)明書的記載根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)配制即可。態(tài)下以及病理狀態(tài)下的血液自然凝固后析出的血清。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，除非特別說(shuō)明本發(fā)明所用到的試劑、培養(yǎng)基均為市售商品。制備實(shí)施例1(1)現(xiàn)有丙酮酸氧化酶poxB基因的合成按照文獻(xiàn)["編碼植物乳桿菌中丙酮酸氧化酶的poxB基因的特征和功能分析(CharacterizationandFunctionalAnalysisofthepoxBGene,WhichEncodesPyruvateOxidaseinZ^cto6ac///usp/awton^m)，，，F(xiàn)r6d6riqueLorquet等人,纟田菌學(xué)雜志(JournalofBacteriology),第186巻，第12期，第3749-3759頁(yè)，2004年6月]報(bào)道的植物乳桿菌Uactok^7/wsp/朋toraw)丙酮酸氧化酶序列，委托捷瑞生物工程(上海)有限公司利用DNA合成儀合成DNA片段，然后用DNA連接技術(shù)連接所得的DNA片段，最后將所得DNA片段用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的310型全自動(dòng)DNA測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示所得DNA片段中含有長(zhǎng)度為1812bp(起始于起始密碼子atg并終止于終止密碼子taa)的蛋白編碼基因與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致的，為SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。(2)目的基因的荻得本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計(jì)了正向引物CGTCATATGGTTATGAAACAAACAAAAC,其上附加有Ndel酶切位點(diǎn)；反向引物ATTCTCGAGTTAAAACCCACCCTGTCC,其上附加有Xhol酶切位點(diǎn)。以上述步驟(1)得到的現(xiàn)有丙酮酸氧化酶poxB基因DNA為模板，按照如下條件擴(kuò)增丙酮酸氧化酶基因易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的混合物包括正向引物(lOpM):2(il;反向引物(10pM):2pl;dNTPs(2.5mM,寶生物(Takara)/>司產(chǎn)品)4^1;10XPCR緩沖液(不含Mg2+,Takara公司產(chǎn)品)lO)il;TaqDNA聚合酶(5U/|il,Takara公司產(chǎn)品)5^1;才莫板DNA:0.5^1;10XMgCl2(30mM):5pl;10XMnCl2(3mM):5pl;加滅菌去離子水至50(il。在94。C保持2.5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94°C，0.5min;50°C,0.5min;72°C,2min);退火溫度為72。C,延伸時(shí)間7min，得到基因擴(kuò)增產(chǎn)物。將得到的擴(kuò)增基因片段用瓊脂糖凝膠電泳回收純化出1.8-1.9kb單一條帶的DNA片段(如圖1所示)。將所得DNA片l殳用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的310型全自動(dòng)DNA測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示所得DNA片段中含有長(zhǎng)度為1812bp(起始于起始密碼子atg并終止于終止密碼子taa)的蛋白編碼基因，詳細(xì)序列如SEQIDNO:2所示。(3)構(gòu)建重組載體用限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol酶切(2)得到的蛋白編碼基因，酶切所得大片段通過(guò)使用T4DNA連接酶，連接至同樣已經(jīng)用限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol酶切過(guò)的空載體pET28a(+)上。將包括重組載體的連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，然后所得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有50jug/mL的卡那霉素LB瓊脂平板上，在37。C培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑選10個(gè)克隆接種到含有50ng/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶AWeI和Xhol進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。結(jié)果測(cè)到大小約為1.8Kb片段的酶切片段的相應(yīng)重組質(zhì)粒為陽(yáng)性克隆，即證明獲得了重組表達(dá)載體pET28a-poxB。培養(yǎng)所述陽(yáng)性克隆，提取重組表達(dá)載體pET28a-poxB。所述重組表達(dá)載體pET28a-poxB在pH為7.0的50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中保存。(4)重組載體對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及所得重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)挑取在LB固體培養(yǎng)基上37。C培養(yǎng)16小時(shí)的大腸桿菌BL21(DE3)的單菌落，于液體LB培養(yǎng)基中在37°C、150rpm的搖床再培養(yǎng)16小時(shí)。取1ml所得液體培養(yǎng)物轉(zhuǎn)4矣于100ml新鮮液體LB培養(yǎng)基中，在37。C搖床上以250-300rpm的轉(zhuǎn)速劇烈振蕩培養(yǎng)2.5小時(shí)。吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘后，在4。C、3000g下離心5分鐘。棄去上清，加入lOOiil在冰上預(yù)冷的O.lmol/L的CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，重懸細(xì)胞，在水放置20分鐘。然后在4。C、3000g下離心5分鐘，棄去上清，加入100pl在水上預(yù)冷的O.lmol/L的CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，重懸細(xì)胞，得到感受態(tài)的宿主細(xì)胞。取200jil上述感受態(tài)的大腸桿菌BL21(DE3)置于1.5ml離心管中，加入體積為lOjil的pET28a-poxB溶液(其中pET28a-poxB含量為40ng)輕輕搖勻，冰上;j丈置30分鐘。然后在42。C水浴中熱擊90秒，接著迅速置于冰上冷卻5分鐘。向離心管中加入lmlLB液體培養(yǎng)基(不含卡那霉素)，混勻后37。C振蕩培養(yǎng)l小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的卡那霉素抗生素抗性基因(KaW)。將上述菌液搖勻后取lOOpl涂布于含Kan的LB篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37。C培養(yǎng)20小時(shí)。在篩選平板上出現(xiàn)了大腸桿菌的菌落，即pET28a-poxB已經(jīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，得到了本實(shí)施例的重組宿主細(xì)胞——大腸4干菌BL21(DE3)畫pET28a-poxB。配制3LLB培養(yǎng)基加入到5L發(fā)酵罐中，在121。C滅菌15分鐘，完全冷卻至室溫后加入卡那霉素，使其終濃度為50ug/mL。在所得培養(yǎng)基中加入60mL生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述大腸桿菌BL21(DE3)-pET28a-poxB(106細(xì)胞/毫升)。在37。C下培養(yǎng)至發(fā)酵液取樣中的細(xì)胞密度達(dá)到107纟田胞/毫升。然后加入lmmol/L的異丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG),誘導(dǎo)8小時(shí)后發(fā)酵完畢。(5)蛋白產(chǎn)物的分離提純將(4)得到的發(fā)酵液在7000rpm下離心20min，收集重組宿主細(xì)胞沉淀。棄去上清，將所得重組宿主細(xì)胞重懸于等體積的pH為7.5的50mmol/L的Tris-HCl溶液中。用高壓勻漿機(jī)破碎重懸的細(xì)胞，在12000rpm下離心20min,收集上清粗酶液，棄取細(xì)胞碎片沉淀。將上述所得粗酶液用孔徑為0.22(am濾膜過(guò)濾后，所得濾液在美國(guó)通用電子公司(GE公司)的安克塔純化者(AKTAPurifier)鎳親和層析柱上進(jìn)行親和層析。其中，上樣緩沖液為50mmol/L的pH為7.0的磷酸鉀緩沖液。在流過(guò)兩個(gè)柱體積的上樣緩沖液后，使用洗脫緩沖液，其為含有0.5mol/L咪唑的50mmol/L的pH為7.0的磷酸鉀緩沖液。當(dāng)咪唑濃度逸0.3mol/L時(shí)開始收集蛋白，收集實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)到的蛋白單峰結(jié)束。向收集到的蛋白溶液中加入40%(W/V)硫酸銨沉淀，然后在10000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘。收集蛋白沉淀，并用O.lmol/L的pH為7.0的磷酸鉀緩沖液復(fù)溶。所得溶液用孔徑為0.22pm的濾膜過(guò)濾后，所得濾液再用葡聚糖凝膠G-25層析柱(SephadexG-25)脫鹽。所述脫鹽緩沖液是O.lmol/L的pH為7.0的磷酸鉀緩沖液。在用脫鹽緩沖液平衡好的層析柱上上樣，其中樣品溶液(即上述用O.lmol/L的pH為7.0的磷酸鉀緩沖液復(fù)溶的蛋白溶液)的流速為5ml/min,然后用脫鹽IC沖液以5ml/min的流速洗脫1.5個(gè)柱體積。收集洗脫下的液體共300毫升。所收集的液體在普通水箱中-l(TC下冷凍2小時(shí)，然后再-4(TC深冷冰箱預(yù)凍8小時(shí)，在德國(guó)科瑞斯特(CHRIST)的ALpHAl-4LSC型冷凍千燥機(jī)中，以真空度0.04mbar、安全壓力0.100mbar且冷阱溫度-60。C的條件凍干10小時(shí)。然后等物料溫度與凍千機(jī)隔板溫度差為零，并且觀察在15秒內(nèi)壓力指示不變時(shí)，結(jié)束凍干。凍干所得蛋白質(zhì)的量為10.5克。凍干蛋白在常溫干燥器中密封保存。采用《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Sambrook等，科學(xué)出版社(第三版)，2002,見1039-1044頁(yè))記載的SDS-PAGE電泳的方法測(cè)定出本實(shí)施例的蛋白質(zhì)的分子量約為66.2KD，測(cè)試結(jié)果如圖2所示。并且根據(jù)"通過(guò)蛋白質(zhì)膠內(nèi)消化作用后的快速技術(shù)完全測(cè)序GABAA受體(33亞基(Completes叫uencingofGABAAreceptorsubimitbeta3byarapidtechniquefollowingin-geldigestionoftheprotein).KangSU,LubecG.電'泳(Electrophoresis).2009Jun;30(12):2159-67，，記載的納米-電噴霧離子化源液相色語(yǔ)-質(zhì)譜聯(lián)用(nano-ESI-LC-MS/MS)方法，測(cè)得本實(shí)施例的蛋白質(zhì)有603個(gè)氨基酸殘基(參見SEQIDNO:1所示的氨基酸序列)，與SEQIDNO:2所示的核苦酸序列編碼結(jié)果一致。其中，SEQIDNO:1所示的氨基酸序列與SEQIDNO:4所示的氨基S臾序列區(qū)別在于SEQIDNO:4第247位上的Met被Thr取代，第301位上的Tyr被lie取代，第561位上的Val被Ala取代。(6)酶活的測(cè)定按照如下方法測(cè)定酶活A(yù))測(cè)定試劑a.丙酮酸鹽溶液0.3M[378mg的丙酮酸鉀鹽(MW=126.15)/10ml的水]b.磷酸鉀緩沖液，pH5.9:0.15M。c.4-氨基安替比林溶液0.15。/。(150mg的4-氨基安替比林/100ml的水)d.EHSPT(TOOS)溶液0.3%[300mg的EHSPT(N-乙基響N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-甲苯胺)/100ml的水]e.TPP溶液3mM[13.8mg的TPP(硫胺素焦磷酸酉旨)(MW=460.77)/10ml的水]f.FAD溶液0.15mM[1.3mg的FAD二鈉鹽(MW=865.55)A0ml的水]g.EDTA溶液15mM[590mg的EDTA二鈉鹽(MW=394.22)A00ml的水]h.MgS04溶液0.15M[3.4g的MgS047H2O(246.48)/100ml的水〗i.過(guò)氧化物酶溶液50U/ml[45mg的過(guò)氧化物酶(110紅掊酚單位)/100ml的水]j.酶稀釋劑50mM磷酸鉀緩沖液，pH5.7B)操作過(guò)程i)在棕色瓶中于冰上制備下列工作液1OmlK磷酸鹽緩沖液，pH5.9(b)2ml4-氨基安替比林溶液(c)2mlEHSPT溶液(d)2mlTPP溶液(e)2mlFAD溶液(f)2mlEDTA溶液(g)2mlMgS04溶液(h)3ml過(guò)氧化物酶(i)測(cè)試混合物中各成分的濃度丙酮酸鹽48mM10mlK磷酸鹽緩沖液,pH5.9(b)50mM2ml4-氨基安替比林溶液(c)0.48mM2mlEHSPT溶液(d)0.58mM2mlTPP溶液(e)0.19mM2mlFAD溶液(f)0.01mM2mlEDTA溶液(g)0.97mM2mlMgS04溶液(h)9.7mM3ml過(guò)氧化物酶(i)ca.4.8U/mlii)將酶制品溶解在冰冷的酶稀釋劑(j)中，稀釋至0.5U/ml并貯存在冰上。iii)吸量管吸耳又2.5ml的上述i)的工作液至比色皿(d=l.Ocm)中，加入0.5ml的丙酮酸溶液(a)，并在37。C下平衡5分鐘。iv)加入O.lml的上述酶溶液，并溫和倒轉(zhuǎn)混合。v)在37。C恒溫的分光光度計(jì)(島津UV-2450分光光度計(jì))中，記錄在550nm下，相對(duì)于水的光密度(OD)4分鐘的增長(zhǎng)，并由曲線的起始線性部分計(jì)算每分鐘△OD(厶OD試樣)。同時(shí)通過(guò)與測(cè)試試樣同樣的方法測(cè)量空白速度(AOD空白)，除了僅加入酶稀釋劑而不是加入酶溶液。C)酶活計(jì)算公式/士*口鵬、-,TT/'、AOD/min(AOD標(biāo)本-AOD空白)xVtxdfAr^^.,〈c^體積酉每活(U/ml)=-=AQD/rrunx1.68xdf36.88x1/2x1.0xVs重量酶活(U/mg)=(U/mL)xl/C其中，Vt:總體積(3.10mL)Vs:酶液樣品體積(0.10mL)36.88:在測(cè)定條件下醌亞胺染料的摩爾吸光系數(shù)(cm2/mmoL)1/2:系數(shù)基于一摩爾11202產(chǎn)生半摩爾的醌亞胺染料1.0:光徑長(zhǎng)度(cm)df:稀釋倍數(shù)C:溶液中酶濃度(cmg/ml)D)測(cè)試結(jié)果見下表1。種新的丙酮酸氧化酶，其分子量約為66.2KD,具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列以及SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)閱讀本實(shí)施例，可以知曉本發(fā)明的核苷酸序列例如SEQIDNO:2,并可以通過(guò)化學(xué)合成方法得到所述核苷酸序列，因此可以在得到具有該核香酸序列的核酸后，無(wú)需實(shí)施本實(shí)施例第(l)-(2)步，而是直接從本實(shí)施例第(3)步開始重復(fù)本實(shí)施例。制備實(shí)施例2按照SEQIDNO:3所示序列進(jìn)行全基因合成，得到SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的同義突變核苷酸序列。然后將得到的核苷酸序列按照制備實(shí)施例1的方法連接到pET28a(+)空載體上，也轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中。在相同條件下培養(yǎng)所得重組宿主細(xì)胞，結(jié)果本實(shí)施例的丙酮酸氧化酶產(chǎn)量比實(shí)施例1的提高了149.7%。制備實(shí)施例3將SEQIDNO:2所示的核苷酸序列按照制備實(shí)施例1的方法連接到pET32a(+)空載體上，也轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中。在相同條件下培養(yǎng)所得重組宿主細(xì)胞，結(jié)果得到的丙酮酸氧化酶，其Km值為5.4xl(T4mol/L，其丙酮酸氧化酶的產(chǎn)量與制備實(shí)施例1基本持平。制備實(shí)施例4將SEQIDNO:3按照制備實(shí)施例1的方法連接到pET28a(+)空載體上，轉(zhuǎn)化入宿主菌大腸桿菌RosettaTM中。在相同條件下培養(yǎng)所得重組宿主細(xì)胞，結(jié)果得到的丙酮酸氧化酶，其Km值為5.2xI0'4mol/L,其丙酮酸氧化酶的產(chǎn)量比制備實(shí)施例l提高了101.7%。對(duì)比例1本對(duì)比例為東洋紡公司(TOYOBO)生產(chǎn)的兔肌來(lái)源的丙酮酸氧化酶，其分子量為237KD,對(duì)丙酮酸的Km為7.0xl(y2mol/L,最適pH值7.0,最適溫度40°C。測(cè)試實(shí)施例1按照制備實(shí)施例1記載的方法測(cè)試制備實(shí)施例2-4和對(duì)比例1的丙酮酸氧化酶活性表1<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由以上結(jié)果可知，制備實(shí)施例l-4所制備的丙酮酸氧化酶其酶活力與對(duì)比例1相比在同一數(shù)量級(jí)上，完全能夠滿足臨床上測(cè)定待測(cè)標(biāo)本中鉀離子濃度的試劑盒的對(duì)丙酮酸氧化酶的要求。測(cè)試實(shí)施例2按照如下方法測(cè)試制備實(shí)施例1-4和對(duì)比例1的丙酮酸氧化酶的熱穩(wěn)定性將5U的丙酮酸氧化酶干粉溶于pH值為6.0的50mmol/L磷酸鉀緩沖液lml中，分別在20.0°C、23.8°C、28.1°C、32.9°C、37.6°C、42.4°C、47.1°C、51.9°C、56.2。C和6CTC下，靜置15分鐘后，按照測(cè)試實(shí)施例1的方法測(cè)定酶活。制備實(shí)施例1(制備實(shí)施例2-4編碼的得到的氨基酸序列與制備實(shí)施例1相同)的熱穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果和對(duì)比例1的熱穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果如圖3所示。通過(guò)比較，制備實(shí)施例2-4的熱穩(wěn)定性(圖中未示出)測(cè)試結(jié)果與制備實(shí)施例1的基本相同。從圖中可以看出，制備實(shí)施例1-4的熱穩(wěn)定性明顯大于對(duì)比例1。測(cè)試實(shí)施例3按照如下方法測(cè)試實(shí)施例l-4和對(duì)比例1的丙酮酸氧化酶的pH穩(wěn)定性將0.5U的丙酮酸氧化酶在25。C下，分別溶于pH值為4.0、5.0、5.7、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的5Ommol/L緩沖液lml中(pH穩(wěn)定性測(cè)定緩沖液的梯度設(shè)定為HAc緩沖液pH4.0、pH5.0、pH6.0;磷酸鉀緩沖液pH5.7、pH6.0、pH7.0、pH8.0;Tris緩沖液:pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0),靜置20小時(shí)。所述靜置在PCR儀中進(jìn)行，用奧林帕斯全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定酶活，按殘存酶活與最大殘存酶活的比值百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，pH值為橫坐標(biāo)繪制曲線。制備實(shí)施例1(制備實(shí)施例2-4編碼的得到的氨基酸序列與制備實(shí)施例1相同)的pH穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果如圖4所示，對(duì)比例1的pH穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果如圖4所示。通過(guò)比較，制備實(shí)施例2-4的pH穩(wěn)定性(圖中未示出)測(cè)試結(jié)果與制備實(shí)施例1的基本相同。從圖中可以看出，制備實(shí)施例1-4的pH穩(wěn)定性顯著好于對(duì)比例1，這樣一來(lái)包括本發(fā)明的丙酮酸氧化酶的試劑盒能夠測(cè)定的待測(cè)樣本的種類比現(xiàn)有技術(shù)更多，對(duì)試劑盒的運(yùn)輸、保存的條件降低，對(duì)使用試劑盒的人員的操作精密精細(xì)要求降低，有利于帶有丙酮酸氧化酶的試劑盒的普及。測(cè)試實(shí)施例4將制備實(shí)施例l-4和對(duì)比例1的酶分別用pH6.0磷酸鉀緩沖液(含10mMMgS04、lOpmFAD、0.2mMTPP)稀釋成lmg/ml，于-20。C冷凍，再在室溫融化，反復(fù)5次，分別測(cè)定酶活。以第一次冷凍前的酶活為100%,凍融后的殘余酶活與冷凍前酶活的百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，凍融次數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。制備實(shí)施例1(制備實(shí)施例2-4編碼的得到的氨基酸序列與制備實(shí)施例1相同)的反復(fù)凍融測(cè)試結(jié)果如圖5所示，對(duì)比例1的反復(fù)凍融測(cè)試結(jié)果如圖5所示。通過(guò)比較，制備實(shí)施例2-4的反復(fù)凍融(圖中未示出)測(cè)試結(jié)果與制備實(shí)施例1的基本相同。從圖5中可以看出，制備實(shí)施例l-4所指丙酮酸氧化酶的反復(fù)凍融穩(wěn)定性顯著大于對(duì)比例1,反復(fù)凍融5次的條件下制備實(shí)施例1殘留酶活性仍達(dá)卯％，而在相同條件下對(duì)比例1殘留酶活性僅為75%。制備實(shí)施例5-8按照表2的配方配制試劑表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>制備實(shí)施例5和6的試劑配制成液體形式即可使用。制備實(shí)施例7和8的試劑分別在如下條件下冷凍干燥在普通冰箱中-l(TC下冷凍2小時(shí)，然后再-40。C深冷冰箱預(yù)凍8小時(shí)，在德國(guó)科瑞斯特(CHRIST)的ALpHAl-4LSC型冷凍干燥機(jī)中，以真空度0.04mbar、安全壓力0.100mbar且冷阱溫度-60。C的條件凍千10小時(shí)。然后等物料溫度與凍干機(jī)隔板溫度差為零，并且觀察在15秒內(nèi)壓力指示不變時(shí)，結(jié)束凍干。凍干得到的試劑干粉可以在使用前用蒸餾水復(fù)溶成原液體形式的體積。凍干得到的試劑干粉，比液體形式的試劑保存的時(shí)間更長(zhǎng)，包裝要求較低，并且體積更小，運(yùn)輸更容易。制備實(shí)施例5-8中所用的丙酮酸氧化酶分別為制備實(shí)施例1-4中獲得的丙酮酸氧化酶。對(duì)比例2按照與制備實(shí)施例5相同的配方配制成液體形式的試劑盒。測(cè)試實(shí)施例5本測(cè)試實(shí)施例測(cè)量了兩個(gè)待測(cè)標(biāo)本第一個(gè)為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶質(zhì)控品(羅氏公司產(chǎn)品，批號(hào)17006501,靶值為46.6U/L);另一個(gè)為健康狀況良好的30歲男性的血清待測(cè)標(biāo)本(乙肝表面抗體陽(yáng)性，乙肝五項(xiàng)其他4項(xiàng)均為陰性)。抽取其10ml血液，靜置至血細(xì)胞沉淀分層，取上層血清5ml用于對(duì)制備實(shí)施例5-8和對(duì)比例2的試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)。在96孔酶標(biāo)板上，Al孔為標(biāo)準(zhǔn)液，A2-H12孔為樣品孔。在A1孔內(nèi)加校準(zhǔn)血清(羅氏公司產(chǎn)品，批號(hào)17006501)20m1;a2—h12孔內(nèi)分別加受檢血清20(il，然后各孔加入制備實(shí)施例5-9中任——種酶反應(yīng)試劑200pl;混勻，置37。C放置10分鐘，用酶標(biāo)儀測(cè)定l次550nm處的吸光度，計(jì)為Al,3分鐘后再測(cè)一次吸光值，計(jì)為A2。用以下公式計(jì)算血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性血清ALT活性(U/L)-^HI^fl"X校準(zhǔn)血清(U/L)測(cè)試結(jié)果見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>由表3可以看出，制備實(shí)施例5-8的試劑盒測(cè)試結(jié)果比對(duì)比例2更接近真實(shí)值；并且制備實(shí)施例5-8的試劑盒測(cè)試結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯小于對(duì)比例2,說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒性能更穩(wěn)定，測(cè)量更準(zhǔn)確。測(cè)試實(shí)施例6本測(cè)試實(shí)施例將實(shí)施例5-8的試劑盒和對(duì)比例2試劑盒置于42。C下進(jìn)行3天的加速的實(shí)驗(yàn)，在第0天、1天、2天和3天，按測(cè)試實(shí)施例5所述方法測(cè)量了丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶質(zhì)控品(羅氏公司產(chǎn)品，批號(hào)17006501，靶值為46.6U/L)。測(cè)試結(jié)果見表4。表4力口速條件測(cè)試時(shí)間制備實(shí)施例6制備實(shí)施例7制備實(shí)施例8制備實(shí)施例9對(duì)比例2質(zhì)控品42。C加速(n=10)0天46.7±0.6946.7±0.6246.6±0.7946.8±0.5046.7±0.871天46.3±0.6546.6±0.8746.5±0.6546.4±0.5746.3±0.782天46.0±0.6746.1±0.6946.4±0.7946.2±0.5435.7±0.953天36.1±0.7836.7±0.6236.2±0.4935.8±0.5015.2±0.81由表4可以看出，制備實(shí)施例5-8的試劑盒測(cè)試結(jié)果比對(duì)比例2的試劑盒更能耐受42。C惡劣環(huán)境實(shí)施例5-8的試劑盒能夠耐受42。C加速兩天，而對(duì)比例2僅能耐受1天。<110〉北京利德曼生化股份有限公司<120>丙酮酸氧化酶及其核苷酸序列、重組載體、重組宿主細(xì)胞和試劑盒<130〉0ICN093784<160〉5<170〉Patentlnversion3.4<210>1<211>603<212〉PRT<213〉Lactobacillusplantar咖〈400>1MetValMetLysGinThrLysGinThrAsnlieLeuAlaGlyAlaAla151015VallieLysValLeuGluAlaTrpGlyValAspHisLeuTyrGlylie202530ProGlyGlySerlieAsnSerlieMetAspAlaLeuSerAlaGluArg354045AspArglieHisTyrlieGinValArgHisGluGluValGlyAlaMet505560AlaAlaAlaAlaAspAlaLysLeuThrGlyLyslieGlyValCysPhe65707580GlySerAlaGlyProGlyGlyThrHisLeuMetAsnGlyLeuTyrAsp859095AlaArgGluAspHisValProValLeuAlaLeulieGlyGinPheGly100105110ThrThrGlyMetAsnMetAspThrPheGinGluMetAsnGluAsnPro115120125lieTyrAlaAspValAlaAspTyrAsnValThrAlaValAsnAlaAla130135140ThrLeuProHisVallieAspGluAlalieArgArgAlaTyrAlaHis145150155160GinGlyValAlaValValGinlieProValAspLeuProTrpGinGin165170175lieProAlaGluAspTrpTyrAlaSerAlaAsnSerTyrGinThrPro180185190LeuLeuProGluProAspValGinAlaValThrArgLeu195200205丁hrGinThrLeuLeuAlaAlaGluArgProLeulieTyrTyrGlylieGlyAlaArg210215220LysAlaGlyLysGluLeuGluGinLeuSerLysThrLeuLysliePro225230235240LeuMetSerThrTyrProAlaLysGlylieValAlaAspArgTyrPro245250255AlaTyrLeuGlySerAlaAsnArgValAlaGinLysProAlaAsnGlu260265270AlaLeuAlaGinAlaAspValValLeuPheValGlyAsnAsnTyrPro275280285PheAlaGluValSerLysAlaPheLysAsnThrArgliePheLeuGin290295300lieAsplieAspProAlaLysLeuGlyLysArgHisLysThrAsplie305310315320AlaValLeuAlaAspAlaGinLysThrLeuAlaAlalieLeuAlaGin325330335ValSerGluArgGluSerThrProTrpTrpGinAlaAsnLeuAlaAsn340345350ValLysAsnTrpArgAlaTyrLeuAlaSerLeuGluAspLysGinGlu355360365GlyProLeuGinAlaTyrGinValLeuArgAlaValAsnLyslieAla370375380GluProAspAlalieTyrSerlieAspValGlyAsplieAsnLeuAsn385390395400AlaAsnArgHisLeuLysLeuThrProSerAsnArgHislieThrSer405410415AsnLeuPheLysLeuAsn435GlyAlaSer450LeuProVsl465Ala丁hrMetGly420TyrProGluArgValGly425GinVal440lieProGlyAlalieAlaAla430PheAsnLeuMetThrMetGin455AspLeuAlaThrGin柳AlaGlyAspGly445ValGinTyrHislieAsnVal470ValPheThrAsnLysAspGluGinGlu485AspThrAsnGinAsn490CysGinTyrGlyPhelie475480AspPhelieGlyValGlu495PheAsnAsplieAspPheSerLyslieAlaAspGlyValHisMetGin500505510AlaPheArgValAsnLyslieGluGinLeuProAspValPheGluGin515520525AlaLysAlalieAlaGinHisGluProValLeulieAspAlaVallie530535540ThrGlyAspArgProLeuProAlaGluLysLeuArgLeuAspSerAla545ThrSerSerAlaAla565550AsplieGluAla555560GinAspLeuGinProLeuSerThrTyr580585PheLysGinArgTyrGluAla570575LeuLysGinPheGlyLeuAsp590A印LeuGinHisGinlieGlyGinGlyGlyPhe595600<210>2<211>1812〈212〉諷<213>Lactobacillusplantarum<400>2atggttatgaatactagcaggtgcagcsgttattaaagtt60ttagaagcttggggagt柳tcatttgtatggtattcctggaggttcaatta_attca_a_tt120atggacgcatstccattatattc犯gtacggcatgaagaa180gttggtgcaatggccgccgctgctgatgctaagctaacgggta^犯tcggggtUgcttc240ggctcagcgggacctggtggcactcatcttatgaatgggttatatgatgcgcgtga卿c300catgtccctgttctagcacttattggtcaatttggaactactgggatgaacatggatacg360ttccaagaaatgaatgag犯tccgatttatgcggacgUgcagattataatgtaacagcc420gtcaatgctgccacgttgccacatgttattgacgaagcaattcgacgcgcctacgctcac480CggttgtgC3aattccagtcgatttaccatggcaacagattccagctgaa540gattggtatgcttccgctaatagttatcaaacgccgttattaccagaacccgacgttcaa600gcagtg￡icg3gattga_cacagacttt已ctcgcagctgaacggccacttatttactatggc660attggagctcgtaaggctggtaaag犯ctcgaacaattgagtaaaacgttgaaaattcca720t"t犯tgagtacgtatccagctaagggtattgtcgcggatcgttatccagcctatttgggt780tctgct犯tcgggtggcacaaaaaccggcgttgcgcaagccgacgttgtt840ttatttgttggtaataattatccgtttgcag犯gtttccaaagcgtttaaaaatacgcgt900attttcttactgatccagctaacgacataaaacagatatt960gcggtacttgctgatgcacaaaaaacgctggctgcaattttagceicaggtatctgaacgg1020gagtcgacscCttggtggC3gcc犯tgtggcttatcta080gcttcattagaagataBgcsggaagggcctttacaagcatatcaagtgctacgtgcggtt1140cggagcctgatgcaatctattcgattgatg1200gcgaatcgacatttgaaattaacgccgtccaatcggcacattscttctaacttatttgct1260acgatgg眺ttggtattccgggagc組tgctgccaaactgagcggc郞1320gtgtttaatctggccggtgstggtggcgcttcgatgaccatgca3gatttggcgacgcaa1380gttcaataccatttaccagtgattaMgttgttttcaccaactgccaatatggatttatc1440aaagatgagcaggaagatacgattttattggcgttgaattcaatgatatt1500gattttagtaagattgccgatggcgtgcacatgcaagcttttcgagtt犯1560casttacctgatgtttttgagcaatcgctcagcatgaacc3gttCtg3tt1620gatgcggtgattacaggagatcggccactgcctgctga朋agcttcgttt3gattcggcs16803Cg兆ttCggcagctgatattgaagcattt1740ccactttcaacttattta犯acaatttggcttagatga_tt:tgc肌catca1800ggtgggtm犯1812<210>3<211〉1812〈212〉腿<213〉Lactobacillusplantarum〈400〉3atggtgat祖acagaccaacattctggcgggcgcggcggtgattaaagtg60ctgg卿cgtggggcgtgg3tcatctgtatggC￡LttCCgggcggcagcatt33C3gC3tt120atggatgcgctgagcgcggaacgtgatcgtattcattatattcaggtgcg180gtgggcgcgatggcggcggcggcggatgcga犯ctgaccggcaaaattggcgtgtgcUt240ggcagcgcgggcccgggcggcacccatxtgatgaacggcctgtatgatgcgcgtga卿t300catgtgccggtgctggcgctgattggccagtttggcaccaccggcatgaacatggatacc360tttC3gg犯3tg幼cgaaaacccgatttatgcggatgtggcggattataacgtgaccgcg420gtg犯cgcggcgaccctgccgcatgtgattg3tgaagcga_Ucgtcgtgcgtatgcgcat480cagggcgtggcggtggtgcagattccggtggatctgccgtggcagcagattccggcggaa540gattggtatgcgagcgcgaacagcteitcagaccccgctgctgccggaaccggatgtgcag600gcggtgacccgtctgacccagaccctgctggcggcgg犯cgtccgctgatttattatggc660attggcgcgcgtaaagcgggcaaaga^ctgg犯cagctgagc犯aaccctgaaaattccg720ctgatgagcacctatccggcg犯3ggcattgtggcggatcgttatccggcgtatctgggc780agcgcgaaccgtgtggcgcagaaaccggcgaacgaagcgctggcgcaggcggatgtggtg840ctgutgtgggcaacaactatccgUtgcgg鄉(xiāng)tg3gC8aaacacccgt900atttttctgctgatccggcgaaactgggcaaacgtcataa犯CCg3tEitt960gcggtgctggcggatgcgcag3肌3CCCtggcggcgattctggcgcaggtgagcg肪cgt翻gaasgcaccccgtggtggcaggcg犯cctggcgaacgtgaaaaactggcgtgcgtatctg1080gcgagcctggaagataaacaggaaggcccgctgcaggcgtatcaggtgctgcgtgcggtg1140aacaaaattgcggaaccggatgcgatttatagcattgatgtgggcgatattaacctgaac1200gcgaaccgtcatctgaaactgaccccgagcaaccgtcatattaccagcaacctgtttgcg1260accatgggcgtgggcattccgggcgcgattgcggcgaaactgaactatccggaacgtcag1320gtgtttaacctggcgggcgatggcggcgcgagcatgaccatgcaggatctggcgacccag1380gtgcagtatcatctgccggtgattaacgtggtgtttaccaactgccagtatggctttatt1440aaagatgaacaggaagataccaaccagaacgattttattggcgtggaatttaacgatatt1500gattttagcaaaattgcggatggcgtgcatatgcaggcgtttcgtgtgaacaaaattgaa1560cagctgccggatgtgtttgaacaggcgaaagcgattgcgcagcatgaaccggtgctgatt1620gatgcggtgattaccggcgatcgtccgctgccggcggaaaaactgcgtctggatagcgcg1680accagcagcgcggcggatattgaagcgtttaaacagcgttatgaagcgcaggatctgcag1740ccgctgagcacctatctgaaacagtttggcctggatgatctgcagcatcagattggccag1800ggcggcttttaa1812<210〉4<211〉603<212>PRT<213〉Lactobacillusplantarum〈400〉4MetValMetLysGinThrLysGinThrAsnlieLeuGlyAlaAlaVallieLysValLeuGluAlaTrpGlyValAspHisLeuTyrGlylie202530ProGlyGlySerlieAsnSerlieMetAspAlaLeuSerAlaGluArg354045AspArglieHisTyrlieGinVal/IrgHisGluGluValGlyAlaMet505560AlaAlaAlaAlaAspAlaLysLeuThrGlyLyslieGlyValCysPhe65707580GlySerAlaGlyProGlyGlyThrHisLeuMetAsnGlyLeuTyrAsp85恥95AlaArgGluAspHisValProValLeuAlaLeulieGlyGinPheGly100105110丁hrThrGlyMetAsnMetAspThrPheGinGluMetAsnGluAsnPro115120125lieTyrAlaAspValAlaAspTyrAsnValThrAlaValAsnAlaAla130135140ThrLeuProHisVallieAspGluAlalieArg145150155ArgAlaTyrAlaHis160GinGlyValAlaValValGinlieProValAspLeuProTrpGinGin165170175lieProAlaGluAspTrpTyr180AlaSerAlaAsnSerTyi185GinThrPro190LeuLeuPro195GluProAspValGinAlaValThr200ArgLeuThrGinThr205LeuLeuAlaAlaGluArgProLeulieTyr丁yrGlylieGlyAlaArg210215220LysAlaGlyLysGluLeuGluGinLeuSerLys225230235ThrLeuLysliePro240LeuMetSerThrTyrProValLysGlylieVal245250AlaAspArgTyrPro255AlaTyrLeuGlySerAlaAsn260ArgValAlaGinLys265ProAlaAsnGlu270AlaLeuAla275GinAlaA印ValValLeuPheValGly280AsnAsnTyrPro285PheAlaGluValSerLysAlaPheLysAsnThrArgTyrPheLeuGin290295300lieAsplieAspProAlaLysLeuGlyLysArg305310315HisLysThrAsplie320AlaValLeuAlaAspAla325GinLysThr匕euAla330Alali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