專利名稱：一種產(chǎn)脂肪氧合酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)脂肪氧化酶(lipoxygenase，EC 1. 13. 11. 12，簡(jiǎn)稱L0X)的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別是一種高產(chǎn)脂肪氧化酶的基因工程菌及構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脂肪氧合酶(Lipoxygenase，ECl. 13. 11. 12，簡(jiǎn)稱L0X)屬氧化還原酶，能專一催化含有cis，cis-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸及其酯，使其通過(guò)分子內(nèi)加氧，形成具有共軛雙鍵的氫過(guò)氧化物。脂肪氧合酶又稱不飽和脂肪酸氧化還原酶，存在于苜蓿、豌豆、扁豆、等豆科植物中，蘿卜及馬鈴薯中也有，但以大豆中的活性最強(qiáng)。由大豆結(jié)晶的脂肪氧合酶，相對(duì)分子量為102000，等電點(diǎn)為5. 14。最適pH不能簡(jiǎn)單決定，而是受底物的溶解性左右，一般pH 6. 10-3. 10，最適溫度在20-30°C之間。脂肪氧合酶可催化分子氧對(duì)面粉中具有戊二烯_1， 4雙鍵的油脂發(fā)生氧化，形成氫過(guò)氧化物。氫過(guò)氧化物氧化蛋白質(zhì)分子的巰基(-SH)形成二硫鍵(-S-S-)并能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子聚合，使蛋白質(zhì)分子變得更大，從而起到強(qiáng)筋的作用。脂肪氧合酶可通過(guò)耦合反應(yīng)破壞胡蘿卜的雙鍵結(jié)構(gòu)，從而起到漂白面粉，改善面粉色澤的作用。而脂肪氧合酶催化亞油酸生成的過(guò)氧化物，可改善面包的香氣，為面包增香。由此可見(jiàn)， 脂肪氧合酶兼具強(qiáng)筋和增白的功效，可以用來(lái)替代強(qiáng)筋劑溴酸鉀以及減少漂白劑過(guò)氧化苯甲酰的用量。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)脂肪氧合酶研究報(bào)道很少，主要集中于生理功能研究，關(guān)于高產(chǎn)脂肪氧合酶基因工程菌的報(bào)道則更少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種產(chǎn)脂肪氧合酶(Lipoxygenase， ECl. 13. 11. 12，簡(jiǎn)稱L0X)的基因工程菌，該菌株所攜帶的質(zhì)粒上含有脂肪氧合酶基因，可分泌表達(dá)脂肪氧合酶基因。所述脂肪氧合酶基因來(lái)源于銅綠假單胞菌，該菌株于2011年5月30日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2011185，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，其分類學(xué)命名為銅綠假單胞菌BBEO^ewi/offloaas aeruginosa BBE)。因大腸桿菌表達(dá)體系具有發(fā)酵周期短、蛋白表達(dá)量高、提取工藝成熟等優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)選大腸桿菌表達(dá)體系為宿主。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供了一種脂肪氧合酶基因工程菌的構(gòu)建方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題提供如下技術(shù)方案 第一步脂肪氧合酶基因的獲得
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中PA1169基因設(shè)計(jì)引物，以銅綠假單胞菌ATCC 15692為模板PCR克隆得到脂肪氧化酶基因；
第二步脂肪氧合酶(LOX)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
為了使脂肪氧合酶基因能在大腸桿菌中的可控高效表達(dá)，選用帶有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體(例如pET22b，美國(guó)^witrogen公司)，利用克隆得到的脂肪氧合酶基因序列端的 3'Nde限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與5’端的HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將脂肪氧合酶基因克隆入載體pET22b ；由于在T7啟動(dòng)子后面有一段pelB信號(hào)肽序列，這也為脂肪氧合酶基因在大腸桿菌中的正確分泌表達(dá)奠定了基礎(chǔ)；另外，由于pET22b載體中含有氨芐青霉素抗性基因， 在篩選重組菌時(shí)較為方便；
將含有脂肪氧合酶基因的載體與要連接的表達(dá)載體pET22b進(jìn)行Nde和Hind III酶切， 連接得到含有脂肪氧合酶基因的重組質(zhì)粒pET22b-L0X ； 第三步脂肪氧合酶基因工程菌的構(gòu)建
將重組質(zhì)粒pET22b-L0X轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌(E coli Rosetta (DE3))，構(gòu)建高效表達(dá)脂肪氧合酶的誘導(dǎo)型大腸桿菌基因工程菌；
本步驟采用的含脂肪氧合酶的重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-L0X可轉(zhuǎn)化大腸桿菌(B. coli Rosetta(DE3) hvitrogen)，成為能分泌表達(dá)外源脂肪氧合酶的功能大腸桿菌；在外源誘導(dǎo)物IPTG存在的情況下，T7啟動(dòng)子啟動(dòng)外源脂肪氧合酶基因的表達(dá)，信號(hào)肽指導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入大腸桿菌的分泌途徑，正確切割成具有生物活性的外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物，最終將產(chǎn)物分泌至胞外。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法首先接種活化后的大腸桿菌一環(huán)于25 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入25 mL LB(250 mL三角瓶)液體培養(yǎng)基中，37 ！振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)直至菌體濃度0D_為0.3-0. 7。隨后參照Takara公司 competent cell試劑盒制作感受態(tài)、轉(zhuǎn)化。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供了一種脂肪氧合酶基因工程菌的應(yīng)用方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供如下技術(shù)方案 第一步重組菌株的篩選
所述重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-L0X上含有氨卞青霉素抗性基因，如果重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，重組菌株具有氨卞青霉素抗性，可在含有氨卞青霉素的平板上生長(zhǎng)；涂布含氨卞青霉素抗性平板，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即為產(chǎn)脂肪氧合酶的大腸桿菌工程菌五coli -LOX ； 第二步菌株經(jīng)培養(yǎng)分泌脂肪氧合酶培養(yǎng)基組成(g/L)
種子培養(yǎng)基蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉5;
發(fā)酵培養(yǎng)基將下列組分溶解在0. 9 L水中蛋白胨12 g，酵母提取物M g，甘油4
mL。；
各組分溶解后高壓滅菌；冷卻到60°C，再加100 mL滅菌的170 mmol/L ΚΗ2Ρ04/0. 72 mol/L K2HPO4的溶液(2. 31 g的KH2PO4和12. 54 gK2HP04溶在足量的水中，使終體積為100 mL ；高壓滅菌或用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌)；
培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)，挑取工程菌單菌落接入裝液量為25 mL的三角瓶Q50 mL)中， 培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)12 h ；發(fā)酵培養(yǎng)，按10%的接種量接入裝液量為 25 mL的三角瓶Q50 mL)中，培養(yǎng)溫度37°C，當(dāng)OD6tltl達(dá)到0. 6時(shí)，將培養(yǎng)溫度降為16°C，同時(shí)加入終濃度為1. 0 mM的誘導(dǎo)劑IPTG。脂肪氧合酶酶活測(cè)定方法
反應(yīng)溫度為25°C。3 mL體系中，178 mM硼酸，0. 011%(ν/ν)亞油酸，0. 01%(ν/ν)乙醇和 500-1000 U/mL的脂肪氧合酶。pH 9. 0，25°C下，3 mL體系中(1 cm比色皿)。每分鐘變化吸光度0.001定義為一個(gè)酶活。本發(fā)明構(gòu)建了一株高效分泌表達(dá)脂肪氧合酶的基因工程菌，解決了現(xiàn)有技術(shù)脂肪氧合酶產(chǎn)量低的問(wèn)題；應(yīng)用該菌種生產(chǎn)脂肪氧合酶，產(chǎn)量高、工藝簡(jiǎn)單、便于工業(yè)化應(yīng)用，該菌株生產(chǎn)的目的蛋白直接分泌到胞外，提取過(guò)程簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高，發(fā)酵結(jié)束后脂肪氧合酶 (LOX)活力可達(dá)1000 U/mL。本發(fā)明為生物法生產(chǎn)脂肪氧合酶的研究、開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)工作奠定了基礎(chǔ)，有利于早日實(shí)現(xiàn)面粉的生物漂白。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照常見(jiàn)的分子克隆手冊(cè)所述的條件進(jìn)行操作。材料和方法所用限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，PCR試劑，DNA Marker等均購(gòu)于 TaKaRa寶生物公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞五c^iJM109，引物，質(zhì)粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)于上海生工生物工程公司；電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自Bio-Rad公司。實(shí)施例1 脂肪氧合酶基因的獲得根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中PA1169基因設(shè)計(jì)引物。:gggaattcca tatgaaacgc aggagtgtgc tcttgtcg 下游:cccaagcttt cagatattgg tgctcgccgg gate
引物3，端分別引入Nde I和Hind III酶切位點(diǎn)，以本實(shí)驗(yàn)室篩選銅綠假單胞菌DNA為模板PCR克隆得到脂肪氧化酶基因，將基因克隆到質(zhì)粒pMD19T。所述銅綠假單胞菌于2011 年5月30日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2011185，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，其分類學(xué)命名為銅綠假單胞菌BBE (Pseudomonas aeruginosa BBE)。實(shí)施例2 重組質(zhì)粒pET22b_L0X的構(gòu)建
帶有脂肪氧合基因的載體和表達(dá)載體pET22b分別進(jìn)行Nde I和Hind III雙酶切，試劑盒回收后，使用T4連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為(10 yL):目的基因片斷2 yL，載體 DNA 2 μ L，IOX T4 連接酶 Buffer 1 μ L, T4 DNA 連接酶 1 μ ，蒸餾水 4 μ L。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法如下
(1)無(wú)菌狀態(tài)下取感受態(tài)細(xì)胞200μ L置于無(wú)菌的微量離心管中；
(2)每管加入1-2μ L重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30 min；
(3)42°C熱休克90 s (準(zhǔn)確)，不要搖動(dòng)離心管；
(4)快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，使細(xì)胞冷卻1-2min；
(5)每管加入無(wú)抗生素的普通LB培養(yǎng)液800uL；
(6)用無(wú)菌鋪菌器將200μ L菌液鋪于含氨芐青霉素的瓊脂平板，37°C平放20 min直至液體被吸收，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜，觀察。 挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明連接成功。
實(shí)施例3 脂肪氧合基因工程菌的構(gòu)建感受態(tài)大腸桿菌Rosetta(DE3)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法如下
(1)無(wú)菌狀態(tài)下取感受態(tài)細(xì)胞200μ L置于無(wú)菌的微量離心管中；
(2)每管加入1-2PL重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30 min ；
(3)42°C熱休克90 s (準(zhǔn)確)，不要搖動(dòng)離心管；
(4)快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，使細(xì)胞冷卻1-2min；
(5)每管加入無(wú)抗生素的普通LB培養(yǎng)液800uL；
(6)用無(wú)菌鋪菌器將200μ L菌液鋪于含氨芐青霉素的瓊脂平板，37°C平放20 min直至液體被吸收，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜，觀察。挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒驗(yàn)證，證明轉(zhuǎn)化成功。實(shí)施例4 發(fā)酵生產(chǎn)脂肪氧合酶培養(yǎng)基組成(g/L)
種子培養(yǎng)基蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉5。發(fā)酵培養(yǎng)基將下列組分溶解在0.9 L水中蛋白胨12 g，酵母提取物24 g，甘油 4 mLo各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60°C，再加IOOmL滅菌的170mmol/L ΚΗ2Ρ04/0. 72 mol/L K2HPO4的溶液(2. 31 g的KH2PO4和12. 54 gK2HP04溶在足量的水中，使終體積為100 mL。高壓滅菌或用0.22 μπι的濾膜過(guò)濾除菌)。培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)，挑取工程菌單菌落接入裝液量為25 mL的三角瓶Q50 mL) 中，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)12 h ；發(fā)酵培養(yǎng)，按10%的接種量接入裝液量為25 mL的三角瓶050 mL)中，培養(yǎng)溫度37°C，當(dāng)OD6tltl達(dá)到0. 6時(shí)，將培養(yǎng)溫度降為16°C， 同時(shí)加入終濃度為1. 0 mM的誘導(dǎo)劑IPTG，發(fā)酵M h胞外酶活達(dá)1000 U/mL。本發(fā)明以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人， 在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)脂肪氧合酶的基因工程菌，其特征在于，所攜帶的質(zhì)粒上含有脂肪氧合酶基因。
2.權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是將脂肪氧合酶基因?qū)氪竽c桿菌。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述脂肪氧合酶基因來(lái)源于CCTCC NO :M 2011185。
4.權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述脂肪氧合酶基因位于表達(dá)載體 pET22b 上。
5.一種權(quán)利要求1所述基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟 第一步以CCTCC NO =M 2011185基因組為模板PCR克隆得到脂肪氧化酶基因； 第二步克隆脂肪氧合酶基因到表達(dá)載體pET22b ；第三步將所得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌，構(gòu)建高效表達(dá)脂肪氧合酶的誘導(dǎo)型大腸桿菌基因工程菌。
6.一種權(quán)利要求1所述大腸桿菌工程菌在脂肪氧合酶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，每升發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下蛋白胨 12 g，酵母提取物 24 g，甘油 4 mL, 2.31 g KH2PO4 和 12.54 g Κ2ΗΡ04。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60°C，再加滅菌后的磷酸鹽緩沖溶液。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖溶液的滅菌采用高壓滅菌或?yàn)V膜過(guò)濾除菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)脂肪氧合酶(Lipoxygenase，EC1.13.11.12，簡(jiǎn)稱LOX)的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)將脂肪氧合酶基因?qū)氪竽c桿菌，構(gòu)建了一株高效分泌表達(dá)脂肪氧合酶的基因工程菌，解決了脂肪氧合酶產(chǎn)量低的問(wèn)題。應(yīng)用該菌種搖瓶條件下生產(chǎn)脂肪氧合酶，產(chǎn)量高達(dá)1000U/mL，并且該生產(chǎn)工藝具有簡(jiǎn)單、適于工業(yè)化應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102268400SQ20111021230
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者堵國(guó)成, 孫福新, 宗偉剛, 張東旭, 蔣曉東, 陸信曜, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:宜興協(xié)聯(lián)生物化學(xué)有限公司, 江南大學(xué)