一種具有改善記憶功能龍眼蛋白多糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及龍眼加工技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有改善記憶功能龍眼蛋白多糖的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 龍眼又稱桂圓，是我國南方亞熱帶特色水果，具有藥食兩用功效。龍眼的益智功能 在《本草綱目》、《滇南本草》等我國古代醫(yī)藥書上已早有記載，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明多糖是龍 眼果肉的主要活性成分，表現(xiàn)出抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、改善記憶功能等多重生物活性。
[0003] 多糖的傳統(tǒng)提取方法以熱水浸提為主，隨著天然產(chǎn)物分離純化技術(shù)的不斷發(fā)展， 酶解和超聲波等技術(shù)已廣泛用于植物活性多糖的提取分離，然而這些方法存在耗時(shí)長、能 耗高、雜質(zhì)含量高及提取率低等缺陷。超高壓技術(shù)是近年來發(fā)展較快的一種新型加工技術(shù)， 通過使得細(xì)胞內(nèi)外形成巨大的壓力差，造成細(xì)胞破裂，釋放出有效成分，具有操作簡單、時(shí) 間短、雜質(zhì)含量少及環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)被應(yīng)用于植物有效活性成分的提取，包括黃酮、 皂苷、生物堿及多酚類物質(zhì)。近年來，已有植物活性多糖的超高壓提取工藝方面的報(bào)道，如 申請?zhí)枮?01310676570. 8的專利公開了一種超高壓提取松茸多糖的工藝。
[0004] 植物蛋白多糖是具有生物活性的大分子，和細(xì)胞壁上的纖維素結(jié)合在一起，結(jié)構(gòu) 緊密，單純采用超高壓技術(shù)不能有效的對多糖進(jìn)行提取，而且提取出來的蛋白多糖的不存 在改善記憶的功能，本發(fā)明采用超聲波-酶協(xié)同前處理結(jié)合超高壓提取龍眼蛋白多糖，可 以用作特殊醫(yī)學(xué)用途食品的配料，為龍眼的精深加工提供了新途徑，對推動我國龍眼產(chǎn)業(yè) 的健康發(fā)展具有十分中藥的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高提取率且具有改 善記憶功能的龍眼蛋白多糖的制備方法。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下方案實(shí)現(xiàn)： 一種具有改善記憶功能龍眼蛋白多糖的制備方法，對龍眼干依次進(jìn)行超聲波_酶協(xié)同 前處理、超高壓處理、乙醇分步沉淀處理和冷凍干燥處理后制得龍眼蛋白多糖。
[0007] 超高壓提取技術(shù)是一種新型的加工技術(shù)，具有快速、高效、耗能小、提取溫度低等 特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用到物料中有效成分的提取，但是經(jīng)過發(fā)明人的試驗(yàn)，雖然利用超高壓提 取技術(shù)也能進(jìn)行提取，但是其提取率較低，并且在隨后的小鼠實(shí)驗(yàn)中，通過超高壓提取技術(shù) 提取得到的龍眼蛋白多糖，其并沒有改善小鼠的記憶功能障礙，經(jīng)過發(fā)明人的進(jìn)一步探究， 在進(jìn)行超高壓處理前，結(jié)合超聲波-酶進(jìn)行前處理后，再通過超高壓提取，不僅僅大幅度的 提高了龍眼蛋白多糖的提取率，而且能顯著改善小鼠的記憶功能障礙。
[0008] 更具體的步驟如下： Si.超聲波-酶協(xié)同前處理：龍眼干加水打漿，將漿液置于超聲場中同時(shí)添加復(fù)合酶進(jìn) 行處理，得酶解液； 52. 超高壓處理：對步驟SI中的酶解液進(jìn)行超高壓處理得龍眼液； 53. 乙醇分步沉淀處理：對步驟S2中的龍眼液過濾后濃縮，于濃縮液中加入乙醇進(jìn)行 分步沉淀； 54. 冷凍干燥處理：將步驟S3中的沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥，得龍眼蛋白多糖。
[0009] 步驟Sl中，水的添加量為龍眼干重量的10~40倍，所述復(fù)合酶為纖維素酶和木 聚糖酶，纖維素酶的添加量為龍眼干重量的〇. 2~0. 6%，木聚糖酶的添加量為龍眼干重量的 0. 1~0. 5%，超聲波功率為200~400w。
[0010] 通過纖維素酶和木聚糖酶結(jié)合超聲波進(jìn)行前處理，再進(jìn)行超高壓處理，正是通過 這兩種方式的結(jié)合，使得最終提取出來的龍眼蛋白多糖具有顯著的改善記憶功能，而且發(fā) 明人在確定這兩種方式后，通過進(jìn)一步的優(yōu)化，采用了纖維素酶和木聚糖酶，并在合適的用 量和酶解條件下，提高最終的龍眼蛋白多糖提取率。
[0011] 步驟Sl中，調(diào)整漿液pH為5.0~6.8,于溫度為35~50°C下處理10~30min。
[0012] 步驟S2中，超高壓壓力為200~500Mpa，處理時(shí)間為3~15min。
[0013] 步驟S3中，將過濾后的龍眼液濃縮汁1/4體積。
[0014] 步驟S3中，于濃縮液中加入乙醇進(jìn)行分步沉淀具體為：于濃縮液中加入95%乙醇 至最終乙醇的體積百分比為30%，在3~6°C下靜置8~12h后過濾去掉沉淀，向上清液中繼續(xù) 加入95%乙醇至最終乙醇的體積百分比為80%，并在3~6°C下靜置8~12h后離心得沉淀。這 一步驟中，分為兩次沉淀操作，通過舍棄第一次得到的沉淀，并且將第二次沉淀操作中乙醇 的濃度定位至80%，這使得最終提取出來的蛋白多糖具備顯著的改善記憶功能。
[0015] 于轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下離心5~10min。
[0016] 步驟S4中，真空冷凍干燥具體為：于-60~-20°C冷凍干燥20~48h得龍眼蛋白多 糖。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 1. 本發(fā)明通過超聲波-酶處理與超高壓處理結(jié)合，使得制備出來的龍眼蛋白多糖具有 顯著的改善記憶功能； 2. 本發(fā)明全套工藝簡單，操作方便，所得產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定，可用作特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品 的配料，同時(shí)也提高了龍眼的附加值，為其他藥食兩用植物資源食品的精深加工提供了指 導(dǎo)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為了讓本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面對本發(fā)明作進(jìn)一步 闡述。
[0019] 實(shí)施例1 一、龍眼蛋白多糖的制備 一種具有改善記憶功能龍眼蛋白多糖的制備方法，包括如下步驟： Si.超聲波-酶協(xié)同前處理：于100g龍眼干添加其重量10倍的水進(jìn)行打漿，將漿液置 于200W功率的超聲場中，同時(shí)添加纖維素酶和木聚糖酶，纖維素酶的添加量為龍眼干重量 的0. 2%，木聚糖酶的添加量為龍眼干重量的0. 1%，調(diào)整漿液的pH為5. 0,于溫度為35°C下 處理IOmin得酶解液； 52. 超高壓處理：將步驟SI中的酶解液于壓力為200Mpa的條件下處理3min得龍眼 液； 53. 乙醇分步沉淀處理：將步驟S2中的龍眼液過濾后濃縮至1/4體積，于濃縮液中加 入95%乙醇至最終乙醇的體積百分比為30%，在3°C下靜置8h后過濾去掉沉淀，向上清液中 繼續(xù)加入95%乙醇至最終乙醇的體積百分比為80%，并在3°C下靜置8h后離心得沉淀； 54. 將S3得到的沉淀于-60°C冷凍干燥20h得龍眼蛋白多糖。
[0020] 經(jīng)測試，龍眼蛋白多糖的提取率為14. 1%。
[0021] 二、動物實(shí)驗(yàn) 1、試驗(yàn)條件 I. 1樣品 本實(shí)施例1的龍眼蛋白多糖粉末。
[0022] 1.2實(shí)驗(yàn)動物 KM小鼠，雄性，體重20~25g，SPF級，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。小鼠于實(shí)驗(yàn) 前7d置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境，溫度23±2°C，濕度為50~60%，自由飲食、攝水。
[0023] L3分組及處理 (1)分組 KM小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨即分為5組，每組12只，包括對照組、模型組和3 個(gè)龍眼蛋白多糖劑量組。對照組和模型組灌胃0.9%生理鹽水，龍眼蛋白多糖組按低劑量 100mg/kg、中劑量200mg/kg、高劑量300mg/kg灌胃給藥，連續(xù)給藥28天，在最后一次給藥 Ih后，除對照組腹腔注射生理鹽水外，其它組均腹腔注射東莨菪堿（3mg/kg b.w.)，并于注 射20min后進(jìn)行明暗箱避暗實(shí)驗(yàn)。
[0024] (2)明暗箱實(shí)驗(yàn) 被動回避實(shí)驗(yàn)時(shí)利用動物的好暗避光（明暗穿梭)、對厭惡刺激(如足電擊）的恐懼和 記憶而建立起來的。避暗系統(tǒng)包括兩個(gè)等大（20. 3cm*15. 9cm*21. 3cm)的隔室，一個(gè)為明 箱，一個(gè)為暗箱，明室上蓋對應(yīng)有LED燈，暗室上蓋對應(yīng)有一紅外探頭，兩室之間由一個(gè) 拱門（8. 9cm*ll. 4cm)相連，門可由實(shí)驗(yàn)需要關(guān)閉或打開。隔室地板為不銹鋼柵欄(直徑 3. 175_)。暗箱一側(cè)的柵欄地板與刺激器相聯(lián)，并可給予電擊；明箱一側(cè)則不與電擊相連， 故沒有電流通過。實(shí)驗(yàn)分為電擊刺激訓(xùn)練和記憶保持測試兩部分。
[0025] 小鼠灌胃第26天起，連續(xù)2天在同一時(shí)間將小鼠放入明暗箱(不通電）中適應(yīng)3 min。第28天腹腔注射東莨菪堿20min后開始測試訓(xùn)練（0 h)，將小鼠背對拱門放入明箱 后，給暗室不銹鋼柵欄通以〇. 4mA電流，小鼠一進(jìn)入暗室即受電擊后回到明室，此為訓(xùn)練過 程，記錄小鼠第一次被電擊的時(shí)間。分別于測試訓(xùn)練24 h和48h后對小鼠進(jìn)行記憶測驗(yàn)， 將小鼠放入明箱，記錄小鼠第一次進(jìn)入暗室的時(shí)間，此為避暗潛伏期，5 min內(nèi)未進(jìn)入暗室 的小鼠其潛伏期按300s計(jì)算。
[0026] (3)樣品處理及分析 記憶測試試驗(yàn)結(jié)束后，立即乙醚麻醉小鼠，摘眼球取血，取血后迅速于冰上斷頭取腦， 用4°C預(yù)冷的生理鹽水漂洗除去血液，吸干多余水分，加9倍重量的冰生理鹽水，用高速 分散勾衆(zhòng)機(jī)制成10%的組織勾衆(zhòng)，3000r/min 4°C離心10min，取上清液，分析其中乙酰膽 堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT)和乙酰膽堿酯酶（TChE)的含量。
[0027] I. 4數(shù)據(jù)分析 采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0028] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2. 1龍眼蛋白多糖對東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠避暗行為實(shí)驗(yàn)潛伏期的影響： 表1龍眼粗多糖對東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠避暗行為實(shí)驗(yàn)潛伏期的影響
注：每一列中字母不同代表差異顯著（/<0.05)。
[0029] 明暗箱是利用小鼠好暗避光，對厭惡刺激(如足電擊）的恐懼來檢測其大腦記憶功 能。
[0030] 小鼠在服用龍眼蛋白多糖21天后采用明暗箱進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能的測試。從表1 可以看出，在記憶的獲取階段（〇h)，5組小鼠都快速的進(jìn)入暗箱，其潛伏期沒有顯著差異， 這表明5組小鼠的生活習(xí)性正常。在學(xué)習(xí)記憶的保持階段（24h)，與對照組相比，注射東莨 菪堿的模型組小鼠進(jìn)入暗箱的時(shí)間快，潛伏期短，表明模型組小鼠已有記憶功能障礙；與 模型組小鼠相比，服用了龍眼蛋白多糖的3組小鼠的潛伏期顯著增加了（p〈0. 05