道地丹參的培育方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種道地丹參的培育方法。步驟是經(jīng)過建立丹參種質(zhì)資源圃、從中評選出代表性的道地丹參種質(zhì)資源、鑒定道地丹參基因組核型結(jié)構(gòu)、確定道地丹參DNA條形碼、進行人工誘變成同源四倍體、進行有性雜交獲得三倍體丹參永久雜種、脫毒處理、組培苗克隆增殖、瓶苗移栽、移栽苗的管理、新品種評比試驗、藥材產(chǎn)量和主要藥物有效成分測定、道地丹參新品種認定和品種鑒定。本發(fā)明是迄今為止唯一具有自然界二大優(yōu)勢，即：多倍體優(yōu)勢和雜種優(yōu)勢的種群，其優(yōu)勢表現(xiàn)出巨大性和不可替代性。因此，本發(fā)明是利用中藥道地功能基因組及其特征基因，依據(jù)道地中藥本身固有的基因，培育對生物及非生物脅迫能力強的道地中藥的有效方法。
【專利說明】道地丹參的培育方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物新品種的培育方法，特別是一種綠色超級道地丹參的培育方法。
【背景技術】
[0002]丹參miltiorrhiza Bunge)是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中應用最早、最廣泛的中藥之一，是著名的活血化淤藥，在臨床上被廣泛用于治療冠心病、心絞痛、缺血性中風等疾病。隨著我國人口老齡化，心血管疾病成為危害人類健康的主要疾病，發(fā)病率逐年上升，對藥物需求量增大。目前我國以丹參為原料生產(chǎn)的復方中藥有100多種，涉及的企業(yè)有100多家，對優(yōu)質(zhì)丹參藥材的需求量巨大。然而，我國至今還沒有一個統(tǒng)一的道地丹參栽培品種。近年來，農(nóng)業(yè)界為迎接第三次綠色革命，繼袁隆平的“超級稻”之后又提出培育“綠色超級稻”的奮斗目標。在這種啟發(fā)下，作者提出培育“綠色超級道地丹參”的奮斗目標。
[0003]實際上，與農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源相比，我國中藥種質(zhì)資源更豐富，對培育綠色超級物種更具有優(yōu)勢。傳統(tǒng)中藥在我國應用歷史悠久，在全國各地分布著一批具有獨特功能的藥用植物，它們是經(jīng)過長期的自然選擇和人工選擇的積累而形成的特殊種群，具有特征性功能基因組，是培育綠色超級道地中藥最寶貴的基因庫。很多道地中藥都是長期生長在極端特殊的自然環(huán)境條件下，積累了能抵抗各種外界脅迫能力的基因，因此，盡快的挖掘、保全和利用道地中藥材中的特殊功能基因組，不僅對培育綠色超級道地中藥有利，對我國中藥現(xiàn)代化發(fā)展也具有引領作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種綠色超級道地丹參的培育方法，它是依據(jù)道地中藥丹參本身固有的道地功能基因組和基因，抵抗外來生物及非生物的脅迫，達到增加藥材產(chǎn)量，提高主要藥物有效成分含量的目標，實現(xiàn)不打農(nóng)藥，不施或少施化肥的目的。
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種綠色超級道地中藥丹參的培育方法包括以下步驟: 首先是收集全國野生丹參種質(zhì)資源，建立中國丹參種質(zhì)資源圃。
[0006]第二，從形態(tài)學、細胞生物學(染色體)、分子生物學不同層面對我國丹參種質(zhì)資源進行研究，評選出具有代表性的道地丹參種質(zhì)資源，并從基因組染色體結(jié)構(gòu)和DNA分子條形碼技術對道地丹參進行鑒定。
[0007]第三，將一個具有隱性標記性狀的二倍體道地丹參和一個具有顯性標記性狀的二倍體道地丹參，分別進行人工誘變成同源四倍體(4x，含有4個相同的道地丹參功能基因組)。
[0008]第四，三倍體丹參雜交轉(zhuǎn)育，分別將具有隱性標記性狀(如白花)和具有顯性標記性狀(如紫花)的四倍體丹參，分別與具有相對標記性狀的二倍體道地丹參(2x，含有2個相同道地丹參功能基因組)進行有性雜交(4x早Χ2χ ?或2x早Χ4χ ?)，獲得三倍體丹參永久雜種(3χ，含有3個相同道地丹參功能基因組)。
[0009]第五，脫毒處理:以三倍體丹參雜交當代種子幼苗莖尖或新生幼葉為外植體，用75%酒精和0.1 %升汞進行脫毒處理。
[0010]第六，組培苗克隆增殖:將脫毒處理好的外植體接種在MS + 6BA1.5mg/L培養(yǎng)基上，在光周期14小時/天，光強度3000LUX，室溫20— 25°C條件下進行光照培養(yǎng)，待接種材料切割面產(chǎn)生叢生芽，轉(zhuǎn)入1/2MS + 6BAlmg/L培養(yǎng)基上，進行克隆增殖。
[0011 ] 第七，瓶苗移栽，待瓶苗新根長1-2公分時，進行瓶苗移栽，移栽前2天先打開瓶蓋練苗。
[0012]第八，移栽苗管理，剛移出的苗要半遮光，保持45-55%的濕度，加強管理成活率可達90%以上。
[0013]第九，新品種評比試驗，按常規(guī)新品種評比試驗要求進行。
[0014]第十，藥材產(chǎn)量、藥物主要有效成分含量測定:根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)定，對丹參酮II A、丹酚酸B和隱丹參酮進行測定。
[0015]第十一，綠色超級道地丹參新品種認定:按上述程序，依據(jù)得到的丹參藥材產(chǎn)量和主要藥物有效成分含量，可培育出綜和生物學性狀好，抗生物及非生物脅迫能力強的綠色超級道地丹參新品種(藥村產(chǎn)量和主要藥物有效成分含量全面提高50%以上)。
[0016]第十二，綠色超級道地丹參新品種鑒定:通過基因組染色體鑒定，可以確定新培育出來的綠色超級道地丹參是一個具有3個相同基因組的三倍體丹參(2n=3x=24)，通過道地丹參親本標記性狀和DNA條形碼可以確定被固定的道地丹參功能基因組的來源。 [0017]通過本發(fā)明以上程序選育出來的丹參新品種，與常規(guī)的有性雜交育種不同，它是將已知的道地丹參功能基因組及其所有特征基因，以三倍體丹參形式被“永久”的固定下來，三倍體不能行正常有性生殖，在“空間”上與其他物種形成了生殖隔離，沒有有性后代分離，是“永久F1”永久雜種，是迄今為止唯一具有自然界二大優(yōu)勢，即:多倍體優(yōu)勢和雜種優(yōu)勢的種群，其優(yōu)勢表現(xiàn)出巨大性和不可替代性。因此，本發(fā)明是利用中藥道地功能基因組及其特征基因，依據(jù)道地中藥本身固有的基因，培育對生物及非生物脅迫能力強的綠色超級道地中藥的有效方法。
[0018]本發(fā)明提供的綠色超級道地中藥丹參新品種的培育方法，與以往的常規(guī)有性雜交育種不同，所謂綠色中藥(丹參)是不施或少施化肥，不打農(nóng)藥，它完全是依據(jù)道地中藥(丹參)自身固有的特征功能基因組和基因，抵抗外來生物及非生物脅迫，達到提高藥材產(chǎn)量，增加藥物有效成分含量，促進中藥可持續(xù)性生產(chǎn)。它一不靠化肥，二不靠農(nóng)藥，三不靠外來基因，完全靠道地中藥自身固有的特征功能基因組和基因，實現(xiàn)綠色健康中藥產(chǎn)業(yè)化。所謂超級丹參，也不是靠外來異源基因，它是依據(jù)高等植物主要進化途徑一一基因組多倍化與雜交相結(jié)合，將3個以上同源道地功能基因組聚合在一起，充分顯示出道地丹參特征基因組的劑量效應。通過生殖隔離，形成一個永久雜種，將多倍體優(yōu)勢和雜種優(yōu)勢永久的被保存下來，并固定在一個品種中，使其成為具有迄今為止自然界唯一具有的兩大優(yōu)勢一雜種優(yōu)勢和多倍體優(yōu)勢的種群。因此，本發(fā)明提供的綠色超級道地丹參的培育方法，是挖掘和利用我國道地中藥功能基因組的重要途徑，對我國中藥新品種培育和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義和應用價值。
[0019]【專利附圖】

【附圖說明】[0020]圖1:中國丹參種質(zhì)資源圃。
[0021]圖2:丹參基因組染色體結(jié)構(gòu):(a)2x，(b)3x, (c)4x。
[0022]圖3-1:丹參顯性、隱性標記性狀:(a)紫花，(b)白花。
[0023]圖3-2:道地丹參三聯(lián)密碼DNA條形碼。
[0024]圖4:綠色超級道地丹參大田種植生長勢。
[0025]圖5:綠色超級道地丹參新品種根部藥材。
[0026]【具體實施方式】: 本發(fā)明可從下述實例中得以體現(xiàn)，但它不會對本發(fā)明作任何限制。
[0027]本發(fā)明提供的綠色超級道地丹參的培育方法包括以下步驟:
⑴建立中國丹參種質(zhì)資源圃，收集全國野生丹參種質(zhì)資源；
⑵從形態(tài)學、細胞生物學、分子生物學、化學(藥物成分測定)層面對我國丹參種質(zhì)資源進行研究，評選出具有代表性的道地丹參種質(zhì)資源。
[0028]⑶對評選出的道地丹參種質(zhì)資源的基因組染色體結(jié)構(gòu)進行鑒定。
[0029]⑷利用AFLP分子標記技術(王冰等:中國中藥雜志32 (19) 2007.10))確定道地丹參DNA條形碼。
[0030](5)三倍體雜交轉(zhuǎn)育:分別將具有隱性標記性狀和具有顯性標記性狀的四倍體丹參，分別與具有相對標記性狀的二倍體道地丹參(2x，含有2個相同道地丹參功能基因組)進行雜交(4x早Χ2χ ?或2x早Χ4χ ? )，獲得三倍體丹參永久雜種(3x，含有3個相同道地丹參功能基因組)。
[0031](6)脫毒處理:以三倍體丹參雜交當代種子幼苗莖尖或新生幼葉為外植體，用75%酒精和0.1 %升汞進行脫毒處理。
[0032](7)組培苗克隆增殖，將脫毒處理完的外植體接種在1/2MS + 6BA1。5mg/L培養(yǎng)基上，在光周期14小時/天，光強度3000LUX，室溫20— 25°C條件下進行光照培養(yǎng)，待接種材料切割面產(chǎn)生叢生芽，轉(zhuǎn)入1/2MS + 6BAlmg/L培養(yǎng)基上，進行擴大繁殖。
[0033](8)瓶苗移栽:待瓶苗新根長2— 3公分時，進行瓶苗移栽，移栽前2天先打開瓶蓋
練苗；
⑶移栽苗管理:剛移出的瓶苗要半遮光，保持50%左右的濕度，加強管理成活率可達90%以上。
[0034](10)新品種評比試驗:按常規(guī)新品種評比試驗要求進行。
[0035]除按一般常規(guī)新品種評比試驗要求進行外，本發(fā)明提供的綠色超級道地中藥丹參，只施2000公斤/畝農(nóng)家有機肥，全程不施或少施化肥，不打農(nóng)藥，完全依靠綠色超級丹參本身所具有的道地功能基因組，對生物及非生物脅迫的抵抗能力。
[0036](11)藥材產(chǎn)量、藥物主要有效成分含量測定:根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)定，對丹參酮II A、丹酚酸B和隱丹參酮進行測定。
[0037](12)綠色超級道地丹參新品種認定:按上述程序，可培育出綜合生物學性狀好，抗生物及非生物脅迫能力強，藥材產(chǎn)量和主要藥物有效成分含量高的綠色超級道地丹參新品種(全面提高50%以上)。
[0038]通過基因組染色體鑒定，可以確定新培育出來的綠色超級道地丹參是一個具有3個相同基因組的三倍體丹參(2n=3x=24)，通過道地丹參親本標記性狀和DNA條形碼可以確定被固定的道地丹參功能基因組的來源。
[0039]按照上述的步驟進行，2004— 2012年從全國12個省、市采集了 36個不同地理居群丹參，并在天津市北部山區(qū)薊縣建立了中國丹參種質(zhì)資源圃(圖1)。
[0040]經(jīng)2005— 2007年從形態(tài)學、化學、細胞生物學和分子生物學不同層面的研究，評選出33號、I號、135號種質(zhì)資源為我國道地丹參種質(zhì)資源。
[0041]隨后應用AFLP分子標記技術，以三聯(lián)密碼法(3個引物法)確定這3個道地丹參DNA條形碼，并以“紫花”和“白花”作為顯性與隱性形態(tài)性狀標記，隨后將33號(白花)和I號(紫花)道地丹參人工誘變成同源四倍體(2n=4x=32)，然后與相對標記性狀的二倍體丹參進行有性雜交，獲得同源三倍體丹參永久雜種(2 η = 3 X = 24)。例如:以白花隱性性狀的四倍體雜交，不論是做父本或是母本，其Fl三倍體均為紫花，即:白花4χ早X紫花2χ ? —3χ紫花，或紫花2χ早X白花4χ ? —3χ紫花。這樣，通過紫花與白花標記性狀和DNA條形碼就可知道其基因組來自哪個道地丹參親本。表1為采用高效液相色譜法測定其含量，綠色超級道地丹參主要藥物有效成分測定結(jié)果。
[0042]表1:
代號根條數(shù)/株根長根粗根重Kg/株丹參酮II A mg/g丹參酮I mg/g穩(wěn)丹參酮mg/g丹酸酸B mg/g RY3 50.25 57.50 18.20 2.4206.3891.07952.04662.992 注解:《中華人民共和國藥典》2005年版規(guī)定:丹參酮II A含量為0.2%，丹酚酸含量為3%。
【權利要求】
1.一種道地丹參的培育方法，其特征在于包括以下步驟: 1)收集全國野生丹參種質(zhì)資源建立丹參種質(zhì)資源圃，建立具有中國代表性的丹參種質(zhì)資源圃； 2)從形態(tài)學、細胞生物學(染色體水平)、分子生物學水平對中國丹參種質(zhì)資源進行研究，評選出具有代表性的道地丹參種質(zhì)資源； 3)對評選出的道地丹參種質(zhì)資源的基因組染色體結(jié)構(gòu)進行鑒定； 4)利用AFLP分子標記技術確定道地丹參DNA條形碼； 5)將一個具有隱性標記性狀的二倍體道地丹參和一個具有顯性標記性狀的二倍體(2x)道地丹參，分別進行人工誘變成同源四倍體:4x，含有4個相同的道地丹參功能基因組； 6)三倍體丹參雜交轉(zhuǎn)育，分別將具有隱性標記性狀(白花)和具有顯性標記性狀(紫花)的四倍體丹參，分別與具有相對性標記性狀的二倍體道地丹參，2x，含有2個相同道地丹參功能基因組，進行雜交轉(zhuǎn)育:4x早Χ2χ ?或2x早Χ4χ ?，獲得具有標記性狀的三倍體丹參永久雜種:3χ，含有3個相同道地丹參功能基因組； 7)脫毒處理:取三倍體丹參雜交當代種子幼苗莖尖或新生幼葉為外植體，用75%酒精和0.1%升汞進行脫毒處理； 8)組培苗克隆快繁:將脫毒處理完的材料接種在1/2MS+ 6ΒΑ1.5mg/L培養(yǎng)基上，在光周期14小時/天，光強度3000Lux，室溫20— 25°C條件下進行培養(yǎng)，待材料切割面產(chǎn)生叢生芽，轉(zhuǎn)入含1/2MS + 6BAlmg/L培養(yǎng)基上進行擴大繁殖； 9)瓶苗移栽，待瓶苗新根長2—3公分時，進行瓶苗移栽，移栽前2天打開瓶蓋練苗； 10)移栽苗管理，剛移出的瓶苗要半遮光，保持50%左右的濕度，加強管理成活率可達90%以上； 11)新品種評比試驗，按常規(guī)新品種評比試驗要求進行； 12)藥材產(chǎn)量、藥物主要有效成分含量測定，根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)定，對丹參酮II A、丹酚酸B和隱丹參酮進行測定； 13)道地丹參新品種認定:按上述程序，依據(jù)得到的丹參藥材產(chǎn)量和主要藥物有效成分含量，可培育出綜合生物學性狀好，抗生物及非生物脅迫能力強，全面提高50%以上的道地丹參新品種。
2.按照權利要求1所述的培育方法，其特征在于步驟8)所述的擴大繁殖采用每瓶接種5—10棵苗。
3.按照權利要求1所述的培育方法，其特征在于步驟9)所述的瓶苗移栽是用長攝子取出瓶苗，洗凈培養(yǎng)基，直接移栽在經(jīng)過事先堆積發(fā)酵好的磨姑泥與砂土 3:1混合營養(yǎng)缽中。
4.一種道地中藥丹參的培育方法，其特征在于包括以下步驟: O收集全國野生丹參種質(zhì)資源，建立具有代表性的丹參種質(zhì)資源圃； 2)從形態(tài)學、細胞生物學(染色體水平)、分子生物學水平對丹參種質(zhì)資源進行研究，評選出具有代表性的道地丹參種質(zhì)資源； 3)對評選出的道地丹參種質(zhì)資源的基因組染色體結(jié)構(gòu)進行鑒定； 4)利用AFLP分子標記技術確定道地丹參DNA條形碼； 5)將一個具有隱性標記性狀和一個具有顯性標記性狀的二倍體(2x)道地丹參，分別進行人工誘變成同源四倍體:4x，含有4個相同的道地丹參功能基因組； 6)三倍體丹參雜交轉(zhuǎn)育，分別將具有隱性標記性狀(如:白花)和具有顯性標記性狀(如:紫花)的四倍體丹參，分別與具有相對標記性狀的二倍體道地丹參(即2x，含有2個相同道地丹參功能基因組)進行雜交轉(zhuǎn)育:4x早Χ2χ ?或2x早Χ4χ ?，獲得具有標記性狀的三倍體丹參永久雜種:3χ，含有3個相同道地丹參功能基因組； 7)脫毒處理:以三倍體丹參雜交當代種子幼苗莖尖或新生幼葉為外植體，用75%酒精和0.1%升汞進行脫毒處理； 8)組培苗克隆快繁:將脫毒處理完的外植體接種在1/2MS+ 6ΒΑ1.5mg/L培養(yǎng)基上，在光周期14小時/天，光強度3000Lux，室溫20— 25°C條件下進行培養(yǎng)，待材料切割面產(chǎn)生叢生芽，轉(zhuǎn)入1/2MS + 6BAlmg/L培養(yǎng)基上，進行擴大繁殖，每瓶可接種5 —10棵苗； 9)瓶苗移栽:待瓶苗新根長1-2公分時，進行瓶苗移栽，移栽前2天先打開瓶蓋練苗，用長攝子取出瓶苗，洗凈培養(yǎng)基，直接移栽在經(jīng)過事先堆積發(fā)酵好的磨姑泥與砂土 3:1混合營養(yǎng)缽中。 10)移栽苗管理:剛移出的苗要半遮光，保持45-55%的濕度，按常規(guī)方法加強管理； 11)新品種評比試驗:按常規(guī)新品種評比試驗要求進行； 12)藥材產(chǎn)量、藥物主要有效成分含量測定:根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)定，對丹參酮II A、丹酚酸B和隱丹參酮進行測定； 13)道地丹參新品種認定:按上述程序，依據(jù)得到的丹參藥材產(chǎn)量和主要藥物有效成分含量，培育出綜和生物學性狀好，抗生物及非生物脅迫能力強的道地丹參新品種。
5.按照權利要求4所述的培育方法，其特征在于步驟5)所述的隱性標記性狀為白花，顯性標記性狀為紫花。
6.按照權利要求4所述的培育方法，其特征在于步驟6)所述的三倍體丹參雜交轉(zhuǎn)育是:將白花道地丹參和紫花道地丹參人工誘變成同源四倍體:2n=4x=32，然后與相對標記性狀的二倍體丹參進行有性雜交，獲得同源三倍體丹參永久雜種:2 η = 3 X = 24，即以白花隱性性狀的四倍體雜交，不論是做父本或是母本，其Fl三倍體均為紫花: 白花4χ早X紫花2χ ? — 3χ紫花，或紫花2χ早X白花4χ ? — 3χ紫花。
【文檔編號】A01H1/02GK103828705SQ201410013083
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權日:2014年1月13日
【發(fā)明者】陳瑞陽 申請人:陳瑞陽