本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，涉及中藥及中藥材鑒定領域，特別涉及一種用于鑒定霍山石斛的葉綠體微衛(wèi)星引物對及其應用。

背景技術：

霍山石斛（Dendrobium huoshanense）是安徽省大別山區(qū)特有的、國家重點保護的名貴中草藥，隸屬于蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）。由于霍山石斛同屬的近緣植物比較多，導致混淆品較多。目前市場上的一些混淆品包括廣東石斛、羅河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、疊鞘石斛、美花石斛和黃花石斛等。

霍山石斛與同屬混淆品的形態(tài)特征比較相近，外形鑒別比較困難，采用傳統的鑒定方法有一定的局限。因此，亟需尋找一種快速、準確的鑒定方法，以確?；羯绞幉蔫b定的準確性。丁小余等建立了楓斗類石斛的rDNA ITS全序列數據庫，其中包括霍山石斛一個單倍型的ITS序列，研究發(fā)現楓斗類石斛在ITS區(qū)的種間差異顯著而穩(wěn)定，并利用該數據庫對部分石斛屬植物進行了準確鑒別，但沒有進行霍山石斛樣品的鑒別（丁小余，王崢崢，徐紅，徐珞珊，周開亞，楓斗類石斛rDNA ITS區(qū)的全序列數據庫及其序列分析鑒別，藥學學報，2002，37（7）：567）。栗丹等利用DNA條形碼ITS序列對霍山石斛及其近緣物種進行了鑒定（栗丹，李振堅，毛萍，嚴雪鋒，淳澤，馬欣榮，基于ITS序列石斛材料的鑒定及系統進化分析，園藝學報，2012，39（8）：1539），但該方法需要進行測序，耗時較長，且使用大型儀器，不利于實現快速、現場檢測。

技術實現要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種用葉綠體微衛(wèi)星引物對鑒定或輔助鑒定霍山石斛的方法。

一種用葉綠體微衛(wèi)星引物對鑒定霍山石斛的操作步驟如下：

（1）提取待測樣品的DNA作為模板，采用引物對進行PCR擴增反應，得到PCR擴增產物；

所述引物對為：上游引物CPSSR1s：5’-CGTATGCGATAGAAGAAT-3’，

下游引物CPSSR1a：5’-ATCTGTAGATTGGGCTCT-3’；

（2）瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR擴增產物

若PCR擴增產物中含有282 bp的DNA片段，則所述待測樣品中含有霍山石斛；若PCR擴增產物中不含有282 bp的DNA片段，則所述待測樣品中不含有霍山石斛。

進一步限定的具體鑒定操作步驟如下：

步驟（1）PCR擴增反應中，PCR反應體系的總體積25 μL，其中0.5 μL待測樣品的DNA，1.0μL含量為10 pmol的上游引物CPSSR1s，1.0 μL含量為10 pmol的下游引物CPSSR1a，2.5 μL 10×buffer緩沖液，1.5 μL濃度為25 mM的氯化鎂水溶液，0.5 μL濃度為10 mM的dNTPs ，0.5 μL濃度為5U/μL的Taq DNA聚合酶，無菌雙蒸水補足至25 μL；

PCR擴增反應條件： 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

步驟（2）的具體操作如下：取5 μL PCR擴增產物，用2%的瓊脂糖凝膠，在電壓80-90V下電泳30分鐘，凝膠成像系統下觀察并拍照；若PCR擴增產物中含有282 bp的DNA片段，則所述待測樣品為霍山石斛；若PCR擴增產物中未含有282 bp的DNA片段，則所述待測樣品為非霍山石斛。

一種用葉綠體微衛(wèi)星引物對鑒定霍山石斛的檢測試劑盒，將PCR反應體系中的上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a分別單獨包裝；將除待測樣品的DNA、上游引物CPSSR1s和下游引物外CPSSR1a的其它物質混合均勻單獨包裝；將以上分別單獨包裝的物質放置于同一個試劑盒內，組成一個檢測試劑盒。

進一步限定的檢測試劑盒的技術方案如下：

根據進一步限定的鑒定操作技術方案所述的檢測試劑盒，在每次檢測時，需要從檢測試劑盒中取用不同的物質，各種物質所取的量必須滿足進一步限定的鑒定操作技術方案中PCR反應體系中各物質量的要求。

實驗證明，采用本發(fā)明所提供的引物對，通過快速PCR方法實現了霍山石斛與廣東石斛、羅河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、疊鞘石斛、美花石斛和黃花石斛等混淆品的快速、準確鑒別，實現藥材分子鑒別的現場運用提供技術支撐。

附圖說明

圖1為通用引物擴增凝膠電泳圖。M：DNA分子標準（DNA Marker，從上到下依次為2000、1000、750、500、250和100 bp）；1：霍山石斛；2：廣東石斛；3：羅河石斛；4：鼓槌石斛；5：球花石斛；6：聚石斛；7：疊鞘石斛；8：美花石斛；9：黃花石斛；10：空白對照。

圖2為特異性PCR引物對cpSSR1（上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a）擴增凝膠電泳圖。M：DNA分子標準（DNA Marker，從上到下依次為2000、1000、750、500、250和100 bp）；1：用特異性PCR引物對CPSSR1擴增1個霍山石斛樣本的結果；2：用特異性PCR引物對CPSSR1擴增1個廣東石斛的結果；3：用特異性PCR引物對CPSSR1擴增1個羅河石斛樣本的結果；4：用特異性PCR引物對CPSSR1擴增1個鼓槌石斛樣本的結果；5：用特異性PCR引物對CPSSR1擴增1個球花石斛樣本的結果；6：用特異性PCR引物對CPSSR1擴增1個聚石斛樣本的結果；7：用特異性PCR引物對CPSSR1擴增1個疊鞘石斛樣本的結果；8：用特異性PCR引物對CPSSR1擴增1個美花石斛樣本的結果；9：用特異性PCR引物對CPSSR1擴增1個黃花石斛樣本的結果；10：空白對照。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、用于鑒定霍山石斛的試劑盒的制備及使用方法

一、用于鑒定霍山石斛的引物對的設計與合成

從GenBank查找獲得霍山石斛葉綠體基因組全序列，GenBank登錄號為NC_028430。利用SSRIT軟件搜索葉綠體基因組全序列中的多核苷酸堿基重復序列，再通過SciRoKo 2.1軟件分析校正，共搜索得到簡單重復序列位點52個。利用primer5和oligo6軟件對含有(AT)₂₃簡單重復序列位點（葉綠體微衛(wèi)星位點）的兩端設計霍山石斛檢測特異性PCR引物，如下：

上游引物CPSSR1s：5’-CGTATGCGATAGAAGAAT-3’（序列1）；

下游引物CPSSR1a：5’-ATCTGTAGATTGGGCTCT-3’（序列2）。

理論PCR產物長度為282 bp（序列3）

二、用于鑒定霍山石斛的試劑盒的組裝

將PCR反應體系中，步驟一設計合成的上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a分別單獨包裝；將除待測樣品的DNA、上游引物CPSSR1s和下游CPSSR1a外的其它物質混合均勻單獨包裝；將以上分別單獨包裝的物質放置于同一個試劑盒內，組成本發(fā)明用于鑒定霍山石斛的檢測試劑盒。

三、鑒定待測樣品中是否含有霍山石斛的方法

采用步驟二的試劑盒按照包括如下步驟的方法鑒定待測樣品中是否含有霍山石斛：

1、PCR擴增

從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用步驟一設計合成的上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a外（序列1和序列2）按照如下進行PCR擴增：

PCR反應總體積25μL，包括以下試劑：0.5μL模板DNA，1.0μL上游引物CPSSR1s（10 pmol），1.0μL下游引物CPSSR1a（10 pmol），2.5μL 10×buffer緩沖液，1.5μL濃度為25 mM的MgCl₂水溶液，0.5μL濃度為10 mM的dNTPs ，0.5μL Taq DNA聚合酶（5U/μL），無菌雙蒸水補足至25μL。

PCR反應液配制完后，輕輕震蕩混勻，將PCR管放入PCR儀中，進行PCR擴增，具體反應條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2、PCR產物檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產物，具體如下：

取5μL擴增產物，采用2%的瓊脂糖凝膠，在電壓80-90V下電泳30分鐘，凝膠成像系統下觀察并拍照。根據目的條帶的大小，按照如下方法確定待測樣品中是否含有霍山石斛：若獲得大小約為282 bp的目的條帶（序列3），則所述待測樣品中含有霍山石斛；若沒有獲得大小為282 bp的目的條帶（序列3），則所述待測樣品中不含有霍山石斛。

實施例2、采用實施例1制備的試劑盒鑒定霍山石斛的特異性分析

待測樣品：霍山石斛（采自于安徽）、廣東石斛（采自于廣西）、羅河石斛（采自于廣西）、鼓槌石斛（采自于廣西）、球花石斛（采自于廣西）、聚石斛（采自于廣西）、疊鞘石斛（采自于廣西）、美花石斛（采自于廣西）和黃花石斛（采自于廣西）。均符合中國植物志的鑒別特征描述。通過鑒定，各樣品的實物與名稱相符，質量符合標準。

一、從待測樣品中提取基因組DNA

分別取約50 mg干燥樣品（當然也可采用100 mg新鮮樣品進行基因組DNA提取），用CTAB法提取總DNA。具體如下：

將無霉變的干燥藥材置于粉碎機中研磨粉碎，過40目篩。將粉末轉移到2.0 mL的微量離心管中，加入900 μL已滅菌的CTAB提取液（配方：2%(2g/100ml)CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl）、0.02 g PVP 40000、10 μL β-巰基乙醇充分振蕩混勻，65℃水浴1.5 h-2 h，期間輕搖2-3次。結束后取出冷卻至室溫，加入900 μL氯仿-異戊醇（體積比24：1），充分振蕩混勻，12000 g離心10 min。取上清，加入等體積氯仿-異戊醇（體積比24：1），充分振蕩混勻，12000 g離心10 min。取上清，加入2/3體積預冷的異丙醇溶液，-20℃放置0.5 h以上。取出，12000 g離心10 min，棄上清，沉淀用70 %（體積分數）乙醇洗滌兩次，37℃揮干乙醇，用適量滅菌水溶解，-20℃保存。

用通用引物TY2s和TY2a檢測以上提取的霍山石斛、廣東石斛、羅河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、疊鞘石斛、美花石斛和黃花石斛的基因組DNA質量。

TY2s：5’- CGCCATATTGATTGACACG-3’；

TY2a：5’- GGCAGCCAACGAGAAGA-3’。

反應總體系為25μL，包括DNA模板0.5μL（5- 50ng），上游引物1μL（10 pmol），下游引物1μL（10 pmol），10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl₂（25 mM）1.5μL，dNTPs（10 mM）0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL） 0.5μL，ddH₂O補足至25μL。通用引物PCR反應條件為：95℃ 5 min、35個循環(huán)（每個循環(huán)包括95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s）、72 ℃ 10 min。

結果發(fā)現所有樣品均能擴增出DNA條帶（圖1）。

二、PCR擴增

以步驟一從待測樣品中提取的基因組DNA為模板，采用實施例1步驟一設計的引物對（上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a）進行PCR擴增。具體的反應體系和反應條件同實施例1步驟三1。實驗同時設置以雙蒸水為模板作為陰性對照。實驗重復三次。

反應結束后，按照實施例1中步驟三2的方法對待測樣品進行鑒定。

結果如圖2所示，從圖2中可以看出：

利用本發(fā)明的引物對（上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a）對霍山石斛、廣東石斛、羅河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、疊鞘石斛、美花石斛和黃花石斛進行檢測，霍山石斛能夠擴增出片段大小約為282 bp的目的條帶。而廣東石斛、羅河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、疊鞘石斛、美花石斛和黃花石斛均未擴增出目的條帶。這表明該反應體系能將霍山石斛分別與廣東石斛、羅河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、疊鞘石斛、美花石斛和黃花石斛準確的鑒別出來。將大小約為282 bp的目的條帶回收測序，其序列正為序列表中序列3。