本發(fā)明涉及一種制備高含量霍山石斛多糖的方法。

背景技術(shù)：

石斛為蘭科石斛屬植物，是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)中一種名貴藥材，其有效成分主要為多糖和生物堿，其中，石斛的品質(zhì)優(yōu)劣在很大程度上取決于石斛中多糖的含量多少。而石斛中以霍山石斛最為著名，霍山石斛多糖的藥理作用主要表現(xiàn)在免疫、強(qiáng)壯、抗衰老、抗腫瘤等作用。隨著社會(huì)發(fā)展，人們對(duì)健康的關(guān)注越來越高，其需求量也會(huì)越來越大，但傳統(tǒng)霍山石斛多糖的提取方法是用霍山石斛屬植物的根、莖、葉等植物體提取所得，這種工藝所得的產(chǎn)品已經(jīng)不能滿足未來市場(chǎng)對(duì)霍山石斛精深加工的需求。雖然，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了不少霍山石斛的加工方法，但效果甚微，因此研究重點(diǎn)又回歸到從霍山石斛粗粉中盡可能多的將多糖成分提取出來這一觀點(diǎn)上。因此開發(fā)一種高效、高產(chǎn)率的霍山石斛多糖類提取方法是十分有意義的。

隨著植物細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，利用植物細(xì)胞增殖技術(shù)進(jìn)行快速繁殖，并使用植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行調(diào)節(jié)植株生長速度研究的越來越多。利用細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)霍山石斛多糖的技術(shù)，在國內(nèi)外早有研究，也取得了諸多成果，但在生產(chǎn)過程中存在很多難題問題，如工藝復(fù)雜、生物量增速低、目標(biāo)產(chǎn)物收率低、生產(chǎn)周期長等。尋求一種能夠快速繁殖并短時(shí)間能使得霍山石斛能夠生長至多糖含量最高水平的方法，具有重要意義及應(yīng)用前景。因此開發(fā)一種制備高含量霍山石斛多糖類天然產(chǎn)物的方法是十分有意義的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種制備高含量霍山石斛多糖的方法，所述方法能夠大幅度縮短霍山石斛的細(xì)胞培養(yǎng)及植株成長周期，能在短時(shí)間內(nèi)生長到多糖含量最高階段，能大大提高霍山石斛多糖的產(chǎn)率，且工藝比較簡單、穩(wěn)定，環(huán)境友好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明涉及一種制備高含量霍山石斛多糖的方法，包括如下步驟：

（1）選擇霍山石斛原球莖做外植體，經(jīng)前處理，于無菌接種室中接種培養(yǎng)，再誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)；

（2）繼代生根培養(yǎng)，形成單株；

（3）形成單株后，在植株生長的不同階段添加不同的生長調(diào)節(jié)劑，使得植株快速生長，達(dá)到預(yù)期效果。

優(yōu)選地，所述步驟（1）中，所述前處理方法為：清洗霍山石斛原球莖并用酒精擦洗，剝?nèi)ハ虏咳~片及葉鞘，在0.1~0.15%升汞中浸泡5~10min，再在5~10%的次氯酸鈉溶液中浸泡10~15min，再用蒸餾水清洗至無異味。

優(yōu)選地，所述步驟（1）中，原球莖前處理后，將處理好的霍山石斛原球莖，除去外表皮，保留莖尖，并將其接種到培養(yǎng)基中，無菌培養(yǎng)10~20天。

優(yōu)選地，所述步驟（1）中，誘導(dǎo)培養(yǎng)即將接種培養(yǎng)的莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)15~20天。

優(yōu)選地，所述步驟（2）中，所述繼代生根培養(yǎng)為將誘導(dǎo)生成的不定芽接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待苗生長至2~4cm，有4~6片葉及4~6條跟時(shí)，進(jìn)行移栽。

優(yōu)選地，所述步驟（3）中，使用的生長調(diào)節(jié)劑包括生長調(diào)節(jié)劑A，生長調(diào)節(jié)劑B，生長調(diào)節(jié)劑C；所述生長調(diào)節(jié)劑A包括吲哚丁酸、多效唑和復(fù)硝酚鈉，移栽后5~7天使用；所述生長調(diào)節(jié)劑B多效唑、三碘苯甲酸和赤霉素，生長調(diào)節(jié)劑A使用后15~20天使用；所述生長調(diào)節(jié)劑C包括酶制劑、增甘膦及皮克斯，在生長調(diào)節(jié)劑B使用15~20天后使用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

本發(fā)明所述制備方法能夠大幅度縮短霍山石斛的細(xì)胞培養(yǎng)及植株成長周期，能在短時(shí)間內(nèi)生長到多糖含量最高階段，能大大提高霍山石斛多糖的產(chǎn)率，且工藝比較簡單、穩(wěn)定，環(huán)境友好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例涉及一種制備高含量霍山石斛多糖的方法，具體步驟如下：

（1）選擇生長健壯、活力旺盛的霍山石斛原球莖做外植體，先用水清洗，再用酒精擦洗，剝?nèi)ハ虏咳~片及葉鞘，在0.12%升汞中浸泡8min，再在8%的次氯酸鈉溶液中浸泡10min，再用蒸餾水清洗至無異味。將處理好的霍山石斛原球莖，出去外表皮，保留莖尖，并將其接種到培養(yǎng)基中，無菌培養(yǎng)15天。將接種培養(yǎng)的莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)15天。

（2）繼代生根培養(yǎng)，將誘導(dǎo)生成的不定芽接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待苗生長至2~4cm，有4~6片葉及4~6條根時(shí)，進(jìn)行移栽。

（3）移栽后5~7天使用生長調(diào)節(jié)劑A包括吲哚丁酸12份、多效唑15份和復(fù)硝酚鈉3份；生長調(diào)節(jié)劑A使用后15~20天使用生長調(diào)節(jié)劑B包括多效唑10份、三碘苯甲酸12份和赤霉素10份；在生長調(diào)節(jié)劑B使用15~20天后使用生長調(diào)節(jié)劑C包括酶制劑10份、增甘膦10份及皮克斯12份。

（4）培養(yǎng)所得的霍山石斛植株，按照常規(guī)方法制成霍山石斛粗粉，并取50g粗粉進(jìn)行霍山石斛多糖提取，最后獲得目標(biāo)產(chǎn)物霍山石斛多糖9.66g，收率19.33%。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例涉及一種制備高含量霍山石斛多糖的方法，具體步驟如下：

（1）選擇生長健壯、活力旺盛的霍山石斛原球莖做外植體，先用水清洗，再用酒精擦洗，剝?nèi)ハ虏咳~片及葉鞘，在0.1%升汞中浸泡10min，再在5%的次氯酸鈉溶液中浸泡15min，再用蒸餾水清洗至無異味。將處理好的霍山石斛原球莖，出去外表皮，保留莖尖，并將其接種到培養(yǎng)基中，無菌培養(yǎng)20天。將接種培養(yǎng)的莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)20天。

（2）繼代生根培養(yǎng)，將誘導(dǎo)生成的不定芽接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待苗生長至2~4cm，有4~6片葉及4~6條根時(shí)，進(jìn)行移栽。

（3）移栽后5~7天使用生長調(diào)節(jié)劑A包括吲哚丁酸10份、多效唑15份和復(fù)硝酚鈉3份；生長調(diào)節(jié)劑A使用后15~20天使用生長調(diào)節(jié)劑B包括多效唑10份、三碘苯甲酸10份和赤霉素8份；在生長調(diào)節(jié)劑B使用15~20天后使用生長調(diào)節(jié)劑C包括酶制劑10份、增甘膦5份及皮克斯8份。

（4）培養(yǎng)所得的霍山石斛植株，按照常規(guī)方法制成霍山石斛粗粉，并取50g粗粉進(jìn)行霍山石斛多糖提取，最后獲得目標(biāo)產(chǎn)物霍山石斛多糖9.61g，收率19.22%。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例涉及一種制備高含量霍山石斛多糖的方法，具體步驟如下：

（1）選擇生長健壯、活力旺盛的霍山石斛原球莖做外植體，先用水清洗，再用酒精擦洗，剝?nèi)ハ虏咳~片及葉鞘，在0.15%升汞中浸泡5min，再在10%的次氯酸鈉溶液中浸泡10min，再用蒸餾水清洗至無異味。將處理好的霍山石斛原球莖，出去外表皮，保留莖尖，并將其接種到培養(yǎng)基中，無菌培養(yǎng)10天。將接種培養(yǎng)的莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)15天。

（2）繼代生根培養(yǎng)，將誘導(dǎo)生成的不定芽接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待苗生長至2~4cm，有4~6片葉及4~6條根時(shí)，進(jìn)行移栽。

（3）移栽后5~7天使用生長調(diào)節(jié)劑A包括吲哚丁酸15份、多效唑20份和復(fù)硝酚鈉5份；生長調(diào)節(jié)劑A使用后15~20天使用生長調(diào)節(jié)劑B包括多效唑15份、三碘苯甲酸15份和赤霉素15份；在生長調(diào)節(jié)劑B使用15~20天后使用生長調(diào)節(jié)劑C包括酶制劑15份、增甘膦15份及皮克斯15份。

（4）培養(yǎng)所得的霍山石斛植株，按照常規(guī)方法制成霍山石斛粗粉，并取50g粗粉進(jìn)行霍山石斛多糖提取，最后獲得目標(biāo)產(chǎn)物霍山石斛多糖9.53g，收率19.06%。

對(duì)比例1

選取播種生長8個(gè)月的霍山石斛組培苗，將組培苗洗凈瀝干后殺青，再70℃干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆?。?0g粗粉進(jìn)行霍山石斛多糖提取，稱量得到的霍山石斛多糖的重量為8.28g，收率為16.57%。

通過上述對(duì)比，可以很清楚的判定本發(fā)明所述的方法所培育出的霍山石斛中多糖含量明顯高于常規(guī)生長環(huán)境下獲得的霍山石斛植株中多糖的含量，本發(fā)明具有較好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的制備高含量霍山石斛多糖的方法利用快速繁殖技術(shù)進(jìn)行繁殖，再通過不同的植物生長調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)作用下，使得霍山石斛快速生長，在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到多糖含量最高值的一種方法，所述方法能夠大幅度縮短霍山石斛的細(xì)胞培養(yǎng)及植株成長周期，能在短時(shí)間內(nèi)生長到多糖含量最高階段，能大大提高霍山石斛多糖的產(chǎn)率，且工藝比較簡單、穩(wěn)定，環(huán)境友好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。