本發(fā)明涉及一種利用組培苗葉片再生不定芽途徑快速繁育羊躑躅的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

羊躑躅(Rhododendron molle(Blume)G.Don)，又名鬧羊花、黃杜鵑、黃色映山紅，隸屬于杜鵑花科杜鵑花屬羊躑躅亞屬落葉灌木，是中國羊躑躅亞屬中僅有的一個原生種。羊躑躅是有待開發(fā)的優(yōu)良的園林綠化樹種，可引種馴化成為露地栽培的園藝觀賞植物，是杜鵑花色品種改良的重要資源。同時它也是珍稀瀕危藥用植物，全株器官均含有多種活性成分，花、根、果實等均可供藥用，具有祛濕、除風(fēng)、解痛等功效，可用于治療風(fēng)濕、頑癬和疼痛等癥；對農(nóng)作物蟲害的防治也有一定的作用，是開發(fā)綠色農(nóng)藥的植物源。羊躑躅主要是通過種子、扦插等方式繁殖。然而羊躑躅種子細(xì)小難采集，且種子萌發(fā)率較低，種子苗生長緩慢，距開花結(jié)果的時間較長；以扦插、嫁接方式繁殖又存在生根率及移栽成活率極低等問題，使其開發(fā)及利用受到極大限制。因此，亟待采取有效的方法對羊躑躅加以繁殖，使之能夠規(guī)模化生產(chǎn)，滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求。

利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖羊躑躅可以不受季節(jié)和環(huán)境條件等因素的影響，并能得到大規(guī)模整齊的瓶苗，且繁殖系數(shù)高，是解決上述難題的重要途徑。國內(nèi)羊躑躅組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究是通過剪取羊躑躅的枝條獲得無菌組培苗，進(jìn)一步通過剪取組培苗的莖節(jié)，誘導(dǎo)和培養(yǎng)嫩莖段腋芽叢生的方式建立羊躑躅離體培養(yǎng)和植株再生體系，芽叢的增殖率為4-5倍以上(顧宏輝,袁群英,朱春艷,朱丹華.羊躑躅的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(4):683；顧地周,陸爽,巴春影,李媛媛.羊躑躅嫩莖離體培養(yǎng)和植株再生[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2010,43(4):574-578)；以誘導(dǎo)和培養(yǎng)嫩莖段腋芽叢生的方式建立的快繁體系不能作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系對羊躑躅進(jìn)行遺傳改良。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本申請以羊躑躅組培苗頂生第三至第五個葉片為外植體材料，通過篩選不同的葉片切割方式、暗培養(yǎng)時間及細(xì)胞分裂素和生長素組合，提高葉片不定芽的誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)目，建立高頻率植株再生技術(shù)體系，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

一種利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法，其具體步驟如下：

A)在超凈工作臺上剪取羊躑躅無菌組培苗頂生第三到第五個葉片(該葉片不太老也不太嫩，成熟度適中))，對葉片垂直于主脈切割一刀并去除葉柄和葉稍；

B)將葉片置于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)10-15天后進(jìn)行光照培養(yǎng)，同時觀察葉片，可發(fā)現(xiàn)光照培養(yǎng)13-16天左右，切口處開始出現(xiàn)不定芽；

C)光照培養(yǎng)35天后，將帶不定芽的葉片轉(zhuǎn)到不定芽生長培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，30d后形成幼苗；

D)將幼苗切下，轉(zhuǎn)移到成苗和生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行成苗和生根培養(yǎng)，30d后，幼苗即發(fā)育成具有根、莖和葉的完整再生植株。

WPM培養(yǎng)基：由WPM大量元素(990mg/L K₂SO₄、180.5mg/L MgSO₄、400mg/L NH₄NO₃、170mg/L KH₂PO₄、471mg/LCa(NO₃)₂·4H₂O和72.5mg/L CaCl₂)、WPM微量元素(0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、22.3mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、6.2mg/LH₃BO₃和36.7mg/L FeNa-EDTA)與WPM有機(jī)物(100mg/L肌醇、1.0mg/L鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸吡哆醇、0.5mg/L煙酸和2.0mg/L甘氨酸)組成，8g/L的瓊脂粉作為固化劑。

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：向WPM培養(yǎng)基中加入終濃度為1.0mg/L的細(xì)胞分裂素噻苯隆TDZ、終濃度為1.0mg/L的生長素吲哚乙酸IAA、終濃度為30g/L的蔗糖，高壓滅菌，氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整pH值至5.8；

不定芽生長培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基中加入終濃度為1.0mg/L的細(xì)胞分裂素玉米素ZT、終濃度為0.1-0.5mg/L的生長素吲哚丁酸IBA、終濃度為30g/L蔗糖，高壓滅菌，氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整pH值至5.8；

成苗和生根培養(yǎng)基：按照1/2WPM培養(yǎng)基(即WPM培養(yǎng)基中各元素、有機(jī)物添加量減半)，加入終濃度為10-12.5mg/L的生長素吲哚丁酸IBA、終濃度為15g/L的蔗糖、終濃度為0.3g/L的活性炭，高壓滅菌，氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整pH值至5.8。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法中，步驟B)所述光照培養(yǎng)是指：光照強(qiáng)度為1500lx，光照時間為12h/d；培養(yǎng)室溫度為25±2℃。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法中，步驟D)所述成苗和生根培養(yǎng)培養(yǎng)是指：光照強(qiáng)度為1500lx，光照時間為12h/d；培養(yǎng)室溫度為25±2℃。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法中，無菌組培苗葉片暗處理后不定芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生、成苗和生根培養(yǎng)均在光照條件下進(jìn)行，光照強(qiáng)度為1500lx，光照時間為12h/d；培養(yǎng)室溫度為25±2℃。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法中，步驟A)所述組培苗是這樣獲得的：剪取當(dāng)年羊躑躅帶有4～6個側(cè)芽的新發(fā)枝條3～5cm，通過組織培養(yǎng)方法(顧宏輝,袁群英,朱春艷,朱丹華.羊躑躅的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(4):683))獲得羊躑躅無菌組培苗。

本發(fā)明在前人研究基礎(chǔ)上，采用羊躑躅組培快繁中丟棄不用的葉片為材料，通過誘導(dǎo)葉片直接再生不定芽建立了羊躑躅的快速繁殖體系，增殖系數(shù)提高到7倍以上；通過采用羊躑躅無菌組培苗葉片誘導(dǎo)直接再生不定芽，避免了羊躑躅組織培養(yǎng)過程中外植體需要滅菌、污染率高等問題；通過解決葉片再生不定芽的葉片切割方式、暗培養(yǎng)時間、最適宜培養(yǎng)基組分以及不定芽生長和組培苗生根等關(guān)鍵技術(shù)問題，建立了羊躑躅快速、高效的繁殖體系，最終實現(xiàn)羊躑躅在短時間內(nèi)大量、快速、高質(zhì)量的繁殖，有效地滿足人們對羊躑躅日益增長的需求；同時這個快速繁殖體系也可以作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系對羊躑躅進(jìn)行遺傳改良，具有較大的科研價值和經(jīng)濟(jì)價值。

附圖說明

圖1為組培苗葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽示意圖片。

圖2為不定芽伸長示意圖片。

圖3為不定芽長成幼苗示意圖片。

圖4為組培苗生根培養(yǎng)示意圖片。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖實施例詳細(xì)說明本發(fā)明所具有的有益效果，旨在幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，但不能對本發(fā)明的實施和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限定。

實施例涉及材料來源：

羊躑躅地栽苗由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所觀賞植物與茶研究室提供；

蔗糖、瓊脂、生長素吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，簡稱IAA)、吲哚丁酸(3-indolebutyric acid，簡稱IBA)和細(xì)胞分裂素玉米素(Zeatin，簡稱ZT)均購自南京鼎國生物技術(shù)有限公司；

細(xì)胞分裂素噻苯隆(Thidiazuron)簡稱TDZ，購于南京生興生物技術(shù)有限公司；

實施例涉及的培養(yǎng)基：

WPM培養(yǎng)基：由WPM大量元素(990mg/L K₂SO₄、180.5mg/L MgSO₄、400mg/L NH₄NO₃、170mg/L KH₂PO₄、471mg/LCa(NO₃)₂·4H₂O和72.5mg/L CaCl₂)、WPM微量元素(0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、22.3mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、6.2mg/LH₃BO₃和36.7mg/L FeNa-EDTA)與WPM有機(jī)物(100mg/L肌醇、1.0mg/L鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸吡哆醇、0.5mg/L煙酸和2.0mg/L甘氨酸)組成，8g/L的瓊脂粉作為固化劑。(該培養(yǎng)基為木本植物組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基，也可參見LloydGB,McCownBH.Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel,Kalmia latifolia,by use of shoot-tip culture[J].Comb.Proc.Int.Plant Prop.Soc.,1980,30:421-426制備方法)；

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基中加入終濃度為1.0mg/L的細(xì)胞分裂素噻苯隆TDZ、終濃度為1.0mg/L的生長素吲哚乙酸IAA、終濃度為30g/L的蔗糖，氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整pH值至5.8，高壓滅菌；

不定芽生長培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基中加入終濃度為1.0mg/L的細(xì)胞分裂素玉米素(ZT)、終濃度為0.1-0.5mg/L的生長素吲哚丁酸(IBA)、終濃度為30g/L蔗糖，氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整pH值至5.8，高壓滅菌；

成苗和生根培養(yǎng)基：按照1/2WPM培養(yǎng)基(即WPM培養(yǎng)基中各元素、有機(jī)物添加量減半)，加入終濃度為10-12.5mg/L的生長素吲哚丁酸IBA、終濃度為15g/L的蔗糖、終濃度為0.3g/L的活性炭，氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整pH值至5.8，高壓滅菌；

Aderson培養(yǎng)基：由Aderson大量元素、Aderson微量元素和Aderson有機(jī)物組成(具體參見Anderson WC.A revised tissue culture medium for shoot multiplication of Rhododendron[J].J.Amer.Soc.Hort Sci..,1984,109:343-4347)。

實施例1

1、羊躑躅無菌組培苗的獲得與增殖

剪取羊躑躅3～5cm長，當(dāng)年新發(fā)枝條(帶有4～6個側(cè)芽)，應(yīng)用組織培養(yǎng)方法(顧宏輝,袁群英,朱春艷,朱丹華.羊躑躅的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(4):683)獲得無菌苗并對其進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

2、葉片切割方式對葉片直接再生不定芽的影響

剪取步驟1中羊躑躅無菌組培苗頂生第三至第五個葉片，分別采取以下四種處理方式：

(1)不切割；

(2)垂直于主脈切割一刀；

(3)垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍；

(4)垂直于主脈切割兩刀并去葉柄和葉稍。

分別將經(jīng)過這四種不同方式處理的葉片接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度為25±2℃(該溫度為暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)溫度)，暗培養(yǎng)10天后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)35d(光照強(qiáng)度為1500lx，光照時間為12h/d；)后統(tǒng)計葉片不定芽誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)，其結(jié)果如表1所示：

表1不同切割方式對葉片直接再生不定芽的影響

表1結(jié)果表明，在光照培養(yǎng)35天調(diào)查時，第(1)和第(2)種葉片切割方式的葉片很少有不定芽再生；而采用第(3)種方式，即垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍的切割方式有效地提高了葉片直接再生不定芽的頻率，且不定芽主要發(fā)生在葉片切口處(如圖1所示)，葉片再生不定芽百分率達(dá)86.2％，平均再生芽數(shù)4.7個/葉片；而采用第(4)種方法葉片再生率顯著降低，主要原因可能是切口過多導(dǎo)致葉片死亡率增加，從而降低了其再生頻率。

3、基本培養(yǎng)基類型對葉片直接再生不定芽的影響

剪取步驟1中羊躑躅無菌組培苗頂生第三至第五個葉片，采取垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍的切割方式接種于WPM培養(yǎng)基和Aderson培養(yǎng)基中，并分別附加終濃度TDZ 0.2mg/L+IAA 1.0mg/L的激素組合，培養(yǎng)室溫度為25±2℃，暗培養(yǎng)10天后進(jìn)行光照培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為1500lx，光照時間為12h/d)，35d后統(tǒng)計葉片誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)，結(jié)果如表2所示：

表2不同培養(yǎng)基對葉片直接再生不定芽的影響

由表2可見，葉片外植體在WPM培養(yǎng)基上的再生率和再生芽數(shù)與Anderson培養(yǎng)基沒有顯著差異，但Anderson培養(yǎng)基上葉片再生的不定芽葉色偏黃，質(zhì)量不如WPM培養(yǎng)基上的不定芽。

4、暗培養(yǎng)時間對葉片直接再生不定芽的影響

剪取步驟1中羊躑躅無菌組培苗頂生第三至第五個葉片，采取垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍的切割方式接種于WPM培養(yǎng)基中(加入終濃度為0.2mg/L的TDZ和終濃度為1.0mg/L的IAA)，分別進(jìn)行0天、5天、10天、15天和20天五個時間點的暗培處理。處理完后將其置于光照環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)35d后統(tǒng)計葉片誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)。處理結(jié)果如表3所示：

表3暗培養(yǎng)時間對葉片直接再生的影響

表3結(jié)果表明暗培養(yǎng)對羊躑躅不定芽再生有一定促進(jìn)作用；暗培養(yǎng)為10-15天，葉片的再生頻率和平均再生芽數(shù)均顯著高于其它處理。因此，葉片外植體最佳的暗培養(yǎng)時間為10-15天。

5、不同植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片直接再生不定芽的影響

剪取步驟1中羊躑躅無菌組培苗頂生第三至第五個葉片，采取垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍的切割方式接種于包含不同激素組合的WPM培養(yǎng)基上：不同濃度TDZ(分別為0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L和1.0mg/L)與IAA(1.0mg/L和2.0mg/L)的完全隨機(jī)組合，結(jié)果如表4所示：

表4不同激素配比對葉片直接再生的影響

表4結(jié)果可見，在基本培養(yǎng)基(WPM)和培養(yǎng)條件相同的情況下，接種于激素配比終濃度為TDZ 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L培養(yǎng)基(因此選擇其作為不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并加入蔗糖，給植物提供能量)上的葉片外植體再生率和分化芽數(shù)最高，顯著高于其它激素配比。

6、不定芽伸長生長：

將在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)(培養(yǎng)方式同上述暗培養(yǎng))10天后的葉片繼續(xù)進(jìn)行光照培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為1500lx，光照時間為12h/d；培養(yǎng)室溫度為25±2℃)35天產(chǎn)生不定芽的葉片轉(zhuǎn)到不定芽生長培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代(如圖2所示)，30d后形成幼苗(如圖3所示)。

7、成苗和生根培養(yǎng)

將步驟6培養(yǎng)30d天后形成的幼苗切下轉(zhuǎn)移到成苗和生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d后，幼苗發(fā)育成具有根、莖和葉的完整小植株(如圖4所示)，生根率達(dá)95％以上。

成苗后如果不適宜大田栽培，可以移入溫房栽培，待機(jī)再移出。

實施例2

1、羊躑躅、江南春早和胭脂蜜3個杜鵑品種無菌組培苗的獲得與增殖

分別剪取羊躑躅、江南春早和胭脂蜜3～5cm長，當(dāng)年新發(fā)枝條(帶有4～6個側(cè)芽)，應(yīng)用組織培養(yǎng)方法(顧宏輝,袁群英,朱春艷,朱丹華.羊躑躅的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(4):683)獲得無菌苗并對其進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

2、羊躑躅、江南春早和胭脂蜜3個杜鵑品種對本發(fā)明的平行試驗

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基中加入終濃度為1.0mg/L的細(xì)胞分裂素噻苯隆TDZ、終濃度為1.0mg/L的生長素吲哚乙酸IAA、終濃度為30g/L的蔗糖，氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整pH值至5.8，高壓滅菌；

分別剪取步驟1中羊躑躅、江南春早和胭脂蜜無菌組培苗頂生第三至第五個葉片，采取垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍的切割方式接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度為25±2℃，暗培養(yǎng)10天后進(jìn)行光照培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為1500lx，光照時間為12h/d)，35d后統(tǒng)計葉片誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)，結(jié)果如表5所示：

表5羊躑躅、江南春早和胭脂蜜3個杜鵑品種對本發(fā)明的平行試驗

表5顯示杜鵑品種江南春早組培苗葉片直接再生不定芽的頻率僅為30％，而杜鵑品種胭脂蜜組培苗葉片不能產(chǎn)生不定芽。表5結(jié)果表明本發(fā)明的葉片切割方式、暗培養(yǎng)時間及不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基只適用于杜鵑品種羊躑躅，對杜鵑品種江南春早和胭脂蜜并不適用，進(jìn)而證明本發(fā)明不適宜其他同類產(chǎn)品，為羊躑躅專屬快速繁殖方法。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)該指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干修改和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。