本發(fā)明涉及一組用于金黃色葡萄球菌多重耐藥基因檢測的液態(tài)芯片引物及其探針，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2010年，隨著“超級細菌”這一名詞頻繁地見諸報端，細菌多重耐藥、抗生素的合理使用重返人們視線。超級細菌其實并非新事物，它不是一個細菌的名稱，而是一類細菌的名稱，這一類細菌的共性是對幾乎所有的抗生素都有強勁的耐藥性，它們一直存在并且隨著人類濫用抗生素而進化出強大耐藥性。細菌耐藥性，尤其是多重耐藥性(multidrugresistance,MDR)已經(jīng)成為非常嚴重的醫(yī)療問題及社會問題。
細菌耐藥機理十分復雜，在抗生素的壓力選擇下，臨床細菌耐藥狀況的日益惡化。細菌耐藥性的檢測與監(jiān)測對于正確的目標性抗感染治療以及監(jiān)測細菌耐藥性變遷和耐藥菌感染的流行病學調(diào)查，制定防控細菌耐藥性增加的措施至關(guān)重要。然而，目前臨床實驗室多采用耐藥表型的檢測方法，其檢測周期長時效性差、檢測通量低、影響因素多是最主要的問題，不能滿足目前臨床抗感染治療和醫(yī)院感染控制的要求。
液態(tài)芯片(又稱流式熒光技術(shù)、液相芯片、懸浮陣列等)是在后基因組時代發(fā)展起來的新一代標準化開放式高通量技術(shù)平臺，它有機地整合了編碼微球、激光技術(shù)、應用流體學、最新的高速數(shù)字信號處理器和計算機運算法則，具有高通量、高速度、低成本、靈敏度高、重復性好、線性范圍廣等優(yōu)點，可廣泛應用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體和配體識別分析等研究，也是是目前唯一得到權(quán)威機構(gòu)和醫(yī)學界共同認可用于臨床診斷的生物芯片平臺。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：利用液態(tài)芯片技術(shù)，提供一組使金黃色葡萄球菌的5種耐藥基因的PCR產(chǎn)物能在一個雜交條件下完成特異性雜交的引物組和探針。
本發(fā)明所述金黃色葡萄球菌5個多重耐藥基因包括MecA、qacA、aac(6′)-aph(2″)、ermA、TetM。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
本發(fā)明提供的一組用于金黃色葡萄球菌多重耐藥基因檢測的液態(tài)芯片引物，所述5個耐藥基因的引物序列為：
一組用于金黃色葡萄球菌多重耐藥基因檢測的液態(tài)芯片探針，所述5個耐藥基因的探針序列為：
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明提供的是一個引物和探針的組合，這5組引物和探針之間無交叉反應，形成一個多重引物組合，不能將其單獨分開。所述的引物和探針組合用于液態(tài)芯片，可以同時檢測金黃色葡萄球菌多重耐藥基因。
具體實施方式
實施例1
一組用于金黃色葡萄球菌多重耐藥基因檢測的液態(tài)芯片引物，所述5個耐藥基因的引物序列為：
一組用于金黃色葡萄球菌多重耐藥基因檢測的液態(tài)芯片探針，所述5個耐藥基因的探針序列為：
實施例2特異性驗證：
1.分別取MecA、qacA、aac(6′)-aph(2″)、ermA、TetM耐藥的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液，提取DNA。利用上述的引物配制多重PCR反應體系(40ul)：
2.配制的反應體系按下述程序擴增：
a)第一階段：95℃，10min，1個循環(huán)。
b)第二階段：95℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；40個循環(huán)。
c)第三階段：72℃，10分鐘,1個循環(huán)。
3.擴增后的PCR產(chǎn)物利用Luminex流式分析儀進行分析，步驟如下：
a.根據(jù)PCR反應的管數(shù)，用剪刀剪取相應大小的微孔雜交板。打開Luminex儀器預熱，并將儀器上微孔板適配銅板的溫度設定在48℃。
b.將微球雜交液試劑瓶置于渦旋儀上振蕩30秒，使微球充分混懸在溶液中。并在每一個雜交孔中加入22μl；
c.每個樣本吸取PCR擴增產(chǎn)物3μl，并依次加入到相應的上述雜交孔中，并抽吸幾次加以混勻；
d.剪取相應大小的封板紙，將微孔雜交板覆蓋封口。請用指壓封口數(shù)次，確保封嚴，以防在高溫變性和雜交時溶液蒸發(fā)；
e.將雜交板置于金屬恒溫浴(可以用PCR儀代替)，把儀器的蓋子壓緊已封口的雜交板，以防封板膜在加熱后張開，導致液體蒸發(fā)。變性和雜交過程運行如下程序：
95℃ 5分鐘 變性
48℃ 30分鐘 雜交
f.小心將封板紙撕下，每孔加入熒光素SA-PE 75μl，并抽吸幾次加以混勻。加完后將封板紙重新粘好，繼續(xù)在48℃下孵育15分鐘；
g.將微孔雜交板快速轉(zhuǎn)移至預熱好的Luminex流式分析儀上進行閱讀，得到檢測結(jié)果。
4.MecA、qacA、aac(6′)-aph(2″)、ermA、TetM耐藥金黃色葡萄球菌雜交檢測結(jié)果如下表，結(jié)果表明設計的引物和檢測探針具有良好的特異性。
實施例3靈敏度驗證
分別取MecA、qacA、aac(6′)-aph(2″)、ermA、TetM耐藥的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液，菌落計數(shù)后，統(tǒng)一稀釋到1000/ml,然后梯度稀釋并提取DNA，按實施例2中的步驟進行檢測分析，結(jié)果如下表，表明設計的引物和檢測探針均能檢出125/ml的菌。
SEQUENCE LISTING
<110> 孫青菊，黃寧
<120> 一組用于金黃色葡萄球菌多重耐藥基因檢測的液態(tài)芯片引物和探針
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GGTTCAACTCAAAAAATATTAACAG 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CCACTTCATATCTTGTAACGTTGT 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
AAAAAGATAAATCTTGGGGTG 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GGTACAATTGCTGCATTTATGAC 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
AGGAGAAAGTTCTTCCACAACC 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
TTATTAGCTTCACAATGGTTACA 23
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
GGTATGCCCTTATTGCTCTTG 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 13
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
CCATCTAAAACTGATAATGAACGA 24
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
CATAGACACGCCAGGACATA 20