一種抗甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌的藥物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及協(xié)同抗甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌（MRSA)感染的藥物組合物， 該藥物組合物包括抗菌肽Cbf-K 16和選自頭孢他啶或氨芐青霉素在內(nèi)的抗生素。
【背景技術】
[0002] 抗生素自用于細菌性感染的治療以來，大大延長了人的壽命。然而，隨著抗生素的 大量使用，抗生素耐藥性問題也日益嚴重，細菌耐藥性的產(chǎn)生速度遠遠超出了新抗生素的 開發(fā)速度。金黃色葡萄球菌是臨床感染的主要病原菌之一，可以引起如皮膚軟組織感染、 肺炎、菌血癥、手術部位及導管相關性感染等，嚴重危害人類的健康。過去的20年里，MRSA 已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，受到世界范圍的廣泛關注。MRSA具有多重耐藥性，對包括 0-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素等多種抗菌藥物 耐藥。萬古霉素是治療MRSA感染的首選藥物，有較強的抗MRSA活性，能夠降低其致病力。 然而，近年來在日本和美國等地先后出現(xiàn)了對萬古霉素中度耐藥（VISA)或耐藥（VRSA)的 MRSA，給萬古霉素對MRSA的治療帶來了挑戰(zhàn)。因此，單一抗生素針對MRSA感染的治療已經(jīng) 無法滿足臨床的需要。
[0003] 頭孢他啶、氨芐青霉素為半合成的廣譜0-內(nèi)酰胺類抗生素，主要作用于青霉素 結合蛋白（PBPs)。PBPs是細菌細胞壁肽聚糖生物合成的重要酶，具有催化肽聚糖聚合（轉 糖基）和交聯(lián)（轉肽）的作用，在細菌細胞壁的生物合成、細胞分裂和形態(tài)維持中發(fā)揮重要 作用。這兩種抗生素通過抑制PBPs在細菌細胞壁肽聚糖的合成、細胞生長以及維持細胞 形態(tài)過程中的作用，導致細菌細胞壁的完整性被破壞，原生質(zhì)流失，從而達到殺滅細菌的目 的。但是，MRSA對頭孢他啶和氨芐青霉素具有一定的耐藥性；其耐藥機制主要有兩種，一是 產(chǎn)生0 -內(nèi)酰胺酶以降解藥物，另一種是產(chǎn)生特異的青霉素結合蛋白PBP2a，取代對0 -內(nèi) 酰胺抗生素具有高親和力的PBP2和PBP3的功能。
[0004] 抗菌肽作為一類天然的小分子多肽，因其獨特的作用機制及廣譜殺菌性，近年來 備受人們的關注。抗菌肽的活性高，對細菌、真菌、病毒和寄生蟲等均有抑制作用；而其獨 特的作用機制，使得病原體不易對其產(chǎn)生耐藥性。因此，抗菌肽有望成為新一代的抗菌藥 物。Cbf-K 1^發(fā)明人在前期研宄中，將抗菌肽Cathelicidin-BF部分活性氨基酸位點進 行突變，采用固相化學合成法獲得的對耐藥性病原菌具有高抑制活性的抗菌肽，其具有SEQ ID No : 1所示的氨基酸序列，其分子量為3637. 63Da，全序列為：賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨 酸-精氨酸-賴氨酸_亮氨酸_賴氨酸_賴氨酸_絲氨酸_纈氨酸_賴氨酸-賴氨酸-精 氨酸-丙氨酸-賴氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-精氨 酸-纈氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。體外 抗菌活性研宄表明，Cbf-K 16具有一定的殺滅耐藥性細菌的作用。該技術記載于本專利發(fā)明 人周長林等已申請的中國專利ZL201210171901. 8中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對MRSA對傳統(tǒng)抗生素敏感性下降，提出一種抗MRSA的藥物組合物，能有 效地預防和治療MRSA引起的感染。
[0006] 本發(fā)明公開了一種抗菌肽Cbf-K16與抗生素的復方藥物組合物，由藥物活性組分 和藥學上可接受的載體組成，其中藥物活性組分含序列為SEQ ID No :1的多肽（即多肽 Cbf-K16)及選自頭孢他啶、氨芐青霉素在內(nèi)的任一組分，構成復方藥物。
[0007] 多肽0^_1(16與選自頭孢他啶或氨芐青霉素中的任一組分的重量比可選 8 : 1-1 : 8。優(yōu)選 4 : 1-1 : 4。更優(yōu)選 1 : 1-1 : 2。最優(yōu)選 1 : 1。
[0008] 可通過常規(guī)的操作手段，向藥物活性組分中直接或間接加入藥學上可接受的輔料 制成膠囊劑、顆粒劑、丸劑、散劑、片劑、口服液、糖漿、口崩片、含漱液、細粒劑、粉末、或者注 射劑等劑型供臨床應用。
[0009] 下面是本發(fā)明的部分抗菌試驗及結果：
[0010] 一、抗菌肽Cbf-K16、頭孢他啶和氨芐青霉素的藥效、優(yōu)選配比研宄以及協(xié)同作用評 價
[0011] ⑴接種物的制備
[0012] 將實驗所需菌株從保藏的甘油管中接至營養(yǎng)瓊脂斜面，37°C培養(yǎng)16h，接種環(huán)挑取 少許接種至2ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)8h，用MH肉湯培養(yǎng)基稀釋成I X 105CFU/ml左右 的細菌懸液。
[0013] (2)藥物的配置
[0014] 稱取一定量的Cbf-K16、頭孢他啶、氨芐青霉素，溶于無菌的生理鹽水中，配制成濃 度為1024 y g/ml的母液，經(jīng)0. 22 y m濾膜過濾除菌，分裝。置于-20°C備用。
[0015] (3)最小抑菌濃度（MIC)的測定
[0016] 將IX IO5CFUAiI左右的細菌懸液接種至96孔板中，每孔100 y 1。然后等體積加 入經(jīng)MH倍比稀釋的藥物。使最終藥物濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0. 5、0. 25yg/ ml。同時設不含藥物的空白對照組。37°C培養(yǎng)16-20h。觀察結果，記錄最低不長菌的藥物 濃度，即為最低抑菌濃度。結果見表1。
[0017] 表1抗菌肽Cbf-K16與抗生素對細菌的MIC
[0018]
[0019] 由表1可看出，本發(fā)明所選的耐藥性細菌臨床株對頭孢他啶、氨芐青霉素都表現(xiàn) 出較強的耐藥性，MIC值均大于64 y g/ml ;而對抗菌肽Cbf-K16相對敏感，MIC值均小于 32 y g/ml〇
[0020] (4) 0^-1(16與抗生素優(yōu)選配比研宄
[0021] 用無菌MH肉湯培養(yǎng)基將藥物原液倍比稀釋成含藥濃度為1024、512、256、128、64、 32、16、8、4、2μg/ml的藥液。根據(jù)MIC值，由低到高依次將2種抗菌藥物按棋盤法設計， 兩兩組合加入96孔板中，每種抗菌藥物加50 y 1，再取100 y 1菌液加入孔中，置37°C培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)16-20h。另設不含藥組作為對照。觀察抗菌效果，并記錄聯(lián)合的MIC值。通過 計算部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)判斷相互作用。
同、相加、無關、拮抗作用。結果見表2。
[0022] 表2 0^_1(16與抗生素優(yōu)選配比研宄
[0023]
[0025] 由表2可知，Cbf-^與抗生素聯(lián)用時，不同的配比對MRSA的活性不同。在 Cbf-K 16與抗生素重量比為8 : 1-1 : 8范圍內(nèi)有協(xié)同效果，在Cbf-K16與抗生素重量比為 4 : 1-1 : 4范圍內(nèi)協(xié)同效果明顯，2 : 1-1 : 2時效果更好，Cbf-K16與抗生素以I : 1配 比時協(xié)同效果最高。
[0026] (5)棋盤法測定Cbf-K16與抗生素聯(lián)用的效果
[0027] 用無菌MH肉湯培養(yǎng)基將藥物原液倍比稀釋成含藥濃度為1024、512、256、128、64、 32、16、8、4、2 y g/ml的藥液。根據(jù)MIC值，由低到高依次將2種抗菌藥物按棋盤法設計，兩 兩組合（Cbf-K16 :抗生素重量比=I : 1)加入96孔板中，每種抗菌藥物加50 yl，再取 100 y 1菌液加入孔中，置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-20h。另設不含藥組作為對照。觀察抗菌效 果，計算FIC。結果見表3。
[0028] 表3 Cbf-K16與頭孢他啶或氨芐青霉素聯(lián)用對耐藥株的MIC值以及部分抑菌濃度 指數(shù)（FIC)
[0029]
[0030] 由表3可以看出，Cbf-K16與抗生素聯(lián)合用藥對MRSA顯示出較強的協(xié)同抗菌活性， FIC指數(shù)均< 0. 5。但藥物組合物對耐藥性革蘭陰性細菌大腸埃希菌沒有顯示出聯(lián)用活性， FIC指數(shù)均> 0. 5。
[0031] 二、抗菌肽Cbf-Klf^抗生素聯(lián)用的藥物組合物對MRSA的殺菌活性
[0032] (1)抗菌肽Cbf-K16與抗生素聯(lián)用后對MRSA的殺菌曲線的繪制
[0033] 將1/2 XMIC濃度的抗菌肽C