檢測八種金黃色葡萄球菌耐藥基因的試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測八種金黃色葡萄球菌耐藥基因的試劑盒及檢測方法；該試劑盒，其特征在于非標(biāo)記熒光PCR擴增過程中的反應(yīng)體系由以下組分組成：HRM反應(yīng)預(yù)混液，dNTPs混合液，Taq聚合酶，上游引物，下游引物，熒光染料，DNA模版，水；本發(fā)明一種檢測方法，其特征在于包括以下步驟：A、根據(jù)八種金黃色葡萄球菌耐藥基因設(shè)計引物對；B、提取樣本DNA后，利用設(shè)計的引物對進行熒光PCR擴增；C、應(yīng)用帶HRM模塊的熒光定量PCR儀對PCR擴增產(chǎn)物進行HRM分析，確定擴增產(chǎn)物Tm值，從而判定結(jié)果；本發(fā)明的目的是為了提供一種操作簡便、快速，成本低的多重?zé)晒釶CR檢測八種耐藥基因的方法，而且檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
【專利說明】檢測八種金黃色葡萄球菌耐藥基因的試劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高分辨率熔解曲線HRM分析和熒光PCR技術(shù)，本方法為一種基于高分 辨熔解曲線HRM分析技術(shù)可同時檢測八種金黃色葡萄球菌耐藥基因的多重?zé)晒釶CR檢測 試劑盒。其中八種耐藥基因包括耐甲氧西林基因 mecA、紅霉素耐藥基因 ermc、四環(huán)素耐藥 基因 tetM、氨基糖苷類藥物耐藥基因 aph3、消毒劑耐藥基因 qacA/qacB、萬古霉素耐藥基因 vanA和莫匹羅星耐藥基因 mupA和耐藥性輔助基因 femB。

【背景技術(shù)】
[0002] 由于抗生素的使用，細菌也為了自身發(fā)展而不斷變異，就形成了細菌對抗菌藥物 的耐藥性，使本來有效的抗菌藥物在遇到耐藥菌引起的感染時療效下降甚至完全無效。金 黃色葡萄球菌至今仍然是國內(nèi)外醫(yī)院獲得性感染最常見的細菌之一。隨著β_內(nèi)酞胺類抗 生素在臨床的廣泛應(yīng)用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA在臨床分離的葡萄球菌中比例 不斷增加，MRSA幾乎對所有β-內(nèi)酞胺類抗生素都耐藥。1996年，又出現(xiàn)了首例對萬古霉 素敏感性下降的MRSA。不僅對甲氧西林和其他β-內(nèi)酞胺類抗生素耐藥，而且還常對氨基 糖苷類、紅霉素等耐藥，因此準(zhǔn)確及時的檢出，對于耐藥金黃色葡萄球菌感染的早期快速 診斷，指導(dǎo)臨床用藥及防止耐藥菌的播散極為重要。因此，本發(fā)明對金黃色葡萄球菌八種耐 藥基因包括包括耐甲氧西林基因 mecA、紅霉素耐藥基因 ermc、四環(huán)素耐藥基因 tetM、氨基 糖苷類藥物耐藥基因 aph3、消毒劑耐藥基因 qacA/qacB、萬古霉素耐藥基因 vanA和莫匹羅 星耐藥基因 mupA和耐藥性輔助基因 femB，采用HRM分析技術(shù)并結(jié)合熒光PCR技術(shù)對其開展 多重PCR檢測技術(shù)研究。
[0003] 熒光PCR檢測技術(shù)大致分為兩大類：熒光探針法標(biāo)記熒光PCR和通用型的熒光染 料法非標(biāo)記熒光PCR。前者則利用熒光標(biāo)記的特異性探針或者引物來識別模版，優(yōu)點是特 異性更高，適用于擴增序列專一檢測，不過檢測成本高。后者主要是利用熒光染料與雙鏈 DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴增產(chǎn)物的增加，無需另外設(shè)計熒光探針，簡便易行，成本 較低。相對以往普通非探針標(biāo)記熒光PCR所用非飽和染料，新型飽和燃料如LC Green等具 有以下優(yōu)點：①飽和的染料對PCR反應(yīng)沒有任何抑制作用。②DNA高溫變性時，非飽和熒 光染料加入則會造成DNA雙鏈高溫變性時，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生遷移，熒光染料 分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位點，造成熒光信號沒有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下 降，而飽和染料則不會出現(xiàn)此類情況。③高溫穩(wěn)定，對于高GC含量的PCR產(chǎn)物，Tm值較高， 在DNA雙鏈高溫熔解時，飽和熒光染料結(jié)合核酸更穩(wěn)定。
[0004] 針對金黃色葡萄球菌各類耐藥基因，研究人員已開展了多重常規(guī)PCR和多重?zé)晒?PCR方法研究，但是同時針對這八種主要耐藥基因開展多重?zé)晒釶CR檢測的研究尚未見報 道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種操作簡便、快速，成 本低的多重?zé)晒釶CR檢測八種耐藥基因的方法，而且檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：
[0007] -種檢測八種金黃色葡萄球菌耐藥基因的試劑盒，其特征在于非標(biāo)記熒光PCR擴 增過程中的反應(yīng)體系由以下組分組成：
[0008]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測八種金黃色葡萄球菌耐藥基因的試劑盒，其特征在于非標(biāo)記熒光PCR擴增 過程中的反應(yīng)體系由以下組分組成：
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測八種金黃色葡萄球菌耐藥基因的試劑盒，其特征在 于所述的上游引物包括有： 耐甲氧西林基因 mecA上游引物：GCAATCGCTAAAGAACTA 紅霉素耐藥基因 ermc上游引物：TGCCATTGAAATAGACCA 四環(huán)素耐藥基因 tetM上游引物：AAAATCCGCACCCTCTAC 氨基糖苷類藥物耐藥基因 aph3上游引物：AAAATACCGCTGCGTAAA 消毒劑耐藥基因 qacA/qacB上游引物：GGGTCGTGTTATTAGGCA 萬古霉素耐藥基因 vanA上游引物：TGAATCGGCAAGACAATA 莫匹羅星耐藥基因 mupA上游引物：TCACGAATACGCACCAAG 耐藥性輔助基因 femB上游引物：CGAATCGTGGTCCAGTAA 所述的下游引物包括有： 耐甲氧西林基因 mecA下游引物：TGGGACCAACATAACCTA 紅霉素耐藥基因 ermc下游引物：AAACCCGTATTCCACGAT 四環(huán)素耐藥基因 tetM下游引物：ATCCGTCACATTCCAACC 氨基糖苷類藥物耐藥基因 aph3下游引物：GGAGTGAAAGAGCCTGATG 消毒劑耐藥基因 qacA/qacB下游引物：TGGCATTATCTTTGGCTC 萬古霉素耐藥基因 vanA下游引物：TCCTGATGAATACGAAAGA 莫匹羅星耐藥基因 mupA下游引物：TAGAGCCGCTATCAAACC 耐藥性輔助基因 femB下游引物：TCCAGCACGCTCTTCAGT。
3. -種檢測方法，其特征在于包括以下步驟： A、 根據(jù)八種金黃色葡萄球菌耐藥基因設(shè)計引物對； B、 提取樣本DNA后，利用設(shè)計的引物對樣本DNA進行熒光PCR擴增； C、 應(yīng)用帶HRM模塊的熒光定量PCR儀對PCR擴增產(chǎn)物進行HRM分析，確定擴增產(chǎn)物Tm 值，從而判定結(jié)果； 其中步驟B中進行熒光PCR擴增反應(yīng)體系由以下組分組成：
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的上游引物包括有： 耐甲氧西林基因 mecA上游引物：GCAATCGCTAAAGAACTA 紅霉素耐藥基因 ermc上游引物：TGCCATTGAAATAGACCA 四環(huán)素耐藥基因 tetM上游引物：AAAATCCGCACCCTCTAC 氨基糖苷類藥物耐藥基因 aph3上游引物：AAAATACCGCTGCGTAAA 消毒劑耐藥基因 qacA/qacB上游引物：GGGTCGTGTTATTAGGCA 萬古霉素耐藥基因 vanA上游引物：TGAATCGGCAAGACAATA 莫匹羅星耐藥基因 mupA上游引物：TCACGAATACGCACCAAG 耐藥性輔助基因 femB上游引物：CGAATCGTGGTCCAGTAA 所述的下游引物包括有： 耐甲氧西林基因 mecA下游引物：TGGGACCAACATAACCTA 紅霉素耐藥基因 ermc下游引物：AAACCCGTATTCCACGAT 四環(huán)素耐藥基因 tetM下游引物：ATCCGTCACATTCCAACC 氨基糖苷類藥物耐藥基因 aph3下游引物：GGAGTGAAAGAGCCTGATG 消毒劑耐藥基因 qacA/qacB下游引物：TGGCATTATCTTTGGCTC 萬古霉素耐藥基因 vanA下游引物：TCCTGATGAATACGAAAGA 莫匹羅星耐藥基因 mupA下游引物：TAGAGCCGCTATCAAACC 耐藥性輔助基因 femB下游引物：TCCAGCACGCTCTTCAGT。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的檢測方法，其特征在于所有致病菌檢測時PCR擴增的反 應(yīng)程序按以下步驟進行： (1) 92°C ?96°C預(yù)變性 30s ; (2) 92°C ?96°C變性 10 ?30s, 55°C ?63°C退火 10 ?30s, 72°C 10 ?30s，共進行 45 ? 55個循環(huán)； (3) 72°C延伸 10 ?30s。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟C中所述HRM分析按以下步驟進 行： (1) 92°C?96°C變性 Imin ; (2) 40°C復(fù)性 Imin ; (3) 然后初始熔解溫度60°C?65°C，開始程序升溫熔解至92°C?96°C，并在熔解過程 中實時檢測熒光信號，15?25次/秒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的熒光染料為DNA飽和性染料。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述的DNA飽和性染料為Eva Green 染料、LCGreen?PLUS染料、SYTO 9染料中的一種或兩種以上的混合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述dNTP混合液為由2. 5mM dATP、 2. 5mM dCTP、2. 5mM dTTP、2. 5mM dGTP 組成的混合液。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388554SQ201410621338
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】蔡先全, 魚海瓊, 岳巧云, 柏建山, 李蓉, 邱德義, 趙美轉(zhuǎn), 張磊, 蕭綺倩 申請人:蔡先全