本發(fā)明涉及一種shRNA及其構(gòu)建和應(yīng)用，具體地說是一種靶向ZNF185的慢病毒干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：RNA干擾（RNAinterference,RNAi）是真核生物中高度保守的，由小分子干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，在基因的功能研究中得到了廣泛應(yīng)用，并有望在疾病治療中發(fā)揮重要的作用。鋅指蛋白(zincfingerprotein,ZNF)185是一種LIM蛋白。1997年，Heiss等人應(yīng)用外顯子捕獲的方法，首先發(fā)現(xiàn)了ZNF185基因。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，ZNF185是一種特殊的鋅指蛋白基因，在生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要的功能。研究發(fā)現(xiàn)ZNF185在小鼠睪丸組織中的表達(dá)顯著高于其它組織，特別在睪丸間質(zhì)細(xì)胞和精子中呈高表達(dá)。睪丸間質(zhì)細(xì)胞是構(gòu)成睪丸組織的重要細(xì)胞，在曲細(xì)精管周圍的結(jié)締組織中廣為分布，其主要功能是分泌雄性激素和細(xì)胞因子，其中男性體內(nèi)大約95%的睪酮均由間質(zhì)細(xì)胞合成并分泌。研究表明，睪酮在人類精子發(fā)生、性分化調(diào)控、維持性功能與促進(jìn)附屬性腺發(fā)育等過程中發(fā)揮重要的作用。因此，ZNF185可能與睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌合成功能密切相關(guān)，進(jìn)而調(diào)控精子的生成，而目前關(guān)于ZNF185在睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌功能方面的研究尚未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于，設(shè)計(jì)了一種靶向ZNF185的慢病毒干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，針對(duì)小鼠ZNF185基因的mRNA序列設(shè)計(jì)合成shRNA，該shRNA不會(huì)損傷小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，但能有效抑制睪酮的分泌，為人類避孕研究提供新的靶點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案為：本發(fā)明針對(duì)與精子發(fā)生密切相關(guān)的重要基因ZNF185，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種shRNA，該shRNA能顯著降低小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中ZNF185的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)不會(huì)損傷小鼠間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，但能有效抑制睪酮的分泌。一種慢病毒干擾載體，所述載體含有小鼠的ZNF185基因干擾片段，所述慢病毒載體的shRNA序列是：F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′。所述慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞后，能顯著敲低ZNF185蛋白的表達(dá)，細(xì)胞增殖能力未發(fā)生明顯變化，睪酮分泌能力顯著降低。一種上述靶向ZNF185的慢病毒干擾載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：（一）ZNF185干擾載體的構(gòu)建首先針對(duì)小鼠ZNF185基因（GeneID:22673）設(shè)計(jì)一套干擾序列，并合成miRNAoligos，退火后序列亞克隆到pcDNA6.2?-GW/EmGFP-miR載體中，測(cè)序驗(yàn)證；具體過程如下：1、OligoDNA的設(shè)計(jì)與合成針對(duì)ZNF185基因序列，通過BLOCK-iT?RNAiExpress數(shù)據(jù)庫提交基因信息選擇干擾位點(diǎn)，設(shè)計(jì)互補(bǔ)的OligoDNA，正義鏈的5′端添加了TGCT，反義鏈的5′端添加了CCTG。其正義鏈與反義鏈序列分別為：F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′；陰性對(duì)照的正義鏈與反義鏈序列分別為：F:5′-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3′；R:5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTT-3′；2、miRNA載體的構(gòu)建與驗(yàn)證將上述步驟1合成好的OligoDNA經(jīng)退火后合成雙鏈DNA，然后連接到pcDNA6.2?-GW/EmGFP-miR載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，最后挑取克隆，搖菌抽提質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，得到陽性的克隆和質(zhì)粒；（二）ZNF185慢病毒載體構(gòu)建將上述步驟（一）構(gòu)建的miRNA干擾載體經(jīng)單酶切后純化；然后將線性化的干擾質(zhì)粒與pDONR221載體進(jìn)行BP重組反應(yīng)，以獲得含干擾序列的入門載體；然后將含干擾序列的入門載體和慢病毒目的載體pLenti6.3/V5-dest進(jìn)行LR重組反應(yīng)，以獲得含干擾序列的慢病毒表達(dá)載體；具體過程如下：1、干擾質(zhì)粒線性化1.1配制30ul單酶切體系如下：Sterilewater10.5ul10xbuffer(NEBbuffer3)3.0ulEagI1.5ul干擾質(zhì)粒(~2ug)10ulTotal25ul混合均勻后37℃孵育2小時(shí)；1.2用AxygenPCR純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，最終溶于15ulelutionBuffer中；2、BP重組2.1按下表配制BP重組體系：TEbuffer(elutionbufferfromInvitrogenminiprepkit)5.0ulLinearizedattBexpressionclone2.0ulDonervectorwithattPsite(pDONR221)1.0ul2.2取出BPclonaseII冰上溶解后混勻；2.3在2.1配制的體系中加入2.0ulBPclonaseII，混合均勻；2.4室溫孵育過夜；2.5取3ul至一管中，其余-20℃保存；3．LR重組3.1按下表配制LR重組反應(yīng)體系：BP重組質(zhì)粒3.0ulDestinationvector(pLenti6.3/V5-DEST)1.0ulLRclonaseenzymemix2.0ulddH2O4.0ul3.225℃反應(yīng)5小時(shí)；3.3加入1ul的蛋白酶K，37℃反應(yīng)10分鐘；3.4取5ul重組反應(yīng)液轉(zhuǎn)化100ul的stbl3感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)胞涂布于含有100ug/ml氨芐青霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)；3.5從平板挑單克隆接種于4ml含100ug/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm過夜培養(yǎng)；3.6用Axygen質(zhì)粒DNA質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒；3.7質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果顯示序列完全正確，慢病毒載體構(gòu)建成功。ZNF185基因慢病毒表達(dá)載體的包裝，具體過程如下：1、293T細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶板底面積80%左右時(shí)，通過常規(guī)消化、收集、離心、重懸、洗滌后吹打分散，計(jì)數(shù)后稀釋為6×106個(gè)/ml接種于培養(yǎng)皿中，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h；2、移去培養(yǎng)液，加入Opti-MEM培養(yǎng)液；3、將3μg慢病毒表達(dá)載體和9μgPackagingMix加入到1.5mlOpti-MEM中，混合液混勻；4、將36μllipofectamine2000和1.5mlOpti-MEM混勻，室溫放置5min；5、混勻步驟3和4得到的溶液，室溫放置20min即得慢病毒；6、將上述步驟5得到的慢病毒加入到步驟1的培養(yǎng)溶液中，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h，換成含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；7、48h后收集步驟6得到的上清，500×g離心10min，棄上清，吹打懸浮，0.45μm濾器過濾；8、將步驟7得到的過濾液50000×g離心2h，沉淀重懸于opti-MEM培養(yǎng)液，最終獲得ZNF185-shRNA的慢病毒培養(yǎng)液。ZNF185慢病毒干擾效率的檢測(cè)應(yīng)用westernblot方法檢測(cè)ZNF185-shRNA的干擾效果，以未處理組和轉(zhuǎn)染空載體慢病毒為對(duì)照組，結(jié)果顯示ZNF185-shRNA能顯著降低間質(zhì)細(xì)胞ZNF185的表達(dá)。ZNF185慢病毒對(duì)細(xì)胞增殖與睪酮分泌的影響本發(fā)明通過CCK-8法和ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染ZNF185-shRNA的間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力與睪酮分泌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ZNF185干擾沉默后，睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力未發(fā)生明顯變化，但睪酮分泌能力顯著低于對(duì)照組。一種上述靶向ZNF185的慢病毒干擾載體作為避孕藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：成功構(gòu)建了靶向ZNF185的shRNA，該shRNA不會(huì)損傷小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，但能有效抑制睪酮的分泌，為人類避孕提供新的靶點(diǎn)。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。附圖說明圖1以本專利中ZNF185-shRNA包裝出的慢病毒感染小鼠間質(zhì)細(xì)胞，westernblot實(shí)驗(yàn)證明ZNF185-shRNA干擾效果顯著；本專利中的ZNF185-shRNA干擾序列能有效沉默間質(zhì)細(xì)胞中ZNF185的表達(dá)。其中，1組為未處理組，2組為感染ZNF185-shRNA的實(shí)驗(yàn)組，3組為感染空載體慢病毒的對(duì)照組；圖2以本專利中ZNF185-shRNA將ZNF185敲低后，CCK-8實(shí)驗(yàn)證明小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力未發(fā)生明顯變化；其中，1組為未處理組，2組為感染ZNF185-shRNA的實(shí)驗(yàn)組，3組為感染空載體慢病毒的對(duì)照組；圖3以本專利中ZNF185-shRNA將ZNF185敲低后，ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌能力受到明顯抑制；其中，1組為未處理組，2組為感染ZNF185-shRNA的實(shí)驗(yàn)組，3組為感染空載體慢病毒的對(duì)照組。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例1一種慢病毒干擾載體，所述載體含有小鼠的ZNF185基因干擾片段，所述慢病毒載體的shRNA序列是：F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′。所述慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞后，能顯著敲低ZNF185蛋白的表達(dá)，細(xì)胞增殖能力未發(fā)生明顯變化，睪酮分泌能力顯著降低。上述靶向ZNF185的慢病毒干擾載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：1、ZNF185基因干擾載體的構(gòu)建1.1OligoDNA的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)基因序列和BLOCK-iT?RNAiExpress數(shù)據(jù)庫提交的基因信息，選擇干擾位點(diǎn)（干擾位點(diǎn)序列均經(jīng)過Blast檢驗(yàn)靶基因特異性），設(shè)計(jì)并合成互補(bǔ)oligoDNA；合成的序列如下，F(xiàn):5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′；合成的結(jié)構(gòu)如下：1.2miRNA載體的構(gòu)建與驗(yàn)證（1）將合成的DNA依次溶解為100μM，按下表配置混合物，然后95℃5min，室溫20min；ReactionComponentConcentrationVolume(μl)topstrandoligo100μM5bottomstrandoligo100μM5oligoannealingbuffer10×2ddH208Totalvolume20（2）將步驟（1）的產(chǎn)物按下表配置混合物，室溫30min；ReactionComponentConcentrationVolume(μl)ligationbuffer5×4dsoligo10nM4T4DNAligase1U/μl1pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2ddH2O9Totalvolume20（3）取10μl步驟（2）的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂LB平板（含50μg/mlSpectinomycin）后，37℃孵育；（4）每個(gè)平板分別挑取3個(gè)克隆，搖菌抽提質(zhì)粒，取一部分測(cè)序，其余-20℃保存。2、ZNF185基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建2.1miRNA載體的線性化（1）按照下表配置單酶切體系，混合均勻后37℃孵育2h；（2）用AxygenPCR純化試劑盒純化含attB位點(diǎn)的線性dsDNA酶切產(chǎn)物，最終溶于15μlelutionbuffer中；ReactionComponentVolume(μl)Sterilewater10.510xbuffer(NEBbuffer3)3EagI1.5干擾質(zhì)粒(~2ug)10Totalvolume252.2線性載體的BP重組（1）按照下表配置BP重組體系；（2）室溫孵育過夜；ReactionComponentVolume(μl)TEbuffer(elutionbufferfromInvitrogenminiprepkit)5LinearizedattBexpressionclone2DonervectorwithattPsite(pDONR221)1BPclonaseII2Totalvolume10ul2.3LP重組（1）按照下表配置LP重組體系；ReactionComponentVolume(μl)BP重組質(zhì)粒3Destinationvector(pLenti6.3/V5-DEST)1LRclonaseenzymemix2ddH2O4Totalvolume10（2）將混合液置于25℃反應(yīng)5h；（3）加入1μl的蛋白酶K，37℃反應(yīng)10min；（4）取少量（3）轉(zhuǎn)化stbl3感受態(tài)細(xì)胞；（5）將stbl3細(xì)胞涂布于LB平板（含100μg/mlAmpicillin）上，37℃培養(yǎng)12h；（6）從平板挑單克隆，接種于LB培養(yǎng)基（含100μg/mlAmpicillin）中，37℃振蕩培養(yǎng)12h；（7）DNA質(zhì)粒試劑盒提取慢病毒表達(dá)載體；（8）取一部分進(jìn)行測(cè)序，其余-20℃保存。3、ZNF185基因慢病毒表達(dá)載體的包裝（1）293T細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶板底面積80%左右時(shí)，常規(guī)消化、收集、離心、重懸、洗滌后吹打分散，計(jì)數(shù)后稀釋為6×106個(gè)/ml接種于培養(yǎng)皿中，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h；（2）移去培養(yǎng)液，加入Opti-MEM培養(yǎng)液；（3）將3μg慢病毒表達(dá)載體和9μgPackagingMix加入到1.5mlOpti-MEM中，混合液混勻；（4）將36μllipofectamine2000和1.5mlOpti-MEM混勻，室溫放置5min；（5）混勻（3）和（4）的溶液，室溫放置20min即得慢病毒；（6）將上述慢病毒加入到（1）中，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h，換成含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；（7）48h后收集上清，500×g離心10min，棄上清，吹打懸浮，0.45μm濾器過濾；（8）將過濾液50000×g離心2h，沉淀重懸于opti-MEM培養(yǎng)液。4、ZNF185慢病毒干擾效率的檢測(cè)應(yīng)用westernblot方法檢測(cè)ZNF185-shRNA的干擾效果，以未處理組和轉(zhuǎn)染空載體慢病毒為對(duì)照組，結(jié)果顯示ZNF185-shRNA能顯著降低間質(zhì)細(xì)胞ZNF185的表達(dá)（詳見圖1），其中1組為未處理組，2組為感染ZNF185-shRNA的實(shí)驗(yàn)組，3組為感染空載體慢病毒的對(duì)照組。實(shí)施例2ZNF185-shRNA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖能力的作用1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（1）先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞；（2）按1︰2的體積比，依次用培養(yǎng)液等比例稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3個(gè)復(fù)孔；（3）接種后培養(yǎng)4h左右使細(xì)胞貼壁，然后加入CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定O.D值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X軸），O.D值為縱坐標(biāo)（Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量。2、細(xì)胞增殖的檢測(cè)（1）設(shè)置空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；（2）在96孔板中接種細(xì)胞懸液，每孔100mL，待細(xì)胞貼壁后，分別加入相應(yīng)MOI值的不含病毒的培養(yǎng)基、含有干擾序列慢病毒的培養(yǎng)基和含有空載體慢病毒的培養(yǎng)基；將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2濃度；（3）培養(yǎng)48h后，向每孔加入10μL的CCK-8溶液，注意不要在孔中生成氣泡，以免影響O.D值的讀數(shù)；（4）將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育約2h；（5）用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度；（6）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞數(shù)。3、結(jié)果顯示，與未處理組和感染空載體慢病毒組比較，ZNF185-shRNA處理后，小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖能力未發(fā)生明顯變化（未處理組vs感染ZNF185-shRNA組vs感染空載體慢病毒組=100%vs91.2%vs93.5%，p＞0.05，詳見圖2），其中1組為未處理組，2組為感染ZNF185-shRNA的實(shí)驗(yàn)組，3組為感染空載體慢病毒的對(duì)照組。實(shí)施例3ZNF185-shRNA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌能力的抑制1、細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)孔板底面積80%，設(shè)置空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；2、分別加入相應(yīng)MOI值的不含病毒的培養(yǎng)基、含有干擾序列慢病毒的培養(yǎng)基和含有空載體慢病毒的培養(yǎng)基；3、感染24h時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)，若無大量細(xì)胞死亡，則繼續(xù)感染；48h時(shí)再次進(jìn)行觀察，若無大量細(xì)胞死亡，補(bǔ)液后繼續(xù)感染，直到感染率達(dá)到80%以上，更換為無病毒完全培養(yǎng)基；4、繼續(xù)培養(yǎng)96h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照睪酮檢測(cè)試劑盒說明書處理后，送至濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院測(cè)睪酮的分泌量；5、結(jié)果顯示，與未處理組和感染空載體慢病毒組比較，ZNF185-shRNA能顯著抑制間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌（未處理組vs感染ZNF185-shRNA組vs感染空載體慢病毒組=0.31μg/Lvs0.11μg/Lvs0.29μg/L，p＜0.01，詳見圖3），其中1組為未處理組，2組為感染ZNF185-shRNA的實(shí)驗(yàn)組，3組為感染空載體慢病毒的對(duì)照組。本發(fā)明針對(duì)小鼠ZNF185基因的mRNA序列設(shè)計(jì)合成shRNA，該shRNA不會(huì)損傷小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，但能有效抑制睪酮的分泌，為人類避孕研究提供新的靶點(diǎn)。本發(fā)明是ZNF185在生殖細(xì)胞功能上的首次研究，首次證明ZNF185對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌功能具有調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明中所用原料均為本領(lǐng)域生產(chǎn)中常用原料，均可從市場(chǎng)中得到，且對(duì)于生產(chǎn)結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生影響；本發(fā)明中所采用的各種設(shè)備，均為本領(lǐng)域生產(chǎn)工藝中使用的常規(guī)設(shè)備，且各設(shè)備的操作、參數(shù)等均按照常規(guī)操作進(jìn)行，并無特別之處。慢病毒載體的shRNA序列：F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′當(dāng)前第1頁1 2 3