本發(fā)明涉及T淋巴細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種CAR表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：CAR-T細(xì)胞(ChimericantigenreceptorTcell，嵌合抗原受體T細(xì)胞)即是表達(dá)嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞，而CAR-T細(xì)胞的嵌合抗原受體(Chimericantigenreceptor，CAR)包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)三部分構(gòu)成。其中，胞膜外抗原結(jié)合區(qū)是一段單鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(singlechainFvdomain，scFv)，具有特異性識(shí)別并結(jié)合TAA(tumor-associatedantigen，腫瘤相關(guān)性抗原)的功能。scFv的構(gòu)成是將單克隆抗體的重鏈可變區(qū)(thevariableregionofheavychain，VH)和輕鏈可變區(qū)(thevariableregionoflightchain，VL)用一可彎曲的多肽接頭(Linker)將VH和VL連接起來(lái)，構(gòu)成VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。鉸鏈區(qū)通常是由免疫球蛋白超家族組成，比如CD8、CD28和IgG。胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)包括共刺激分子(costimulatorymolecule，CM)和免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAM)，其中，CM通常為CD28，ITAM通常為CD3ζ或FcεRIγ。表達(dá)CAR的T細(xì)胞可通過(guò)scFv直接識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的TAA，CAR將信號(hào)傳入T細(xì)胞內(nèi)，激活T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子包括穿孔素、顆粒酶、INF-γ、TNF-a等，從而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用。因此，CAR-T細(xì)胞是MHC非限制性的。CAR-T細(xì)胞將抗體-抗原特異性結(jié)合能力以及T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷功能結(jié)合于一體，是免疫抗腫瘤治療的重要方法。嵌合性抗原受體方法應(yīng)用的關(guān)鍵是確定一種腫瘤相關(guān)性抗原，在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，而在正常組織中無(wú)表達(dá)或者低表達(dá)。原癌基因人上皮生長(zhǎng)因子受體2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，Her-2/neu)又稱HER2或c-erbB-2基因，在多種腫瘤的發(fā)病及臨床進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，體外與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)己明確顯示Her-2/neu基因擴(kuò)增、蛋白過(guò)度表達(dá)在致瘤轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。研究證實(shí)：30％以上的人類腫瘤組織中，如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、輸卵管癌、宮頸癌、前列腺癌、胃癌、唾液腺癌、舌癌、頭頸部鱗癌、非小細(xì)胞性肺癌等，均伴有Her-2/neu基因的擴(kuò)增及p185蛋白的過(guò)度表達(dá)，而正常組織中p185蛋白為陰性或微量表達(dá)。而在乳腺癌中，大約有1/3的病人過(guò)表達(dá)HER2蛋白。過(guò)表達(dá)HER2蛋白使腫瘤的侵襲性更強(qiáng)，是乳腺癌病人預(yù)后不良的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。盡管抗HER2單克隆抗體(如曲妥株單抗)在臨床的應(yīng)用使部分病人獲益，但是其價(jià)格昂貴，很大程度上限制了其大規(guī)模臨床應(yīng)用。HER2蛋白位于細(xì)胞表面，容易被抗體識(shí)別，因此，HER2蛋白可作為CAR-T細(xì)胞抗腫瘤治療的一個(gè)理想靶點(diǎn)。CAR-T細(xì)胞是由CAR表達(dá)載體與T細(xì)胞進(jìn)行基因重組而成的，然而，現(xiàn)有技術(shù)中并未提供表達(dá)抗HER2單克隆抗體的CAR表達(dá)載體，導(dǎo)致現(xiàn)有的CAR-T細(xì)胞并不能以HER2蛋白為靶向而直接識(shí)別并結(jié)合HER2蛋白，導(dǎo)致CAR無(wú)法將信號(hào)傳入T細(xì)胞內(nèi)，而無(wú)法分泌殺傷高表達(dá)HER2蛋白的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的在于提供一種CAR表達(dá)載體，旨在表達(dá)抗HER2單克隆抗體，而使CAR-T細(xì)胞的CAR以HER2蛋白為靶向直接識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的HER2蛋白。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種CAR表達(dá)載體，包括載體和接入所述載體的CAR，所述CAR包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，所述胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合HER2蛋白的chA21scFv；所述胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)為CD28-X-ITAM，其中，所述X為ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。優(yōu)選地，所述X為ICOS共刺激分子。優(yōu)選地，所述載體為病毒質(zhì)粒。此外，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種如上所述的CAR表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括步驟如下：獲取所述chA21scFv的基因片段、所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段；提供引導(dǎo)鏈，基因融合所述引導(dǎo)鏈與所述chA21scFv的基因片段，而形成引導(dǎo)鏈-chA21scFv；基因融合所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述ITAM的基因片段，而形成鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM；基因融合所述引導(dǎo)鏈-chA21scFv和所述鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM，而形成引導(dǎo)鏈-chA21scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM；將所述引導(dǎo)鏈-chA21scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM接入載體，而獲得CAR表達(dá)載體。優(yōu)選地，所述獲取所述chA21scFv的基因片段、所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段的過(guò)程中，包括步驟如下：獲取并激活PMBCs；提取所述PMBCs的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；分別提供所述鉸鏈區(qū)的引物、所述CD28的引物、所述X的引物和所述ITAM的引物，且均以所述PMBCs的cDNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段；提供所述chA21scFv的模板DNA和所述chA21scFv的引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得所述chA21scFv的基因片段。優(yōu)選地，所述載體為病毒質(zhì)粒。本發(fā)明技術(shù)方案，通過(guò)表達(dá)chA21scFv而識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的HER2蛋白，并通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)將信號(hào)傳入T細(xì)胞，從而活化T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子進(jìn)而可以殺傷高表達(dá)HER2蛋白的腫瘤細(xì)胞。而且，胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)整合了CD28共刺激分子以及X共刺激分子，可使T細(xì)胞持續(xù)活化增殖，細(xì)胞因子持續(xù)分泌，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞作用。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖示出的內(nèi)容獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAR表達(dá)載體的基因結(jié)構(gòu)圖；圖2為ELISA法檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞及現(xiàn)有的NT-T細(xì)胞分別與HER2+/-腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)后的IFN-γ分泌量的柱狀圖；圖3為ELISA法檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞及現(xiàn)有的NT-T細(xì)胞分別與HER2+/-腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)后的IL-2分泌量的柱狀圖；圖4為ELISA法檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞的HER2特異性的統(tǒng)計(jì)圖；圖5為51Cr釋放試驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的特異性殺傷作用的統(tǒng)計(jì)圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供一種CAR表達(dá)載體，該CAR表達(dá)載體包括載體和接入該載體的CAR，該CAR包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合HER2蛋白的chA21scFv；胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)為CD28-X-ITAM，其中，X為ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。本發(fā)明CAR表達(dá)載體通過(guò)表達(dá)chA21scFv而識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的HER2蛋白，并通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)將信號(hào)傳入T細(xì)胞，從而活化T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子進(jìn)而可以殺傷高表達(dá)HER2蛋白的腫瘤細(xì)胞。而且，胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)整合了CD28共刺激分子以及X共刺激分子，可使T細(xì)胞持續(xù)活化增殖，細(xì)胞因子持續(xù)分泌，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞作用。需要說(shuō)明的是，在該CAR的結(jié)構(gòu)中，chA21為采用表面包埋法(surfaceepitopemaskingmethod，SEM)生產(chǎn)的人源化單克隆抗體A21，是一種抗ErbB2抗體，其具有很強(qiáng)的結(jié)合特異性和抑瘤活性；chA21可特異性識(shí)別HER2胞外區(qū)C-端的第I結(jié)構(gòu)域，遠(yuǎn)離HER2受體二聚化功能位，因此，本發(fā)明以抗HER2的chA21為基礎(chǔ)構(gòu)建CAR-T細(xì)胞；chA21scFv由chA21單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域通過(guò)多肽接頭連接形成，由于不少供應(yīng)商或科研機(jī)構(gòu)已經(jīng)成功合成chA21scFv，且合成方法也為現(xiàn)有技術(shù)，故該chA21scFv可以直接由供應(yīng)商或科研機(jī)構(gòu)提供。鉸鏈區(qū)可以是CD3、CD4、CD8、或者CD28，具體視實(shí)際情況而定。胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)的共刺激分子X(jué)可為ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子，均可起到傳導(dǎo)信號(hào)的作用，實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞持續(xù)活化增殖，細(xì)胞因子持續(xù)分泌，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的目的；胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)的ITAM通常為CD3ζ或者FcεRIγ。進(jìn)一步地，該載體為病毒質(zhì)粒，可以為逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，也可以為慢病毒質(zhì)粒，其實(shí)質(zhì)是以質(zhì)粒的形式存在的病毒。本發(fā)明還提供一種上述的CAR表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括步驟如下：S1、獲取chA21scFv的基因片段、鉸鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段以及ITAM的基因片段；S2、提供引導(dǎo)鏈，基因融合引導(dǎo)鏈與chA21scFv的基因片段，而形成引導(dǎo)鏈-chA21scFv；S3、基因融合鉸鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段和ITAM的基因片段，而形成鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM；S4、基因融合引導(dǎo)鏈-chA21scFv和鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM，而形成引導(dǎo)鏈-chA21scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM；S5、將引導(dǎo)鏈-chA21scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM接入載體，而獲得CAR表達(dá)載體。通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)和重疊PCR技術(shù)，將chA21scFv的基因片段、鉸鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段以及ITAM的基因片段進(jìn)行基因融合，而構(gòu)建CAR表達(dá)載體，其構(gòu)建方式高效、簡(jiǎn)單。需要說(shuō)明的是，該引導(dǎo)鏈優(yōu)選為人CD8α引導(dǎo)鏈，人CD8α引導(dǎo)鏈可以從人CD8α細(xì)胞中提取，也可以從相應(yīng)的供應(yīng)商中獲取，而人CD8α引導(dǎo)鏈的引物可由相應(yīng)的供應(yīng)商提供。進(jìn)一步地，步驟S1具備包括如下步驟：S10、獲取并激活PMBCs(peripheralbloodmononuclearcells，外周血單核細(xì)胞)；S11、提取PMBCs的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；S12、分別提供鉸鏈區(qū)的基因的引物、CD28的引物、X的引物和ITAM的引物，且均以PMBCs的cDNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得鉸鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段以及ITAM的基因片段；S13、提供chA21scFv的模板DNA和chA21scFv的引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得chA21scFv的基因片段。通過(guò)PMBCs獲得T細(xì)胞的mRNA，然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，從而為不同種類的T細(xì)胞的基因片段的擴(kuò)增提供了模板，同時(shí)通過(guò)現(xiàn)有的chA21scFv的模板DNA和chA21scFv的引物對(duì)chA21scFv進(jìn)行PCR擴(kuò)增，顯然，上述PCR擴(kuò)增高效、簡(jiǎn)便，有利于提供CAR表達(dá)載體的構(gòu)建。進(jìn)一步地，該載體為病毒質(zhì)粒，可以為逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，也可以為慢病毒質(zhì)粒，其實(shí)質(zhì)是以質(zhì)粒的形式存在的病毒?，F(xiàn)通過(guò)實(shí)施例1對(duì)本發(fā)明CAR表達(dá)載體及其構(gòu)建方法、CAR-T細(xì)胞的制備方法以及CAR-T細(xì)胞抗HER2的效果做進(jìn)一步解釋和說(shuō)明，在該CAR-T細(xì)胞中，CAR的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)的X共刺激分子優(yōu)選為ICOS共刺激分子，CAR-T細(xì)胞具體構(gòu)建方式參見(jiàn)如下詳述的內(nèi)容。同理，根據(jù)下述的構(gòu)建方式，可以構(gòu)建X共刺激分子為其他共刺激分子時(shí)的CAR-T細(xì)胞，至于X共刺激分子的引物序列可以從NCBI的GenBank中查找獲得，X共刺激分子的引物可以相應(yīng)的商家中購(gòu)買獲得，也可以自行設(shè)計(jì)。實(shí)施例1一、本發(fā)明實(shí)施例所用到的材料及試劑1、人外周血單核細(xì)胞三位健康志愿者的外周血單核細(xì)胞來(lái)源于北京大學(xué)深圳醫(yī)院腫瘤介入科。2、細(xì)胞系人乳腺癌細(xì)胞株SKBR3，T47D，MCF-7，MDA-MB-231和卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，0VCAR3，A1847和A2780，以及HER2陰性的腫瘤細(xì)胞株MDA-MB-468(購(gòu)買于ATCC)。TC-1是HPV-16轉(zhuǎn)染的小鼠肺癌細(xì)胞，用來(lái)作為人HER2陰性表達(dá)的對(duì)照，也購(gòu)買于ATCC。293T細(xì)胞購(gòu)買于ATCC。3、試劑(1)RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)(2)滅活胎牛血清(Invitrogen公司)(3)青一鏈霉素10000U/ml10000IU/ml(Invitrogen公司)(4)抗CD3/抗CD28磁珠(Invitrogen公司)(5)重組人白介素-2(IL-2)(PeproTech公司)(6)DMSO(二甲基亞砜)(Invitrogen公司)(7)0.25％胰酶(Invitrogen公司)(8)LTS1077淋巴細(xì)胞分層液(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)(9)mRNA提取試劑盒(Invitrogen公司)(10)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)(11)PCR試劑盒(Invitrogen公司)(12)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen公司)(13)含有人源化抗HER2的chA21scFv的質(zhì)粒PEE14-chA21(中國(guó)科技大學(xué)提供)(14)人CD8α引導(dǎo)鏈(CD8αleader鏈)(Takara公司)(15)人CD8α引導(dǎo)鏈的正向引物AF(Takara公司)(16)CD8α鉸鏈區(qū)(CD8αhinge)的正向引物CF和反向引物CR(Takara公司)(17)CD28的正向引物DF和反向引物DR(Takara公司)(18)ICOS的正向引物GF和反向引物GR(Takara公司)(19)CD3ζ的正向引物EF和反向引物ER(Takara公司)(20)chA21scFv的正向引物BF和反向引物BR(Takara公司)(21)pMD.G質(zhì)粒、pMDLg/p質(zhì)粒、Rev表達(dá)質(zhì)粒(Qiagen公司)(22)FITC標(biāo)記的山羊抗鼠F(ab’)2抗體(JacksonImmunoResearch公司)(23)APCCY7標(biāo)記的抗人-CD3，PE標(biāo)記的抗人-CD45，F(xiàn)ITC抗人-CD4，PE抗人-CD4，APC抗人-CD8，PE抗人CD45RO，APC抗人CD62L抗體(Biolegend公司)(24)IFN-γELISA試劑盒(Biolegend公司)(25)IL-2ELISA試劑盒(Biolegend公司)(26)HER2-Fc嵌合蛋白(R&DSystems公司)(27)CD19-Fc嵌合蛋白(SPEEDBioSystems公司)(28)鉻酸鈉(Na251CrO4)(DuPontNEN公司)(29)FITC兔抗人HER2抗體(Clone24D2，Biolegend公司)(30)脂質(zhì)體2000(Invitrogen公司)(31)凝聚胺(Sigma公司)4、引物序列表表一二、本實(shí)施例的技術(shù)方案(一)、外周血單核細(xì)胞的分離與激活1、人外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)的分離(1)抗凝血管抽取健康志愿者的外周血15ml；(2)向該抗凝血管中加入等體積的PBS，輕輕吹打成細(xì)胞懸液30ml；(3)另取兩支50ml離心管，向一離心管加入15ml的LTS1077淋巴細(xì)胞分層液；然后，用吸管吸取15ml的細(xì)胞懸液，在距離LTS1077淋巴細(xì)胞分層液上方1cm處將細(xì)胞懸液小心而緩慢的加入，使細(xì)胞懸液重疊于LTS1077淋巴細(xì)胞分層液上，2000rpm離心20min；(4)取出離心后的離心管，移液管吸去最上層的血漿，移液槍吸取血漿層下的單個(gè)核細(xì)胞置入另一離心管中；然后，加入l5ml的PBS洗滌，輕輕吹打均勻后再次離心，1500rpm，l0min，去掉上清；共洗滌3次；(5)向去掉上清后的離心管內(nèi)加入含10％滅活胎牛血清、100U/ml青一鏈霉素、100U/mlIL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基，放置于37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，而分離獲得PBMC細(xì)胞制劑。2、人外周血單核細(xì)胞的激活(1)取步驟1獲得的PBMC細(xì)胞制劑，于24孔板中種植1x106個(gè)PBMC細(xì)胞(1×106/ml)；(2)按照免疫磁珠分選試劑盒的說(shuō)明書(shū)的方法，用PBS將包被抗CD3/CD28的磁珠洗3遍；(3)將磁珠按3:1(磁珠:細(xì)胞)比例加入PBMC細(xì)胞中，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；(4)細(xì)胞激活12～24小時(shí)后，離心，收取被激活的人外周血單核細(xì)胞，用作提mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。(二)、提取激活的外周血單核細(xì)胞的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA1、外周血單核細(xì)胞的mRNA的提取(1)取出被激活后的人外周血單核細(xì)胞1.5×106個(gè)，用PBS沖洗2遍；(2)去掉上清后，向細(xì)胞沉淀中加入1.5ml的Trizol，吹打成均勻細(xì)胞懸浮液；(3)采用1ml注射器來(lái)回抽吸細(xì)胞懸浮液，以剪切基因組DNA，然后用注射器直接將樣品轉(zhuǎn)移到一新的1.5ml的EP管中；(4)向EP管中加入250μl的氯仿，劇烈震蕩30sec，12000rpm離心5min；(5)將離心后產(chǎn)生的上清移至另一新的1.5ml的Ep管中，并加入等體積的異丙醇，室溫放置5min；(6)12000rpm離心5min，吸走上清液；(7)向吸走上清液后的Ep管中加入70％的乙醇750μl，不需吹打，12000rpm離心2min；(8)盡可能徹底吸走離心后產(chǎn)生的上清，室溫干燥使乙醇揮發(fā)，而形成沉淀；(9)向該沉淀加入60μl的DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水，而溶解該沉淀，即溶解外周血單核細(xì)胞的mRNA；(10)取溶解的mRNA3μl，加至1ml的DEPC水中，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量260nm和280nm的吸光度值：OD260/280＝1.9～2.0；按1OD＝40μg的mRNA計(jì)算mRNA的產(chǎn)率，OD260/280在1.9～2.0視為提取的mRNA純度很高；(11)用提取的RNA產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行下一步的RT反應(yīng)。2、RT(ReverseTranscription，反轉(zhuǎn)錄)反應(yīng)(1)將步驟1提取的mRNA與其他試劑構(gòu)成如下的反應(yīng)體系：試劑體積mRNA1.5μlOligodT-AdaptorPrimer(引物)1μldNTPMixture(各10nM)2μlAMVReverseTranscriptase1μl10×RTBuffer1.5μlRNaseFreedH2O3.75μlMgCl22μlRNaseInhibitor0.25μlTotal13μl(2)RT反應(yīng)條件：室溫，10min；42℃，1h；99℃，5min滅活A(yù)MVReverseTranscriptase；進(jìn)而反轉(zhuǎn)錄獲得PMBCs的cDNA；(3)將反轉(zhuǎn)錄得到的PMBCs的cDNA置于-80℃冰箱保存，備用。(三)、靶向HER2的嵌合性抗原受體(CAR)載體的構(gòu)建1、PCR擴(kuò)增chA21scFv、CD8αhinge、CD28、ICOS和CD3ζ1.1、PCR擴(kuò)增chA21scFva、提供chA21scFv的DNA模板及chA21scFv的引物：chA21scFv的DNA模板由中國(guó)科技大學(xué)提供的質(zhì)粒PEE14-chA21獲得；chA21scFv的正向引物BF和反向引物BR由Takara公司提供，其引物系列具體見(jiàn)上表一)；b、按照如下的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件獲得PCR產(chǎn)物；PCR反應(yīng)體系：試劑體積DNA模板(chA21scFv)1.5μl(75ng)10×PCRbuffer7.5μl10mMdNTP1.5μl10um正向引物BF3μl10um反向引物BR3μl50mMMgSO43μlTaqDNA聚合酶1μl(5單位)加三蒸水至80μlPCR反應(yīng)條件：c、電泳配制瓊脂糖凝膠(20g/L)：稱取0.6g的瓊脂糖凝膠粉，加入30ml的TAE電泳緩沖液，混勻后放入微波爐中加熱45s，加入1ul的EB液，混勻后灌注，室溫冷卻；向電泳槽中加入適量TAE電泳緩沖液，用DL2000作為DNAMarker，向樣本孔中加入5u1的上述PCR產(chǎn)物，調(diào)節(jié)電泳儀電壓為90mV，電泳半小時(shí)；d、結(jié)果觀察利用數(shù)碼凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析可知：上述PCR產(chǎn)物為chA21scFv基因片段；e、PCR產(chǎn)物回收(1)將電泳后余下的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至2ml的EP管中，加入300ul的PB緩沖液，充分混勻；(2)吸附：QIAquick柱子鏈接2ml的EP管，將含PCR產(chǎn)物的PB緩沖液緩慢加入QIAquick柱子，13000轉(zhuǎn)/分離心30秒；(3)洗滌：棄去EP管中的液體，向QIAquick柱子中加入800ul的PE緩沖液，13000轉(zhuǎn)/分離心30秒；(4)棄去EP管中的液體，13000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘；(5)洗脫：將QIAquick柱子置于新的1.5ml的EP管中，向柱子中加入60ul的EB緩沖液，13000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，棄去EP管中的液體而回收PCR產(chǎn)物；(6)將回收后的PCR產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存。1.2、PCR擴(kuò)增CD8αhinge、CD28和CD3ζa、提供引物以及步驟(二)制得的PBMCs的cDNA：CD8αhinge的正向引物CF和反向引物CR由Takara公司提供，其引物系列見(jiàn)上表一；CD28的正向引物DF和反向引物DR由Takara公司提供，其引物系列見(jiàn)上表一；ICOS的正向引物DF和反向引物DR由Takara公司提供，其引物系列見(jiàn)上表一；CD3ζ的正向引物EF和反向引物ER由Takara公司提供，其引物系列見(jiàn)上表一；b、按照如下的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件獲得PCR產(chǎn)物；PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)條件：與PCR擴(kuò)增chA21scFv的PCR反應(yīng)條件相同；c、PCR產(chǎn)物回收(與PCR擴(kuò)增chA21scFv的PCR產(chǎn)物回收的步驟相同)，進(jìn)而獲得CD8αhinge/CD28/ICOS/CD3ζ的PCR產(chǎn)物。2、重疊PCR而進(jìn)行基因融合2.1、提供CD8αleader鏈(CD8α引導(dǎo)鏈)，將CD8αleader鏈與PCR擴(kuò)增后的chA21scFv進(jìn)行基因融合，而形成CD8αleader-chA21scFv：a、第一步PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系和反應(yīng)時(shí)間如下；第一步PCR反應(yīng)體系：試劑體積CD8αleader鏈～50ng擴(kuò)增后的chA21scFv～50ng10×PCRbuffer5μl10mMdNTP1μl50mMMgSO42μlTaqDNA聚合酶0.2μl加水至50μl第一步PCR反應(yīng)條件：b、第二步PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系和反應(yīng)時(shí)間如下；第二步PCR反應(yīng)體系：向第一步PCR反應(yīng)完成后的體系中加入CD8αleader鏈的正向引物AF(其引物系列如表一所示)以及chA21scFv的反向引物BR(其引物序列如表一所示)各2ul；第二步PCR反應(yīng)條件：e、將第二步PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，數(shù)碼凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，而證明第二步PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物為CD8αleader-chA21scFv；f、第二步PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物回收(與PCR擴(kuò)增chA21scFv的PCR產(chǎn)物回收的步驟相同)，而獲得CD8αleader-chA21scFv；2.2、將擴(kuò)增后的CD8αhinge與擴(kuò)增后的CD28進(jìn)行基因融合，獲得CD8αhinge-CD28；將CD8αhinge-CD28與擴(kuò)增后的ICOS進(jìn)行基因融合，獲得CD8αhinge-CD28-ICOS；將CD8αhinge-CD28-ICOS與擴(kuò)增后的CD3ζ進(jìn)行基因融合，獲得CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ；將CD8αleader-chA21scFv與CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ進(jìn)行基因融合，獲得CD8αleader-chA21scFv-CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ，其基因結(jié)構(gòu)如圖1所示；具體方法同上，其中，CD8αhinge與CD28融合過(guò)程中所添加的引物為CF，DR；CD8αhinge-CD28與ICOS融合過(guò)程中所添加的引物為CF，GR；CD8αhinge-CD28-ICOS與CD3ζ融合過(guò)程中所添加的引物為CF，ER；CD8αleader-chA21scFv與CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ融合過(guò)程中所添加的引物為AF，ER(引物序列如表一所示)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，數(shù)碼凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，最終回收PCR產(chǎn)物CD8αleader-chA21scFv-CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ。3、將CD8αleader-chA21scFv-CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ交由美國(guó)劍橋加基因公司(Addgene，Cambridge，MA，USA)接入pSin(慢病毒)骨架形成pSin-chA21-28ζ質(zhì)粒，即CAR表達(dá)載體。(四)包裝CAR表達(dá)載體(包裝pSin-chA21-28ζ慢病毒質(zhì)粒)，而制得感染混合物1、293T細(xì)胞傳代培養(yǎng)及準(zhǔn)備a、293T細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)(1)細(xì)胞培養(yǎng)基：配置含10％滅活胎牛血清、100U/ml青一鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基；(2)從液氮罐取出凍存的293T細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋，凍存的293T細(xì)胞融化后，在超凈臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞懸液移入離心管中，加入4ml的RPMI-1640培養(yǎng)基，放入離心機(jī)中，1000轉(zhuǎn)/分離心3～4分鐘；(3)棄去上清液，加入1ml配制的RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕吹打成細(xì)胞懸液，移入75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640培養(yǎng)基至10ml，放入37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后給予換液；b、293T細(xì)胞傳代培養(yǎng)皿中的細(xì)胞布滿約80～90％時(shí)進(jìn)行傳代。將舊的培養(yǎng)基吸走，向培養(yǎng)皿中加入2～3ml的PBS沖洗1遍，吸走PBS，向培養(yǎng)皿中加入0.25％的胰蛋白酶2ml，消化3～5min，注意在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，當(dāng)見(jiàn)到細(xì)胞回縮，形態(tài)變圓，細(xì)胞間連接間隙增大時(shí)，向培養(yǎng)皿中加5ml的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，吸管反復(fù)吹打使細(xì)胞脫落，制成細(xì)胞懸液后，按大約1:3比例傳代培養(yǎng)；c、293T細(xì)胞凍存(1)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，布滿培養(yǎng)瓶約80～90％時(shí)可以凍存。細(xì)胞消化后吹打成細(xì)胞懸液，移入15ml離心管中，放入離心機(jī)中，1000轉(zhuǎn)/分離心3～4分鐘；(2)棄去上清液，加入含10％二甲基亞砜的滅活胎牛血清1ml，輕輕吹打成細(xì)胞懸液，移入細(xì)胞凍存管中，做好標(biāo)記，置入冰上，并迅速投入液氮罐中保存。2、慢病毒質(zhì)粒的包裝(1)取出凍存的293T細(xì)胞，并置于75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；選取融合度60～70％的293T細(xì)胞，換液后三小時(shí)后備用；(2)將3種包裝質(zhì)粒pMD.G、pMDLg/p、Rev及pSin-chA21-28z質(zhì)粒按下表比例于1ml無(wú)血清無(wú)雙抗的37℃預(yù)熱的RPMI-1640中混合均勻，室溫孵育5分鐘，而獲得質(zhì)?；旌衔?；pMDLg/p5.5μgRev3μgpMD.G4.5μgpSin-chA21-28z13μg總計(jì)26μg(3)將26μg的上述質(zhì)?；旌衔锱c39μl脂質(zhì)體2000(質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000的比率為1μg:1.5μl)逐滴加入1ml無(wú)血清無(wú)抗生素的RPMI-1640中輕輕混合均勻，室溫孵育5分鐘，而獲得混合液；(4)將最終的脂質(zhì)體2000及質(zhì)粒共混物的混合液逐滴加到293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕混合均勻，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(5)收集轉(zhuǎn)染24小時(shí)和48小時(shí)的293T細(xì)胞上清液；(6)取收集的293T細(xì)胞上清液約35ml，收集于50ml離心管中，2000轉(zhuǎn)，10分鐘，去除293T細(xì)胞碎片，而獲得去碎片后的上清液；(7)將步驟(6)獲得的上清液置于冰上，用60ml注射器連接0.45μm針頭濾器將離心后的上清液過(guò)濾于35ml超速離心管中，25000轉(zhuǎn)，3小時(shí)；(8)將離心管輕輕取出，置于冰上；(9)在病毒專用超凈臺(tái)中，打開(kāi)金屬離心管，吸去部分離心后的病毒上清，用鑷子取出超速離心管，吸去大部分上清，剩余約4ml；(10)用5ml移液管反復(fù)吹打剩余的4ml病毒上清約10次，0.75ml/管進(jìn)行分裝，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫@得慢病毒顆粒，即感染混合物。(五)、轉(zhuǎn)染外周血單核細(xì)胞1、人外周血單核細(xì)胞的分離與激活與步驟(一)相同。2、人外周血單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(1)人外周血單核細(xì)胞在24孔板中激活12～24小時(shí)后，離心24孔板，吸走800μl上清培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液，調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)目約0.5×106/200μl；(2)從人外周血單核細(xì)胞分選出T細(xì)胞并激活，取(7～9)×105激活的T細(xì)胞，用CD45RO，CD62L抗體染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前激活的人外周血單核細(xì)胞的分型(方法同上)；(3)在室溫下將凍存的慢病毒顆粒融化，輕輕混勻，將1ml的慢病毒顆粒加入T細(xì)胞中，向24孔板中加入凝聚胺，用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整至終濃度為12μg/ml，將24孔板放入離心機(jī)離心，2500r/min，離心1.5小時(shí)；離心后將24孔板放于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；(4)離心過(guò)夜培養(yǎng)的24孔板，去掉大部分含慢病毒顆粒的上清培養(yǎng)液，加入新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液，擴(kuò)增T細(xì)胞；(5)每2天計(jì)數(shù)T細(xì)胞，向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入IL-250IU/ml，維持T細(xì)胞密度為(0.5～1)×106/ml；(6)2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45RO，CD62L抗體以及FITC標(biāo)記的羊抗鼠F(ab')2抗體，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析(方法同上)；(7)轉(zhuǎn)染成功的chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞備用。(六)、表達(dá)抗HER2的CAR-T細(xì)胞體外功能的檢測(cè)在檢測(cè)前，先將實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞與表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞株(實(shí)施例1所涉及的材料中的細(xì)胞系)按如下步驟進(jìn)行共培養(yǎng)，而獲得共培養(yǎng)液：(1)用0.25％胰酶消化腫瘤細(xì)胞后，加入RPMI1640培養(yǎng)基中和胰酶，離心后調(diào)整細(xì)胞密度為1x106/ml，取100μl(1x105)腫瘤細(xì)胞接種于U型96孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；(2)表達(dá)抗HER2的chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增14天后，離心去掉抗CD3/CD28磁珠，在無(wú)IL-2的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜，使T淋巴細(xì)胞靜息；(3)收取靜息的T淋巴細(xì)胞，離心去掉上清，將細(xì)胞重懸于RPMI1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1x106/ml，取100μl(1x105)T細(xì)胞接種于U型96孔板中已經(jīng)接種腫瘤細(xì)胞的相應(yīng)的孔中，將96孔板放置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。只有T細(xì)胞的孔作為陰性對(duì)照孔。1、ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)液中IFN-γ的含量(1)包被：按說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)，將Capture抗體稀釋于1X包被緩沖液中，向試劑盒提供的微孔板中的各反應(yīng)孔中各加0.1ml，塑料貼紙覆蓋微孔板，放置4℃過(guò)夜；(2)封閉：將過(guò)夜后的微孔板用自動(dòng)ELISA洗板機(jī)洗漆4次后，拋干，用IX分析緩沖液100μl封閉1小時(shí)；(3)加樣：將微孔板再次洗漆4次后，拋干，向各反應(yīng)孔加入待檢測(cè)的T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液100μl，相應(yīng)稀釋倍數(shù)的上清液及IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品(1000pg/ml，倍比稀釋至15.6pg/ml)，室溫孵育2小時(shí)；(4)加檢測(cè)抗體：微孔板洗滌4次后，拋干，按說(shuō)明書(shū)指定將Detection抗體用1X分析緩沖液稀釋，取100μl加入各反應(yīng)孔中，室溫孵育1小時(shí)；(5)加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗：微孔板洗漆4次后，拋干，將HRP標(biāo)記的抗體用1X分析緩沖液稀釋，向各反應(yīng)孔中各加100μl，室溫孵育0.5小時(shí)；(6)微孔板洗漆4次后，拋干，向各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液100μl，避光孵育15分鐘；(7)向各反應(yīng)孔中加入1M硫酸100μl終止反應(yīng)；(8)結(jié)果判定：在ELISA檢測(cè)儀上，以空白對(duì)照孔調(diào)零，檢測(cè)各孔450nm吸光值(OD值)，計(jì)算IFN-γ濃度值。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。根據(jù)圖2可知，chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞可以特異性的識(shí)別所有HER2+的腫瘤細(xì)胞并大量分泌IFN-γ，針對(duì)乳腺癌細(xì)胞(SKBR3)分泌的IFN-γ高達(dá)19000pg/ml以上，但將chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞與HER2陰性的MDA-MB-468和TC-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中只能檢測(cè)到非常低劑量的IFN-γ。而NT-T細(xì)胞與HER2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中檢測(cè)不到IFN-γ。因此，結(jié)果表明：HER2-特異性的T細(xì)胞可以特異性的識(shí)別并殺傷HER2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。2、ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)液中IL-2的含量檢測(cè)步驟與IFN-γ的步驟相同，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。根據(jù)圖3可知，chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞可以特異性的識(shí)別所有HER2+的腫瘤細(xì)胞并大量分泌IL-2，針對(duì)乳腺癌細(xì)胞(SKBR3)分泌的IL-2高達(dá)2800pg/ml以上。但將chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞與HER2陰性的MDA-MB-468和TC-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中只能檢測(cè)到非常低劑量的IL-2。而NT-T細(xì)胞與HER2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中檢測(cè)不到IL-2。因此，結(jié)果表明：HER2-特異性的T細(xì)胞可以特異性的識(shí)別并殺傷HER2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。3、CAR-T細(xì)胞的抗原特異性評(píng)價(jià)試驗(yàn)(1)包被：用200μl5μg/mlHER2-Fc嵌合蛋白或者CD19-Fc嵌合蛋白的包被96孔板，用塑料貼紙覆蓋96孔板，4℃過(guò)夜；(2)加入活化的T細(xì)胞：次日，PBS洗滌3次后，拋干，向96孔板中加入1×105個(gè)chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞或NTT細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；(3)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IFN-γ的分泌，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。根據(jù)圖4可知，NT-T細(xì)胞對(duì)HER2-FC嵌合蛋白和CD19-FC嵌合蛋白均無(wú)特殊反應(yīng)，chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞對(duì)CD19-Fc嵌合蛋白也無(wú)特殊反應(yīng)，但是在HER2-FC嵌合蛋白封閉的96孔板中，chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞釋放了大量的INF-γ，且高達(dá)19000pg/ml以上。4、51Cr釋放試驗(yàn)檢測(cè)chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞殺傷乳腺癌細(xì)胞能力(1)收獲處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞(SKBR3)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml；(2)取1×106細(xì)胞(0.5ml)，加Na251CrO4100uCi，37度孵育2～3h，每15min輕輕振搖一次；(3)用10％FCSRPMI1640洗滌3次，每次800rpm、5min。(4)重懸細(xì)胞濃度1×105/ml；(5)96孔U型培養(yǎng)板中，每孔加100μl(1x104細(xì)胞)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；(6)按照效應(yīng)T細(xì)胞與靶細(xì)胞為1:1，3:1和10:1的比例，每孔加入100μl不同細(xì)胞濃度的實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞；設(shè)置最大釋放組，向乳腺癌細(xì)胞加100μl1％TritonX-100；設(shè)置自然釋放組，向乳腺癌細(xì)胞中加100μlRPMI1640培養(yǎng)基；(7)200g離心1min，放入37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)4h。(8)200g離心1min，每孔取出100μ上清，用Wizard2gamma計(jì)數(shù)(PerkinElmer)檢測(cè)；(9)計(jì)算：特異性殺傷率(％)＝(實(shí)驗(yàn)組cpm-自然釋放cpm)/(最大釋放組-自然釋放cpm)，計(jì)算結(jié)果圖5所示。根據(jù)圖5可知，chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞特異性的裂解HER2-陽(yáng)性的SKBR3腫瘤細(xì)胞，而NTT細(xì)胞對(duì)于HER2陽(yáng)性或者陰性的SKBR3腫瘤細(xì)胞均未有裂解作用。同時(shí)，將NT-T細(xì)胞和chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞分別與表達(dá)HER2的SK0V3細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，可以看到NT-T細(xì)胞對(duì)SK0V3細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，而加入chA21-28-ICOSζCAR-T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中可以看到T細(xì)胞集落的形成，且SKBR3腫瘤細(xì)胞明顯減少。5、統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均為表示。利用GraphPadPrism5.0(GraphPadSoftware，Inc.，SanDiego，CaliforniaUSA)軟件，T檢驗(yàn)法分析細(xì)胞因子分泌的差異及特異性細(xì)胞裂解的差異。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，本發(fā)明以CAR表達(dá)載體為基礎(chǔ)構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞對(duì)表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞具有良好的殺傷效果，且CAR-T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞(SKBR3)共培養(yǎng)時(shí)分泌的INF-γ高達(dá)19000pg/ml以上，IL-2高達(dá)2800pg/ml以上，遠(yuǎn)高于其他第三代CAR-T細(xì)胞分泌的INF-γ和IL-2。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是在本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思下，利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所作的等效變換，或直接/間接運(yùn)用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
均包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3