本發(fā)明屬于微生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業(yè)化液體發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)水域環(huán)境的甲藻赤潮頻發(fā)，養(yǎng)殖水源環(huán)境的污染日趨惡化，這嚴(yán)重影響了池塘養(yǎng)殖生產(chǎn)的健康發(fā)展。有研究表明當(dāng)池塘水體形成以甲藻、藍(lán)藻等有害微藻為優(yōu)勢(shì)時(shí)，養(yǎng)殖水質(zhì)惡化，養(yǎng)殖對(duì)蝦的生長(zhǎng)和健康水平受到嚴(yán)重影響(劉孝竹,2011)；當(dāng)甲藻濃度升高到10⁴cells/L時(shí)，致使對(duì)蝦行為異常并逐漸死亡(Linares,2009)。而南方海水或咸淡水池塘在養(yǎng)殖前中期容易形成以甲藻為優(yōu)勢(shì)的微藻群落結(jié)構(gòu)，在此環(huán)境下養(yǎng)殖對(duì)蝦極易發(fā)生病害，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖效益(彭聰聰,2011；劉孝竹,2009)。所以，嚴(yán)格控制甲藻的生態(tài)優(yōu)勢(shì)，穩(wěn)定養(yǎng)護(hù)以綠藻或硅藻為優(yōu)勢(shì)的微藻環(huán)境，對(duì)保障池塘養(yǎng)殖生產(chǎn)順利開展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前在甲藻防控領(lǐng)域的研究主要集中在對(duì)海灣赤潮(Mayali,2007；Rooney,2005)及相關(guān)有害藻特性與治理(謝志浩,2008)，以及相應(yīng)溶藻菌的分離篩選與溶藻機(jī)制分析等(Yang et al,2013；Shi et al,2013)。養(yǎng)殖池塘環(huán)境與上述水環(huán)境差異巨大，有關(guān)利用溶藻菌防控池塘甲藻優(yōu)勢(shì)并維護(hù)優(yōu)良微藻藻相的研究及應(yīng)用還少見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)報(bào)道的微藻溶藻菌種類主要有：芽孢桿菌、海洋桿菌、屈撓細(xì)菌、假單胞菌、弧菌、噬胞菌、黃桿菌、節(jié)桿菌、葡萄球菌、鞘氨醇單胞菌等。史榮君(2013)、Yang(2013)等從赤潮環(huán)境中篩選了可有效溶解赤潮硅藻和甲藻的溶藻菌菌株，它們屬于芽孢桿菌、海洋桿菌等多個(gè)菌種。

本申請(qǐng)中的溶藻菌株JZBC1為蠟樣芽孢桿菌(保藏名稱為蠟樣芽孢桿菌JZBC1，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢，保藏日期：2016年3月3日，保藏號(hào)：CCTCC M 2016081，申請(qǐng)?zhí)枺?01610209371.X)，它僅對(duì)池塘優(yōu)勢(shì)甲藻——錐狀斯氏藻具有溶解消除作用，對(duì)小球藻、柵藻、小環(huán)藻等優(yōu)良綠藻和硅藻無(wú)不良影響。

蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于環(huán)境中，為革蘭氏陽(yáng)性菌，其非毒性菌株可凈化養(yǎng)殖水質(zhì)，促進(jìn)養(yǎng)殖生物健康生長(zhǎng)，已被應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域(李煜等，2012；李俠等，2001)。曹煜成等在養(yǎng)殖池塘施用蠟樣芽孢桿菌CZBC1菌劑，有效控制了顫藻、微囊藻等有害藍(lán)藻，而對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦和水體其他優(yōu)良綠藻和硅藻沒(méi)有影響(曹煜成等，ZL201310 203745.3)；陽(yáng)鋼等使用蠟樣芽孢桿菌BC-1有效提高了刺參的生長(zhǎng)速度(陽(yáng)鋼等，2012)；何鑒堯等研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌L7和L8對(duì)螺旋鞘絲藻有顯著地控制效果(何鑒堯等，2008)。王善龍研究指出雖然對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中也存在蠟樣芽孢桿菌，但只有施用了蠟樣芽孢桿菌CZBC1的養(yǎng)殖水環(huán)境中的藍(lán)藻數(shù)量才得到有效控制(王善龍，2015)?？梢?jiàn)，即使是同屬于蠟樣芽孢桿菌，但不同來(lái)源的菌株其生態(tài)功能特性存在較大的差異。

雖然就芽孢桿菌發(fā)酵工藝、溶藻菌發(fā)酵條件優(yōu)化等已有報(bào)道(王海云等，一株蠟樣芽胞桿菌及其制備方法應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)?01410223612.7；朱杰等，芽孢桿菌屬溶藻菌的固體發(fā)酵與應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)?01210308126.6；孫梅等，一種巨大芽孢桿菌及其固體發(fā)酵制備菌劑的方法和應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)?01310413693.2；榮小軍等，一種蠟樣芽孢桿菌及其制劑和應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)?01010602326.3；葉姜瑜等，響應(yīng)曲面法優(yōu)化溶藻細(xì)菌發(fā)酵條件的研究，2011；許珂等，溶藻細(xì)菌W5培養(yǎng)條件優(yōu)化及發(fā)酵培養(yǎng))。但目前針對(duì)蠟樣芽孢桿菌JZBC1菌劑的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)方法還未見(jiàn)報(bào)道。由于蠟樣芽孢桿菌不是所有菌株都具有溶解池塘甲藻的特性，而上述研究中的溶藻菌也非本申請(qǐng)中的蠟樣芽孢桿菌或類似的溶藻菌株，也未見(jiàn)相關(guān)菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)品。所以，本申請(qǐng)擬在溶解池塘優(yōu)勢(shì)甲藻—錐狀斯氏藻的蠟樣芽孢桿菌菌株JZBC1的工業(yè)化液體發(fā)酵方法方面進(jìn)行研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業(yè)化液體發(fā)酵方法，該方法通過(guò)研究蠟樣芽孢桿菌JZBC1的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵參數(shù)，建立了將菌劑從菌種到產(chǎn)品的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的相關(guān)工藝。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業(yè)化液體發(fā)酵方法，包括以下步驟：

(1)確定蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業(yè)化發(fā)酵罐培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基；

(2)種子液培養(yǎng)：選取蠟樣芽孢桿菌JZBC1，在恒溫振蕩條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)，獲得發(fā)酵種子液；

(3)工業(yè)化發(fā)酵罐培養(yǎng)：依照50L—500L—5000L的發(fā)酵罐規(guī)模，將發(fā)酵種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中逐級(jí)進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵，獲得發(fā)酵液，其中，50L和500L發(fā)酵罐的發(fā)酵菌濃度均達(dá)到5.0×10⁸～10⁹cfu/mL以上，5000L發(fā)酵罐的最終菌濃度達(dá)到5.0×10⁹～10¹⁰cfu/mL以上，芽孢獲得率90～95％以上；

(4)菌泥后處理與包裝：采用離心機(jī)除去步驟(3)所得發(fā)酵液中的多余水分，獲得菌泥，將菌泥與載體混勻，經(jīng)包括干燥、粉碎和包裝工序處理后，獲得溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1制劑。

在上述溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業(yè)化液體發(fā)酵方法中：

步驟(1)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：1L水中含有玉米漿18.5～24.5g、大豆蛋白12～20g、NaCl 0.8～1.5g、KH₂PO₄ 0.15～0.4g、MgSO₄ 0.15～0.4g、CaCl₂ 0.1～0.3g、質(zhì)量百分含量為3％的MnSO₄溶液1mL。

進(jìn)一步的，步驟(1)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：1L水中含有玉米漿20g、大豆蛋白13.5g、NaCl 1g、KH₂PO₄ 0.2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.1g，質(zhì)量百分含量為3％的MnSO₄溶液1mL。

在此條件下菌株的生長(zhǎng)、芽孢形成率和發(fā)酵菌體的甲藻溶藻效率最佳。

步驟(2)中的蠟樣芽孢桿菌JZBC1，該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，保藏名稱為蠟樣芽孢桿菌JZBC1，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢，保藏日期：2016年3月3日，保藏編號(hào)：CCTCC No：M 2016081。具體內(nèi)容可參閱申請(qǐng)?zhí)枮?01610209371.X的專利申請(qǐng)。

步驟(2)在恒溫振蕩條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)時(shí)，活化培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(優(yōu)選是營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，市售產(chǎn)品，本申請(qǐng)購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，此處僅為列舉，并非限定)，培養(yǎng)條件優(yōu)選為：pH 6.00～7.50，170～240rpm，28～32℃恒溫振蕩培養(yǎng)18～30h。

步驟(3)中各發(fā)酵罐使用前經(jīng)滅菌處理，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積占各發(fā)酵罐總?cè)莘e的60～75％。

滅菌處理時(shí)，優(yōu)選開啟加熱設(shè)備對(duì)發(fā)酵罐及管道系統(tǒng)進(jìn)行滅菌(溫度121℃，時(shí)間18～24min)，待罐體冷卻至28～30℃，在50L發(fā)酵罐中接種入JZBC1發(fā)酵種子液。

步驟(3)中首先將發(fā)酵種子液接種入50L發(fā)酵罐中，發(fā)酵種子液的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的2.5～5.5％，再依照50L發(fā)酵罐—500L發(fā)酵罐—5000L發(fā)酵罐的流程，進(jìn)行逐級(jí)放大發(fā)酵，發(fā)酵條件為pH 6.8～7.5，溫度28～32℃，轉(zhuǎn)速450～700rpm，通氣量20～60L/min，發(fā)酵培養(yǎng)16～28h。每級(jí)發(fā)酵時(shí)的條件均保持基本一致。

其中500L發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，將50L發(fā)酵罐中的發(fā)酵液全部接種入500L發(fā)酵罐中，5000L發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，將500L發(fā)酵罐中的發(fā)酵液全部接種入5000L發(fā)酵罐。

50L發(fā)酵罐—500L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液取樣進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)，保證發(fā)酵液未受到污染，菌量達(dá)到5.0×10⁸cfu/mL～10⁹cfu/mL以上。

步驟(3)中依照50L—500L—5000L的發(fā)酵規(guī)模，進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵，各級(jí)發(fā)酵的操作要求同上所述，5000L發(fā)酵罐的最終菌濃度達(dá)到5.0×10⁹cfu/mL～10¹⁰cfu/mL以上，芽孢獲得率90％～95％以上。

對(duì)步驟(3)的最終發(fā)酵液進(jìn)行抽檢，檢測(cè)發(fā)酵菌體的甲藻溶藻效率，以池塘優(yōu)勢(shì)甲藻—錐狀斯氏藻為測(cè)試藻，藻液的初始藻細(xì)胞濃度設(shè)為1.0×10⁴cell/mL，依照10⁵cfu/mL的菌濃度將發(fā)酵菌體添加至藻液中，當(dāng)錐狀斯氏藻5d內(nèi)的死亡率達(dá)到90％以上時(shí)視為甲藻溶藻性能合格，保證發(fā)酵獲得的菌體保持良好的甲藻溶藻特性。

步驟(4)中優(yōu)選按單機(jī)單次裝載量為3～6kg將發(fā)酵液引入離心機(jī)，設(shè)定離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)為10000～14000rpm，離心40～50min，獲得菌量超過(guò)10¹⁰cfu/mL的菌泥。

步驟(4)中所述載體優(yōu)選為麩皮，菌泥和麩皮的質(zhì)量份配比為1：3～5，干燥在63～75℃下用流化床干燥，使得物料的水分含量達(dá)到8％以下。

最后以孔徑80～120目的規(guī)格用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，再按濃度10⁹個(gè)/g用真空密封包裝。然后隨機(jī)抽取包裝好的菌劑產(chǎn)品，進(jìn)行甲藻溶藻功效復(fù)查，復(fù)查程序和溶藻指標(biāo)要求同上文所述，確保菌泥后處理加工過(guò)程對(duì)菌株的生長(zhǎng)及溶藻特性無(wú)不良影響。

步驟(4)中對(duì)獲得的獲得溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1制劑進(jìn)行隨機(jī)抽檢，抽檢芽孢含量、菌體生長(zhǎng)情況和甲藻溶藻情況，制劑中菌濃度達(dá)到5.0×10⁹～10¹⁰cfu/mL以上，芽孢獲得率達(dá)到90～95％以上，以池塘優(yōu)勢(shì)甲藻—錐狀斯氏藻為測(cè)試藻，藻液的初始藻細(xì)胞濃度設(shè)為1.0×10⁴cell/mL，依照10⁵cfu/mL的菌濃度將發(fā)酵菌體添加至藻液中，當(dāng)錐狀斯氏藻5d內(nèi)的死亡率達(dá)到90％以上時(shí)，視為合格產(chǎn)品，確保蠟樣芽孢桿菌JZBC1經(jīng)過(guò)各項(xiàng)工序處理后仍然保持良好的生長(zhǎng)性能和甲藻溶藻特性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)優(yōu)選水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘甲藻溶藻菌——蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業(yè)化液體發(fā)酵生產(chǎn)，建立了將菌劑從菌種到產(chǎn)品的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的相關(guān)工藝，實(shí)現(xiàn)了甲藻溶藻菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用；

(2)本發(fā)明針對(duì)發(fā)酵環(huán)節(jié)實(shí)行多次抽樣檢測(cè)，在保證發(fā)酵菌體保持甲藻溶藻性能的前提下，獲得高純度的發(fā)酵菌劑，并且菌劑僅對(duì)池塘優(yōu)勢(shì)甲藻具有溶解專一性，對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦和水體中的優(yōu)良綠藻和硅藻無(wú)不良影響，可安全用于池塘養(yǎng)殖生產(chǎn)應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1是JZBC1菌劑在滅菌池塘水體的生長(zhǎng)曲線。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于闡明與實(shí)施本發(fā)明，屬于發(fā)明的保護(hù)范圍，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)以上公開的內(nèi)容均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。

實(shí)施例1

菌劑的工業(yè)化液體發(fā)酵參數(shù)的確立

利用50L發(fā)酵罐系統(tǒng)平臺(tái)研究確立菌劑工業(yè)化液體發(fā)酵工藝參數(shù)。以蠟樣芽孢桿菌JZBC1的生長(zhǎng)速率、芽孢形成率、發(fā)酵菌劑的溶藻效率為評(píng)估指標(biāo)，建立和優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)。所獲得的相關(guān)發(fā)酵參數(shù)即可應(yīng)用于50L-500L-5000L的逐級(jí)發(fā)酵系統(tǒng)平臺(tái)進(jìn)行JZBC1菌株的工業(yè)化擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)。

首先，利用單因素試驗(yàn)方法，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選取不同的碳源(蔗糖、葡萄糖+蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜、玉米漿、麩皮、麩皮+糖蜜、可溶性淀粉+玉米漿)等量替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖；再以不同的氮源(酵母膏、蛋白胨+酵母膏、硫酸銨、豆粕、大豆蛋白、豆粕+大豆蛋白)等量替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，分析不同種類的培養(yǎng)基配方對(duì)蠟樣芽孢桿菌JZBC1的影響，并結(jié)合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的具體要求建立優(yōu)化培養(yǎng)基配方。

其次，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將玉米漿(碳源)、大豆蛋白(氮源)、pH、接種量、轉(zhuǎn)速、溫度、裝液量等7個(gè)因素作為測(cè)試變量，測(cè)試次數(shù)設(shè)為12，進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析。

結(jié)果表明，1L水中含有玉米漿18.5～24.5g、大豆蛋白12～20g、NaCl 0.8～1.5g、KH₂PO₄ 0.15～0.4g、MgSO₄ 0.15～0.4g、CaCl₂ 0.1～0.3g、質(zhì)量百分含量為3％的MnSO₄溶液1mL時(shí)，尤其是在1L水中含有玉米漿20g，大豆蛋白13.5g，NaCl 1g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄0.2g，CaCl₂ 0.1g，質(zhì)量濃度3％的MnSO₄溶液1mL時(shí)，發(fā)酵16～28h得到的菌濃度達(dá)到5.0×10⁹cfu/mL～10¹⁰cfu/mL以上，芽孢獲得率90％～95％以上，以10⁵cfu/mL的用菌濃度，錐狀斯氏藻(初始密度10⁴cells/mL)5d內(nèi)的死亡率達(dá)到90％以上。

表1-表3的結(jié)果表明，培養(yǎng)基最佳為：1L水中含有玉米漿20g、大豆蛋白13.5g、NaCl 1g、KH₂PO₄ 0.2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.1g，質(zhì)量百分含量為3％的MnSO₄溶液1mL。

表1不同碳源對(duì)蠟樣芽孢桿菌JZBC1的影響

表2不同氮源對(duì)蠟樣芽孢桿菌JZBC1的影響

表3不同因素的數(shù)量水平對(duì)蠟樣芽孢桿菌JZBC1的影響貢獻(xiàn)

實(shí)施例2

在廣州市花都區(qū)中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所花都微生物工業(yè)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)工廠進(jìn)行了蠟樣芽孢桿菌JZBC1工業(yè)化液體發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用，發(fā)酵系統(tǒng)為50L—500L—5000L的工業(yè)化液體發(fā)酵系統(tǒng)。

(1)蠟樣芽孢桿菌JZBC1菌種用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化制備種子液，pH6.00～7.50，200～240rpm，28～32℃恒溫振蕩培養(yǎng)20～30h。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為在1L水中含有玉米漿20g，大豆蛋白13.5g，NaCl 1g，KH₂PO₄0.2g，MgSO₄ 0.2g，CaCl₂ 0.1g，質(zhì)量百分含量為3％的MnSO₄溶液1mL，依照以上配方按70％的裝液量在發(fā)酵罐配制所需的培養(yǎng)基。

(3)開啟加熱設(shè)備對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌(溫度121℃，時(shí)間18～24min)，待罐體冷卻至28～30℃，在50L發(fā)酵罐中接種合格的JZBC1種子液，種子液的接種體積占發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的3％，發(fā)酵條件設(shè)定為pH 7.0，溫度30℃，轉(zhuǎn)速500rpm，通氣量45L/min，發(fā)酵培養(yǎng)16～28h，對(duì)發(fā)酵液取樣進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)，菌量達(dá)到5.0×10⁸cfu/mL～10⁹cfu/mL以上，依照50L——500L——5000L的規(guī)模發(fā)酵流程，進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵，各級(jí)發(fā)酵的操作要求基本一致，5000L發(fā)酵罐的最終菌濃度為5.0×10⁹cfu/mL～10¹⁰cfu/mL以上，芽孢獲得率95％以上。

(4)對(duì)5000L發(fā)酵罐的發(fā)酵液進(jìn)行抽檢，以池塘優(yōu)勢(shì)甲藻—錐狀斯氏藻為測(cè)試藻，藻液的初始藻細(xì)胞濃度設(shè)為1.0×10⁴cell/mL，以10⁵cfu/mL的菌濃度將菌體添加至藻液中，當(dāng)錐狀斯氏藻5d內(nèi)的死亡率達(dá)到90％以上時(shí)視為甲藻溶藻性能合格。

(5)將5000L發(fā)酵罐的發(fā)酵菌液去除多余水分，按單機(jī)單次裝載量為3～6kg引入離心機(jī)，轉(zhuǎn)速設(shè)為10000～14000rpm，離心40～50min，獲得菌量超過(guò)10¹⁰cfu/mL的菌泥；菌泥和麩皮按質(zhì)量比1:3～1:5的比例進(jìn)行攪拌混勻，在63～75℃下用流化床干燥，使得水分含量達(dá)到8％以下；最后以孔徑80～120目的規(guī)格用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，再按10⁹個(gè)/g濃度用真空密封包裝。

(6)隨機(jī)抽取包裝好的菌劑產(chǎn)品，進(jìn)行芽孢含量、菌體生長(zhǎng)情況、甲藻溶藻功效等檢測(cè)，制劑中菌濃度達(dá)到5.0×10⁹～10¹⁰cfu/mL以上，芽孢獲得率達(dá)到90～95％以上，以池塘優(yōu)勢(shì)甲藻—錐狀斯氏藻為測(cè)試藻，藻液的初始藻細(xì)胞濃度設(shè)為1.0×10⁴cell/mL，依照10⁵cfu/mL的菌濃度將發(fā)酵菌體添加至藻液中，當(dāng)錐狀斯氏藻5d內(nèi)的死亡率達(dá)到90％以上時(shí)，視為合格產(chǎn)品，確保蠟樣芽孢桿菌JZBC1經(jīng)過(guò)各項(xiàng)加工過(guò)程后仍然保持良好的生長(zhǎng)性能和甲藻溶藻特性。

結(jié)果顯示，菌劑中的芽孢在滅菌池塘水體環(huán)境能萌發(fā)復(fù)活生長(zhǎng)(圖1)。其次，在加入菌劑的微藻培養(yǎng)系統(tǒng)中，錐狀斯氏藻的藻細(xì)胞數(shù)量在第6天時(shí)減少了98.3％，而未加菌的對(duì)照組錐狀斯氏藻數(shù)量則增加了1.1倍；而在小環(huán)藻培養(yǎng)液中，加菌組的小環(huán)藻數(shù)量由4.7×10⁵cell/mL下降到4.1×10⁵cell/mL，僅減少了12.8％；加菌組的小球藻數(shù)量則由3.3×10⁶cell/mL上升到2.9×10⁷cell/mL，增加了7.8倍?？梢?jiàn)，JZBC1菌在經(jīng)過(guò)一系列發(fā)酵培養(yǎng)及后處理工藝制備成菌劑，它依然保持了對(duì)池塘優(yōu)勢(shì)甲藻—錐狀斯氏藻的溶藻專一性，對(duì)綠藻和硅藻等有益微藻無(wú)明顯影響。

實(shí)施例3

與實(shí)施例2不同的是，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：1L水中含有玉米漿18.5g、大豆蛋白0g、NaCl 0.8g、KH₂PO₄ 0.4g、MgSO₄ 0.15g、CaCl₂ 0.3g、質(zhì)量百分含量為3％的MnSO₄溶液1mL。

實(shí)施例4

與實(shí)施例2不同的是，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：1L水中含有玉米漿24.5g、大豆蛋白12g、NaCl 1.5g、KH₂PO₄ 0.15g、MgSO₄ 0.4g、CaCl₂ 0.1g、質(zhì)量百分含量為3％的MnSO₄溶液1mL。

實(shí)施例5

以汕頭養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)基地對(duì)蝦養(yǎng)殖初期的池塘水體為本底，利用純培養(yǎng)的錐狀斯氏藻、蛋白核小球藻、條紋小環(huán)藻的藻液，調(diào)配養(yǎng)殖水體的微藻群落結(jié)構(gòu)，使得上述各種微藻細(xì)胞的初始濃度穩(wěn)定在10⁴cell/mL的數(shù)量水平。其中，加菌組JZBC1菌劑(實(shí)施例2制備獲得)的初始添加濃度設(shè)定為10⁴cfu/mL～10⁵cfu/mL，對(duì)照組養(yǎng)殖水體不施加JZBC1。自然條件下培養(yǎng)14d，各培養(yǎng)桶的水體容積為100L，每組設(shè)4個(gè)平行，培養(yǎng)過(guò)程中以充氣方式為水體增氧，光照強(qiáng)度2000～7800lx。每24h取樣以顯微鏡檢測(cè)水體中的錐狀斯氏藻、蛋白核小球藻、條紋小環(huán)藻的數(shù)量。結(jié)果表明，JZBC1加菌組2～3d內(nèi)可令水體中的錐狀斯氏藻數(shù)量由初始的10⁴cell/mL大幅減少至32～50，測(cè)試結(jié)束時(shí)水體中蛋白核小球藻的數(shù)量則明顯升高至10⁶cell/mL～10⁷cell/mL，條紋小環(huán)藻的數(shù)量無(wú)明顯變化，而對(duì)照組中的錐狀斯氏藻數(shù)量始終維持在10⁴cell/mL～10⁵cell/mL數(shù)量水平?？梢?jiàn)，JZBC1可有效去除錐狀斯氏藻，促進(jìn)水體形成以蛋白核小球藻、條紋小環(huán)藻等優(yōu)良綠藻和硅藻為優(yōu)勢(shì)的微藻環(huán)境。

表4測(cè)試結(jié)束時(shí)各試驗(yàn)組的微藻數(shù)量 單位(cells/mL)

本發(fā)明不局限于上述特定的實(shí)施方案范圍內(nèi)，上述實(shí)施方案僅僅是為了能夠?qū)Ρ景l(fā)明的使用過(guò)程進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明，而且有相等功能的生產(chǎn)方法和技術(shù)細(xì)節(jié)也屬于本發(fā)明內(nèi)容的一部分。事實(shí)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)前文的描述，就能夠根據(jù)各自需要找到不同的調(diào)整方案，這些調(diào)整都應(yīng)在所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。