專利名稱：一種蠟樣芽孢桿菌菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說涉及一種蠟樣芽孢桿菌菌株，同時還涉及其蠟樣芽孢桿菌菌株在抑制煙草黑脛病方面的用途。
背景技術(shù)：
煙草是重要的經(jīng)濟作物，也是病害危害最嚴(yán)重的作物之一，從播種到收獲，整個過程都可受到病原物的侵染，而引起侵染性病害。煙草黑胚病parasiticavar nicotianae (Breda de Hean) Tuker)是煙草生產(chǎn)危害嚴(yán)重的病害之一,在我國除東北煙區(qū)零星發(fā)生以外，包括臺灣省在內(nèi)的華南、華中、華東和西北種植煙區(qū)均廣泛發(fā)生，經(jīng)濟損失較為嚴(yán)重。目前生產(chǎn)上一般采用抗病品種、栽培防治、化學(xué)防治以及生物防治措施，但由于該病菌的游動孢子形成速度快且數(shù)量大，侵染煙株后潛育期短、發(fā)病快，在一個生長季節(jié)可以發(fā)生多次再侵染，同時該病有時還與其它病害混合發(fā)生，從而導(dǎo)致一些抗黑脛病品種抗性的喪失；化學(xué)防治中化學(xué)農(nóng)藥的采用，短期內(nèi)有效。但長期反復(fù)施用，會造成煙株藥害、煙株農(nóng)藥殘留和病菌對農(nóng)藥的抗藥性。生物防治是國際上目前進行植物病害防治的首選防治措施，這種從自然界中分離、篩選有益微生物并用于病原微生物的拮抗、抑制作用的防治方法，具有聞效、無毒、無殘留和低成本等特點。
從現(xiàn)有植物病害生物防治的研究報道來看，采用的微生物種類有細菌、真菌、放線菌等微生物。但生防菌種普遍存在著定殖不易，容易受外界條件的影響，如對光、紫外、干燥較為敏感。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述問題而提供的一種具有抗逆性強、營養(yǎng)要求簡單、較穩(wěn)定、易于定殖，對光和紫外穩(wěn)定，易產(chǎn)業(yè)化、成本較低、儲存期長、易于施用等特點，且對煙草有一定的促生長作用的蠟樣芽孢桿菌菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供該蠟樣芽孢桿菌菌株在抑制煙草疫霉方面的用途。一種蠟樣芽孢桿菌UmiBacillus cereus 1205)，其形態(tài)特征:1205菌株在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，37 °C，培養(yǎng)36 h，菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm，邊緣不整齊呈擴展?fàn)?，表面粗糙顆粒狀似毛玻璃狀或蠟狀，不分泌色素；為革蘭氏陽性細菌，桿狀，1.0 1.3 X 3.0 5.0 μ m，成鏈，運動性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯；能耐受7%NaCl的培養(yǎng)，接觸酶陽性、葡萄糖發(fā)酵陽性、淀粉水解陽性、硝酸鹽還原陽性、明膠液化陽性、麥芽糖發(fā)酵陽性 、半固體穿刺試驗陽性、酪素水解陽性、VP試驗陰性、檸檬酸鹽利用試驗陰性、吲哚實驗陰性、蔗糖發(fā)酵陰性、乳糖發(fā)酵陰性、甘露醇水解陰性。該菌種已于2012年9月26日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:中國武漢武漢大學(xué)),保藏號:CCTCC NO: M2012382，名稱為:蠟樣芽孢桿菌1205 (.Bacillus cereus1205)。對煙草疫霉有抑制作用的蠟樣芽孢桿菌1205 (.Bacillus cereus 1205)的分離步驟:
(I)拮抗菌的分離與純化:稱取采自貴州省畢節(jié)市大方縣的IOg植煙土樣于90mL帶有玻璃珠的無菌水中，搖床上160rpm振蕩20min,靜置5min,吸取土壤懸浮液用無菌水逐級梯度稀釋。吸取0.1mL稀釋液涂布牛肉膏蛋白胨平板，37°C倒置培養(yǎng)36h，待平板長出菌落后，挑取單菌落純化，編號保存，待測。(2)拮抗細菌的篩選:采用平板對峙法，倒好燕麥培養(yǎng)基平板，用5mm打孔器打取10% V8汁培養(yǎng)基上的疫霉菌絲塊放在平板中央，在其周圍距離2.5cm處對稱接種待測菌株，以不接菌體的平板為對照。重復(fù)三次，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，觀察到有一株細菌周圍產(chǎn)生了明顯的抑菌圈，對煙草疫霉有明顯的拮抗效果，挑出此細菌菌株，將之編號為1205。(3)拮抗菌的鑒定:將1205菌株點接在普通瓊脂平板上，37 °C，培養(yǎng)36 h，菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm,邊緣不整齊呈擴展?fàn)?，表面粗糙顆粒狀似毛玻璃狀或蠟狀，不分泌色素；為革蘭氏陽性細菌，桿狀，1.0 1.3 X 3.0 5.0 μ m，成鏈，運動性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯；能耐受7%NaCl的培養(yǎng)，接觸酶陽性、葡萄糖發(fā)酵陽性、淀粉水解陽性、硝酸鹽還原陽性、明膠液化陽性、麥芽糖發(fā)酵陽性、半固體穿刺試驗陽性、酪素水解陽性、VP試驗陰性、檸檬酸鹽利用試驗陰性、吲哚實驗陰性、蔗糖發(fā)酵陰性、乳糖發(fā)酵陰性、甘露醇水解陰性。參考《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《芽孢桿菌屬》，初步鑒定為芽孢桿菌屬。將1205菌株接種于牛肉膏蛋白 胨液體培養(yǎng)基中，160rpm 28°C培養(yǎng)12h，離心收集菌體。采用上海生工Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細菌)提取基因組DNA。以提取到的DNA為模板，用正向引物
16SF(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
和反向引物16SR(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)對菌株的16S rDNA基因進行PCR擴增。PCR 條件為:94°C 3min ；94°C 45s，54°C 30s, 72°C lmin，25 個循環(huán)；72°C終延伸 5min，4°C停止。PCR產(chǎn)物送由上海生工生物工程股份有限公司測序，長度為1468bp。測序結(jié)果在GenBank中與cerews相似性為97%。綜合菌落形態(tài)、生理生化及分子鑒定,將這一菌株記為臘樣芽抱桿菌cereus 1205)。蠟樣芽孢桿菌菌株1205抑制煙草疫霉方面的應(yīng)用:
(I)將活化的1205菌株挑一環(huán)接入NYBD培養(yǎng)液(牛肉膏Sg，酵母膏5g，葡萄糖10g，水lL，pH自然，121°C，滅菌45min)中，160rpm 28°C培養(yǎng)48h，作為拮抗效果測定的發(fā)酵液。采用平板對峙法，倒好燕麥培養(yǎng)基(燕麥片30g，加入IOL蒸餾水，100°C水浴約lh，8層紗布過濾去渣，再加蒸餾水補足1L，瓊脂18g，pH自然，121°C，滅菌30min)平板，用5mm打孔器打取疫霉菌絲塊放在平板中央，在其周圍距離2.5cm處對稱放置三個浸泡過臘樣芽孢桿菌cereus 1205)發(fā)酵液的濾紙片(直徑為5mm),以不加發(fā)酵液的為對照，重復(fù)三次，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，1205對煙草黑脛病菌的抑菌圈直徑達到了20.5mmο
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，從以上技術(shù)方案可知:本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌(feci77心cereus 1205)來源可靠，對溫度、pH等自然環(huán)境條件的適應(yīng)范圍廣，對不良環(huán)境的耐受力強，能維持生態(tài)平衡，能適應(yīng)病害生態(tài)系統(tǒng)，容易培養(yǎng)和保存，抑制煙草疫霉效果好，在農(nóng)業(yè)方面有很大的應(yīng)用前景。該技術(shù)路線合理，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的中試數(shù)據(jù)和設(shè)計依據(jù)，實現(xiàn)液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)臘樣芽孢桿菌{Bacillus cereus1205)，為開發(fā)相關(guān)生物制劑及大田推廣奠定基礎(chǔ)。
具體實施例方式對煙草疫霉有抑制作用的蠟樣芽孢桿菌1205 (.Bacillus cereus 1205)的分離步驟:
(I)供試菌株:煙草黑胚病病原菌-煙草疫霉從ora flicoiiaaae),貴州大
學(xué)微生物實驗室分離、篩選、鑒定、保存。(2)拮抗菌的分離與純化:稱取采自貴州省畢節(jié)市大方縣的IOg植煙土樣于90mL帶有玻璃珠的無菌水中，搖床上160rpm振蕩20min,靜置5min,吸取土壤懸浮液用無菌水逐級梯度稀釋。吸取0.1mL稀釋液涂布牛肉膏蛋白胨(牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0g, NaCl5.0g,瓊脂20g,水1L，ρΗ7.2，121。。，滅菌45min)平板，37°C倒置培養(yǎng)36h，待平板長出菌落后，挑取單菌落純化，編號保存，待測。(3)拮抗細菌的篩選:米用平板對峙法，倒好燕麥培養(yǎng)基(燕麥片30g,加入IL蒸餾水，100°C水浴約lh，8層紗布過濾去渣，再加蒸餾水補足1L，瓊脂18g，pH自然，121°C，滅菌30min)平板，用5mm打孔器打取10%V8培養(yǎng)基(IOmL V8加去離子水90 mL, CaCO3 0.02g,瓊脂2g，pH自然，121°C，滅菌30min)上的疫霉菌絲塊放在平板中央，在其周圍距離2.5cm處對稱接種待測菌株，以不接菌體的平板為對照。重復(fù)三次，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，觀察到有一株細菌對煙草疫霉有明顯的拮抗效果，將這株細菌編號為1205。 將活化的1205菌株挑一環(huán)接入NYBD培養(yǎng)液(牛肉膏Sg，酵母膏5g，葡萄糖10g，水1L，pH自然，121°C，滅菌45min)中，160rpm, 28°C培養(yǎng)48h，作為拮抗效果測定的發(fā)酵液。采用平板對峙法，倒好燕麥培養(yǎng)基平板，用5_打孔器打取疫霉菌絲塊放在平板中央，在其周圍距離2.5cm處對稱放置三個浸泡過1205發(fā)酵液的濾紙片(直徑為5mm)，以不加發(fā)酵液的為對照，重復(fù)三次，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，1205對煙草疫霉的抑菌圈直徑達到了 20.5mm。同時，挑取菌落邊緣和抑菌帶接觸部位的菌絲制片，顯微觀察到煙草疫霉菌絲溶解，斷裂，原生質(zhì)凝結(jié)現(xiàn)象。拮抗菌的鑒定:1205在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，37 °C，培養(yǎng)36 h，菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm,邊緣不整齊呈擴展?fàn)?，表面粗糙顆粒狀似毛玻璃狀或蠟狀，不分泌色素；為革蘭氏陽性細菌，桿狀，1.0 1.3 X 3.0 5.0 μ m，成鏈，運動性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯；能耐受7%NaCl的培養(yǎng)，接觸酶陽性、葡萄糖發(fā)酵陽性、淀粉水解陽性、硝酸鹽還原陽性、明膠液 化陽性、麥芽糖發(fā)酵陽性、半固體穿刺試驗陽性、酪素水解陽性、VP試驗陰性、檸檬酸鹽利用試驗陰性、吲哚實驗陰性、蔗糖發(fā)酵陰性、乳糖發(fā)酵陰性、甘露醇水解陰性。參考《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《芽抱桿囷屬》，初步鑒定為牙抱桿囷屬。
將1205菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0g, NaCl5.0gjJClL，pH7.2)*，160rpm 28°C培養(yǎng)12h，離心收集菌體。采用上海生工Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細菌)提取基因組DNA。以提取到的DNA為模板，用正向引物
16SF(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
和反向引物16SR(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)對菌株的16S rDNA基因進行PCR擴增。PCR 條件為:94°C 3min ；94°C 45s，54°C 30s, 72°C lmin，25 個循環(huán)；72°C終延伸 5min，4°C停止。PCR產(chǎn)物送由上海生工生物工程股份有限公司測序，長度為1468bp。測序結(jié)果在GenBank中與cerews相似性為97%。因此,綜合菌落形態(tài)、生理生化及分子鑒定，將這一菌株記為臘樣芽抱桿菌cereus 1205)。通過對抑菌試驗來說明本發(fā)明的臘樣芽孢桿菌(ifeci77i/5.cereus 1205)的抑制煙草疫霉的用途:
(I)發(fā)酵液的制備:
將活化蠟樣芽孢桿菌(Mcillus cereus 1205 )菌株挑一環(huán)接入NYBD培養(yǎng)液(牛肉膏8g，酵母膏 5g，葡萄糖 10g, 7jC lL，pH7.2，121°C，滅菌 45min)中，160rpm 28°C培養(yǎng) 12h，作為種子液。按3%接種量將1205種子液接入裝有50ml NYBD發(fā)酵培養(yǎng)液的250ml培養(yǎng)瓶中，280C，160rpm,搖瓶培養(yǎng)48h，得拮抗菌發(fā)酵液。(2)用無菌的圓濾紙片(直徑5_)，吸取發(fā)酵液在酒精燈前略微干燥，輕輕放在接種煙草疫霉的燕麥平板(燕麥片30g，加入IL蒸餾水，100°C水浴約lh，8層紗布過濾去渣，再加蒸餾水補足1L，瓊脂18g，pH自然，121 °C，滅菌30min)上，倒置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，1205對煙草疫霉的抑菌圈直徑達到20.5 mm。
權(quán)利要求
1.一種臘樣芽孢桿菌1205 {Bacillus cereus 1205),其特征在于所述菌種的保藏號為 CCTCC NO: M2012382。
2.按權(quán)利要求1所述的蠟 樣芽孢桿菌1205在抑制煙草疫霉方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蠟樣芽孢桿菌菌株(Bacilluscereus1205)及其用途，其形態(tài)特征1205菌株在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)36h，菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm，邊緣不整齊呈擴展?fàn)?，表面粗糙顆粒狀似毛玻璃狀或蠟狀，不分泌色素；為革蘭氏陽性細菌，桿狀，1.0～1.3×3.0～5.0μm，成鏈，運動性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯；能耐受7%NaCl的培養(yǎng)。本發(fā)明具有抗逆性強、營養(yǎng)要求簡單、較穩(wěn)定、易于定殖，對光和紫外穩(wěn)定，易產(chǎn)業(yè)化、成本較低、儲存期長、易于施用等特點，且對煙草有一定的促生長作用。
文檔編號C12N1/20GK103087944SQ201210521818
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者張傳萍, 李祝, 葛永怡, 黃化剛, 申燕, 胡瑋, 高冬冬, 張龍林 申請人:貴州省煙草公司畢節(jié)市公司, 貴州大學(xué)