本發(fā)明涉及生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,尤其涉及的是一種蠟芽孢桿菌與抗生素復(fù)配制備生物農(nóng)藥的工藝。
背景技術(shù):
近兩百年來,工業(yè)技術(shù)革命引發(fā)了農(nóng)業(yè)科技革命,化肥、農(nóng)藥、機(jī)械和電力進(jìn)入原有的以可再生的生物質(zhì)物質(zhì)能量循環(huán)為基礎(chǔ)的閉合式體系,產(chǎn)生了工業(yè)化的農(nóng)業(yè)——“近代農(nóng)業(yè)”。近代農(nóng)業(yè)的發(fā)展極大促進(jìn)了農(nóng)村及社會(huì)經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步。然而,一系列不可修復(fù)的問題隨之涌現(xiàn):農(nóng)村及城鎮(zhèn)生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重破壞,植物病蟲害抗藥性增強(qiáng),部分生物種群瀕臨滅絕,食品內(nèi)化肥農(nóng)藥殘留使人類攝入過量引發(fā)疾病??萍寂c生產(chǎn)、人類與自然的關(guān)系極不和諧,資源、環(huán)境和生態(tài)問題已成為中國這樣一個(gè)農(nóng)業(yè)大國可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸,也是世界各國面臨的一個(gè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。當(dāng)以生物技術(shù)和信息技術(shù)為主導(dǎo)的新農(nóng)業(yè)革命成為新的科技驅(qū)動(dòng)時(shí),農(nóng)業(yè)科技不再只是化肥農(nóng)藥的事了。傳統(tǒng)的“天、地、人合一”的農(nóng)業(yè)理念重被拾起,生物防治作為減少化學(xué)藥劑的一種有效方式,從“被遺忘的角落”重返“歷史的舞臺(tái)”?,F(xiàn)代生物技術(shù)手段正成為人類改變非良性農(nóng)業(yè)循環(huán)模式的一把利刃,極大緩解了科技與生產(chǎn)、人類與自然的突出矛盾。生物防治作為減少化學(xué)農(nóng)藥的一種有效方式越來越受到重視,開發(fā)低毒、高效、無殘留的生物農(nóng)藥已經(jīng)是一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。
蠟樣芽孢桿菌能促進(jìn)植物生長且對(duì)多種植物病害有明顯的抑制作用,能在植物活體內(nèi)定植,對(duì)寄主植物不產(chǎn)生任何危害并與其建立和諧關(guān)系,促進(jìn)植物生長,減少病害蟲害,提高植物抵御不良環(huán)境的能力并減少化肥使用量。
蠟樣芽孢桿菌在菌劑加工過程中存在著菌體死亡率高的問題,加工的粉劑和液體制劑在儲(chǔ)存中存在芽孢存活率低、抑菌率低、貨架期短的問題,而且單個(gè)蠟樣芽孢桿菌制劑抑菌效率低。在發(fā)酵工業(yè)中,為了延長菌體的壽命,增加生物農(nóng)藥制劑抑菌效率,對(duì)菌體采用干燥和抗菌素復(fù)配措施。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是為了改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種蠟芽孢桿菌與抗生素復(fù)配制備生物農(nóng)藥的工藝。
本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種蠟芽孢桿菌與抗生素復(fù)配制備生物農(nóng)藥的工藝,其具體步驟為:(1)活化培養(yǎng):將蠟樣芽孢桿菌bacilluscereuscmcc63305的1~2個(gè)菌落接入活化培養(yǎng)基中,控制培養(yǎng)液體積裝液量為10~20%,活化培養(yǎng)溫度為30~40℃,ph為6.5~8.5,轉(zhuǎn)速為160~200r/min,活化培養(yǎng)10~20h得活化液;(2)發(fā)酵培養(yǎng):將活化液等體積接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,控制發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30~40℃,ph為6.5~8.5,轉(zhuǎn)速為160~200r/min,通氣速率0.5~2.0vvm,發(fā)酵培養(yǎng)8~11h添加糖和無機(jī)鹽,發(fā)酵培養(yǎng)20~25h添加多元醇、氨基酸和抗菌素溶液,攪拌均勻后進(jìn)行噴霧干燥。
優(yōu)選步驟(1)中所述的活化培養(yǎng)基成分為:葡萄糖5.0~20.0g/l、蛋白胨5.0~10.0g/l、酵母膏3.0~8.0g/l和nacl3.0~8.0g/l。
優(yōu)選步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖5.0~20.0g/l、蛋白胨5.0~15.0g/l、酵母膏3.0~8.0g/l、nacl3.0~8.0g/l、mgso4·7h2o0.1~1.5g/l和kh2po41.0~5.0g/l。
優(yōu)選步驟(2)中添加的糖為葡萄糖、蔗糖或乳糖的一種或多種;糖的添加量與發(fā)酵液的體積比為2.5~6.5g/l。
優(yōu)選步驟(2)中添加的無機(jī)鹽為氯化鈉、磷酸二氫鉀或氯化鈣的一種或多種;無機(jī)鹽的添加量與發(fā)酵液的體積比為0.01~0.03g/l。
優(yōu)選步驟(2)中添加的多元醇為聚乙二醇1000、山梨醇或甘油的一種或多種;多元醇的添加量與發(fā)酵液的體積比為4.5~7.5g/l。
優(yōu)選步驟(2)中添加的氨基酸為精氨酸或賴氨酸的一種或兩種;氨基酸的添加量與發(fā)酵液的體積比為2.5~5.5g/l。
優(yōu)選步驟(2)中添加的抗菌素溶液為多抗菌素溶液、安來霉素溶液或井岡霉素溶液的一種或多種;抗菌素溶液濃度為1500~1800mg/l;抗菌素溶液的添加量與發(fā)酵液的體積比為6.5~10.5g/l。
優(yōu)選步驟(2)中噴霧干燥采用壓力式噴嘴霧化,參數(shù)為:進(jìn)風(fēng)口溫度為100~150℃,噴口壓力為10~20mpa,容積干燥強(qiáng)度為3~6kg/(m3·h),出風(fēng)口溫度為50~60℃,流化層高度為200~300mm,運(yùn)行時(shí)間2~3min。
本發(fā)明所述的蠟樣芽孢桿菌,其分類命名為蠟樣芽孢桿菌,菌種的拉丁學(xué)名是bacilluscereus,參據(jù)的微生物:njyh63305,保藏日期是2010年11月15日,保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)是cgmccno.4348.
蠟樣芽孢桿菌具有下述性質(zhì):
(1)形態(tài)與培養(yǎng)特征:
在固體平板上37℃培養(yǎng),15~30h形成脫落的芽孢,到30~40h芽孢大部分脫落。菌體呈鏈狀桿菌,菌體大小1.0um×3.0um,橢圓形芽孢,芽孢位于桿菌中心或稍微偏向一端,大小1.0um×1.8um。在肉湯培養(yǎng)基上生長渾濁并產(chǎn)生菌膜;在營養(yǎng)瓊脂上37℃培養(yǎng)24h,形成圓形凸起菌落,菌落邊緣整齊,呈乳白色、不透明,菌落表面呈毛玻璃狀,迎光呈白蠟樣。
(2)生理生化特性:
主要生理生化特征見表1:
表1菌株的生理生化特征
注:+:陽性或生長;-:陰性或不生長
有益效果:
本發(fā)明得到蠟樣芽孢桿菌活菌-抗生素復(fù)配制劑,顯著提高菌體存活率和對(duì)農(nóng)作物的抑菌效率。本方法工藝簡單,生產(chǎn)周期短,操作簡便,解決了常規(guī)方法生產(chǎn)的蠟樣芽孢桿菌生物農(nóng)藥制劑活力低的問題,更加適用于工業(yè)化生產(chǎn)的需求。
保藏信息
上述的蠟樣芽孢桿菌,其分類命名為蠟樣芽孢桿菌,菌種的拉丁學(xué)名是bacilluscereus,參據(jù)的微生物:njyh63305,該菌株是由本實(shí)驗(yàn)室選育并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào),中國科學(xué)院微生物所),其簡稱為cgmcc,保藏日期是2010年11月15日,保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)是cgmccno.4348。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明,但實(shí)施案例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
實(shí)施例1:
(1)活化培養(yǎng):將蠟樣芽孢桿菌bacilluscereuscmcc63305的1個(gè)菌落接入活化培養(yǎng)基中,控制培養(yǎng)液體積裝液量為10%,活化培養(yǎng)溫度為30℃,ph為6.5,轉(zhuǎn)速為160r/min,活化培養(yǎng)10h?;罨囵B(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖5.0、蛋白胨5.0、酵母膏3.0、nacl3.0。
(2)發(fā)酵培養(yǎng):將活化液等體積接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,改變發(fā)酵條件,使得發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30℃,ph為6.5,轉(zhuǎn)速為160r/min,通氣速率0.5vvm,發(fā)酵培養(yǎng)8h添加糖和無機(jī)鹽,發(fā)酵培養(yǎng)20h添加多元醇、氨基酸、抗菌素溶液,攪拌均勻后進(jìn)行噴霧干燥。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖5.0、蛋白胨5.0、酵母膏3.0、nacl3.0、mgso4·7h2o0.1、kh2po41.0。糖為葡萄糖,添加量與發(fā)酵液的體積比為2.5g/l。無機(jī)鹽為氯化鈉和磷酸二氫鉀,體積比為1:1,總添加量與發(fā)酵液的體積比為0.01g/l。多元醇為聚乙二醇1000和山梨醇,體積比為1:1,總添加量與發(fā)酵液的體積比為4.5g/l。氨基酸為精氨酸,添加量與發(fā)酵液的體積比為2.5g/l;抗菌素溶液為多抗菌素溶液,濃度為1500mg/l,添加量與發(fā)酵液的體積比為6.5g/l;噴霧干燥的參數(shù)為:進(jìn)風(fēng)口溫度為100℃,噴口壓力為10mpa,容積干燥強(qiáng)度為3kg/(m3·h),出風(fēng)口溫度為50℃,流化層高度約200mm,運(yùn)行時(shí)間2min。
(3)結(jié)果:所得制劑經(jīng)稀釋平板計(jì)數(shù)后計(jì)算,菌體存活率達(dá)65%,與蠟樣芽孢桿菌經(jīng)常規(guī)液體發(fā)酵后直接進(jìn)行噴霧干燥相比,存活率提高15%。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,以200g/(hm2)的劑量進(jìn)行葉面噴霧,對(duì)農(nóng)作物的抑菌作用達(dá)65%,與單純使用蠟樣芽孢桿菌制劑抑菌效率提高15%。
實(shí)施例2:
(1)活化培養(yǎng):將蠟樣芽孢桿菌bacilluscereuscmcc63305的2個(gè)菌落接入活化培養(yǎng)基中,控制培養(yǎng)液體積裝液量為15%,活化培養(yǎng)溫度為35℃,ph為7.0,轉(zhuǎn)速為180r/min,活化培養(yǎng)15h?;罨囵B(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖10.0、蛋白胨6.0、酵母膏5.0、nacl5.0。
(2)發(fā)酵培養(yǎng):將活化液等體積接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,改變發(fā)酵條件,使得發(fā)酵培養(yǎng)溫度為35℃,ph為7.0,轉(zhuǎn)速為180r/min,通氣速率1.5vvm,發(fā)酵培養(yǎng)9h添加糖和無機(jī)鹽,發(fā)酵培養(yǎng)22h添加多元醇、氨基酸、抗菌素溶液,攪拌均勻后進(jìn)行噴霧干燥。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖15.0、蛋白胨10.0、酵母膏5.0、nacl5.0、mgso4·7h2o0.8、kh2po42.5;糖為蔗糖和乳糖,體積比為1:1,總添加量與發(fā)酵液的體積比為4.5g/l。無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀和氯化鈣,體積比為1:1,總添加量與發(fā)酵液的體積比為0.02g/l。多元醇為聚乙二醇1000和甘油,體積比為1:1,總添加量與發(fā)酵液的體積比為6.0g/l。氨基酸為賴氨酸,添加量與發(fā)酵液的體積比為4.5g/l??咕厝芤簽榈葷舛鹊亩嗫咕睾途畬顾鼗旌先芤?,體積比為1:1,總濃度為1650mg/l,混合溶液添加量與發(fā)酵液的體積比為8.5g/l。噴霧干燥的參數(shù)為:進(jìn)風(fēng)口溫度為130℃,噴口壓力為15mpa,容積干燥強(qiáng)度為4.5kg/(m3·h),出風(fēng)口溫度為55℃,流化層高度約250mm,運(yùn)行時(shí)間2.5min。
(3)結(jié)果:所得制劑經(jīng)稀釋平板計(jì)數(shù)后計(jì)算,菌體存活率達(dá)85%,與蠟樣芽孢桿菌經(jīng)常規(guī)液體發(fā)酵后直接進(jìn)行噴霧干燥相比,存活率提高35%。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,以200g/(hm2)的劑量進(jìn)行葉面噴霧,對(duì)農(nóng)作物的抑菌作用達(dá)80%,與單純使用蠟樣芽孢桿菌制劑抑菌效率提高30%。
實(shí)施例3:
(1)活化培養(yǎng):將蠟樣芽孢桿菌bacilluscereuscmcc63305的2個(gè)菌落接入活化培養(yǎng)基中,控制培養(yǎng)液體積裝液量為20%,活化培養(yǎng)溫度為40℃,ph為8.5,轉(zhuǎn)速為200r/min,活化培養(yǎng)20h。活化培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖20.0、蛋白胨10.0、酵母膏8.0、nacl8.0。
(2)發(fā)酵培養(yǎng):將活化液等體積接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,改變發(fā)酵條件,使得發(fā)酵培養(yǎng)溫度為40℃,ph為8.5,轉(zhuǎn)速為200r/min,通氣速率2.0vvm,發(fā)酵培養(yǎng)11h添加糖和無機(jī)鹽,發(fā)酵培養(yǎng)25h添加多元醇、氨基酸、抗菌素溶液,攪拌均勻后進(jìn)行噴霧干燥。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖20.0、蛋白胨15.0、酵母膏8.0、nacl8.0、mgso4·7h2o1.5、kh2po45.0;糖為乳糖,添加量與發(fā)酵液的體積比為6.5g/l。無機(jī)鹽為氯化鈉和氯化鈣,體積比為1:1,總添加量與發(fā)酵液的體積比為0.03g/l。多元醇為山梨醇和甘油,體積比為1:1,總添加量與發(fā)酵液的體積比為7.5g/l;氨基酸為賴氨酸,添加量與發(fā)酵液的體積比為5.5g/l;抗菌素溶液為等濃度的多抗菌素溶液和安來霉素溶液的混合溶液,體積比為1:1,混合溶液濃度為1800mg/l,混合溶液的添加量與發(fā)酵液的體積比為10.5g/l;噴霧干燥的參數(shù)為:進(jìn)風(fēng)口溫度為150℃,噴口壓力為20mpa,容積干燥強(qiáng)度為6kg/(m3·h),出風(fēng)口溫度為60℃,流化層高度約300mm,運(yùn)行時(shí)間3min。
(3)結(jié)果:所得制劑經(jīng)稀釋平板計(jì)數(shù)后計(jì)算,菌體存活率達(dá)70%,與蠟樣芽孢桿菌經(jīng)常規(guī)液體發(fā)酵后直接進(jìn)行噴霧干燥相比,存活率提高20%。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,以200g/(hm2)的劑量進(jìn)行葉面噴霧,對(duì)農(nóng)作物的抑菌作用達(dá)70%,與單純使用蠟樣芽孢桿菌制劑抑菌效率提高20%。