本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地，本發(fā)明特別涉及一種環(huán)烴基取代的甲磺?；郊柞０费苌锛捌渲苽浞椒ê妥鳛殁c離子通道(特別是Nav1.7)抑制劑的應(yīng)用，以及由其制備的藥物組合物和藥用組合物。
背景技術(shù)：
：最近，英國的Cox等在Nature上首次報道了編碼電壓門控Nav1.7通道的SCN9A基因突變導(dǎo)致遺傳個體無痛癥的出人意料研究結(jié)果。該遺傳突變的個體先天失去痛覺，但機體的其它功能完全正常，此外最近的研究表明，表達在DRG神經(jīng)元的電壓門控Nav1.7通道參與痛信號的產(chǎn)生并發(fā)揮控制痛覺信號傳入的閘門功能。該研究提示Nav1.7通道可能會成為選擇性治療疼痛并無副作用的藥物靶點。Nav1.7(PN1，SCN9A)VGSC對河豚毒素的阻斷敏感，其主要表達于末梢交感神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元。SCN9A基因已由多種物種(包括人類、大鼠及兔)復(fù)制，并且顯示人與大鼠基因之間的氨基酸有約90％的一致性。越來越多的身體證據(jù)表明Nav1.7在多種疼痛狀態(tài)(包括急性、慢性、炎性和/或神經(jīng)性疼痛)中扮演重要的角色，在人類中，Nav1.7蛋白質(zhì)積累于神經(jīng)瘤，特別是引起疼痛的神經(jīng)瘤。Nav1.7功能增加的突變(不論是遺傳性或偶發(fā)性)已被認為涉及原發(fā)性紅斑性肢痛(一種特征為四肢的灼痛和發(fā)炎的疾病)，和突發(fā)性極度疼痛癥。有關(guān)非選擇性鈉通道阻斷劑利多卡因和美西律可緩和遺傳性紅斑性肢痛的癥狀，以及卡馬西平可有效地減低PEPD的侵襲的次數(shù)和嚴重度的報道結(jié)果與上述觀察相一致。Nav1.7在疼痛中扮演的角色的其他證據(jù)可見于SCN9A基因的功能喪失的突變的顯型。后續(xù)的研究已顯示會導(dǎo)致SCN9A基因的功能喪失與CIP顯型的許多不同的突變。由于Nav1.7特異地在DRG感覺神經(jīng)元表達而不在心肌細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等其它組織表達，因此研發(fā)其特異阻斷劑用于治療慢性痛，不僅可能提高療效，且副作用也會大大減少，并且Nav1.7離子通道的選擇性抑制劑幾乎可用于各種疼痛的治療。此外，該蛋白家族的成員之一的Nav1.5和Nav1.2也是重要的一類離子型通道，NaV1.5主要在心肌細胞中表達(Raymond,C.K.等,op.cit.)，包括心房、心室、竇房結(jié)、房室結(jié)和心臟浦肯野纖維。心臟動作電位的迅速升支和通過心臟組織的迅速脈沖傳導(dǎo)由于NaV1.5的開啟。NaV1.5功能的異常可導(dǎo)致多種心律失常的形成。人體NaV1.5的突變導(dǎo)致多種心律不齊綜合征，包括，例如，長QT3(LQT3)、Brugada綜合征(BS)、遺傳性心臟傳導(dǎo)缺陷、突發(fā)性猝死綜合征(SUNDS)和嬰兒猝死綜合征(SIDS)(Liu,H.等,Am.J.Pharmacogenomics(2003),3(3):173-9)。已經(jīng)將鈉通道阻斷劑治療廣泛用于治療心律失常。因此抑制Nav1.5通道會產(chǎn)生心臟毒性。此外NaV1.2在大腦中高度表達(Raymond,C.K.等,J.Biol.Chem.(2004),279(44):46234-41)并且對正常的大腦功能是重要的。因此抑制Nav1.2通道會對大腦產(chǎn)生抑制毒性。因此，鑒于目前可用藥劑有限的效力和不可接受的副作用，迫切需要開發(fā)更加安全有效的鎮(zhèn)痛藥，使其具有較高功效和較少副作用。而Nav1.7離子通道是開發(fā)無成癮性鎮(zhèn)痛藥物的重要靶標，開發(fā)具有Nav1.7離子通道高度選擇性且具有良好藥代動力學(xué)特征的抑制劑十分必要。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種Nav1.7離子通道選擇性抑制劑及其在醫(yī)藥上應(yīng)用。本發(fā)明第一方面，提供一種式(I)所示的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、立體異構(gòu)體或前藥：式中，R1為氟或氯；R2為環(huán)丙基或環(huán)己烯基；n為0或1；Z為N或CR7；R3、R4、R5、R6、R7各自獨立地為氫、鹵素、鹵代C1-20烷基、C1-20烷氧基、鹵代C1-20烷氧基。在另一優(yōu)選例中，R1為氟；R2為環(huán)丙基。在另一優(yōu)選例中，Z為CR7，R7的定義如前所述。在另一優(yōu)選例中，n為1。在另一優(yōu)選例中，R3、R4、R5、R6、R7各自獨立地為氫、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基。在另一優(yōu)選例中，R6為氫。在另一優(yōu)選例中，Z為CR7；R3、R4、R5、R6、R7各自獨立地為氫、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、三氟甲基；且R3、R4、R5、R6、R7中的三個為氫。在另一優(yōu)選例中，Z為CR7；R3、R4、R5、R7各自獨立地為氫、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、三氟甲基；R6為氫，且R3、R4、R5、R7中的兩個為氫。在另一優(yōu)選例中，Z為CR7；R3、R5和R6為氫；且R4和R7各自獨立地為氟、氯、三氟甲基、或三氟甲氧基。在另一優(yōu)選例中，Z為CR7；R3、R5和R6為氫；且R4為各自獨立地為氟、氯、三氟甲基、或三氟甲氧基，且R7為氯。在另一優(yōu)選例中，Z為N。在另一優(yōu)選例中，Z為N；R3、R4、R5、R6各自獨立地為氫、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、三氟甲基；且R3、R4、R5、R6中的兩個為氫。在另一優(yōu)選例中，Z為N；R3、R6為氫；R4、R5各自獨立地為氫、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、三氟甲基。在另一優(yōu)選例中，所述化合物為本申請實施例所制備的化合物：本發(fā)明第二方面提供了一種藥物組合物，所述組合物包括本發(fā)明第一方面所述的化合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、立體異構(gòu)體或前藥；以及藥學(xué)可接受的載體。本發(fā)明第三方面提供了如本發(fā)明第一方面所述的化合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、立體異構(gòu)體或前藥，或本發(fā)明第二方面所述藥物組合物在制備治療疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用。在另一優(yōu)選例中，所述疾病或病癥選自疼痛、抑郁癥、心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、精神疾病或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述疾病或病癥選自與HIV相關(guān)的疼痛、HIV治療誘導(dǎo)的神經(jīng)病變、三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、急性疼痛、熱敏感、結(jié)節(jié)病、腸易激綜合征、g羅恩病、與多發(fā)性硬化(MS)有關(guān)的疼痛、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、糖尿病性神經(jīng)病變、周圍神經(jīng)病變、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、突發(fā)性張力障礙、肌無力綜合征、肌強直、惡性高熱、囊性纖維化、假性醛固酮增多癥、橫紋肌溶解癥、甲狀腺功能減退、雙相抑郁癥、焦慮癥、精神分裂癥、鈉通道毒素相關(guān)病癥、家族性紅斑性肢痛癥、原發(fā)性紅斑性肢痛癥，家族性直腸疼痛、癌癥、癲癇、局部和全身強直性發(fā)作、不寧腿綜合征、心律失常、纖維肌痛、在由中風(fēng)或神經(jīng)損傷導(dǎo)致的缺血性疾病狀態(tài)下的神經(jīng)保護、快速性心律失常、心房顫動和心室顫動。在另一優(yōu)選例中，所述疼痛選自神經(jīng)性疼痛、炎性疼痛、內(nèi)臟疼痛、癌癥疼痛、化療疼痛、創(chuàng)傷疼痛、手術(shù)疼痛、手術(shù)后疼痛、生產(chǎn)疼痛、分娩疼痛、牙痛、慢性疼痛、持續(xù)性疼痛、外周介導(dǎo)的疼痛、中樞介導(dǎo)的疼痛、慢性頭痛、偏頭痛、竇性頭痛、緊張性頭痛、幻肢痛、周圍神經(jīng)損傷、三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、急性疼痛、家族性紅斑性肢痛癥、原發(fā)性紅斑性肢痛癥、家族性直腸疼痛或纖維肌痛或其組合。本發(fā)明第四方面提供了一種治療哺乳動物疾病或病癥的方法，所述方法包括給需要的對象(如哺乳動物)施用治療有效量的本發(fā)明第一方面所述的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、立體異構(gòu)體或前藥，或本發(fā)明第二方面所述的藥物組合物。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1為大鼠冷痛覺測試基線圖。圖2為化合物Z-2的使用單因素方差分析附加Dunnett多重比較檢驗結(jié)果圖。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的環(huán)烴基取代(特別是環(huán)丙基取代)的甲磺?；郊柞０费苌锊粌H對Nav1.7具有較高的抑制活性，同時對Nav1.5和Nav1.2的抑制活性明顯較弱，具有明顯的選擇抑制活性。同時在疼痛模型測試中還顯示出明顯的鎮(zhèn)痛效果，在藥代動力學(xué)研究中具有明顯的藥代吸收效果和良好的生物利用度，并且具有明顯的代謝穩(wěn)定性。因此本發(fā)明的系列化合物可開發(fā)成用于廣泛疼痛的治療的藥物。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。術(shù)語定義如本文所用，“C1-20烷基”指包含1至20個碳原子的直鏈和支鏈的飽和的脂族烴基，如下定義類似；更優(yōu)選為C1-10烷基，非限制性的例子包括：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構(gòu)體等；更優(yōu)選為C1-6烷基，最優(yōu)選為C1-3烷基。如本文所用，“部分不飽和”是指含有一個或多個不飽和鍵但不具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。如本文所用，“C1-20烷氧基”指-O-(C1-20烷基)，其中烷基的定義如上所述。優(yōu)選C1-10烷氧基，更優(yōu)選C1-6烷氧基，最優(yōu)選C1-3烷氧基。非限制性實施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、異丁氧基、戊氧基等。如本文所用，“鹵素”指氟、氯、溴或碘。如本文所用，“鹵代”指基團中一個或多個(如1、2、3、4或5個)氫被鹵素所取代。例如，“鹵代C1-20烷基”指烷基被一個或多個(如1、2、3、4或5個)鹵素取代，其中烷基的定義如上所述。優(yōu)選為鹵代C1-10烷基，更優(yōu)選為鹵代C1-6烷基，最優(yōu)選為鹵代C1-3烷基。鹵代C1-20烷基的例子包括(但不限于)一氯乙基、二氯甲基、1,2－二氯乙基、一溴乙基、一氟乙基、一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基等。又例如，“鹵代C1-20烷氧基”指烷氧基被一個或多個(如1、2、3、4或5個)鹵素取代，其中烷氧基的定義如上所述。優(yōu)選為鹵代C1-10烷氧基，更優(yōu)選為鹵代C1-6烷氧基，最優(yōu)選為鹵代C1-3烷氧基。包括(但不限于)三氟甲氧基、三氟乙氧基、一氟甲氧基、一氟乙氧基、二氟甲氧基、二氟乙氧基等。如本文所用，“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，優(yōu)選為1～5個氫原子彼此獨立地被相應(yīng)數(shù)目的取代基取代，更優(yōu)選為1～3個氫原子彼此獨立地被相應(yīng)數(shù)目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學(xué)位置，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(通過實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的氨基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結(jié)合時可能是不穩(wěn)定的。制備方法本發(fā)明提供了式(I)化合物的制備方法，本發(fā)明中的化合物可以通過多種合成操作容易地制備，這些操作是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟練掌握的。這些化合物的示例性制備方法可以包括(但不限于)下文所述的流程。本發(fā)明式(I)化合物可以參照下述合成路線進行制備，在具體操作過程中，可以根據(jù)需要對方法中的步驟進行擴展或合并。路線1步驟1：在堿體系的存在下，通過式(I-b)化合物中所具有的親核性質(zhì)的反應(yīng)基團(如OH等)與式(I-a)化合物發(fā)生取代反應(yīng)(例如親和取代反應(yīng)等)生成式(I-c)化合物，合適的堿體系包括存在于DMSO的叔丁醇鉀、存在于DMF中的氫化鈉、存在于DMF的碳酸鉀等，式(I-a)中的Lev為離去基團，包括(但不限于)三氟甲磺酸酯；氯、溴、碘；磺酸酯基，如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、對溴苯磺酸酯、對甲苯磺酸酯等；酰氧基，如乙酰氧基、三氟乙酰氧基等。X為氯、溴或碘。步驟2：式(I-c)化合物通過基團X與環(huán)烴基硼酸酯或者硼酸在一定溫度下，使用合適的催化劑及適當?shù)娜軇┻M行反應(yīng)，生成化合物I。使用Suzuki方法，所用的鈀催化劑可以是但不限于PdCl2(dppf)、醋酸鈀，所用的堿可以是但不限于碳酸鉀或碳酸銫。所用的配體可以是但不限于三環(huán)己基膦。路線2式(I-a)化合物可通過Suzuki反應(yīng)得到式(I-d)化合物，隨后與式(I-b)化合物發(fā)生取代反應(yīng)生成式I化合物，各步驟的反應(yīng)條件及基團定義同路線1。上述制備方法中，式(I-b)化合物可市購或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。式(I-a)化合物可通過以下兩種示例方法合成，方法1以式(I-a-1-1)化合物為起始原料，依次通過取代、縮合、溴代、取代、水解和?；磻?yīng)得到式(I-a-1)化合物，其中各步驟均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)反應(yīng)。方法2以式(I-a-2-1)化合物為起始原料，依次通過取代、縮合反應(yīng)得到式(I-a-2)化合物，其中各步驟均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)反應(yīng)。以上各步驟中的反應(yīng)均是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)反應(yīng)。如無特殊說明，合成路線中所使用的試劑和原料化合物均可市購得到，或本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所設(shè)計的不同化合物結(jié)構(gòu)參考已知方法制備得到。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：本發(fā)明系列化合物對Nav1.7的抑制活性高，同時對Nav1.5和Nav1.2的抑制活性較弱，對Nav1.5和Nav1.2均具有選擇抑制活性。本發(fā)明系列化合物是具有統(tǒng)計學(xué)意義的抑制冷刺激痛覺超敏的效果。本發(fā)明系列化合物不僅具有明顯的藥代吸收效果和良好的生物利用度，并且具有明顯的代謝穩(wěn)定性。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，本文所用的術(shù)語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或同等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。如本文所用，DMB為2,4-二甲氧基芐基，THF為四氫呋喃，EA為乙酸乙酯，PE為石油醚，Ac2O為乙酸酐，NBS為N-溴代琥珀酰亞胺，DCM為二氯甲烷，AIBN為偶氮二異丁腈，Pd(dppf)Cl2為1,1'-雙(二苯基磷)二茂鐵]二氯化鈀，TFA為三氟乙酸，TBSCl為叔丁基二甲基氯硅烷，NCS為N-氯代丁二酰亞胺，DHP為二氫吡喃，LiAlH4為氫化鋁鋰，PMB為對甲氧基芐基，LiHMDS為二(三甲基硅基)氨基鋰，Pd2(dba)3為三(二亞芐基丙酮)二鈀，RuPhos為2-二環(huán)己基磷-2',6'-二異丙氧基-1,1'-聯(lián)苯,DMAP為4-二甲氨基吡啶，THP為四氫吡喃，n-BuLi為正丁基鋰，TMsOTf為三氟甲磺酸三甲基硅酯，TEBAC為三乙基芐基氯化銨，HATU為2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，DMF為二甲基甲酰胺，DMSO為二甲基亞砜，DIEA為N,N-二異丙基乙胺，BINAP為(2R,3S)-2,2'-雙二苯膦基-1,1'-聯(lián)萘。如本文所用，室溫是指約為20-25℃?；衔?-a的制備方法：步驟a:向化合物1-a-1(41.7g,0.271mol)部分溶解在二氯甲烷(500ml)的溶液中加入液溴(103.8g,0.65mol)，處于氮氣保護狀態(tài)下分批次加入鐵粉(46.2g,0.82mol)，加熱到40℃，攪拌24小時，冷卻至室溫，10％的保險粉水溶液(200ml*3)洗滌，分液，水相用EA(100ml*3)萃取，飽和食鹽水(50ml)洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，濾液旋干得到一黑色固體(45g)，加入乙酸乙酯打漿得到化合物1-a-2(45g,產(chǎn)率：71％)呈白色固體；ESI-MS:233.0(M+H)+。步驟b:向裝有化合物1-a-2(26g,0.112mmol)，甲磺酰胺(16.34g,0.172mol),EDCI(32.93g,0.172mol)，DMAP(21g,0.172mol)的反應(yīng)瓶中加入二氯甲烷(270ml)，N2保護，室溫過夜，水(100ml)淬滅，HCl(1M)調(diào)pH＝1～2，DCM(3*150ml)，飽和食鹽水(100ml)洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，濾液旋干得到白色固體化合物1-a-3(22.5g,產(chǎn)率65％)。ESI-MS:310.7(M+H)+。步驟c:在氮氣保護下，向化合物1-a-3(22.5g,0.073mol)，NBS(16.8g,0.094mol)的混合物中加入二氯乙烷(250ml)，升溫至80℃，反應(yīng)液逐漸澄清，將溶解AIBN(238mg,1.45*10-3mmol)的二氯乙烷溶液滴加到上述反應(yīng)液中，過夜反應(yīng)。冷卻至室溫，保險粉水溶液(10％，100ml)淬滅，分液，水相乙酸乙酯(3*150ml)萃取，中氨水(150ml)和甲醇(100ml)的混合溶液中加入上述反應(yīng)液，允許反應(yīng)液升至室溫，攪拌10分鐘，乙酸乙酯(100ml*3)萃取，合并有機相，飽和食鹽水(50ml)洗滌，硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到27g粗品，乙酸乙酯打漿得到化合物1-a-4(5.2g，收率：18％)。ESI-MS：389.9(M+H)+。步驟d:在N2保護，向化合物1-a-4(5.2g，1.34*10-2mol)醋酸鉀(2.62g，2.68*10-2mol)的混合物中加入DMF(25ml)，加熱到80℃，攪拌過夜。冷卻至室溫，乙酸乙酯(200ml)稀釋，水(10ml*7)洗滌，飽和食鹽水(10ml)洗滌，硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到化合物1-a-5(3.0g，收率：61％)，為一白色固體。ESI-MS：363.0(M+Na)+。步驟e:在N2保護下，向化合物1-a-5(3.68g,10mmol)和環(huán)丙基硼酸(1.28g，15mmol)的甲苯(40ml)懸濁液加入磷酸鉀(9.5g，45mmol)的水(10ml)懸濁液，攪拌約3～4分鐘，然后三環(huán)己基膦氟硼酸鹽(3.68g，10mmol)和醋酸鈀(225mg，1mmol)依次加入上述反應(yīng)液中，加熱至110℃，攪拌過夜，降至室溫，水(50ml)淬滅反應(yīng)液，乙酸乙酯(100ml)稀釋，硅藻土過濾，分液，鹽酸(1mol/L)酸化至pH＝2，乙酸乙酯(4*50ml)萃取，飽和食鹽水(20ml)洗滌，硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到油狀物，制備HPLC純化得到化合物1-a(430mg，收率14％)。ESI-MS：288.1(M+Na)+，1HNMR(400MHz,DMSO)δ:12.15(s,1H),7.28(d,J＝11.6Hz,1H)，7.22(d,J＝6.8Hz,1H)，5.5(s,1H)，4.27(s,2H)，3.36(s,3H)，1.84(m,1H),0.9(m,2H),0.67(m,2H)?；衔?-a的制備方法：步驟a:在氮氣保護下，0～5℃，向裝有NaH(6.4g,0.167mol)的反應(yīng)瓶中加入四氫呋喃(165ml)溶液；在0～5℃，向上述渾濁液中滴加異丙醇(12.8ml，0.167mol)，滴加時間約1小時，加畢后，反應(yīng)液允許升溫至室溫，攪拌1小時?；衔?-a-1(15.57g,0.105mol)的四氫呋喃(50ml)溶液加入上述渾濁液中，加熱至60℃，攪拌過夜，在30℃，飽和氯化銨(50ml)和水(60ml)淬滅，分液，乙酸乙酯(3x50ml)萃取，飽和食鹽水(20ml)洗滌，硫酸鈉干燥，濃縮得到黑色液體化合物2-a-2(20.0g，收率71％)；ESI-MS:172.0(M+H)+。步驟b:向化合物2-a-2(6g，0.035mol)的乙酸乙酯(30ml)溶液中加入醋酸鈉(3.2g，0.039mol)，在攪拌狀態(tài)下，7℃以下，向上述渾濁液中滴加液溴(10.6g，0.042mol)，允許升室溫，攪拌過夜。在5℃以下，將氫氧化鈉(4.6g)和硫代硫酸鈉(2g)的水溶液(20ml)滴加至反應(yīng)液中(滴加時pH小于8)，分液，水相用乙酸乙酯(2x40ml)萃取，合并有機相，飽和食鹽水(30ml)洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得油狀物，柱層析(硅膠：300-400目，洗脫劑：石油醚)純化得到化合物2-a-3(5.1g，收率：58％)，為液體。ESI-MS:249.8(M+H)+。步驟c:向聯(lián)硼酸頻那醇酯(6.7g，2.65x10-3mol)，醋酸鉀(7g，7.13x10-2mol)和PdCl2(dppf).DCM(831mg，1.02x10-3mol)的混合物加入化合物2-a-3(5.1g，2.04x10-3mol)的DMF(60ml)溶液，反應(yīng)液氮氣置換3次，加熱到65℃，攪拌過夜，乙酸乙酯稀釋(400ml)，水洗(6x30ml)，飽和食鹽水(50ml)洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得一化合物2-a-4(6.0g，粗品，收率：100％)，為一漿狀物。ESI-MS:298.0(M+H)+。步驟d:在15℃，向化合物2-a-4(6.0g，0.02mol)的反應(yīng)瓶中加入水(19ml)，醋酸(38ml)，過氧乙酸(1.8g，0.0236mol)，允許升至室溫，氮氣保護下攪拌過夜。將余下的醋酸用油泵旋掉，剩余物用乙酸乙酯(250ml)稀釋，水(2x30ml)洗，飽和食鹽水(20ml)洗滌，過濾，硫酸鈉干燥，濃縮得一黑色油狀物，柱層析(硅膠：200-300目；洗脫劑-石油醚：乙酸乙酯＝15：1)純化得到化合物2-a(5.1g，收率：58％)，為一液體。ESI-MS:188.0(M+H)+?；衔?-a的制備方法：化合物4-a的制備方法：步驟a:向冷的的濃硫酸(120ml)中加入化合物4-a-1(23.4g，0.148mol)，待底物溶解后，保持溫度在5℃以下，分批加入N-碘代丁二酰亞胺(33g，0.148mol)，加畢后維持該溫度，攪拌5小時。反應(yīng)液倒入劇烈攪拌的冰水(20ml)中，過濾，濾餅采用乙醇：水(1：1)打漿，過濾，得化合物4-a-2(8.0g，收率：20％)，為一粉色固體。ESI-MS:285.0(M+H)+。步驟b:二碳酸二叔丁酯(21g，0.0962mol)，4-二甲氨基吡啶(1g，8x10-3mol)依次加入得化合物4-a-2(7.2g，2.54x10-2mol)的叔丁醇(40ml)溶液中，氮氣保護下，加熱到60℃，攪拌過夜。乙酸乙酯稀釋(300ml)，稀鹽酸洗(1M，30ml)，飽和碳酸氫鈉水溶液(30ml)，飽和食鹽水(20ml)洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得得化合物4-a-3(8.0g，收率：93％)，為一棕色固體。ESI-MS:362.8(M+H)+。步驟c:向化合物2-a(3.4g，1.8x10-2mol)，化合物4-a-3(6.18g，1.82x10-2mol)，碳酸鉀(5.0g，3.64x10-2mol)中加入二甲亞砜(30ml)，氮氣保護下室溫攪拌過夜，乙酸乙酯稀釋(300ml)，水(3x30ml)洗滌，飽和食鹽水(20ml)洗滌，硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到化合物4-a-4(8.91g，收率：89.8％)，為一棕色固體。ESI-MS:508.0(M+H)+。步驟d:向化合物4-a-4(150mg，2.95x10-4mol)，環(huán)丙基硼酸(76mg，8.86x10-4mol)，磷酸鉀(250mg，1.18x10-3mol)，四三苯基膦鈀(30mg，2.95x10-5mol)中加入1,4-二氧六環(huán)(1.5ml)，氮氣置換三次，加熱到150℃，微波反應(yīng)45分鐘。LCMS顯示有部分副產(chǎn)物為產(chǎn)品中的氯也被環(huán)丙級取代。乙酸乙酯稀釋，硅藻土過濾，濃縮得1.7g黃色油狀物，Pre-HPLC純化，濃縮得到化合物4-a-5(0.06g，收率：50％)，為一白色漿狀物。ESI-MS:421.9(M+H)+。步驟e:在0℃，向化合物4-a-5(0.5g，1.85x10-3mol)的二氯甲烷(15ml)溶液中，加入三氟乙酸(0.5ml)，允許升至室溫，氮氣條件下攪拌24小時。濃縮反應(yīng)液得到白色固體，溶于乙酸乙酯，經(jīng)純化得到化合物4-a(0.32g，收率：73％)。ESI-MS:365.9(M+H)+，1HNMR(400MHz，DMSO)δ:13.12(s，1H),8.04(d,J＝2.4Hz，1H)，7.90(s，J＝2.8Hz，1H)，7.45(d,J＝8Hz，1H)，6.73(d,J＝11.6Hz，1H)，5.28(quint,J＝6Hz，1H)，2.10(m,1H),1.37(s,3H)，1.33(s,3H)，0.95(m,2H)，0.71(m,2H)?；衔?-a的制備方法：化合物5-a以化合物4-a-1為起始原料，參照化合物4-a的方法進行制備，不同的是將步驟c中化合物2-a換成化合物3-a。實施例14-((3-氯-4-(三氟甲基)苯氧基)甲基)-5-環(huán)丙基-2-氟-N-(甲基磺?；?苯甲酰胺(Z-1)的制備步驟1：向化合物1-a(150mg，0.522mmol)和三乙胺(106mg，1.044mmol)的5ml二氯甲烷溶液中在零攝氏度加入甲基磺酰氯(60mg，0.522mmol)，室溫攪拌2小時。反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液倒入冰水中，二氯甲烷萃取，有機相用飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮得淺黃色油狀粗品化合物1-b(147mg)。直接用于下一步反應(yīng)。步驟2：化合物1-b(117mg，0.32mmol)，3-氯-4-(三氟甲基)苯酚(68mg，0.32mmol)，碳酸鉀(89mg，0.64mmol)加入5ml乙腈溶液中，60攝氏度攪拌2小時。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，反應(yīng)液減壓濃縮，加入10ml水，調(diào)節(jié)pH為7，二氯甲烷萃取(2×10ml)，有機相用飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗品。經(jīng)制備液相分離純化后得白色固體化合物Z-1(60.3mg)，產(chǎn)率：39.2％，MSm/z(ESI):481.9[M+H]+。1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ12.23(br.s.,1H),7.54(dd,J＝9.2,1.2Hz,1H),7.49(d,J＝3.2Hz,1H),7.43(d,J＝10.8Hz,1H),7.29(d,J＝6.8Hz,1H),7.19(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),5.37(s,2H),3.37(s,3H),2.00-2.06(m,1H),0.92-1.00(m,2H),0.73-0.79(m,2H)。實施例2-3化合物Z-2和Z-3以化合物1-a為起始原料，參照實施例1的方法進行制備，不同的是將步驟2中的3-氯-4-(三氟甲基)苯酚分別換成3,4-二氯苯酚，3,5-二氯苯酚。實施例44-(5-氯-6-異丙基吡啶-3-基氧基)-5-環(huán)丙基-2-氟-N-(甲基磺?；?苯甲酰胺(Z-4)的制備化合物4-a(100mg，0.273mmol)，化合物6-a(52mg，0.546mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)(104mg，0.273mmol),DIPEA(N,N-二異丙基乙胺)(71mg，0.546mmol)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)(4mg，0.027mmol)加入5ml二氯甲烷溶液中，室溫攪拌3小時。反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液水洗，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗品。經(jīng)TLC純化后得黃色固體化合物Z-4(21mg)，MSm/z(ESI):443.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.09(s,1H),8.04(d,J＝2.8Hz,1H),7.87(d,J＝2.4Hz,1H),7.28(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(d,J＝11.6HZ,1H),5.31-5.25(m,1H),3.35(s,3H),2.15-2.10(m,1H),1.34(d,J＝6.4Hz,6H),0.98-0.93(m,2H),0.83-0.79(m,2H).實施例5化合物Z-5以化合物6-a為起始原料，參照實施例4的方法進行制備，不同的是將步驟中的化合物4-a換成化合物5-a。實施例65-環(huán)己烯基-4-((3,4-二氯苯氧基)乙基)-2-氟-N-(甲基磺?；?苯甲酰胺(Z-7)的制備以化合物6-b(471mg)為原料參考實施例6步驟2的合成方法，不同的是將步驟中4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環(huán)-2-基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯換成2-環(huán)己基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環(huán)。得到黃色化合物z-7(36.8mg)，產(chǎn)率42％，MSm/z(ESI):472.0[M+H]+。1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ7.54(d,J＝8.8Hz,1H),7.47(d,J＝7.2Hz,1H),7.25-7.34(m,2H),7.01(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),5.60(br.s.,1H),5.07(s,2H),3.04(s,3H),2.17-2.24(m,2H),2.04-2.12(m,2H),1.64-1.74(m,2H),1.49-1.64(m,2H)。實施例74-((5-氯-6-異丙基吡啶-3-基氧基)甲基)-5-環(huán)丙基-2-氟-N-(甲基磺?；?苯甲酰胺(Z-8)的制備步驟1：向化合物2-a(86mg，0.46mmol)的8ml乙腈溶液中加入化合物1-a-4(178mg，0.46mmol)，碳酸鉀(128mg，0.92mmol)，80℃攪拌4小時。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，過濾，濾餅加入鹽酸(3N，5ml)，乙酸乙酯萃取，有機相減壓濃縮得黃色固體化合物8-b(130mg)。MSm/z(ESI):495.0[M+H]+。直接用于下一步反應(yīng)。步驟2：向化合物8-b(117mg，0.32mmol)的甲苯和水中加入環(huán)丙基硼酸(68mg，0.32mmol)，三環(huán)己基膦(89mg，0.64mmol)，碳酸鉀(89mg，0.64mmol)，醋酸鈀(89mg，0.64mmol)，氬氣保護，100℃攪拌1小時。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，乙酸乙酯萃取，有機相用飽和碳酸氫鈉洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗品。經(jīng)制備液相分離純化后得白色固體化合物Z-8(18mg)，產(chǎn)率：18％，MSm/z(ESI):457.1[M+H]+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ7.97(d,J＝2.5Hz,1H),7.81(d,J＝2.5Hz,1H),7.31(d,J＝7.5Hz,1H),7.17(d,J＝11.5Hz,1H),5.27(s,2H),5.23-5.18(m,1H),2.83(s,3H),2.01-1.96(m,1H),1.30(d,J＝6.0Hz,6H),0.94-0.91(m,2H),0.62-0.60(m,2H).實施例84-((3-氯-4-(三氟甲基)苯氧基)甲基)-5-環(huán)丙基-2-氟-N-(甲基磺?；?苯甲酰胺(Z-9)的制備步驟1：化合物3-氯-4-(三氟甲基)苯酚(200mg，1.017mmol)，化合物1-a-4(395mg，1.017mmol)，碳酸鉀(218mg，2.035mmol)加入10ml乙腈溶液中，80攝氏度攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，倒入水中，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得黃色固體化合物9-b(0.647g)。MSm/z(ESI):503.9[M-H]-。直接用于下一步反應(yīng)。步驟2：化合物9-b(300mg，0.594mmol)，環(huán)丙基硼酸(103mg，1.189mmol)，Pd(dppf)Cl2(44mg，0.059mmol)，碳酸銫(388mg，1.189mmol)加入10ml二氧六環(huán)溶液中，氬氣保護，80℃攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，硅藻土過濾，濾液減壓濃縮，經(jīng)Combi-flash柱層析純化得到粗品，加適量甲醇超聲洗，過濾得白色固體化合物z-9(37mg)。產(chǎn)率：12％，MSm/z(ESI):464.0[M-H]-。1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ12.26(s,1H),7.82(d,J＝9.0Hz,1H),7.52(d,J＝2.5Hz,1H),7.45(d,J＝11.5Hz,1H),7.30(d,J＝7.0Hz,1H),7.25(dd,J＝2.0,9.0Hz,1H),5.44(s,2H),3.37(s,3H),2.05-2.01(m,1H),0.98-0.94(m,2H),0.78-0.74(m,2H).實施例9-11化合物Z-10，Z-11，Z-12以化合物1-a-4為起始原料，參照實施例9的方法進行制備，不同的是將步驟1中的3-氯-4-(三氟甲基)苯酚分別換成4-氯苯酚，3-氯-4-氟苯酚，2-氯-4-(三氟甲基)苯酚。實施例124-((3-氯-4-異丙基苯氧基)甲基)-5-環(huán)丙基-2-氟-N-(甲基磺?；?苯甲酰胺(Z-13)的制備步驟1：向?qū)Ρ蕉?2g，0.018mol)和化合物2-碘丙烷(3.072g，0.018mol)的20ml乙醇回流溶液中加入氫氧化鉀(1.070g，0.019mol)的10ml水溶液，回流攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，減壓濃縮，加入2N鹽酸，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得粗品，經(jīng)Combi-flash柱層析純化得到黃色油狀化合物13-b(1.031g)。純度：89.84％，產(chǎn)率：37％，直接用于下一步反應(yīng)。步驟2：向化合物13-b(330mg，2.168mmol)的5ml三氯甲烷溶液中逐滴加入乙酰氯(189mg，2.602mmol)，室溫攪拌6小時。反應(yīng)結(jié)束，逐滴加入適量碳酸氫鈉溶液，分離有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得黃色油狀粗品化合物13-c(400mg)。產(chǎn)率：95％，直接用于下一步反應(yīng)。步驟3：向化合物13-c(300mg，1.544mmol)的10ml乙腈溶液中逐滴加入N-氯代丁二酰亞胺(309mg，2.317mmol)，室溫攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束，加入飽和食鹽水洗，分離有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得黃色油狀粗品化合物13-d(435mg)。直接用于下一步反應(yīng)。步驟4：向化合物13-d(378mg，1.653mmol)的5ml甲醇溶液中加入氫氧化鉀(92mg，1.818mmol)的1ml水溶液，室溫攪拌3小時。反應(yīng)結(jié)束，加入適量1M鹽酸溶液，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得棕色油狀粗品化合物13-e(283mg)。產(chǎn)率：91％，直接用于下一步反應(yīng)。步驟5：化合物13-e(180mg，0.964mmol)，化合物1-a-4(375mg，0.964mmol)，碳酸鉀(267mg，1.929mmol)加入5ml乙腈溶液中，80攝氏度攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，加入適量1M鹽酸溶液，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得黃色固體粗品化合物13-f(382mg)。產(chǎn)率：80％，MSm/z(ESI):494.0[M-H]-。直接用于下一步反應(yīng)。步驟6：化合物13-f(382mg，0.772mmol)，環(huán)丙基硼酸(221mg，1.544mmol)，醋酸鈀(29mg，0.077mmol)，三環(huán)己基膦(72mg，0.154mmol)，碳酸鉀(355mg，1.544mmol)加入甲苯/水(5ml/0.2ml)溶液中，氬氣保護，90℃攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，硅藻土過濾，濾液減壓濃縮得粗品，經(jīng)Combi-flash柱層析純化得到粗品，再經(jīng)制備液相分離純化后得白色固體化合物Z-13(33.54mg)，產(chǎn)率：5％，MSm/z(ESI):454.1[M-H]-。1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ7.31(d,J＝7.0Hz,1H),7.19(d,J＝3.0Hz,1H),7.16(d,J＝11.0Hz,1H),7.12(d,J＝9.5Hz,1H),7.09(brs,4H),6.98(dd,J＝3.0,9.0Hz,1H),5.21(s,2H),4.53-4.46(m,1H),2.87(s,3H),2.02-1.95(m,1H),1.26(d,J＝6.0Hz,6H),0.95-0.90(m,2H),0.64-0.60(m,2H).化合物Z-0的制備步驟1：將化合物Z-0-1(20.0g,155mmol)溶解在叔丁醇(150mL)中，冷卻到0℃，氮氣保護下加入疊氮磷酸二苯酯(47g,170mmol),三乙胺(17.3g,170mmol)?；旌衔锘亓鲾嚢?8h后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干。殘留物溶解在二氯甲烷(400mL)中，用水(200mLx2)，食鹽水(200mL)洗。無水硫酸鈉干燥，抽濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，殘留物用柱層析(PE:EA＝3:1)純化后得淺黃色固體Z-0-2(15.2g,收率:49％).ESI-MS(M-55)+:145,純度＝97％(UV214)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ：8.85(brs,1H),8.61(d,1H),7.32(s,1H),1.55(s,9H)。步驟2：在N2保護下，將Z-0-2(8.0g，0.04mol)溶解在無水THF(80ml)中，混合物冷卻到-78℃，滴加LiHMDS(1M，48ml，0.048mol)的THF溶液。滴加完成后，混合物在-78℃，攪拌0.5h。將反應(yīng)液慢慢升溫至室溫，攪拌1h，然后降溫至-78℃，將5-氯-2,4-二氟苯磺酰氯(11.11g，0.048mol)的THF(50ml)溶液滴加到上述反應(yīng)液?；旌衔镌?78℃，攪拌1h后升至室溫，并在室溫攪拌16h。向反應(yīng)液中加入飽和氯化銨水溶液(250ml)中,用乙酸乙酯(3x100ml)萃取,合并有機相，用飽和食鹽水(200ml)洗，干燥，40℃旋干。粗品過柱(100-200目硅膠),淋洗液為石油醚：乙酸乙酯＝(4:1)，得到Z-0-3(5.11g,產(chǎn)率：31.8％)為白色固體。ESI-MS(M+Na)+:434.0，純度:95.9％(UV214)。步驟3：將化合物Z-0-4(50.8g,254mmol)溶解在THF(600mL)中，在冰浴中冷卻至0℃攪拌，分批加入氫化鋰鋁(8.4g,220mmol)?；旌衔镌?℃攪拌2h后，加水淬滅反應(yīng)，加鹽酸(6N)調(diào)節(jié)PH＝3,分離水相，有機相無水硫酸鈉干燥，抽濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，得白色固體Z-0-5(32.0g,收率:73.5％).1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.22–7.16(m,1H),6.77(d,J＝8.7Hz,1H),4.61(d,J＝3.7Hz,2H),3.82(s,3H),2.63(s,1H).步驟4：將化合物Z-0-5(32.0g,190mmol)溶解在二氯甲烷(400mL)中，然后加入氯化亞砜(50mL)?；旌衔镌诘獨獗Ｗo下，加熱至回流攪拌3h?；旌衔锝抵潦覝?，加水(200mL)淬滅反應(yīng)，分離有機相，水相用二氯甲烷萃取(200x2mL)。合并有機相用食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，抽濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，得紅色固體Z-0-6(33.0g,收率:92.2％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.34(d,J＝2.6Hz,1H),7.25(dd,J＝8.7,2.7Hz,1H),6.81(d,J＝8.8Hz,1H),4.59(s,2H),3.86(s,3H).步驟5：將化合物Z-0-6(32g,168mmol)溶解在DMSO(200mL)中，加入氰化鈉(29g,606mmol)。混合物在氮氣保護下，加熱至80℃攪拌3h。反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加水分散，抽濾。濾餅用少量水洗滌。風(fēng)干得桔紅色固體Z-0-7(31g,收率:98.3％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.35(d,J＝2.5Hz,1H),7.28(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),6.82(d,J＝8.7Hz,1H),3.86(s,3H),3.66(s,2H).步驟6：將化合物Z-0-7(32g,177mmol)溶解在甲酸甲酯(400mL)中，加入鈉(8.14g,354mmol)。混合物在氮氣保護下，加熱回流攪拌24h。反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加水淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯提取(400x2mL)，合并有機相水洗(200x2mL)，無水硫酸鈉干燥，抽濾。減壓蒸干得黃色固體Z-0-8(10.5g,收率:28.4％)。1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.91(s,1H),7.71(d,J＝93.3Hz,1H),7.40–7.32(m,1H),7.29(dd,J＝12.2,2.6Hz,1H),7.08(dd,J＝8.7,3.1Hz,1H),3.82(s,3H)。步驟7：將化合物Z-0-8(10.5g,50.2mmol)溶解在乙醇(150mL)中，加入叔丁基肼(7.5g,60.3mmol)?；旌衔镌诘獨獗Ｗo下，加熱回流攪拌3.5h。反應(yīng)混合物冷卻至室溫，減壓蒸干得黃色固體(15g)，快速柱層析得黃色固體Z-0-9(14.0g,收率:99.9％)。步驟8：將化合物Z-0-9(13.5g,48.4mmol)溶解在二氯甲烷(300mL)中，在冰浴中冷卻至0℃，加入三氟乙酸酐(30.5g,145.2mmol)，三乙胺(14.7g,145.2mmol)?；旌衔镌诘獨獗Ｗo下，升至室溫攪拌4h。反應(yīng)混合物加入碳酸鈉淬滅反應(yīng)至中性，分離水相，有機相用飽和食鹽水洗滌(100x2mL)，無水硫酸鈉干燥，抽濾。減壓蒸干得棕色固體Z-0-10(12.0g,收率:66.1％)。ESI-MS(M-H):376,純度＝89.23％(UV254).步驟9：將化合物Z-0-10(11.0g,29.3mmol)溶解在二氯甲烷(200mL)中，在冰浴中冷卻至0℃，加入三溴化硼(36.7g,146.6mmol)?；旌衔镌诘獨獗Ｗo下，升至室溫攪拌4h。反應(yīng)混合物慢慢加入冰水(100mL)，分離水相，有機相用飽和食鹽水洗滌(100x2mL)，無水硫酸鈉干燥，抽濾。減壓蒸干得棕色固體Z-0-11(6.3g,收率:68.9％)。ESI-MS(M-H):362,純度＝80.83％(UV254).步驟10：將化合物Z-0-11(25.0g,69mmol)溶解在甲醇(100mL)中，鹽酸二氧六環(huán)溶液(4M/L,100mL)?；旌衔镌?0℃攪拌18h。冷卻至室溫后，旋干。將氨的甲醇(50mL)溶液慢慢加入到殘留物(100mL)，40℃旋干。粗品過柱(100-200目硅膠),淋洗液為二氯甲烷：甲醇(10:1)，得到灰色固體Z-0-12(8.0g,收率:38％)。ESI-MS(M-H):210.1,純度＝90％(UV214)。步驟11：將化合物Z-0-12(4.18g,20mmol)，Z-0-3(8.20g,20mmol)，碳酸鉀(8.28g,60mmol)溶解在DMF(100mL)中，混合物在氮氣保護下，加熱至40℃攪拌18h。反應(yīng)混合物加入水(500mL)，二氯甲烷萃取(200mLx3)，合并有機相用水洗(100mLx2)，飽和食鹽水洗滌(100x2mL)，無水硫酸鈉干燥，抽濾。減壓蒸干得紅色固體Z-0-13(15.1g,收率:>100％)。ESI-MS(M+H)+:600.1,純度＝28％(UV254).步驟12：將化合物Z-0-13(12.0g,20mmol)溶解在二氯甲烷(40mL)中，加入三氟乙酸(20mL)?；旌衔镌诘獨獗Ｗo下，室溫下攪拌24h。減壓蒸干得粗產(chǎn)物為黃色固體，經(jīng)HPLC制備得類白色固體粉末Z-0(3.04mg,收率:31％)。ESI-MS(M+H)+:499.8,純度＝100％(UV254)。1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.56(s,2H),8.91(d,J＝2.4Hz,1H),7.90(d,J＝6.8Hz,1H),7.69(s,1H),7.43(s,1H),7.32(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.22(dd,J＝8.4Hz,1H),7.07(d,J＝2.0Hz,1H),6.73(d,J＝10.8Hz,1H),4.92(s,2H)。電生理學(xué)測定測試例1hNav1.7、hNav1.5和hNav1.2通道的手動膜片鉗實驗?zāi)て妷恒Q電生理學(xué)可以直接測量并定量電壓門控鈉通道(各種Nav)的電流阻斷并可以測定阻斷的時間和電壓依賴，其已被解釋為對鈉通道的靜息、開放和失活狀態(tài)的結(jié)合差異來反映化合物的抑制或激活效應(yīng)(Hille,B.,JournalofGeneralPhysiology(1977),69:497-515)。本發(fā)明代表性的化合物采用手動膜片鉗實驗進行，本研究的目的是應(yīng)用手動膜片鉗的方法在轉(zhuǎn)染特定離子通道的穩(wěn)定細胞株上測試化合物對該離子通道電流的作用。其使用的穩(wěn)定細胞株CHO-hNav1.7和HEK-hNav1.5分別來自Genionics公司和WuXiApptec(上海)公司。手動膜片鉗實驗方案如下：(一)溶液及化合物的配制：采用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄hNav1.7和hNav1.5電流。實驗中，細胞外液的組成成分(mM)：HEPES：5,NaCl：40,KCl：3,CaCl2：1,MgCl2：1,CdCl2：0.1,TEA-Cl：20。用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.3，同時用蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓至310-320mOsm，過濾后4℃保存。細胞內(nèi)液的組成成分(mM)：HEPES：10,NaCl：10,CsOH：5,CsF：140,EGTA：1。用CsOH調(diào)節(jié)pH值至7.3，同時用蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓至280-290mOsm，過濾后-20℃保存。陽性對照藥和待測化合物先溶于100％DMSO(Sigma-Aldrich,D2650，配置成一定濃度(100nM，1000nM)的儲備溶液。實驗前用DMSO將上述儲備溶液進行系列稀釋，然后再用細胞外液進一步稀釋得到所需濃度的測試溶液。細胞外液中DMSO最終濃度不超過0.30％。(二)手動膜片鉗實驗：取細胞懸液加于35mm的培養(yǎng)皿中，置于倒置顯微鏡載物臺上。待細胞貼壁后，用細胞外液灌流，流速為1–2mL/min。玻璃微電極由微電極拉制儀兩步拉制，其入水電阻值為2-5MΩ。通過Digidata1440(MolecularDevices)和pCLAMP軟件(10.2版，MolecularDevices)A/D–D/A數(shù)模轉(zhuǎn)換，進行刺激發(fā)放及信號采集；膜片鉗放大器(Multiclamp700B，MolecularDevices)放大信號，濾波為4KHz。在hNav1.7和hNav1.5手動膜片鉗實驗中運用兩種不同的電壓刺激程序。一種是失活刺激程序，鉗制電位設(shè)置在相對應(yīng)通道的V1/2，即大約50％的通道處于失活狀態(tài)。接著給予電壓至-120mV，持續(xù)50ms。然后去極化至-10mV，持續(xù)20ms引出鈉電流，最后回到鉗制電位。這種刺激程序也可以稱之為通道狀態(tài)依賴的電壓刺激程序。另一種是非失活刺激程序，保持鉗制電位在-120mV,給予電壓刺激至-10mV，持續(xù)20ms引出鈉電流，最后回到鉗制電位。也就是說在該種刺激程序條件下，所有的通道都沒有經(jīng)歷過失活狀態(tài)，而是直接從靜息狀態(tài)進行激活。上述兩種電壓刺激程序的時間間隔均為10s?；衔锏囊种菩?yīng)通過加藥前后的電流變化來進行計算，而IC50數(shù)值由Hill方程進行擬合所得。如果化合物在上述兩種不同的電壓刺激下顯示出對通道效應(yīng)有一定倍數(shù)的差異，那么該化合物對該通道是具有狀態(tài)依賴性的。數(shù)據(jù)分析將每一個藥物濃度作用后的電流和空白對照電流標準化(化合物峰拖尾電流/對照物峰拖尾電流)，然后計算每一個藥物濃度對應(yīng)的抑制率(1-(化合物峰拖尾電流/對照物峰拖尾電流))。對每一個濃度計算平均數(shù)和標準誤差，并用以下的方程計算每種化合物的半抑制濃度：抑制率＝1/(1+(IC50/c)h)用以上方程對劑量依賴效應(yīng)進行非線性擬合，其中c代表藥物濃度，IC50為的半抑制濃度，h代表希爾系數(shù)。曲線擬合以及IC50的計算利用IGOR軟件完成。結(jié)果分別見表1和表2。表1本發(fā)明代表性化合物在兩種濃度下對Nav1.7的抑制率表2本發(fā)明代表性化合物對Nav1.7和Nav1.5的IC50值化合物Nav1.7(IC50/nM)Nav1.5(IC50/nM)Nav1.5/Nav1.7Z-14.220047.6Z-28.4781095.6hNav1.2手動膜片鉗實驗細胞準備：NaV1.2基因信息：重組HEK293細胞系穩(wěn)定表達人電壓門控鈉通道亞型1.2(hNaV1.2).cDNA嚴格遵循GenBank序列號:NM_001040142.1。穩(wěn)定表達Nav1.2通道的HEK293細胞系在含有10％胎牛血清及1.2mg/mlG418的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，二氧化碳濃度為5％。細胞傳代：除去舊培養(yǎng)基并用PBS洗一次，然后加入1mlTrypLETMExpress溶液，37℃孵育1分鐘。當細胞從皿底脫離，加入5ml37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基。將細胞懸液用吸管輕輕吹打使聚集的細胞分離。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，1000rmp離心5分鐘收集細胞。擴增或維持培養(yǎng)，將細胞接種于10厘米細胞培養(yǎng)皿，每個細胞培養(yǎng)皿，接種細胞量為3.5*105(最終體積：10ml)。為維持細胞的電生理活性，細胞密度必須不能超過80％。膜片鉗檢測，實驗之前細胞用TrypLETMExpress分離，將3*103細胞鋪到蓋玻片上，在24孔板中培養(yǎng)(最終體積：500μl)，18個小時后，進實驗檢測。膜片鉗實驗方法：用微電極拉制儀(P97，SutterInstruments)將毛細玻璃管(BF150-86-10，SutterInstruments)拉制成記錄電極。在倒置顯微鏡(IX71，Olympus)下操縱微電極操縱儀(MP285，SutterInstruments)將記錄電極接觸到細胞上，給予負壓抽吸，形成GΩ封接。形成GΩ封接后進行快速電容補償，然后繼續(xù)給予負壓，吸破細胞膜，形成全細胞記錄模式。然后進行慢速電容的補償并記錄膜電容及串聯(lián)電阻，并給以串聯(lián)電阻補償，不給予漏電補償。當全細胞記錄的電流穩(wěn)定后開始記錄。實驗數(shù)據(jù)由EPC-10放大器(HEKA)進行采集并儲存于PatchMaster(HEKA)軟件中。當全細胞記錄的電流穩(wěn)定后開始給藥，每個藥物濃度作用至5分鐘(或者電流至穩(wěn)定)，每一個測試化合物檢測1000nM濃度值。將鋪有細胞的蓋玻片置于倒置顯微中的記錄浴槽中，測試化合物以及不含化合物的外液利用重力灌流的方法從低濃度到高濃度依次流經(jīng)記錄小室從而作用于細胞，在記錄中利用真空泵進行液體交換。每一個細胞在不含化合物的外液中檢測到的電流作為自己的對照組。獨立重復(fù)檢測3個細胞。所有電生理實驗在室溫下進行。鈉離子通道記錄所用液體：細胞外液:140mMNaCl、4mMKCl、1mMMgCl2、2mMCaCl2、5mMD-一水葡萄糖、10mMHEPES(pH＝7.4NaOH調(diào)節(jié))。細胞內(nèi)液液:145mMCsCl、0.1mMCaCl2、2mMMgCl2、10mMNaCl、0.5mMNa2-GTP、2mMMg-ATP、1.1mMEGTA、10mMHEPES(pH7.2CsOH調(diào)節(jié))。鈉離子通道的刺激方案:首先將細胞的膜電位維持在-90mV，然后以5mv的階躍間隔，將細胞膜電位階躍至-120mV至100mV。通過上述公式計算抑制率結(jié)果如表a所示。表a同種濃度下Nav1.7和Nav1.2的抑制率比較化合物(Z-2)1000nM(％)Nav1.798.20Nav1.235.00從表1、表2和表a可以看出，本發(fā)明代表性化合物對Nav1.7具有較高的抑制活性，對Nav1.5和Nav1.2的抑制活性明顯較弱，因此本發(fā)明代表性化合物不僅對Nav1.5而且對Nav1.2均具有選擇性。測試例2冷刺激痛覺超敏法實驗動物為雄性Sprague-Dawley大鼠，實驗開始時體重140-150g。實驗用動物均采購于斯萊g公司，購買后采用自由采食的方式進行食物和水供應(yīng)，分籠飼養(yǎng)，4只/籠，采用動物尾部標記法l進行動物標記。檢測化合物及分組：溶劑對照物(Vehicle)：5％二甲基乙酰胺(國藥科技)、5％聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯(solutol)(Sigma)和90％生理鹽水陽性對照物：化合物Z-0；待測藥物：化合物Z-2；陽性對照物和待測藥物的溶劑成分為5％二甲基乙酰胺,5％聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯和90％生理鹽水?？诜?小時后，Z-2100mg/kg劑量抑制大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的冷痛覺超敏。Z-075mg/kg和100mg/kg劑量抑制大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的冷痛覺超敏。如表3所示。表3化合物在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠中藥效測試分組實驗方法：1.1.脊神經(jīng)結(jié)扎模型·手術(shù)過程執(zhí)行無菌操作。·手術(shù)器械(剪刀，鑷子，手術(shù)刀，手術(shù)棉，縫合線，撐開器)在手術(shù)前已消毒。·使用戊巴比妥那(50mg/kg,腹腔注射)麻醉動物。擠壓動物腳趾以確認動物手術(shù)前已經(jīng)完全麻醉。在動物眼部涂抹眼用軟膏以防止動物角膜干燥?！ぬ耆游锵掳肷硎中g(shù)區(qū)域毛發(fā)，使用碘伏和70％乙醇對手術(shù)區(qū)域皮膚消毒三遍。待皮膚干燥后開始手術(shù)?！な褂檬中g(shù)刀在動物腰部薦骨后部開一縱向切口，暴露左側(cè)椎旁肌，使用撐開器分離肌肉組織以暴露脊椎骨?！し蛛x左側(cè)脊神經(jīng)L5和L6，使用6-0絲線結(jié)扎。·縫合傷口?！で鍧嵤中g(shù)器械，使用熱珠滅菌器滅菌?！な中g(shù)后將動物放置在電熱毯上，皮下注射5mL生理鹽水以防止脫水。等動物完全蘇醒后(可自由活動)將動物放回籠中。1.2.冷痛覺超敏基線測試和分組給藥前兩天，對大鼠進行冷痛覺超敏基線測試，使用移液器將100μl丙酮涂在動物術(shù)側(cè)后足部皮膚。記錄動物在一分鐘內(nèi)拍打，縮腳，抬腳，舔舐術(shù)側(cè)足部的時間。丙酮測試共進行兩次，兩次間隔10分鐘。兩次時間之和記錄為大鼠冷痛覺超敏反應(yīng)時間。根據(jù)給藥前一天的冷痛覺超敏反應(yīng)測試結(jié)果將動物隨機分組。1.3.冷痛覺超敏測試給藥兩小時后，使用移液器將100μl丙酮涂在動物術(shù)側(cè)后腳趾部皮膚。記錄動物在一分鐘內(nèi)拍打，縮腳，抬腳，舔舐受影響的腳部的時間。丙酮測試共進行兩次，兩次間隔10分鐘。兩次時間之和記錄為大鼠冷痛覺超敏反應(yīng)時間。1.4.給藥冷刺激痛覺測試2小時前口服給藥。其中給藥記錄和動物體重如表4所示：表4給藥記錄和動物體重表5大鼠冷痛覺超敏測試結(jié)果1.5.數(shù)據(jù)收集和分析使用Excel軟件收集數(shù)據(jù)。使用Prism軟件分析數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果如圖1和圖2所示，結(jié)果表明本發(fā)明示例化合物Z-2在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠模型中具有抑制冷刺激痛覺超敏效果，在大鼠體內(nèi)神經(jīng)痛模型中是有統(tǒng)計學(xué)意義的抑制效果。圖2中，與溶劑對照物比較，使用單因素方差分析附加Dunnett多重比較檢驗，***p<0.001，口服化合物Z-2和化合物Z-0(100mg/kg和75mg/kg)兩小時后分別抑制大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的冷痛覺超敏。測試例3：大鼠體內(nèi)試驗應(yīng)用LC/MS/MS法測定了大鼠分別灌胃和靜注給予實施例化合物后不同時刻血漿中的藥物濃度，研究本發(fā)明化合物在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為，評價其藥動學(xué)特征。實驗方案：試驗動物：健康成年雄性SD大鼠(體重215-225g，6只，禁食)，由斯萊克公司提供；給藥方式與劑量：給予SD大鼠足背靜脈給藥(1mg/kg，1mL/kg，5％DMAC(二甲基乙酰胺),5％SolutolHS15(聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯)和90％鹽水和灌胃給藥(2mg/kg，2mL/kg，0.5％CMC-Na水溶液)血樣采集：首先對給藥前挑選符合實驗要求的動物，稱重標記。采集血樣前，綁定大鼠，每一只給藥的大鼠在預(yù)定的采血時間點(靜脈給藥：分別于給藥前，給藥后的0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24h采血，共9個時間點；灌胃給藥：分別于給藥前，給藥后的0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24h采血，共9個時間點)，通過尾靜脈采血，或經(jīng)心臟采血(終末采血)約150μL。通過眼眶采血，或經(jīng)心臟采血(終末采血)約150μL。血液轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入K2EDTA的1.5mL試管中。采完的血樣放在濕冰上，離心5min(2000g,4℃)，取出血漿，整個過程在采血后15min內(nèi)完成。所有的樣品都需要存放于-70℃冰箱直到樣品分析。應(yīng)用LC/MS/MS法測定藥物濃度，本發(fā)明部分實施例化合物在相同劑量和給藥方式下，大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)性質(zhì)參數(shù)如表6所示：表6化合物在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)從表6可以看出，本發(fā)明示例化合物的藥代吸收好，具有明顯的藥代吸收效果，同時表現(xiàn)出良好的生物利用度。測試例4：代謝穩(wěn)定性測試1.緩沖液的配制緩沖液A：配制1L含有1mMEDTA(Sigma，V900157-100G)，100mM的磷酸二氫鉀溶液。緩沖液B：配制1L含有1mMEDTA，100mM的磷酸氫二鉀溶液。緩沖液C：取700mL緩沖液B，用緩沖液A滴定，調(diào)至PH為7.4即可。2.待測化合物和陽性對照藥(酮色林(SigmaS006-10MG))的配制2.1取10mM待測化合物和10mM酮色林各10uL，再各加190uL的純乙腈，分別配成500uM待測化合物和酮色林溶液。2.2取20uL(20mg/mL)肝微粒體(CorningLot.452161)和大鼠肝微粒體(CorningLot.452501)儲存液分別加入到513.4uL的緩沖液C，在濕冰上操作。配制得到0.75mg/mL肝微粒體溶液。2.3各取1.5uL上述待測化合物和酮色林溶液，分別加入到498.5uL(0.75mg/mL)的肝微粒體溶液中，在濕冰上操作。配制得到1.5uM待測化合物混合液和酮色林混合液。2.4按照時間點0、5、15、30、45、60min，每孔30uL，分別將待測化合物混合液和酮色林混合液分裝到反應(yīng)板上，在濕冰上操作。2.5稱取5mg還原型輔酶Ⅱ(Roche，10621706001)，溶于1mL緩沖液C中。配制成6mM還原型輔酶Ⅱ溶液。將還原型輔酶Ⅱ溶液分裝到反應(yīng)板中。2.6將丙米嗪溶成10mM的溶液，取100mL空白乙腈，加入10uL丙米嗪溶液。配成內(nèi)標。2.7在0min，每孔加入135uL含有內(nèi)標的冰乙腈(Merck(Lot.1778229518))，再加入15uL緩沖液C。2.8將反應(yīng)板放入37度水浴恒溫箱內(nèi)預(yù)熱5min。在反應(yīng)板中，每孔加15uL還原型輔酶Ⅱ溶液開始反應(yīng)并計時。在5、15、30、45、60min時間點，每孔加入135uL含有內(nèi)標的冰乙腈終止反應(yīng)。2.9將反應(yīng)板用鋁膜封好，放在震蕩混合器上，500rpm，5min。再將反應(yīng)板放在離心機中離心，15min，3750rpm。2.10取樣品和純水按照1:1比例稀釋，LC/MS檢測。將得到的數(shù)值按照以下公式計算得到如表7所示的半衰期和清除率。半衰期：0.693/K(孵化時間與濃度對數(shù)值作圖出來的斜率)清除率：(0.693/半衰期)*(1/蛋白質(zhì)濃度(0.5mg\mL))*(比例因子)其中K值和比例因子為本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有方法以及肝微粒體產(chǎn)品說明書記載的方法計算得到的。表7大鼠和人肝微粒體代謝穩(wěn)定性實驗結(jié)果從表7可以看出，結(jié)構(gòu)的不同對代謝穩(wěn)定性有較明顯的影響，將R2的環(huán)丙基換成環(huán)己烯基后，大鼠和人的代謝穩(wěn)定性明顯降低，此外與氧直接相連的基團換成吡啶基后，代謝穩(wěn)定性也明顯降低。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3