本發(fā)明涉及藥物用途技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一類苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物在制備抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨質(zhì)疏松癥(Osteoprosis簡稱OP)是以骨量減少，骨組織微細結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨脆性增加和骨折危險性增加為特征的一種系統(tǒng)性、全身性骨骼疾病。臨床表現(xiàn)和體征主要是疼痛，其次為身長縮短、駝背、骨折及呼吸系統(tǒng)障礙。流行病學(xué)調(diào)研顯示，50歲以上的人群中，約有50％的女性和20％的男性有骨折的風(fēng)險(Rachner,Khosla et al.2011)。國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示：到2050年，我國50歲以上的人口將近全國人口的一半(49％)，約6.36億，預(yù)計到2050年我國骨質(zhì)疏松患者數(shù)目約為3億人。

破骨細胞(Osteoclast)和成骨細胞(Osteoblast)之間的比例失衡是骨質(zhì)疏松產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)(Rachner,Khosla et al.2011)。破骨細胞分化相對增多或成骨細胞分化相對減少，都會造成骨量流失，引起骨質(zhì)疏松。降低骨吸收、促進骨合成是當(dāng)前臨床上治療骨質(zhì)疏松的主要治療手段。骨吸收抑制劑主要有雌激素受體調(diào)控劑如他莫昔芬，托瑞米芬，屈洛昔芬，雷洛昔芬，阿佐昔芬，巴多昔芬，依普黃酮等、雙磷酸酯/鹽類如乙醇酸膦酸鹽，氯膦酸鹽，帕米膦酸，鹵素磷酸鹽，磷酸艾倫，利塞膦酸鈉，磷酸唑來膦，伊班膦酸鈉等、以及降鈣素等。促進骨合成藥物主要有Wnt信號調(diào)控劑(AMG785,BHQ880)、甲狀旁腺激素Parathyroid hormone(PTH)、鈣敏感受體拮抗劑(如：ATF936)，和他汀類藥物。還有既抑制骨吸收又促成骨的制劑，如阿法骨化醇，骨化三醇(Alfacalcidol,Calcitriol,RO-26-9228,ED-71)等。然而，上述藥物雖然能在一定程度上阻止骨密度下降，但不能顯著降低非典型性骨折的風(fēng)險，而且存在著不同程度的副作用，尚未能滿足抗骨質(zhì)疏松治療的要求(Siris,Selby et al.2009)。因此，目前迫切需要開發(fā)一種新的抗骨質(zhì)疏松的特效藥，以解決當(dāng)前臨床用藥無法滿足治療需求的問題。

破骨細胞是來源于骨髓巨噬細胞系的一種終末分化細胞，是目前所知唯一具有骨吸收作用的細胞。核受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)是破骨細胞維持其結(jié)構(gòu)、功能和存活所必需的一種跨膜的可溶性蛋白。RANK與其配體結(jié)合，激活下游NF-κB、Akt，絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)，激活T細胞核受體(NFAT)，鈣離子通道，和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶信號通路，使得未分化的骨髓巨噬細胞向破骨細胞分化，進而引起骨質(zhì)疏松(Boyle,Simonet et al.2003)。大量的研究證實，干擾RANKL信號通路可抑制破骨細胞分化，產(chǎn)生抗骨質(zhì)疏松的藥理作用(Kim and Kim 2016)。近年來，通過干擾RANKL信號通路研發(fā)新型抗骨質(zhì)疏松藥物成為熱點。尋找具有抑制由RANKL誘導(dǎo)產(chǎn)生的破骨細胞抑制活性的藥物，將有望解決當(dāng)前骨質(zhì)疏松治療藥物存在的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于新靶標RANKL信號通路發(fā)現(xiàn)新的抗骨質(zhì)疏松藥物，以克服現(xiàn)有骨質(zhì)疏松治療藥物不能降低非典型性骨折的風(fēng)險的問題，提供一類苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物在制備抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明的設(shè)計思路是根據(jù)三維結(jié)構(gòu)相似度篩選的方法，以已知具有抗骨質(zhì)疏松或破骨細胞分化抑制劑為模板，對本實驗室現(xiàn)有化合物進行篩選，獲得一系列化合物可能具有抗骨質(zhì)疏松作用的潛在活性化合物，然后在細胞水平對篩選獲得的化合物進行破骨細胞分化抑制實驗，發(fā)現(xiàn)其中一類抑制活性高、細胞毒性低的苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物可以有效抑制破骨細胞分化。所以，此類苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物可安全用于制備治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物。

本發(fā)明所選取的化合物均為現(xiàn)有的化合物。計算機篩選指的是運用計算機輔助藥物設(shè)計相關(guān)軟件，采用相似度檢索等技術(shù)手段對現(xiàn)有的化合物庫進行篩選，篩選得到的化合物進行生物活性測試。

一類苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物在制備抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，所述苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物的結(jié)構(gòu)式如式(I)或式(II)所示：

其中，X為碳原子、氧原子、氮原子或硫原子，Y為碳原子、氧原子、氮原子或硫原子，R₁為氫、羥基、烷基、不飽和烷基、烷氧基或酯基，R₂為氫、羥基、烷基、不飽和烷基、烷氧基或酯基，R₃為氫、羥基、烷基、不飽和烷基、烷氧基、酰胺基或酯基，R₄為氫、烷基，烷氧基或酯基，R₅為氫、烷基、烷氧基和或酯基，R₁、R₂可以成環(huán)，n＝0、1、2、或3。

優(yōu)選地，R₁為氫、羥基、C1～C6烷基，C1～C6烷氧基或酯基，R₂為氫、羥基、C1～C6烷基、C1～C6不飽和烷基、C1～C6烷氧基或酯基，R₃為氫、羥基、C1～C6烷基、C1～C6不飽和烷基、C1～C6烷氧基、酰胺基或酯基，R₄為氫、C1～C6烷基、C1～C6不飽和烷基、C1～C6烷氧基或酯基，R₅為氫、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基或酯基。

優(yōu)選地，所述X為碳原子或硫原子，Y為氧原子、氮原子或硫原子。

優(yōu)選地，R₁為氫或酯基，R₂為氫或烷基，R₃為氫、酰胺基或酯基，R₄為氫或酯基，R₅為氫或酯基。

優(yōu)選地，R₁為氫或酯基，R₂為氫或C1～C6的烷基，R₃為氫、酰胺基或酯基，R₄為酯基，R₅為酯基。

優(yōu)選地，R₁、R₂成環(huán)形成六元飽和環(huán)烷基或六元不飽和芳香基。

最優(yōu)選地，所述苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物的結(jié)構(gòu)式為

術(shù)語“烷基”是用于表示飽和烷烴，C1～C6的烷基是指含有1～6個碳原子的飽和烴基。“不飽和烷基”表示是用于表示碳、氫兩種原子的官能團，可以看作是相應(yīng)的烷基失去1～4氫原子(H)后剩下的自由基。

進一步地，所述藥學(xué)上可接受的鹽為結(jié)構(gòu)式如式(I)或式(II)所示苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物與酸或堿形成的藥學(xué)上可接受的鹽。

最為優(yōu)選地，所述苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

代碼為C-001的或

代碼為C-004的

本發(fā)明同時保護結(jié)構(gòu)式如式(I)或式(II)所示苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物、其藥學(xué)上可接受的鹽或酯或含有它們中任一種的藥物組合物在制備抑制破骨細胞分化藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提及的藥物包括藥學(xué)上可接受的鹽、載體和/或賦形劑。

進一步地，本發(fā)明所述苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物是作為破骨細胞分化抑制劑在制備抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供了一種新的以苯內(nèi)酰烯酯酰胺作為母體的衍生物作為破骨細胞分化抑制劑在制備抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，且本發(fā)明提供的化合物均能在一定程度上抑制破骨細胞分化，尤其以化合物C-001和C-004對破骨細胞分化抑制活性最佳。本發(fā)明提供的苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物結(jié)構(gòu)簡單、易合成；而且此類化合物毒性小，可安全用于制備治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物。

附圖說明

圖1為C-0001破骨細胞分化抑制及C-001細胞毒性曲線圖。

圖2為C-0002破骨細胞分化抑制及C-0002細胞毒性曲線圖。

圖3為C-0003破骨細胞分化抑制及C-0003細胞毒性曲線圖。

圖4為C-0004破骨細胞分化抑制及C-0004細胞毒性曲線圖。

圖5為C-0005破骨細胞分化抑制及C-0005細胞毒性曲線圖。

圖6為C-0006破骨細胞分化抑制及C-0006細胞毒性曲線圖。

圖7為C-0007破骨細胞分化抑制及C-0007細胞毒性曲線圖。

圖8為C-0008破骨細胞分化抑制及C-0008細胞毒性曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。

實施例1：計算機藥物篩選

化合物庫預(yù)處理：化合物庫為自備化合物數(shù)據(jù)庫?；衔飵熳魅缦绿幚恚喝コx子及絡(luò)合水分子、加電荷、質(zhì)子化、產(chǎn)生三維構(gòu)象。這些流程均在藥物設(shè)計軟件包Discovery Studio 2.5中完成。其中質(zhì)子化在pH 6.5～8.5條件下進行。準備好的小分子庫用于虛擬篩選。

以已知抗骨質(zhì)疏松藥物和破骨細胞分化抑制劑進行三維相似度檢索，找出相似度高于80％的化合物。本發(fā)明通過計算機藥物篩選程序為本實驗室自主研發(fā)程序WEGA，預(yù)測出本實驗室化合物儲備庫擁有44個潛在活性的化合物。對該44個化合物進行細胞水平的抑制骨質(zhì)疏松分化活性篩選，發(fā)現(xiàn)其中8個化合物(C-001～C-008)具有抑制破骨細胞分化的作用。這8個化合物均屬苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物，各個活性化合物的結(jié)構(gòu)式及活性見表1。

實施例2：化合物細胞的毒性測定

S1.細胞培養(yǎng)。

體外培養(yǎng)RAW264.7細胞。使用含有10％胎牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃，5％二氧化碳濃度條件下進行常規(guī)維持培養(yǎng)和傳代。

S2.化合物干預(yù)。

收集對數(shù)期細胞，將細胞懸液濃度配成1×10⁵個/ml，加入96孔細胞培養(yǎng)板中。于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換成含有不同化合物濃度的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)2天，于第3天檢測細胞毒性。使用DMSO將待測化合物配置為不同濃度的溶液。每個濃度設(shè)3個平行復(fù)孔，并設(shè)不經(jīng)化合物處理的對照組進行比較。

S3.測試方法。

采用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法測定經(jīng)化合物處理6天之后的細胞。應(yīng)用酶標儀(檢測波長570nm，參考波長630nm)測定個孔吸光值(OD值)。

S4.結(jié)果處理。

按下面的公式計算各個藥物對RAW264.7細胞的生長抑制率：

以RAW264.7細胞生長抑制率為縱坐標，化合物濃度得log值為橫坐標繪制各化合物對細胞生長的抑制曲線圖，根據(jù)各化合物對細胞抑制率，求出半數(shù)毒性濃度CC₅₀，即抑制細胞生長達50％時藥物濃度。

另按照公式：選擇抑制常數(shù)(SI)＝CC₅₀/IC₅₀計算各化合物的選擇抑制常數(shù)，以評價各化合物的用藥安全性。C-001～C-008八個化合物的選擇抑制常數(shù)結(jié)果見表1。C-001～C-008八個化合物對RAW264.7細胞的毒性測定結(jié)果分別見圖1～圖8。

實施例3：破骨細胞分化抑制實驗

S1.細胞培養(yǎng)。

體外培養(yǎng)RAW264.7細胞。使用含有10％胎牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃，5％二氧化碳濃度條件下進行常規(guī)維持培養(yǎng)和傳代。

S2.化合物干預(yù)。

收集對數(shù)期細胞，將細胞懸液濃度配成2×10⁴個/ml，加入96孔細胞培養(yǎng)板中。于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換成含有100ng/ml RANKL及不同化合物濃度的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)5天，每2天換上相同RANKL濃度和化合物濃度的培養(yǎng)基，于第5天檢測采用TRAP染色法對破骨細胞進行染色。每個濃度設(shè)3個平行復(fù)孔，并設(shè)不經(jīng)化合物處理的對照組進行比較。

S3.測試方法。

采用TRAP試劑盒對分化形成的破骨細胞進行染色，計數(shù)≧3個細胞核融合的破骨細胞數(shù)目。

S4.結(jié)果處理。

按下面的公式計算各藥物對RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化抑制率：

以破骨細胞分化抑制率為縱坐標，化合物濃度的log值為橫坐標繪制各化合物對破骨細胞分化抑制曲線圖，根據(jù)各化合物對破骨細胞分化的抑制率，求出半數(shù)有效率IC₅₀，即抑制破骨細胞分化達50％時藥物濃度。

另按照公式：選擇抑制常數(shù)(SI)＝CC₅₀/IC₅₀計算各化合物的選擇抑制常數(shù)，以評價各化合物的用藥安全性。C-001～C-008八個化合物的選擇抑制常數(shù)結(jié)果見表1。C-001～C-008八個化合物對宿主細胞的毒性測定結(jié)果分別見圖1～圖8。

根據(jù)選擇性指數(shù)SI＝CC₅₀/IC₅₀值，按以下標準評價化合物的抗骨質(zhì)疏松分化的效果。SI<1.0表明化合物有毒無效，1.0≤SI≤2.0表明化合物低效有毒即弱陽性，2.0<SI<10.0表明化合物有效低毒即陽性，SI≥10.0表明化合物高效低毒即強陽性。

由表1和圖1～8的結(jié)果可見，本發(fā)明通過破骨細胞分化抑制實驗，發(fā)現(xiàn)8個化合物對破骨細胞分化均有不同程度的抑制作用，其中C-001、C-002、C-003、C-004、C-005、C-007選擇性高(SI為10.64～200.66)，C-001抑制破骨細胞分化活性最好、選擇性最高，IC50為12.5μM、SI為200.66(見圖1、表1)。

表1 藥物篩選獲得的化合物結(jié)構(gòu)及其對破骨細胞分化的抑制作用

本發(fā)明通過破骨細胞分化抑制實驗，發(fā)現(xiàn)C-001、C-004對破骨細胞分化抑制活性最高，均小于10μM，并且細胞毒性低。C-001對破骨細胞分化半數(shù)抑制劑量(IC₅₀)為4.24μM，細胞半致死劑量(CC₅₀)為850.80μM，選擇抑制常數(shù)(SI)為220.66(表1，圖1)。C-005對破骨細胞分化半數(shù)抑制劑量(IC₅₀)為5.13μM，細胞半致死劑量(CC₅₀)為279.20μM，選擇抑制常數(shù)(SI)為54.42(表1，圖4)。