本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及分離制備天然萘醌類(lèi)化合物的方法，具體涉及采用高速逆流色譜連續(xù)循環(huán)分離法制備萘醌類(lèi)化合物。

背景技術(shù)：

新疆紫草(arnebiaeuchroma(royle)johnst)，為紫草科軟紫草屬植物，其干燥根入藥收載與《中國(guó)藥典》中，紫草是我國(guó)常用中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，味甘、咸，性寒，歸心、肝經(jīng)。傳統(tǒng)功效有清熱涼血，活血，解毒透疹的功效。化學(xué)成分研究和現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紫草含有多種生理活性成分,現(xiàn)已從紫草植物中分離到萘醌、苯醌、單萜苯酚生物堿、酚酸類(lèi)、咖啡酸酯類(lèi)、三萜酸類(lèi)物質(zhì)、酸性多糖類(lèi)和黃酮類(lèi)等物質(zhì)。以紫草素及其衍生物為代表的萘醌類(lèi)化合物具有多種生物功效,如抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗血栓和傷口愈合等作用。另外，紫草素等萘醌化合物作為天然色素已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和印染工業(yè)中，具有較好的應(yīng)用前景。盡管如此，由于萘醌類(lèi)化合物具有相似的結(jié)構(gòu)以及這些化合物在分離填料上的較強(qiáng)吸附作用，從新疆紫草中制備分離萘醌類(lèi)化合物仍然比較困難。

高速逆流色譜(hsccc)是一種連續(xù)液-液色譜分離技術(shù)，它的固定相和流動(dòng)相均是液體，沒(méi)有不可逆吸附，具有樣品無(wú)損失、高效、快速和大制備量分離等優(yōu)點(diǎn)。目前hsccc已在天然產(chǎn)物分離純化領(lǐng)域得到較多的應(yīng)用。雖然已有報(bào)道利用常規(guī)hsccc從硬紫草中分離純化得到萘醌類(lèi)化合物，如紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素和異丁酰紫草素等(lu,etal,journalofchromatographya,2004.1023(1):159-163；feng,l,etal,chromatographia,2009.70(7):1197-1200.)，但常規(guī)hsccc方法耗時(shí)較長(zhǎng)且很難同時(shí)分離得到高純度的具有相近結(jié)構(gòu)的單體化合物。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供新的分離制備天然萘醌類(lèi)化合物的方法，本方法中利用hsccc合并在線儲(chǔ)存技術(shù)和連續(xù)循環(huán)洗脫模式，能快速高效地從植物提取物中分離純化得到多個(gè)高純度萘醌類(lèi)化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效分離制備高純度萘醌類(lèi)化合物的方法，該方法中利用hsccc合并在線儲(chǔ)存技術(shù)和連續(xù)循環(huán)洗脫模式，能快速高效地從植物提取物中分離純化得到多個(gè)高純度萘醌類(lèi)化合物。

本發(fā)明的分離制備方法是通過(guò)如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種從新疆紫草中制備萘醌類(lèi)化合物的高速逆流色譜連續(xù)循環(huán)分離方法，包括如下步驟：

(1)設(shè)置高速逆流色譜儀，

其中，高速逆流色譜儀檢測(cè)器后連接流通閥a和b，六通閥a和b分別連接儲(chǔ)存環(huán)ⅰ和ⅱ，恒流泵前連接六通閥c，負(fù)責(zé)切換正常洗脫模式和循環(huán)洗脫模式，(設(shè)置的高速逆流色譜儀結(jié)構(gòu)圖如圖1所示)；

(2)設(shè)定分離條件：

其中，分離的兩相溶劑系統(tǒng)由正己烷、乙酸乙酯、乙腈和水7:2:7～9:1～3混勻后分層得到；

將兩相溶劑體系上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相；

將固定相泵入高速逆流色譜柱內(nèi)，然后啟動(dòng)主機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速并開(kāi)啟旋轉(zhuǎn)，向色譜柱內(nèi)泵入流動(dòng)相；待溶劑體系在色譜柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡；

(3)將包含萘醌類(lèi)化合物的新疆紫草提取物溶于兩相體系中；通過(guò)進(jìn)樣閥將樣品注入柱內(nèi)；

(4)收集高純度的含有目標(biāo)萘醌類(lèi)化合物的流份；

(5)合并回收含有較高純度結(jié)構(gòu)相同的萘醌化合物的流份，濃縮蒸干，分離得到紫草萘醌類(lèi)化合物。

本發(fā)明制備分離得到紫草萘醌類(lèi)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如式(ⅰ)所示：

其中，r為oh，化合物為紫草素；

r為h，化合物為去氧紫草素；

r為ococh2ch3，化合物為丙酰紫草素；

r為ococh(ch3)2，化合物為異丁酰紫草素；

r為ocochc(ch3)2，化合物為β,β-二甲基丙烯酰紫草素；

r為ococh2ch(ch3)2，化合物為異戊酰紫草素。

本發(fā)明中，六通閥a，b和c的位置3#和4#孔用接頭封堵，六通閥a和b所連接的儲(chǔ)存環(huán)ⅰ和ⅱ分別由20-50米ptfe內(nèi)徑為1.6mm的管路組成；本發(fā)明的實(shí)施例中優(yōu)選儲(chǔ)存環(huán)ⅰ和ⅱ的管路長(zhǎng)度30米；

本發(fā)明中，正己烷、乙酸乙酯、乙腈和水按照體積比為7:2:8:2混合得到；

本發(fā)明中，泵入固定相的流速為10-50ml/min，泵入流動(dòng)相時(shí)流速為5-20ml/min；

本發(fā)明中，高速逆流色譜的主機(jī)轉(zhuǎn)速為800-1200rpm；本發(fā)明的實(shí)施例中優(yōu)選泵入流動(dòng)相的流速為15ml/min；高速逆流色譜的主機(jī)轉(zhuǎn)速為1200rpm；

本發(fā)明中，操作溫度為25-35℃，優(yōu)選25℃。

本發(fā)明中，使用紫外檢測(cè)器作為高速逆流色譜的檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254-520nm，優(yōu)選波長(zhǎng)為254nm。

本發(fā)明中，萘醌類(lèi)化合物的樣品溶于兩相體系中的濃度為5-20mg/ml。

本發(fā)明采用自動(dòng)流份收集器接收流份；分離完成后，采用高效液相色譜對(duì)分離的流份進(jìn)行檢測(cè)；合并純度較高的含有相同化合物的流份；隨后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，得到萘醌類(lèi)化合物固體；高效液相色譜分析測(cè)得分離得到的單體化合物純度均高于95％。

本發(fā)明首次利用高速逆流色譜結(jié)合在線存儲(chǔ)技術(shù)和連續(xù)循環(huán)洗脫分離純化得到高純度萘醌類(lèi)化合物，該方法操作簡(jiǎn)便，高效快速，且得到化合物純度高。

附圖說(shuō)明

圖1設(shè)置的高速逆流色譜儀結(jié)構(gòu)圖。

圖2實(shí)施例1的高速逆流色譜圖。

圖3實(shí)施例1的樣品和分離得到的萘醌類(lèi)化合物高效液相色譜，其中，(a)，紫草素；(b)，丙酰紫草素；(c)，去氧紫草素；(d)，異丁酰紫草素；(f)，β,β-二甲基丙烯酰紫草素；(g)，異戊酰紫草素。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的實(shí)施并不僅限于此。

實(shí)施例中所用新疆紫草(arnebiaeuchroma(royle)johnst)干燥全草，購(gòu)于上海華宇藥業(yè)有限公司。

下面實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下面實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

(1)本實(shí)施例中對(duì)江陰逆流科技有限公司生產(chǎn)的optichrome-300plus高速逆流色譜儀進(jìn)行改進(jìn)，使用美國(guó)安捷倫有限公司生產(chǎn)的agilent1200hplc高效液相色譜儀進(jìn)行純度分析；

設(shè)置高速逆流色譜儀，其中，高速逆流色譜儀檢測(cè)器后連接流通閥a和b，六通閥a和b分別連接儲(chǔ)存環(huán)ⅰ和ⅱ，恒流泵前連接六通閥c，負(fù)責(zé)切換正常洗脫模式和循環(huán)洗脫模式，(設(shè)置的高速逆流色譜儀結(jié)構(gòu)圖如圖1所示)；

(2)制備提取物樣品

新疆紫草干燥全草54.8g，用二氯甲烷500ml超聲提取三次得提取液，合并提取液并減壓濃縮、蒸干，得到提取物6.20g，置于冰箱(4℃)備用；

(3)制備兩相溶劑體系：將正己烷、乙酸乙酯、乙腈和水按照體積比為7:2:8:2(v:v)充分混勻后，將上下相分層，并分別超聲脫氣20min除氣泡；

(4)制備樣品溶液：將200mg樣品溶于各5ml的上下相溶劑體系中；

(5)高速逆流色譜分離：將固定相以30ml/min的流速泵入到逆流色譜柱中，待固定相充盈整個(gè)色譜柱后開(kāi)啟主機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速1200rpm，待轉(zhuǎn)速達(dá)到設(shè)定速度后，以15ml/min的流速泵入流動(dòng)相；當(dāng)兩相體系在逆流色譜柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，通過(guò)進(jìn)樣六通閥將10ml樣品溶液注入色譜柱內(nèi)；通過(guò)控制六通閥a將流份a儲(chǔ)存于儲(chǔ)存環(huán)ⅰ中；接著通過(guò)控制六通閥b將流份b儲(chǔ)存于儲(chǔ)存環(huán)ⅱ中；在即將洗脫出流份c前，控制六通閥c使儀器進(jìn)入循環(huán)分離模式，經(jīng)過(guò)3個(gè)循環(huán)結(jié)束循環(huán)模式收集流份；完全洗脫完流份c以后控制六通閥a和c泵入流份a進(jìn)行循環(huán)洗脫3次，釋放循環(huán)收集流份；同理，控制六通閥b和c泵入流份b經(jīng)過(guò)兩個(gè)循環(huán)分離，收集流份。分離過(guò)程中使用紫外檢測(cè)器對(duì)流份進(jìn)行檢測(cè)，波長(zhǎng)為254nm，采用色譜工作站對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集處理，同時(shí)采用自動(dòng)流份收集器收集流份，10ml每管；所得到的高速逆流色譜圖如圖2所示，顯示了六個(gè)萘醌單體化合物得到較好的分離；

(6)樣品合并和純度分析：采用高效液相色譜儀對(duì)收集的流份進(jìn)行純度檢測(cè)；色譜分離條件為：色譜柱eclipsexdb-c18column(5μm,250mm×4.6mm,i.d.)，柱溫25℃，流動(dòng)相為乙腈：0.1％的醋酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫(0-5min,40％b；5-10min,40-30％b；10-15min,30-25％；15-25min,25-30％；25-33min,30％；33-42min,40％)，流速為1ml/min，進(jìn)樣量為10μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；合并純度較高的同個(gè)萘醌的流份，隨后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去合并流份中的溶劑，得到如式(ⅰ)所示的萘醌類(lèi)化合物單體；高效液相色譜分析測(cè)得最終分離得到的萘醌類(lèi)化合物的純度均大于95％(如圖3所示)。