背景

抑郁癥是一種常見(jiàn)的精神障礙，威脅世界上數(shù)百萬(wàn)的人。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中神經(jīng)遞質(zhì)血清素不足被認(rèn)為是抑郁癥的重要生理因素。5-羥基色氨酸(5-HTP)在人類(lèi)和動(dòng)物體內(nèi)是血清素的直接生物合成前體。已經(jīng)示出它在治療抑郁癥中是臨床有效的，伴隨相對(duì)少的副作用。在大多數(shù)歐洲國(guó)家，5-HTP是用于多種治療目的的常用的處方藥；然而在北美市場(chǎng)中，將它作為“非處方”的膳食補(bǔ)充劑銷(xiāo)售。

除了抑郁癥，5-HTP已經(jīng)示出在治療失眠、纖維肌痛、肥胖癥、小腦共濟(jì)失調(diào)、慢性頭痛等中是有效的。(博德塞奧(Birdsall)，替代醫(yī)學(xué)評(píng)論(Altern.Med.Rev.)1998:3(4):271-280)，正如在過(guò)去二十年進(jìn)行的研究所證實(shí)的，5-HTP可以在例如以下障礙的治療中具有積極作用：纖維肌痛(卡魯索(Caruso)等人，國(guó)際醫(yī)療研究雜志(J Int Med Res.)1990；18:201-209；普特尼(Puttini)等人，國(guó)際醫(yī)療研究雜志(J Int Med Res.)1992；20:182-189)、失眠(艾特(Attele)等人，替代醫(yī)學(xué)評(píng)論(Altern.Med.Rev.)2000；5(3):249-259)、偏頭痛以及頭痛(里貝羅(Ribeiro)，2000年6月；40(6):451-6)、進(jìn)食障礙例如多食癥(坎賈諾(Cangiano)等人，肥胖相關(guān)的代謝紊亂國(guó)際雜志(Int J Obes Relat Metab Disord.)1998；22:648-654；莎茜(Ceci)等人，神經(jīng)傳遞雜志(J Neural Transm.)1989；76:109-117)(作為管理肥胖癥和糖尿病的輔助手段)、以及熱潮(柯西奧(Curcio)等人，替代醫(yī)學(xué)評(píng)論(Altern.Med.Rev.)2005；10(3):216-21；弗里德曼(Freedman)，歐洲更年期雜志(Maturitas.)2010年4月；65(4):383-5)。

5-HTP還被認(rèn)為是一種潛在的農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物的飼料添加劑，是抵抗牛的乳腺炎(杰瑞(Jury)等人，公共科學(xué)圖書(shū)館綜合(PLoS One.)2015年2月17；10(2):e0117339；派(Pai)等人，國(guó)際生物醫(yī)學(xué)研究(Biomed Res Int.)2015；2015:364746；豪斯曼(Horseman)等人，動(dòng)物生物科學(xué)年度評(píng)論(Annu Rev Anim Biosci.)2014年2月2:353-74)，以及在哺乳動(dòng)物的泌乳功能調(diào)節(jié)(馬歇爾(Marshall)等人，乳腺腫瘤生物學(xué)(J Mammary Gland Biol Neoplasia.)2014年3月；19(1):139-46；科利爾(Collier)等人，家畜內(nèi)分泌學(xué)(Domest Anim Endocrinol.)2012年8月；43(2):161-70；赫爾南德斯(Hernandez)等人，內(nèi)分泌學(xué)雜志(J Endocrinol.)2009年10月；203(1):123-31)中的一種預(yù)防性或者治療性藥劑，這樣5-HTP具有大的潛力以增加所述動(dòng)物的乳產(chǎn)量。在某些禽類(lèi)中(例如：雞)，5-HTP顯現(xiàn)與晝夜周期調(diào)節(jié)(托馬斯(Thomas)等人，細(xì)胞與分子神經(jīng)生物學(xué)(Cell.Mol.Neurobiol.)1991,11(5):511-527)以及其他的積極健康效應(yīng)(莫內(nèi)瓦(Moneva)等人，保加利亞農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志(Bulgarian J.Ag Sci.)2008 14(4):424-431)相關(guān)聯(lián)，在動(dòng)物生長(zhǎng)和生產(chǎn)能力中有積極影響。

目前，5-HTP通過(guò)從加納籽的種子中提取而產(chǎn)生，它是生長(zhǎng)在非洲的木本的攀緣灌木。該原材料的供應(yīng)依賴(lài)于季節(jié)和地區(qū)，已限制其有成本效益的生產(chǎn)和廣泛的臨床應(yīng)用。此外，來(lái)自加納籽的5-HTP被一種稱(chēng)為頂峰X(qián)的化合物污染，導(dǎo)致USDA暫時(shí)地令該補(bǔ)充劑在美國(guó)下架。

目前，5-HTP的大宗批發(fā)價(jià)格在400到1000美元/kg之間變動(dòng)。盡管當(dāng)前的生產(chǎn)成本高而且供應(yīng)有限，5-HTP的全球市場(chǎng)仍然約120,000kg(整批價(jià)值50-100百萬(wàn)美元)，每年的增長(zhǎng)率為大約7％。5-HTP終產(chǎn)物甚至更貴，并且終產(chǎn)物的零售市場(chǎng)價(jià)值更高。

在2012年，北美代表約48％的市場(chǎng)，隨后是歐洲和亞太地區(qū)，主要的市場(chǎng)細(xì)分是人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。正在出現(xiàn)的市場(chǎng)細(xì)分(例如：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，人類(lèi)治療輔佐劑)可能以比預(yù)測(cè)的非處方人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物快得多的速度增長(zhǎng)。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了可用于微生物生產(chǎn)5-羥基色氨酸(5-HTP)(血清素(5-羥色胺)的前體)的化合物、組合物以及方法。將宿主菌進(jìn)行代謝工程改造以表達(dá)非天然存在的酶，該酶催化色氨酸經(jīng)由色氨酸的5-羥基化作用向5-HTP的轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是過(guò)度產(chǎn)生起始原料色氨酸的細(xì)胞。任選地，將該宿主細(xì)胞進(jìn)一步工程化以包括輔因子再生機(jī)制，允許在不補(bǔ)充外源輔因子的情況下連續(xù)產(chǎn)生5-HTP。本發(fā)明可以導(dǎo)致5-HTP的改進(jìn)的滴度并且允許低成本、大規(guī)模的生產(chǎn)，而不限于補(bǔ)充前體或輔酶。

在一個(gè)方面，該發(fā)明包括基因工程化的微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或酵母細(xì)胞，該基因工程化的微生物細(xì)胞包括細(xì)菌的苯丙氨酸-4-羥化酶(P4H)，已將此酶進(jìn)行修飾以示出與相應(yīng)的野生型P4H相比對(duì)色氨酸增加的親和性。該修飾的細(xì)菌酶可以基于或衍生自例如來(lái)自假單胞菌屬(Pseudomonas)、色桿菌屬(Chromobacterium)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)或黃單胞菌(Xanthomonas)的P4H。在一個(gè)實(shí)施例中，修飾的細(xì)菌P4H包括野油菜黃單胞菌P4H的氨基酸位置98、179以及231中的任何一個(gè)、任何兩個(gè)或全部三個(gè)處的氨基酸突變，或者在來(lái)自另一個(gè)物種(優(yōu)選是細(xì)菌物種)的細(xì)菌P4H酶中的任何一個(gè)、任何兩個(gè)或全部三個(gè)相應(yīng)氨基酸位置處的氨基酸突變(參見(jiàn)例如圖5F)。氨基酸突變的例子包括選自下組的任何一個(gè)、任何兩個(gè)或全部三個(gè)突變，該組由以下各項(xiàng)組成：L98Y、W179F和Y231C(根據(jù)野油菜黃單胞菌P4H氨基酸序列編號(hào))。示例的修飾的苯丙氨酸-4-羥化酶(P4H)是至少并入突變W179F的野油菜黃單胞菌的苯丙氨酸-4-羥化酶。任選的，修飾的細(xì)菌P4H進(jìn)一步包括至少一個(gè)另外的突變，該另外的突變是相應(yīng)于野油菜黃單胞菌P4H的氨基酸位置85、223和282的任何一個(gè)、任何兩個(gè)或全部三個(gè)的位置處，或者在來(lái)自另一個(gè)物種(優(yōu)選細(xì)菌物種)的細(xì)菌P4H酶中的任何一個(gè)、任何兩個(gè)或全部三個(gè)相應(yīng)氨基酸位置處。

任選的，該基因工程化的細(xì)菌或酵母細(xì)胞是已經(jīng)被基因工程化以過(guò)度產(chǎn)生或積累色氨酸的細(xì)胞。

任選的，該基因工程化的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包括輔因子再循環(huán)系統(tǒng)，該輔因子再循環(huán)系統(tǒng)包括喋呤-4α-甲醇胺脫水酶(PCD)和二氫單喋呤還原酶(dihydromonapterin reductase enzyme，DHMR)中的至少一個(gè)。優(yōu)選地，該細(xì)胞包括喋呤-4α-甲醇胺脫水酶(PCD)和二氫單喋呤還原酶(DHMR)二者。在一個(gè)實(shí)施例中，二氫單喋呤還原酶(DHMR)是由大腸桿菌基因folM編碼。

基因工程化的細(xì)菌或酵母細(xì)胞可以包括編碼修飾的P4H、PCD和/或DHMR酶中任一個(gè)或全部的一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒。這些酶可以由分開(kāi)的質(zhì)粒編碼，或兩種或更多種酶可以由同一質(zhì)粒編碼。在一些實(shí)施例中，基因工程化的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包括第一質(zhì)粒，該第一質(zhì)粒包括可操作地編碼修飾的細(xì)菌P4H、以及喋呤-4α-甲醇胺脫水酶(PCD)和二氫單喋呤還原酶(DHMR)中的一個(gè)或兩個(gè)的多核苷酸。該第一質(zhì)?？梢允堑汀⒅谢蚋呖截悢?shù)質(zhì)粒，并且優(yōu)選地是中拷貝數(shù)質(zhì)粒。任選地，該基因工程化細(xì)胞包含一第二質(zhì)粒，該第二質(zhì)粒包括可操作地編碼trp操縱子的全部或部分的多核苷酸，以便導(dǎo)致底物色氨酸的過(guò)度產(chǎn)生和/或積累。該第二質(zhì)?？梢允堑?、中或高拷貝數(shù)質(zhì)粒，并且優(yōu)選地是低拷貝數(shù)質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施例中，該trp操縱子或其部分可以包括在TrpE基因中的突變S40F。

在一些實(shí)施例中，該基因工程化的細(xì)菌細(xì)胞不包括四氫生物喋呤(BH4)輔因子。在其他實(shí)施例中，該基因工程化的細(xì)菌細(xì)胞包括內(nèi)源的四氫生物喋呤(BH4)。另外地或可替代地，該基因工程化的細(xì)菌細(xì)胞可以包括內(nèi)源的四氫單喋呤(MH4)輔因子。

示例性基因工程化的細(xì)菌細(xì)胞包括基因工程化的大腸桿菌細(xì)胞、基因工程化的枯草芽孢桿菌細(xì)胞、或基因工程化的谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞。

制造和使用這些基因工程化細(xì)胞的方法也被包含在本發(fā)明中。

在另一方面，本發(fā)明包括制造5-羥基色氨酸(5-HTP)的方法。該方法涉及在一定條件下以及持續(xù)足以產(chǎn)生5-HTP的時(shí)間來(lái)培養(yǎng)本發(fā)明的基因工程化的微生物細(xì)胞(優(yōu)選基因工程化的細(xì)菌細(xì)胞)。任選地，可以將5-HTP進(jìn)行分離和/或純化。該方法可以進(jìn)一步包含將5-HTP并入食物產(chǎn)品中。該食物產(chǎn)品可以適合人類(lèi)食用和/或可以是動(dòng)物飼料或飲料。該方法可以包含包裝5-HTP或供出售的食物產(chǎn)品并且可任選地向作為食品添加劑、食品補(bǔ)充劑或營(yíng)養(yǎng)食品的5-HTP或食物產(chǎn)品提供使用說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施例中，該食品添加劑、食品補(bǔ)充劑或營(yíng)養(yǎng)食品被包裝作為動(dòng)物飼料或飲料使用。

詞語(yǔ)“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”指可以在某些環(huán)境下提供某些益處的本發(fā)明實(shí)施例。然而，在相同或其他環(huán)境下，其他實(shí)施例也可以是優(yōu)選的。另外，對(duì)一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的描述不暗示其他實(shí)施例是無(wú)用的，并且不意圖從本發(fā)明的范圍中排除其他實(shí)施例。

術(shù)語(yǔ)“包括”及其變體，在這些術(shù)語(yǔ)在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中出現(xiàn)的情況下，不具有限制性含義。

除非另外說(shuō)明，“一個(gè)(a)”、“一種(an)”、“該(the)”、和“至少一個(gè)(at least one)”可互換地使用并且意指一個(gè)或多于一個(gè)。

并且在此，通過(guò)端點(diǎn)詳述的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所歸納的所有數(shù)值(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

對(duì)于本文中披露的、包括分離步驟的任何方法，這些步驟可以按任何可行順序?qū)嵤?。并且，如果適宜，兩個(gè)或更多個(gè)步驟的任何組合可以同時(shí)實(shí)施。

本發(fā)明的以上概述不意在描述本發(fā)明的每個(gè)所披露的實(shí)施例或每一個(gè)實(shí)施方式。以下本說(shuō)明書(shū)更加具體地示例了示意性實(shí)施例。貫穿本申請(qǐng)，在幾個(gè)地方中，通過(guò)一系列實(shí)例提供指導(dǎo)，這些實(shí)例能以多種組合形式使用。在每種情況下，所述系列僅作為代表性群組發(fā)揮作用并且不應(yīng)當(dāng)解釋為排他性系列。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1示出原核的苯丙氨酸-4-羥化酶(P4H)和動(dòng)物的芳香族氨基酸羥化酶(AAAH)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；使用ClustalX 2.1進(jìn)行蛋白序列比對(duì)；使用鄰接法用MEGA 5.02構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)；拔靴法(bootstrapping method)用于系統(tǒng)進(jìn)化測(cè)試(1000次重復(fù))；與分支相關(guān)聯(lián)的數(shù)字指代代表每個(gè)氨基酸殘基取代頻率的自展值。

圖2示出(A)原核的P4H活性在大腸桿菌中的重建；其中黑色和灰色的箭頭分別指示大腸桿菌天然途徑和異源反應(yīng)；加粗箭頭指代過(guò)表達(dá)步驟；灰色框指示被引入的MH4再循環(huán)系統(tǒng)，并且縮寫(xiě)如下：GTP，鳥(niǎo)嘌呤核苷-5'-三磷酸；PCD，喋呤-4α-甲醇胺脫水酶；DMHR，二氫單喋呤還原酶；P4H，苯丙氨酸-4-羥化酶；以及(B)修飾的細(xì)菌的P4H活性引入(A)的大腸桿菌中，進(jìn)一步允許5-羥基色氨酸(5-HTP)從例如糖類(lèi)的簡(jiǎn)單碳源的從頭生產(chǎn)。

圖3示出XcP4H通過(guò)蛋白工程的修飾；(A)，在XcP4H(L98、W179和Y231)、來(lái)自人類(lèi)的P4H(HumP4H；PDB條目1MMK)以及來(lái)自人類(lèi)的T5H1(HumT5H；PDB條目3HF6)結(jié)構(gòu)中3個(gè)關(guān)鍵殘基的位置的比較性說(shuō)明；(B)，野生XcP4H和其突變體的體內(nèi)活性，其中灰色和黑色條分別指示對(duì)色氨酸和苯丙氨酸的活性；(C)，色氨酸向5-HTP的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化，其中實(shí)線(xiàn)和虛線(xiàn)分別指示5-HTP生產(chǎn)和細(xì)胞密度的時(shí)間歷程，并且黑色和灰色的線(xiàn)分別指示在30℃和37℃下的特征，并且其中所有的數(shù)據(jù)均報(bào)告為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±s.d.并且誤差棒定義為s.d.。

圖4示出5-HTP從葡萄糖的從頭生產(chǎn)；(A)，完整的5-HTP生物合成途徑的示意圖，其中黑色和灰色箭頭分別指示大腸桿菌天然途徑和異源反應(yīng)；(B)在30℃和37℃下色氨酸從葡萄糖的生產(chǎn)，其中數(shù)據(jù)報(bào)告為兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±s.d.；(C)，兩種宿主菌株BWΔtnaA(灰色)和QH4ΔtnaA(黑色)的細(xì)胞生長(zhǎng)和5-HTP從葡萄糖生產(chǎn)的曲線(xiàn)，其中所有的數(shù)據(jù)均報(bào)告為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±s.d.并且誤差棒定義為s.d.。

圖5示出(A)，來(lái)自銅綠假單胞菌的P4H的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)(B)，來(lái)自熒光假單胞菌的P4H的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)；(C)來(lái)自惡臭假單胞菌的P4H的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)；(D)，來(lái)自富養(yǎng)羅爾斯通氏菌的P4H的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)；(E)，來(lái)自野油菜黃單胞菌的P4H的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，其中從(A)到(E)，*指代蛋白序列的結(jié)束；(F)來(lái)自銅綠假單胞菌(SEQ ID NO:2)、熒光假單胞菌(SEQ ID NO:3)、惡臭假單胞菌(SEQ ID NO:4)、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(SEQ ID NO:5)和野油菜黃單胞菌(SEQ ID NO:1)的P4H酶的氨基酸序列比對(duì)，其中括號(hào)[]指示從序列的圖形描述中省略的氨基酸的數(shù)量以有利于比對(duì)，包括在序列結(jié)尾的終止標(biāo)志符*，并且其中候選突變位點(diǎn)在L98、W179和Y231處指示出(框中的殘基)，根據(jù)野油菜黃單胞菌的P4H序列編號(hào)；(G)動(dòng)物AAAH智人T5H2(SEQ ID NO:6)，小家鼠T5H2(SEQ ID NO:7)，原雞T5H2(SEQ ID NO:8)，家牛T5H1(SEQ ID NO:9)，智人T5H1(SEQ ID NO:10)，小家鼠T5H1(SEQ ID NO:11)；原雞T5H1(SEQ ID NO:12)，智人P4H(SEQ ID NO:13)，家兔P4H(SEQ ID NO:14)，小家鼠P4H(SEQ ID NO:15)，家牛P4H(SEQ ID NO:16)，原雞P4H(SEQ ID NO:17)；以及XcP4H(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列比對(duì)；被圈住的箭頭指示如在(F)中的在L98、W179和Y231處的候選突變位點(diǎn)；未被圈住的箭頭指示在相應(yīng)于野油菜黃單胞菌Q85、L223、以及L282的氨基酸位置處的另外的候選突變位點(diǎn)。

說(shuō)明性實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明

本發(fā)明提供了可用于微生物生產(chǎn)5-羥基色氨酸(5-HTP)的化合物、組合物以及方法。本發(fā)明涉及代謝工程改造微生物宿主細(xì)胞以表達(dá)非天然存在的羥化酶，該羥化酶優(yōu)選是微生物來(lái)源的，其催化色氨酸經(jīng)由色氨酸的5-羥基化作用向5-HTP轉(zhuǎn)化。當(dāng)基因工程針對(duì)代謝途徑的擾動(dòng)或改變從而引起細(xì)胞的新陳代謝的改變時(shí)，基因工程化的細(xì)胞在此稱(chēng)為“代謝工程化的”細(xì)胞。

優(yōu)選的微生物宿主細(xì)胞是過(guò)度生產(chǎn)起始材料色氨酸的細(xì)胞。任選地，將該微生物宿主細(xì)胞進(jìn)一步工程化以包括輔因子再生機(jī)制，這樣允許在不補(bǔ)充外源輔因子的情況下連續(xù)產(chǎn)生5-HTP。

催化色氨酸經(jīng)由色氨酸的5-羥基化作用向5-HTP的轉(zhuǎn)化的微生物酶(稱(chēng)為色氨酸羥化酶，“TPH”或“T5H”酶)尚未已知。一些動(dòng)物具有能夠催化這個(gè)反應(yīng)的色氨酸羥化酶(使用喋呤輔因子，典型地四氫生物喋呤，還稱(chēng)為“B4H”)；然而由于例如低溶解度、低穩(wěn)定性、以及翻譯后修飾機(jī)制的無(wú)效或缺乏等因素，已證明在微生物系統(tǒng)中真核5-羥化酶的表達(dá)是有問(wèn)題的。一些微生物具有催化苯丙氨酸向酪氨酸轉(zhuǎn)化的4-羥化酶(“P4H”酶)，但是該酶對(duì)底物色氨酸具有很少或沒(méi)有5-羥化酶活性。

本發(fā)明的這種獨(dú)特的生物技術(shù)生產(chǎn)過(guò)程結(jié)合蛋白質(zhì)工程和代謝工程以實(shí)現(xiàn)5-HTP的微生物生產(chǎn)。利用例如定點(diǎn)突變的蛋白質(zhì)工程以產(chǎn)生一種有效的、非天然存在的有效地催化色氨酸向5-HTP轉(zhuǎn)化的羥化酶，使用一種天然存在的微生物酶如苯丙氨酸-4-羥化酶(P4H)的定點(diǎn)突變。將突變的天然存在的微生物酶在此稱(chēng)為“修飾的”酶，例如修飾的細(xì)菌苯丙氨酸-4-羥化酶(P4H)?！把苌浴碧囟ㄉ锏男揎椀拿敢庵敢环N已經(jīng)通過(guò)突變由該生物所產(chǎn)生的野生型酶的氨基酸序列，例如通過(guò)在特定氨基酸位置處的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)突變而創(chuàng)造的修飾的酶。該工程化或“修飾的”微生物來(lái)源酶比它的真核生物中相對(duì)應(yīng)的酶更適于在微生物宿主細(xì)胞中使用。使用代謝工程以改變涉及細(xì)胞內(nèi)色氨酸生產(chǎn)或積累的一種或多種代謝途徑，和/或以將異源輔因子再生系統(tǒng)并入宿主細(xì)胞中。能通過(guò)異源輔因子再生系統(tǒng)再循環(huán)的細(xì)菌輔因子包括四氫喋呤，如四氫單喋呤(MH4)和四氫生物喋呤(BH4)。例如四氫單喋呤(MH4)輔因子再生系統(tǒng)并入大腸桿菌細(xì)胞中允許內(nèi)源的大腸桿菌MH4用作有效的氫供體。

本發(fā)明提供了有成本效益的用于從廉價(jià)碳源例如色氨酸和葡萄糖有效生產(chǎn)5-HTP的微生物方法。預(yù)期該技術(shù)可以促進(jìn)生物催化平臺(tái)的構(gòu)建以將廉價(jià)的原料轉(zhuǎn)化為高純度的產(chǎn)物5-HTP，這與常規(guī)的提取方法相比將顯著降低其生產(chǎn)成本，極大地改善其對(duì)于未經(jīng)良好治療病人的可用性，以及進(jìn)一步擴(kuò)大其市場(chǎng)。

宿主細(xì)胞

本發(fā)明使得在宿主細(xì)胞(優(yōu)選如細(xì)菌或酵母細(xì)胞的微生物宿主細(xì)胞)中的5-HTP的生產(chǎn)成為可能。典型的細(xì)菌宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、芽孢桿菌屬(如枯草芽孢桿菌)、乳桿菌屬(如嗜酸乳桿菌)、雙歧桿菌屬以及棒狀桿菌屬(如谷氨酸棒狀桿菌)。示例性的酵母細(xì)胞包括來(lái)自酵母菌屬(例如，釀酒酵母)和畢赤酵母屬的酵母菌。酵母細(xì)胞可以包含內(nèi)源輔因子，BH4；在某些實(shí)施例中，除在此描述的MH4輔因子再循環(huán)系統(tǒng)外或代替MH4輔因子再循環(huán)系統(tǒng)，將BH4輔因子再循環(huán)系統(tǒng)引入宿主酵母細(xì)胞中。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了將細(xì)菌P4H活性通過(guò)引入來(lái)自不同微生物(例如，并且不限于假單胞菌屬、色桿菌屬、羅爾斯通氏菌屬或黃單胞菌屬)的修飾的細(xì)菌P4H而向細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌(尚未示出包含天然的P4H酶)的引入，其中修飾的酶有利地或出人意料地能夠利用大腸桿菌內(nèi)源輔因子MH4(典型地，該喋呤輔因子BH4與AAAH酶是相關(guān)聯(lián)的)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，將大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)一步工程化以包含如在此描述的用以再循環(huán)MH4的再循環(huán)系統(tǒng)。

任選地，將宿主細(xì)胞基因工程化以增加細(xì)胞內(nèi)的色氨酸的含量，即過(guò)度產(chǎn)生和/或積累用于5-HTP生物合成的起始材料色氨酸。5-HTP的過(guò)度產(chǎn)生或積累可以通過(guò)各種方法實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施例中，色氨酸的過(guò)度產(chǎn)生或積累可以通過(guò)敲除參與色氨酸降解的一種或多種酶實(shí)現(xiàn)。例如，細(xì)胞中色氨酸的量可以通過(guò)敲除色氨酸酶(tnaA)的基因增加，已報(bào)道該色氨酸酶是一種催化色氨酸和5-HTP降解的蛋白。可替代地或另外地，可以將pheA、pheLA、和/或tyrA下調(diào)或敲除以增加細(xì)胞內(nèi)色氨酸的含量。

在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)增加色氨酸的生物合成可以實(shí)現(xiàn)色氨酸的過(guò)度產(chǎn)生或積累。例如，可以將宿主細(xì)胞工程化以過(guò)表達(dá)trp操縱子或其部分。當(dāng)基因產(chǎn)物在代謝工程化的細(xì)胞中表達(dá)水平高于其在可比的野生型細(xì)胞中的表達(dá)水平時(shí)，基因產(chǎn)物例如酶或調(diào)節(jié)蛋白在代謝工程化的細(xì)胞中“過(guò)表達(dá)”。在并非內(nèi)源性地表達(dá)具體基因產(chǎn)物的細(xì)胞中，該基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的任何表達(dá)水平被視為該基因產(chǎn)物為了本發(fā)明的目的的“過(guò)表達(dá)”。典型地，作為從trp操縱子過(guò)表達(dá)一種或多種基因產(chǎn)物的手段，將trp操縱子的另外拷貝以質(zhì)粒、粘?；蚱渌鸇NA或RNA載體引入細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施例中，將宿主細(xì)胞工程化以過(guò)表達(dá)完整的trp操縱子，包括trpEDCBA。在另一個(gè)實(shí)施例中，將宿主細(xì)胞工程化以過(guò)表達(dá)trp操縱子的僅部分，例如trp ED或trpE。

任選地，將trp操縱子工程化以減少或消除反饋抑制。例如，在氨基酸位置S40處的突變(例如，突變S40F)可以并入TrpE中以減少或消除反饋抑制。

在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)改變宿主細(xì)胞的內(nèi)源性色氨酸表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)色氨酸的過(guò)度產(chǎn)生或積累。例如，色氨酸的過(guò)度產(chǎn)生或積累可以通過(guò)改變色氨酸轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白(TrpR)的表達(dá)、使該色氨酸轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白下調(diào)或失活來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)過(guò)度產(chǎn)生色氨酸生物合成前體例如分支酸可以實(shí)現(xiàn)色氨酸的過(guò)度產(chǎn)生或積累?？梢詫⑺拗骷?xì)胞工程化以表達(dá)或過(guò)表達(dá)增加分支酸利用度的一種或多種酶。在分支酸的生產(chǎn)中已知并能操縱幾個(gè)限速步驟以產(chǎn)生生產(chǎn)更多分支酸的微生物。增加碳流向分支酸的酶包括例如莽草酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、轉(zhuǎn)羥乙醛酶、以及3-脫氧-D-阿拉伯糖基-庚酮糖酸-7-磷酸合酶，優(yōu)選地是反饋-抑制抗性的3-脫氧-D-阿拉伯糖基-庚酮糖酸-7-磷酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶、以及分支酸合酶。酶的例子包括但不限于AroL、AroF、AroH、AroG、PpsA、以及TktA。在一些實(shí)施例中，AroL、AroF、AroH、AroG酶中的一個(gè)或多個(gè)可以處于反饋-抑制抗性(fbr)的酶的形式。編碼優(yōu)選的酶的示例多核苷酸分別是aroL、ppsA、tktA、以及aroG^fbr。在一個(gè)實(shí)施例中，大腸桿菌宿主細(xì)胞可以表達(dá)aroL、ppsA、tktA、以及aroG^fbr以增加分支酸利用度。示例的酶還描述于林(Lin)等人，代謝工程(Metab Eng.)2014,23:62-9；林(Lin)等人,自然通訊(Nat.Commun.)2013,4:2603；以及2014年12月18日出版的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2014/0370557中；將這些文獻(xiàn)各自通過(guò)引用結(jié)合在此。

在另一個(gè)實(shí)施例中，色氨酸的過(guò)度產(chǎn)生或積累可以通過(guò)色氨酸轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白(TrpR)的失活來(lái)實(shí)現(xiàn)。在再另一個(gè)實(shí)施例中，色氨酸的過(guò)度產(chǎn)生或積累可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白TrpR的失活來(lái)實(shí)現(xiàn)。

可以使用任何已知的用于色氨酸過(guò)度生產(chǎn)或積累的方法，包括例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,756,345和中國(guó)專(zhuān)利CN 102453691B中描述的方法；還參見(jiàn)趙(Zhao)等人，工業(yè)微生物學(xué)和生物技術(shù)雜志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.),2011,39:1921-1929。

任選地，可以組合一種或多種過(guò)度產(chǎn)生或積累技術(shù)。例如，可以敲除色氨酸降解途徑，而宿主細(xì)胞可以過(guò)表達(dá)整個(gè)trp操縱子。作為另一個(gè)例子，宿主細(xì)胞可以過(guò)表達(dá)完整的trp操縱子以及用以增加色氨酸前體分支酸的產(chǎn)生的一種或多種酶。當(dāng)將宿主細(xì)胞工程化以表達(dá)或過(guò)表達(dá)多種酶時(shí)，可以使用如一個(gè)質(zhì)粒的單一外源構(gòu)建體或者可以使用如多個(gè)質(zhì)粒的多個(gè)外源構(gòu)建體，如在此更詳細(xì)地描述的?？商娲鼗蛄硗獾?，基因工程可以通過(guò)使用染色體添加、缺失或突變來(lái)完成。

工程化的羥化酶

在本發(fā)明中，有利地使用修飾的細(xì)菌羥化酶而不是真核生物羥化酶(參見(jiàn)例如WO 2013127914A1)以催化色氨酸向5-HTP的轉(zhuǎn)化。在細(xì)菌宿主細(xì)胞中修飾的細(xì)菌羥化酶的使用允許可以包含MH4和/或BH4的內(nèi)源細(xì)菌輔因子的使用，并且可以避免與使用真核生物酶相關(guān)聯(lián)的限制，包括低溶解度、低穩(wěn)定性以及翻譯后修飾機(jī)制和/或輔因子的失效或缺乏(參見(jiàn)，例如麥金尼(McKinney)等人，(2004)，蛋白表達(dá)和純化(Protein Expr.Purif.)33(2):185-194；馬丁內(nèi)斯(Martinez)等人，(2001)現(xiàn)代醫(yī)藥化學(xué)(Curr.Med.Chem.)8(9):1077-1091)。相比于已經(jīng)截短以改進(jìn)溶解度的動(dòng)物5-羥化酶(參見(jiàn)例如WO 2013/127914A1)，本發(fā)明的修飾的細(xì)菌4-羥化酶證實(shí)了增加的催化效率。

天然存在的細(xì)菌苯丙氨酸-4-羥化酶(P4H)具有對(duì)色氨酸的很少的活性。本發(fā)明涉及細(xì)菌羥化酶在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，優(yōu)選4-羥化酶，更優(yōu)選已經(jīng)經(jīng)修飾以增加對(duì)底物色氨酸的5-羥化酶活性的苯丙氨酸4-羥化酶。優(yōu)選地，通過(guò)定點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)修飾。不是所有的細(xì)菌都包含P4H酶，但是可以根據(jù)本發(fā)明將任何細(xì)菌P4H酶進(jìn)行修飾以提高它對(duì)色氨酸的活性?？梢愿鶕?jù)該發(fā)明進(jìn)行修飾以提高其對(duì)色氨酸活性的適合的細(xì)菌P4H酶包括而不限于來(lái)自假單胞菌屬、色桿菌屬、羅爾斯通氏菌屬、伯克氏菌屬、黃單胞菌屬、芽孢桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、胞菌屬(Arenimonas)、溶桿菌屬、戴氏菌屬(Dyella)、羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter)、貪銅菌屬、鞘脂菌屬、極單胞菌屬、云母弧菌屬(Micavibrio)、柄細(xì)菌屬等的P4H酶。典型的物種包括紫色色桿菌、惡臭假單胞菌、防御假單胞菌、銅綠假單胞菌、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌、類(lèi)鼻疽伯克氏菌、野油菜黃單胞菌以及蠟樣芽孢桿菌。優(yōu)選的細(xì)菌P4H酶包括來(lái)自銅綠假單胞菌(PaP4H)、惡臭假單胞菌(PpP4H)、熒光假單胞菌(PfP4H)、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(ReP4H)、以及野油菜黃單胞菌(XcP4H)的那些。優(yōu)選的細(xì)菌P4H酶是XcP4H。細(xì)菌P4H可以由基因phhA編碼。

細(xì)菌P4H酶在一個(gè)或多個(gè)殘基處突變以產(chǎn)生對(duì)色氨酸有更大活性的修飾的P4H酶。例如，XcP4H可以在殘基W179、L98、Y231、Q85、L223、和/或L282處突變。在一個(gè)實(shí)施例中，XcP4H在殘基W179、L98、以及Y231處突變。在其他實(shí)施例中，XcP4H只在單一殘基處，例如只在殘基W179處、只在殘基L98處或只在殘基Y231處突變。在其他實(shí)施例中，XcP4H在兩個(gè)或更多個(gè)殘基處，例如在殘基W179和L98處；或在W179和Y231處；或在L98和Y231處突變。在優(yōu)選的實(shí)施例中，W179被氨基酸苯丙氨酸(F)替代。在另一個(gè)實(shí)施例中，L98被酪氨酸(Y)替代。在再另一個(gè)實(shí)施例中，Y231被半胱氨酸(C)替代。在一個(gè)實(shí)施例中，XcP4H包括在下列殘基處的每一個(gè)處的突變：W179F、L98Y、和Y231C。在其他實(shí)施例中，XcP4H包括下列突變：W179F和L98Y；或W179F和Y231C；或L98Y和Y231C。還可以將在細(xì)菌P4H酶PaP4H、PpP4H、PfP4H、和ReP4H(參見(jiàn)例如圖5F)或任何其他的微生物或動(dòng)物P4H酶(參見(jiàn)例如圖5G)中的一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)殘基在一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)氨基酸位置處突變以產(chǎn)生對(duì)色氨酸有增強(qiáng)的偏好性的修飾的P4H酶。優(yōu)選地，將細(xì)菌P4H酶(由在圖5F中的序列舉例說(shuō)明)修飾以生成修飾的P4H酶。然而，還可以使用動(dòng)物的酶。圖5G示出和來(lái)自野油菜黃單胞菌的細(xì)菌P4H比對(duì)的示例性動(dòng)物P4H和T5H氨基酸序列；相應(yīng)于XcP4H位置W179、L98Y、和Y231C的氨基酸位置用被圈住的箭頭指示，并且相應(yīng)于XcP4H位置Q85、L223、和L282的氨基酸位置用未被圈住的箭頭指示。這些位置中的任意一個(gè)、一些或全部是用于突變以產(chǎn)生本發(fā)明的修飾的P4H酶的候選點(diǎn)。

輔因子再循環(huán)

任選地，本發(fā)明進(jìn)一步為修飾的P4H酶提供了輔因子的增加的生產(chǎn)和/或再循環(huán)。該輔因子可以是喋呤，例如四氫生物喋呤(BH4)或四氫單喋呤(MH4)。優(yōu)選地，修飾的P4H酶使用的輔因子對(duì)于宿主細(xì)胞是內(nèi)源的。在優(yōu)選的實(shí)施例中，輔因子是細(xì)菌MH4，例如大腸桿菌MH4。

有利地，可以將輔因子再生機(jī)制引入宿主細(xì)胞中以促進(jìn)內(nèi)源喋呤輔因子(例如MH4或BH4)的再循環(huán)并且由此促進(jìn)增加的5-HTP的過(guò)度產(chǎn)生或積累。為此，優(yōu)選地將宿主細(xì)胞工程化以表達(dá)喋呤4α-甲醇胺脫水酶(PCD)、二氫單喋呤還原酶(DHMR)或兩者，以便允許被P4H酶使用的MH4或BH4喋呤輔因子的再循環(huán)。該P(yáng)CD和/或DHMR酶對(duì)于宿主細(xì)胞可以是天然的(在這種情況中將細(xì)胞工程化以過(guò)表達(dá)該酶)或者它們對(duì)于宿主細(xì)胞可以是異源的(外來(lái)的)。在某些實(shí)施例中，這些酶中的一個(gè)是天然的，另一個(gè)是外源的。這些酶優(yōu)選地是細(xì)菌的酶，但可以是真核生物的酶。優(yōu)選的PCD是來(lái)自銅綠假單胞菌，但是適合的PCD可以從任何便利的原核生物或真核生物中獲得，優(yōu)選地是從具有內(nèi)源P4H酶的細(xì)菌或酵母中獲得。優(yōu)選的DHMR是來(lái)自大腸桿菌，但是適合的DHMR可以從任何原核生物或真核生物中獲得。

質(zhì)粒

修飾的細(xì)菌P4H酶、任選的涉及再循環(huán)其輔因子的酶、以及任選的trp操縱子或trp操縱子的部分以及任何其他感興趣的酶可以通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)包含可操作地編碼該一種或多種酶的多核苷酸的質(zhì)粒來(lái)在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或過(guò)表達(dá)。適合的示例性質(zhì)粒描述于實(shí)例1中，并且包含但不限于pZE12-luc、pCS27、和pSA74。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解也可以使用具有不同啟動(dòng)子、抗生素抗性、以及復(fù)制起點(diǎn)(ori)的另外的質(zhì)粒。

此外，應(yīng)該指出，如果希望的話(huà)，使用熟知的基因工程技術(shù)和方案，可操作地編碼在此描述的酶的任何或所有核苷酸序列可以代之以基因水平上整合到細(xì)菌的基因組。

質(zhì)?？梢允歉呖截悢?shù)、中拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。盡管與本領(lǐng)域公認(rèn)的命名“高”、“中”、以及“低”拷貝數(shù)有關(guān)的邊界是不同并且在實(shí)踐中可能重疊，一般而言，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒的特征是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)，例如，大于50或60拷貝，中拷貝數(shù)的質(zhì)粒的特征是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)，例如，10和60之間的拷貝(例如，15-20拷貝)，而低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的特征是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)，例如，小于10或15拷貝(例如，3-8拷貝)。質(zhì)粒pZE12-luc、pCS27、pSA74分別舉例說(shuō)明了高、中和低拷貝數(shù)質(zhì)粒。在一些實(shí)施例中，pZE12-luc具有大約60-70的拷貝數(shù)，pCS27具有大約15-20的拷貝數(shù)，并且pSA74具有大約5-10的拷貝數(shù)。

P4H，優(yōu)選修飾的P4H的表達(dá)可以通過(guò)將質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)，該質(zhì)粒包括編碼修飾的P4H的phhA，優(yōu)選地phhA已經(jīng)突變以編碼對(duì)底物色氨酸有更大活性的修飾的P4H，如在此所述。編碼修飾的P4H的phhA可以從任何合適的生物中獲得，例如像而不限于如在此描述的銅綠假單胞菌(圖5A，SEQ ID NO:2)、熒光假單胞菌(圖5B，SEQ ID NO:3)、惡臭假單胞菌(圖5C，SEQ ID NO:4)、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(圖5D，SEQ ID NO:5)以及野油菜黃單胞菌(圖5E，SEQ ID NO:1)。

涉及輔因子再循環(huán)的一種或多種酶如PCD和/或DHMR的表達(dá)可以通過(guò)在宿主細(xì)胞中引入包含例如phhB(編碼來(lái)自例如銅綠假單胞菌的PCD)和/或folM(編碼來(lái)自例如大腸桿菌的DHMR)的質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)。編碼PCD和DHMR的多核苷酸序列可以從任何合適的生物中獲得，例如它們可以從內(nèi)源性地表達(dá)P4H的微生物中獲得。

在一個(gè)實(shí)施例中，將phhA(被突變以編碼對(duì)色氨酸有更大活性的修飾的P4H)、phhB和folM克隆到兩個(gè)或更多個(gè)分開(kāi)的質(zhì)粒中。在優(yōu)選的實(shí)施例中，將phhA(如描述被突變)、phhB和folM克隆到同一個(gè)質(zhì)粒中。優(yōu)選地，將基因克隆在中拷貝數(shù)質(zhì)粒例如PCS27中，但可以使用高拷貝數(shù)質(zhì)粒和低拷貝數(shù)質(zhì)粒。

借助于質(zhì)粒，還可以將trp操縱子或trp操縱子的部分表達(dá)或過(guò)表達(dá)于宿主細(xì)胞中。trp操縱子可以包含突變，包括但不限于在TrpE中的突變S40F。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，將包含突變S40F的trp操縱子克隆到低拷貝數(shù)質(zhì)粒如pSA74中，以制得pSA-TrpEDCBA，但可以使用中拷貝數(shù)質(zhì)粒和高拷貝數(shù)質(zhì)粒。

制造5-HTP的方法

如在此描述的表達(dá)修飾的細(xì)菌P4H和其他特征例如輔因子再循環(huán)系統(tǒng)和/或色氨酸過(guò)度產(chǎn)生或積累的微生物宿主細(xì)胞可以有利地在包含簡(jiǎn)單碳源如葡萄糖或甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。其他適合的碳源包括木糖、阿拉伯糖以及其他可再生糖類(lèi)，如在植物或木質(zhì)纖維素水解液中的糖類(lèi)。任選地，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有色氨酸。為了優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)以及生產(chǎn)效率，可以將宿主細(xì)胞在包括但是不限于以下的溫度下孵育：21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃。在一個(gè)實(shí)施例中，將宿主細(xì)胞在30℃下孵育。在可替代的實(shí)施例中，將宿主細(xì)胞在37℃下孵育。優(yōu)選地將葡萄糖用作碳源以用于細(xì)胞生長(zhǎng)和維持(例如0.1-100g/L)；任選地，可以添加檸檬酸鹽以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增加滴度(例如0.1-100g/L)；任選地，可以添加例如胰蛋白胨的其他生長(zhǎng)補(bǔ)充劑。

任選的，將5-HTP從宿主細(xì)胞中分離?？梢詫?duì)所分離的5-HTP進(jìn)行純化。純化的5-HTP可以被用作起始材料用于其他化學(xué)或酶促反應(yīng)以生產(chǎn)其他感興趣的生化制品，例如褪黑素。

任選地，分離的5-HTP作為食品添加劑、食品補(bǔ)充劑或營(yíng)養(yǎng)食品被并入到食物產(chǎn)品中。例如，分離的5-HTP可以被并入到動(dòng)物飼料中，例如家畜或農(nóng)畜的飼料。補(bǔ)充5-HTP對(duì)于鈣代謝可以具有有益作用，并且尤其適合用于懷孕與泌乳農(nóng)畜，例如奶牛。因此，該制造5-HTP的方法任選地包括包裝和/或推廣5-HTP作為動(dòng)物食品補(bǔ)充劑、添加劑或營(yíng)養(yǎng)食品，以及將5-HTP并入到食物產(chǎn)品(例如，動(dòng)物飼料或飲料)中。

有利地，在已經(jīng)如在此描述的被工程化以包含輔因子再循環(huán)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中，不需要添加昂貴的喋呤輔酶或前體；細(xì)胞可以利用簡(jiǎn)單的可再生的碳源。因此該方法在5-HTP的大規(guī)模生產(chǎn)中有巨大潛力。

本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)例來(lái)闡明。應(yīng)該理解地是，具體實(shí)例、材料、量和程序應(yīng)根據(jù)如本文所闡述的本發(fā)明的范圍和精神來(lái)寬泛地解釋。

實(shí)例

實(shí)例1.對(duì)細(xì)菌苯丙氨酸4-羥化酶進(jìn)行工程化以用于人類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)前體5-羥基色氨酸的微生物合成

5-羥基色氨酸(5-HTP)是對(duì)抗抑郁癥、失眠、肥胖癥、小腦共濟(jì)失調(diào)、慢性頭痛等的臨床有效藥物。由于缺少合成方法，它只能通過(guò)從加納籽中提取而進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)。在此，我們報(bào)道了通過(guò)組合的蛋白質(zhì)和代謝工程方法對(duì)5-HTP的有效微生物生產(chǎn)。代替使用比較不易駕馭的動(dòng)物色氨酸5-羥化酶，我們嘗試修飾一種細(xì)菌苯丙氨酸4-羥化酶(P4H)以改變它的底物特異性。首先我們?cè)诖竽c桿菌中重構(gòu)和篩選了原核生物的苯丙氨酸4-羥化酶(P4H)活性。然后，我們使用基于序列和結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)工程以顯著的改變其底物偏好性，允許色氨酸向5-HTP的有效轉(zhuǎn)化。重要地，當(dāng)引入外來(lái)的MH4再循環(huán)機(jī)制后，能夠?qū)⒋竽c桿菌內(nèi)源的四氫單喋呤(MH4)用做輔酶。全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化可以在搖瓶中實(shí)現(xiàn)從色氨酸高水平生產(chǎn)5-HTP(1.1-1.2g l^-1)。進(jìn)一步進(jìn)行代謝工程努力以實(shí)現(xiàn)從葡萄糖從頭合成5-HTP。參見(jiàn)林(Lin)等人，ACS合成生物學(xué)(ACS Synth.Biol.)，2014，3(7)，第497-505頁(yè)。該過(guò)程不需要昂貴的喋呤輔酶或前體的補(bǔ)充，并且能夠利用可再生的碳源。該工作不僅具有大規(guī)模生產(chǎn)的潛力，而且證實(shí)了擴(kuò)展微生物天然代謝的一種策略。

引言

世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道抑郁癥是一種常見(jiàn)的精神障礙，它在全球內(nèi)影響著超過(guò)3.5億的人。每年它導(dǎo)致大約一百萬(wàn)的自殺。不幸的是，全世界超過(guò)50％的受害者(在一些地區(qū)超過(guò)90％)從未接受過(guò)醫(yī)學(xué)治療¹。認(rèn)為血清素(5-羥色胺)代謝的改變對(duì)于抑郁癥是一種重要的生理因素²。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的血清素能機(jī)制的機(jī)能失調(diào)牽涉抑郁癥的病因?qū)W³。然而通過(guò)口服給藥的血清素的供應(yīng)對(duì)抑郁癥沒(méi)有臨床效應(yīng)，因?yàn)樗荒艽┻^(guò)血腦屏障。不像常規(guī)的致力于使血清素?fù)p失最小化的抗抑郁藥(例如選擇性血清素再攝取抑制劑)，5-羥基色氨酸(5-HTP)作為直接前體起作用以增加血清素供應(yīng)。5-HTP口服給藥可以容易地穿過(guò)血腦屏障，無(wú)需轉(zhuǎn)運(yùn)分子。然后通過(guò)內(nèi)源的脫羧酶，它可以在CNS中有效地轉(zhuǎn)化為血清素³。詳細(xì)的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了它在緩解抑郁癥癥狀中的功效。同時(shí)，5-HTP的治療性給藥已經(jīng)示出在治療失眠、纖維肌痛、肥胖癥、小腦共濟(jì)失調(diào)以及慢性頭痛中是有效的⁴。重要地，在治療中，相對(duì)少的不良作用與它的使用相關(guān)聯(lián)²。在大多數(shù)歐洲國(guó)家中，5-HTP是一種用于多種治療目的的常用的處方藥；而在北美，它被作為“非處方的”膳食補(bǔ)充劑銷(xiāo)售。

由于在通過(guò)化學(xué)途徑的色氨酸的區(qū)域選擇性羥基化中的困難，5-HTP的商業(yè)生產(chǎn)只依賴(lài)于從加納籽中分離，其是一種生長(zhǎng)在非洲西部和中部的木本攀緣灌木^3,4。該原材料的供應(yīng)依賴(lài)于季節(jié)和地區(qū)，一直很大地限制其有成本效益的生產(chǎn)和廣泛的臨床應(yīng)用。與基礎(chǔ)遺傳學(xué)、生物化學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié)合的代謝工程和蛋白質(zhì)工程的最新發(fā)展正在提供新的策略以使用微生物系統(tǒng)合成天然和非天然分子?；趯?duì)目標(biāo)產(chǎn)物的天然生物合成機(jī)制的積累的知識(shí)，尤其是所涉及的酶的遺傳和生物化學(xué)信息，可以將異源的酶促反應(yīng)在遺傳上較優(yōu)的微生物宿主內(nèi)重構(gòu)、修飾并且優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)自然中缺乏的在藥學(xué)上重要的化合物的有效生產(chǎn)^5-11。

5-HTP在人類(lèi)和動(dòng)物中從L-色氨酸通過(guò)色氨酸5-羥化酶(T5H)被天然生產(chǎn)，并且然后在正常的生理?xiàng)l件下被轉(zhuǎn)化為神經(jīng)遞質(zhì)血清素⁴。T5H屬于喋呤依賴(lài)性的芳香族氨基酸羥化酶(AAAH)類(lèi)別，該類(lèi)別還包括另外兩個(gè)亞類(lèi)：苯丙氨酸4-羥化酶(P4H)和酪氨酸3-羥化酶(T3H)。AAAH因其和例如苯丙酮尿癥、帕金森病和神經(jīng)精神障礙的人類(lèi)疾病的密切關(guān)系而在動(dòng)物中被廣泛鑒定并進(jìn)行了擴(kuò)展研究¹²。這些酶由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，為N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、中心催化結(jié)構(gòu)域以及涉及到四聚體形成的C端結(jié)構(gòu)域，并且這些酶通常使用四氫生物喋呤(BH4)作為輔酶(或者共底物)¹³。證實(shí)動(dòng)物T5H不穩(wěn)定并且很難在微生物宿主中功能性地表達(dá)^14,15。一個(gè)最近的專(zhuān)利報(bào)道了來(lái)自家兔的截短的T5H1的使用，在大腸桿菌中從色氨酸產(chǎn)生了多達(dá)0.9mM(相當(dāng)于198mg l^-1)的5-HTP。為了供應(yīng)喋呤輔酶，與再生系統(tǒng)偶聯(lián)的動(dòng)物BH4生物合成途徑(包括總計(jì)五種酶)需要在大腸桿菌中共表達(dá)¹⁶。然而，該生產(chǎn)效率仍然不滿(mǎn)足大規(guī)模生產(chǎn)。

在細(xì)菌如假單胞菌屬和色桿菌屬物種中還發(fā)現(xiàn)一些AAAH^17,18。目前為止，將它們的全部鑒定為對(duì)色氨酸羥基化作用具有很低活性的P4H，但是報(bào)道當(dāng)將突變引入來(lái)自紫色色桿菌的P4H中時(shí)這種活性在體外增強(qiáng)¹⁹。原核生物的P4H由相應(yīng)于動(dòng)物AAAH的催化結(jié)構(gòu)域的僅一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成¹³。最近實(shí)驗(yàn)證據(jù)指示細(xì)菌P4H可以使用四氫單喋呤(MH4)代替BH4作為天然喋呤輔酶²⁰，因?yàn)锽H4并非天然存在于大多數(shù)細(xì)菌中。有趣的是，在大腸桿菌中MH4是喋呤的主要形式，雖然它的功能尚不清楚。在該工作中，我們報(bào)道了通過(guò)大腸桿菌內(nèi)源MH4的使用和再循環(huán)而在大腸桿菌中重構(gòu)了細(xì)菌P4H活性。組合的生物探究和蛋白質(zhì)工程方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)色氨酸到5-HTP轉(zhuǎn)化具有高度活性的P4H突變體的開(kāi)發(fā)，這允許通過(guò)進(jìn)一步的代謝工程努力來(lái)確立有效的5-HTP生產(chǎn)平臺(tái)。該從頭方法不需要補(bǔ)充昂貴的喋呤輔因子或前體，而是僅使用可再生的簡(jiǎn)單碳源，這使5-HTP在微生物中的大規(guī)模生產(chǎn)具有巨大潛力。

結(jié)果和討論

芳香族氨基酸羥化酶(AAAH)的系統(tǒng)進(jìn)化分析。和包括三個(gè)亞類(lèi)的動(dòng)物AAAH相比，將它們的原核生物對(duì)應(yīng)物全部?jī)H鑒定或注釋為P4H。之前的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)研究揭示出除了中心催化結(jié)構(gòu)域外，動(dòng)物AAAH通常由兩個(gè)另外的結(jié)構(gòu)域組成，為N端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和C端涉及到四聚體形成的結(jié)構(gòu)域；而原核生物的AAAH(例如來(lái)自紫色色桿菌的P4H)是只有一個(gè)單一結(jié)構(gòu)域的單體，該單一結(jié)構(gòu)域與動(dòng)物AAAH的催化結(jié)構(gòu)域具有中等序列相似度(大約30％)²¹。為了探索在AAAH之間的進(jìn)化關(guān)系，隨機(jī)選擇25個(gè)來(lái)自原核生物和動(dòng)物兩者的氨基酸序列，并且基于鄰接法使用MEGA 5.02構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)²²。該進(jìn)化樹(shù)反映了在原核生物和動(dòng)物的AAAH之間的顯著的進(jìn)化分離。動(dòng)物AAAH的三個(gè)亞族(P4H、T5H、和T3H)也被明顯地分離，其中P4H示出了與T5H(相比于T3H)更親密的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。這些結(jié)果符合之前對(duì)AAAH的系統(tǒng)進(jìn)化研究²³。

結(jié)合功能多樣性的發(fā)展考慮系統(tǒng)進(jìn)化證據(jù)，我們推斷動(dòng)物AAAH是從原核生物P4H通過(guò)復(fù)制和變異進(jìn)化而來(lái)。因此，我們猜測(cè)甚至在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程之后，原核生物和動(dòng)物的P4H可以仍然共享一些保守的氨基酸殘基，這些保守的氨基酸殘基決定它們對(duì)于苯丙氨酸的底物偏好性。同時(shí)，動(dòng)物P4H和T5H具有高度序列相似性，表明底物偏好性從苯丙氨酸到色氨酸的互換可以?xún)H涉及少數(shù)殘基的取代?；谶@些假設(shè)，我們推測(cè)通過(guò)進(jìn)行動(dòng)物AAAH和原核生物P4H的序列的綜合比對(duì)分析，我們可以從后一組中鑒定底物決定殘基并且人工地將它們進(jìn)化為T(mén)5H。

在大腸桿菌中對(duì)原核生物P4H的生物探究和重構(gòu)。在探索底物決定殘基之前，我們從不同的微生物(銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌和野油菜黃單胞菌)中挑選五種P4H以驗(yàn)證和比較它們的活性和底物特異性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)原核生物P4H仍然是推測(cè)的酶，而沒(méi)有對(duì)它們功能的實(shí)驗(yàn)性證明。來(lái)自銅綠假單胞菌的P4H(PaP4H)之前在體外被鑒定并且它的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析²⁴。一些遺傳和生物化學(xué)證據(jù)表明PaP4H使用MH4代替BH4作為天然的喋呤輔酶²⁰。因此，我們首先選擇它作為原型來(lái)確立它在大腸桿菌中的體內(nèi)活性，因?yàn)镸H4是大腸桿菌產(chǎn)生的主要喋呤(圖2)。為了實(shí)現(xiàn)PaP4H的表達(dá)，將它的基因phhA從銅綠假單胞菌的基因組DNA中擴(kuò)增，并且在IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子P_LlacO1的控制下克隆進(jìn)高拷貝數(shù)質(zhì)粒中。將所得的表達(dá)質(zhì)粒pZE-PaphhA引入大腸桿菌菌株BW25113ΔtnaA(縮寫(xiě)為BWΔtnaA)中。因?yàn)閳?bào)道了由tnaA編碼的色氨酸酶催化色氨酸以及5-HTP的降解²⁵，將該基因從本研究中所用的所有菌株中敲除。我們發(fā)現(xiàn)攜帶pZE-PaphhA的BWΔtnaA的細(xì)胞生長(zhǎng)被顯著抑制。它的OD₆₀₀值在8小時(shí)培養(yǎng)后僅達(dá)到了0.8-1.0，顯著低于OD₆₀₀值為5.5-6.0的對(duì)照菌株(攜帶空載體的BWΔtnaA)OD₆₀₀值。在之前的研究中觀察到類(lèi)似的作用²⁶。當(dāng)細(xì)胞用苯丙氨酸(500mg l^-1)孵育時(shí)，幾乎檢測(cè)不到羥化產(chǎn)物(酪氨酸)。確實(shí)，銅綠假單胞菌具有負(fù)責(zé)二氫單喋呤(MH2)再生的喋呤4α-甲醇胺脫水酶(PCD，由phhB編碼)，該二氫單喋呤可以被進(jìn)一步還原為MH4。但是大腸桿菌天然地并不具有這種機(jī)制。為了建立人工的MH4再循環(huán)系統(tǒng)(圖2)，將來(lái)自銅綠假單胞菌的phhB和來(lái)自大腸桿菌的folM(編碼二氫單喋呤還原酶，DHMR)與phhA使用載體pZE-PaABM共表達(dá)。有趣的是，具有此質(zhì)粒的大腸桿菌菌株大幅改進(jìn)了細(xì)胞活力，該細(xì)胞活力是可以和對(duì)照菌株相比的。它的OD₆₀₀值在8個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)后達(dá)到了4.5-5.5。當(dāng)收集這些細(xì)胞并用苯丙氨酸孵育時(shí)，以83.50μM/h/OD₆₀₀的速率產(chǎn)生大量的酪氨酸，如在體內(nèi)測(cè)定中所示的(表1)。這些結(jié)果指示MH4再循環(huán)系統(tǒng)的引入不僅恢復(fù)了細(xì)胞的生長(zhǎng)而且可以實(shí)現(xiàn)大腸桿菌菌株將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸。此外，該菌株能夠?qū)⑸彼徂D(zhuǎn)化為5-HTP(表1)，但產(chǎn)率(0.19μM/h/OD₆₀₀)非常低，只相當(dāng)于對(duì)苯丙氨酸的產(chǎn)率的0.23％。

表1，來(lái)自不同微生物的P4H的體內(nèi)活性

^a所有的數(shù)據(jù)報(bào)告為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±s.d.。

在此基礎(chǔ)上，還將另外四個(gè)P4H通過(guò)用它們對(duì)應(yīng)的基因替代在pZE-PaABM上的PaP4H基因進(jìn)行測(cè)試。如表1中所示的，所有鑒定的P4H在大腸桿菌中示出對(duì)苯丙氨酸的高活性和強(qiáng)的底物偏好性。在它們之間，來(lái)自野油菜黃單胞菌的P4H(XcP4H)展現(xiàn)出對(duì)苯丙氨酸和色氨酸兩者的最高活性。來(lái)自假單胞菌屬物種的三個(gè)示出最相似的催化特性，這和它們親密的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系相一致。因此，我們確認(rèn)所有測(cè)試的P4H可以通過(guò)在再循環(huán)系統(tǒng)的存在下使用大腸桿菌內(nèi)源的喋呤輔酶MH4來(lái)很好地發(fā)揮功能。

通過(guò)蛋白質(zhì)工程修飾XcP4H底物偏好性。選擇XcP4H進(jìn)行蛋白質(zhì)工程，因?yàn)樗哂休^好的催化潛力。為了研究底物決定氨基酸殘基，將它的序列與動(dòng)物P4H和T5H進(jìn)行比對(duì)。僅動(dòng)物P4H和T5H的序列的比較導(dǎo)致一些在每個(gè)組內(nèi)保守但在組間變化的殘基的鑒定。然而，當(dāng)將這些殘基和XcP4H的序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中的僅六個(gè)在P4H中是保守的，并且可能對(duì)底物選擇性是關(guān)鍵的，它們是Q85、L98、W179、L223、Y231、和L282，根據(jù)野油菜黃單胞菌編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)(圖5G，六個(gè)箭頭)。為了進(jìn)一步研究在酶結(jié)構(gòu)中的它們的位置，使用來(lái)自紫色色桿菌的P4H的晶體結(jié)構(gòu)(PDH碼3TK2)作為模板建立了同源模型。保守殘基與在人類(lèi)P4H(PDB碼1MMK)和T5H1(PDB碼3HF6)的晶體結(jié)構(gòu)中的那些良好地匹配，指示該模型的可靠性。在該結(jié)構(gòu)中，W179位于催化口袋內(nèi)部，就在預(yù)測(cè)的苯丙氨酸結(jié)合位點(diǎn)處，而L98和Y231接近口袋的入口，更接近于輔酶MH4結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。然而，Q85、L223和L282并非位于接近催化口袋處，表明這些殘基和酶的底物選擇不太相關(guān)。因此，我們選擇W179、L98和Y231作為靶標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步突變分析。我們假設(shè)如果這些殘基分別被它們對(duì)應(yīng)的在T5H中的殘基即F、Y和C替代，則突變體可能展現(xiàn)對(duì)色氨酸更強(qiáng)的偏好性。因此，和野生型(WT)酶相比，XcP4H的W179F突變體在色氨酸羥基化活性上展現(xiàn)出17.4倍的增加；同時(shí)它對(duì)于苯丙氨酸的活性降低了大約20％。對(duì)苯丙氨酸相對(duì)于對(duì)色氨酸的底物偏好性從33.5轉(zhuǎn)變?yōu)?.5(表2)。當(dāng)L98Y或Y231C的突變和W179F突變組合時(shí)，底物偏好性進(jìn)一步向著色氨酸轉(zhuǎn)變，但它們對(duì)色氨酸的活性并沒(méi)有單獨(dú)W179F的情況下高。三重突變體對(duì)這兩個(gè)底物示出幾乎相同的偏好性(圖3B)。如所提及的，L98和Y231更接近于MH4結(jié)合位點(diǎn)，表明這兩個(gè)殘基可能不會(huì)貢獻(xiàn)于芳香族氨基酸底物選擇。

表2 XcP4H突變體的體內(nèi)活性和底物偏好性

^aR.A.，相對(duì)活性，設(shè)置WT XcP4H的R.A.為100％

^b所有的數(shù)據(jù)報(bào)告為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±s.d.。

為了進(jìn)一步探索XcP4H突變體W179F對(duì)于全細(xì)胞生物催化的潛力，通過(guò)將預(yù)培養(yǎng)的具有pZE-XcABMW179F的大腸桿菌細(xì)胞(初始OD₆₀₀值＝12-13)與2.0g l^-1色氨酸孵育來(lái)進(jìn)行攝入實(shí)驗(yàn)。如圖3C示出的，雖然細(xì)胞在37℃下生長(zhǎng)略快，但初始轉(zhuǎn)化率在30℃和37℃下是相似的。然而，在30℃下的生產(chǎn)效率在5小時(shí)后明顯變得更高。到16小時(shí)結(jié)束時(shí)，在30℃和37℃下的培養(yǎng)物分別消耗了1503.2mg l^-1和1417.1mg l^-1的色氨酸而積累了1114.8mg l^-1和758.3mg l^-1的5-HTP。同時(shí)，我們觀察到培養(yǎng)物的顏色在5小時(shí)后逐漸變黑，尤其是在37℃下，可能是由于在有氧條件下5-HTP和色氨酸的氧化。

5-HTP通過(guò)代謝工程的從頭微生物合成。在實(shí)現(xiàn)了色氨酸向5-HTP的有效生物轉(zhuǎn)化后，我們繼續(xù)構(gòu)造5-HTP生產(chǎn)菌株，該生產(chǎn)菌株允許使用從簡(jiǎn)單碳源產(chǎn)生的內(nèi)源性色氨酸(圖4A)。我們的初次嘗試集中于色氨酸過(guò)度生產(chǎn)者的構(gòu)建。在大腸桿菌中，色氨酸生物合成是從莽草酸途徑在分支酸處通過(guò)trp調(diào)節(jié)子的作用分出的(圖4A)，并且被色氨酸轉(zhuǎn)錄抑制因子(TrpR)響應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)色氨酸水平負(fù)調(diào)控。為了規(guī)避在轉(zhuǎn)錄水平上的固有調(diào)節(jié)，將包含trpEDCBA的完整的trp操縱子克隆進(jìn)低拷貝質(zhì)粒中，處于IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。同時(shí)，為了消除反饋抑制效應(yīng)，將突變S40F根據(jù)之前的研究²⁷并入到TrpE中，產(chǎn)生了質(zhì)粒pSA-TrpEDCBA。當(dāng)將該質(zhì)粒引入大腸桿菌BWΔtnaA時(shí)，所產(chǎn)生的菌株在37℃下在24小時(shí)培養(yǎng)后產(chǎn)生292.2mg l^-1色氨酸；然而在48h后滴度大幅降低(74.4mg l^-1)，可能是由于氧化降解²⁸。當(dāng)生長(zhǎng)溫度變?yōu)?0℃時(shí)，該問(wèn)題解決了(圖4B)。除BWΔtnaA外，我們還嘗試使用QH4ΔtnaA作為宿主以通過(guò)莽草酸途徑提高碳通量，因?yàn)镼H4是pheLA和tyrA被破壞的良好開(kāi)發(fā)的苯丙氨酸過(guò)度生產(chǎn)者ATCC31884的衍生菌，并且在我們之前的研究^29,30中已經(jīng)被成功的工程化以用于加強(qiáng)咖啡酸、水楊酸和已二烯二酸的生產(chǎn)。然而，在本研究中，具有pSA-TrpEDCBA的QH4ΔtnaA并沒(méi)有顯著改進(jìn)色氨酸的生產(chǎn)，但是和BWΔtnaA宿主相比示出在30℃下略微改進(jìn)的滴度。到48小時(shí)結(jié)束時(shí)，產(chǎn)生高達(dá)304.4mg l^-1的色氨酸(圖4B)。沒(méi)有過(guò)表達(dá)trp操縱子的對(duì)照菌株QH4ΔtnaA在任一溫度下都沒(méi)有積累色氨酸。

由于色氨酸生產(chǎn)和色氨酸向5-HTP的生物轉(zhuǎn)化的實(shí)現(xiàn)以及對(duì)于兩種情況都在30℃下更好的進(jìn)行，我們進(jìn)一步的努力是針對(duì)在該溫度下通過(guò)整合這兩個(gè)模塊建立5-HTP從頭生物合成。當(dāng)pZE-XcABMW179F和pSA-TrpEDCBA一起共轉(zhuǎn)入大腸桿菌BWΔtnaA和QH4ΔtnaA時(shí)，所產(chǎn)生的菌株分別只產(chǎn)生19.9mg l^-1和11.5mg l^-1的5-HTP，在培養(yǎng)物中沒(méi)有色氨酸的積累。清楚地，和親本菌株相比，使用高拷貝數(shù)質(zhì)粒引入5-羥基化反應(yīng)對(duì)通過(guò)色氨酸的碳流量有負(fù)影響。我們推測(cè)XcP4H突變體和MH4再循環(huán)系統(tǒng)的過(guò)多表達(dá)可能已經(jīng)導(dǎo)致代謝不平衡并且妨礙了向色氨酸的碳通量。為了測(cè)試這個(gè)假設(shè)，我們將XcP4H突變體W179F、PCD和DHMR的編碼序列克隆進(jìn)代替高拷貝數(shù)質(zhì)粒的中拷貝數(shù)質(zhì)粒中，產(chǎn)生質(zhì)粒pCS-XcABMW179F。有趣的是，我們觀察到具有pCS-XcABMW179F的BWΔtnaA和QH4ΔtnaA兩者在5-HTP生產(chǎn)上的大幅改進(jìn)；到48小時(shí)結(jié)束時(shí)，這兩個(gè)菌株分別產(chǎn)生128.6mg l^-1和152.9mg l^-1的5-HTP(圖4C)，分別消耗了8.5g l^-1和9.7g l^-1葡萄糖。同時(shí)我們檢測(cè)到兩個(gè)菌株的166.3mg l^-1和339.7mg l^-1濃度的色氨酸積累，指示向色氨酸的碳通量完全恢復(fù)。還檢測(cè)到了其他副產(chǎn)物，如表3中描繪的。5-HTP生產(chǎn)菌株遵從生長(zhǎng)依賴(lài)型的生產(chǎn)模式(圖4C)。

表3由5-HTP生產(chǎn)菌株產(chǎn)生的中間體和副產(chǎn)物

^a兩個(gè)宿主菌株都含有質(zhì)粒pSA-TrpEDCBA和pCS-XcABMW179F。

^b所有的數(shù)據(jù)報(bào)告為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±s.d.。誤差棒定義為s.d.

討論。藥物高價(jià)已經(jīng)成為全世界的家庭主要負(fù)擔(dān)。高價(jià)格確實(shí)剝奪了低收入人群對(duì)一些難獲得且昂貴的藥物的使用。該問(wèn)題的原因是從自然資源中分離這些藥物的低效率或它們化學(xué)合成的高成本。微生物生物合成和生物催化為藥學(xué)上有價(jià)值的化合物的生產(chǎn)提供了一種容易可得且環(huán)境友好的方式。代謝工程和合成生物學(xué)工具的發(fā)展使得在所希望的宿主菌株中定制組裝異源的人工途徑以用于目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成成為可能³¹。

缺乏適合的酶是微生物的途徑工程中最頻繁面臨的問(wèn)題之一。真核生物酶的功能性表達(dá)經(jīng)常是有問(wèn)題的，是因?yàn)樗鼈兊牡腿芙舛?、低穩(wěn)定性和/或?qū)Ψg后修飾的需要。例如，已經(jīng)了解色氨酸5-羥基化反應(yīng)很長(zhǎng)時(shí)間了，并且已經(jīng)從人類(lèi)和動(dòng)物中鑒定并表征了許多T5H。然而，動(dòng)物AAAH難以在大腸桿菌中以可溶解且穩(wěn)定的形式表達(dá)^14,32。另外，它們的活性通常受磷酸化作用和它們的產(chǎn)物調(diào)節(jié)³³。雖然截短的或融合蛋白的使用可以幫助獲得可溶性且有活性的酶³²，但是在大腸桿菌中使用截短的動(dòng)物T5H生產(chǎn)5-HTP中催化效率顯現(xiàn)仍然是低的¹⁶。在最近幾年，蛋白質(zhì)工程已經(jīng)成為用于酶修飾以獲得所希望的催化特性的有力工具³⁴。在我們的研究中，將使用MH4的高活性的P4H成功地工程化以催化色氨酸5-羥基化反應(yīng)。另外一個(gè)團(tuán)隊(duì)最近報(bào)道在大腸桿菌中用來(lái)自紫色色桿菌的突變體P4H生產(chǎn)5-HTP³⁵。然而，它的功能不得不依賴(lài)于外源喋呤輔酶6,7-二甲基-5,6,7,8-四氫喋呤鹽酸鹽的補(bǔ)充³⁵，這在經(jīng)濟(jì)可行性方面是不利的。

輔因子(包括粗酶和共底物)的自身供應(yīng)或再生對(duì)于全細(xì)胞生物合成和生物催化是最大的優(yōu)點(diǎn)之一。在大腸桿菌宿主中，許多這樣的分子可以伴隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而天然的產(chǎn)生，如FMN/FMNH₂、FAD/FADH₂、NAD(P)⁺/NAD(P)H、輔酶A、乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A、MH4等。雖然使用這些內(nèi)源的輔因子是更便利和經(jīng)濟(jì)的，但是有時(shí)異源的酶需要并非由宿主菌株產(chǎn)生的一種或多種輔因子。為了解決這種問(wèn)題，一種途徑是在培養(yǎng)基中補(bǔ)充外源輔因子。但是應(yīng)注意大部分輔因子如四氫喋呤是很貴的以至于它們的補(bǔ)充對(duì)于商業(yè)生產(chǎn)不是經(jīng)濟(jì)可行的。另一種途徑是將輔因子生物合成機(jī)制和/或再生機(jī)制引入宿主菌株中。正如本研究中使用動(dòng)物T5H生產(chǎn)5-HTP，將從GTP的BH4生物合成途徑引入到大腸桿菌中¹⁶。同時(shí)，BH4再生系統(tǒng)對(duì)于實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)是必須的。最近，一項(xiàng)有趣的研究報(bào)道小鼠的T3H還可以在BH4再生系統(tǒng)的存在下使用大腸桿菌MH4，但是證實(shí)效率是低的³⁶。在本工作中，在宿主菌株代謝的最小修飾的情況下，原核生物P4H和突變體能夠使用和再循環(huán)大腸桿菌內(nèi)源MH4和NAD(P)H(圖2A和B)。

結(jié)論：本工作在5-HTP的生物生產(chǎn)中同時(shí)解決了兩個(gè)問(wèn)題，這兩個(gè)問(wèn)題涉及酶的相容性和輔因子的自我供應(yīng)。據(jù)我們所知，本工作中從色氨酸產(chǎn)生的5-HTP的滴度(1.1-1.2g l^-1)顯著高于在之前研究中的滴度，示出大的大規(guī)模潛力。此外，本工作還證實(shí)了在無(wú)需補(bǔ)充前體和輔酶的情況下從頭生產(chǎn)5-HTP。由于已經(jīng)實(shí)現(xiàn)色氨酸在大腸桿菌³⁷，內(nèi)的高水平生產(chǎn)(高達(dá)48.7g l^-1)，因此預(yù)期將5-羥基化反應(yīng)在色氨酸過(guò)度生產(chǎn)者中的引入和優(yōu)化會(huì)導(dǎo)致5-HTP的有效和低成本生產(chǎn)。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料。將大腸桿菌XL1-Blue用作宿主菌株以用于克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增；將大腸桿菌BW25113ΔtnaA用作宿主菌株以用于體內(nèi)酶測(cè)定、攝入實(shí)驗(yàn)、以及色氨酸和5-HTP的從頭合成。之前QH4是通過(guò)從苯丙氨酸生產(chǎn)者大腸桿菌ATCC31844中破壞pheLA和tyrA而構(gòu)建²⁹。將包含10g l^-1胰蛋白胨、5g l^-1酵母提取物和10g l^-1NaCl的盧里亞-貝塔尼(LB)培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)和酶表達(dá)。將包含5g l^-1甘油、6g l^-1Na₂HPO₄、0.5g l^-1NaCl、3g l^-1KH₂PO₄、1g l^-1NH₄Cl、246.5mg l^-1MgSO₄·7H₂O、14.7mg l^-1CaCl₂和27.8mg l^-1FeSO₄·7H₂O的M9基本培養(yǎng)基用于P4H的體內(nèi)測(cè)定。將改造的M9(M9Y)培養(yǎng)基用于色氨酸和5-HTP的從頭生產(chǎn)。M9Y培養(yǎng)基包含10g l^-1葡萄糖、6g l^-1Na₂HPO₄、0.5g l^-1NaCl、3g l^-1KH₂PO₄、1g l^-1NH₄Cl、246.5mg l^-1MgSO₄·7H₂O、14.7mg l^-1CaCl₂、27.8mg l_-1FeSO₄·7H₂O、2g l^-1酵母提取物和2g l^-1二水檸檬酸鈉。當(dāng)需要時(shí)，將卡那霉素、氨芐青霉素和/或氯霉素分別以50mgl^-1、100mgl^-1和34mgl^-1的終濃度補(bǔ)充進(jìn)培養(yǎng)基。pZE12-luc、pCS27、pSA74分別是高、中和低拷貝數(shù)質(zhì)粒³⁰，用于在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)酶。在本研究中所用的菌株和質(zhì)粒的細(xì)節(jié)在表4中描述。

表4在本研究中所用的菌株和質(zhì)粒

DNA操作。大腸桿菌BW25113ΔtnaA::kan(JW3686-7)購(gòu)買(mǎi)自桿菌遺傳股份中心(Coli Genetic Stock Center，CGSC)。卡那霉素抗性標(biāo)記物根據(jù)報(bào)道的方案缺失³⁸。從QH4中缺失tnaA基因是使用報(bào)道的Red破壞方法進(jìn)行³⁸。質(zhì)粒pZE-PaphhA是通過(guò)使用限制性酶切位點(diǎn)Acc65I和XbaI在pZE12-luc中插入從銅綠假單胞菌擴(kuò)增的phhA基因來(lái)構(gòu)建。pZE-PaABM是通過(guò)多片段連接使用Acc65I/NdeI、NdeI/HindIII和HindIII/XbaI在pZE12-luc中插入來(lái)自銅綠假單胞菌的phhA和phhB以及來(lái)自大腸桿菌的folM來(lái)構(gòu)建。pZE-PpABM、pZE-PfABM、pZE-ReABM和pZE-XcABM是使用相同的方法構(gòu)建，其中用對(duì)應(yīng)的phhA基因替代來(lái)自銅綠假單胞菌的phhA基因。pSA-trpEDCBA是通過(guò)使用Acc65I和BamHI在pSA74中插入來(lái)自大腸桿菌的trpEDCBA的DNA片段來(lái)構(gòu)建。定點(diǎn)突變通過(guò)重疊PCR進(jìn)行。質(zhì)粒pZE-XcABMW179F、pZE-XcABM2Ma、pZE-XcABM2Mb、pZE-XcABM3M是通過(guò)用對(duì)應(yīng)的突變體基因替代野生型的來(lái)自于野油菜黃單胞菌的phhA基因來(lái)構(gòu)建(表4)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和同源建模。使用“苯丙氨酸4-羥化酶”、“酪氨酸3-羥化酶”和“色氨酸5-羥化酶”作為搜索關(guān)鍵字隨機(jī)地從GenBank選擇AAAH序列。AAAH氨基酸序列的比對(duì)是通過(guò)使用ClustalX 2.1進(jìn)行。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)是使用鄰接法通過(guò)5.02版本的分子進(jìn)化遺傳分析(MEGA)來(lái)構(gòu)建²²。進(jìn)行拔靴測(cè)試以評(píng)價(jià)可靠性(1000次重復(fù))。所有其他所用的參數(shù)是軟件的默認(rèn)值。XcP4H的同源模型是以來(lái)自于紫色色桿菌的P4H的晶體結(jié)構(gòu)(PDB碼3TK2)為模板用SWISS-MODEL在線(xiàn)服務(wù)器建立的。

野生型和突變體P4H的體內(nèi)測(cè)定。將攜帶pZE-PaABM的大腸桿菌BW25113ΔtnaA接種于含有0.5mM IPTG和100μgml^-1氨芐青霉素的50mL LB液體培養(yǎng)基中，并且在37℃下有氧生長(zhǎng)大約8h，直到OD₆₀₀達(dá)到4.5-5.5。然后將細(xì)胞收獲，并且重懸浮到M9基本培養(yǎng)基中(OD₆₀₀＝4.5-5.5)。在20分鐘的適應(yīng)后，將苯丙氨酸或色氨酸添加到細(xì)胞懸浮液中，達(dá)到500mgl^-1的終濃度。同時(shí)，添加1mM抗壞血酸以避免產(chǎn)物氧化。將搖瓶在37℃下?lián)u動(dòng)(300rpm)1小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。接下來(lái)，通過(guò)移除細(xì)胞球粒取得樣品，并且將產(chǎn)物(酪氨酸和色氨酸)用HPLC進(jìn)行定量測(cè)量。相同的方法用于測(cè)量其他P4H和XcP4H突變體的體內(nèi)活性。P4H的體內(nèi)活性以μM/min/OD₆₀₀表示。

色氨酸向5-HTP的生物轉(zhuǎn)化。將大腸桿菌菌株BW25113ΔtnaA用質(zhì)粒pZE-XcABMW179F轉(zhuǎn)化。將單克隆接種于含有0.5mM IPTG的50mL LB培養(yǎng)基中，并且在37℃下有氧生長(zhǎng)大約8h，直到OD₆₀₀達(dá)到大約5.0。將細(xì)胞收獲，重懸浮到20mL包含2g l^-1色氨酸的M9Y培養(yǎng)基中(OD₆₀₀＝12-13時(shí))，并且讓其在30℃和37℃下生長(zhǎng)。將樣品在2h、5h、10h和16h時(shí)取得。將生產(chǎn)的5-HTP的濃度通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。

色氨酸和5-HTP的從頭合成。將生產(chǎn)菌株的過(guò)夜LB培養(yǎng)物以2％接種于含有合適抗生素的M9Y培養(yǎng)基中，并且在30℃和37℃下在300rpm搖動(dòng)下培養(yǎng)。在0h時(shí)，將IPTG添加到培養(yǎng)物中達(dá)到0.5mM的總濃度。每12小時(shí)取出樣品。測(cè)量OD₆₀₀值并且通過(guò)HPLC分析產(chǎn)物、中間體和副產(chǎn)物的濃度。

HPLC分析。將L-酪氨酸(來(lái)自西格瑪奧德里奇公司(SIGMA ALDRICH))、L-色氨酸(來(lái)自西格瑪奧德里奇公司)和5-HTP(來(lái)自安可樂(lè)斯有機(jī)物公司(Acros Organics))用作標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品兩者通過(guò)HPLC進(jìn)行定量(安裝有Ultimate 3000光電二級(jí)管陣列檢測(cè)器以及反相ZORBAX SB-C18柱的Dionex Ultimate 3000)。根據(jù)我們之前的研究³⁹使用梯度洗脫方法。色氨酸、酪氨酸和5-HTP的定量是基于在特定波長(zhǎng)(276nm)下的峰面積。使用之前描述的方法⁴⁰對(duì)葡萄糖、乙酸鹽和丙酮酸鹽進(jìn)行定量。

參考文獻(xiàn)

1.WHO.(2012)世界衛(wèi)生組織關(guān)于抑郁癥的情況說(shuō)明書(shū)(World Health Organization Fact Sheet on Depression)，http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs369/en/index.html。

2.拜爾利，E.F.(Byerley,W.F.)，朱迪，L.L.(Judd,L.L.)，瑞姆赫，F(xiàn).W.(Reimherr,F.W.)，和格瑞斯，B.I.(Grosser,B.I.)(1987)5-羥基色氨酸：它的抗抑郁功效和不良反應(yīng)的綜述(5-Hydroxytryptophan:a review of its antidepressant efficacy and adverse effects)，臨床精神藥理學(xué)雜志(J.Clin.Psychopharmacol)7，127-137。

3.特納，E.H.(Turner,E.H.)，洛夫蒂斯，J.M.(Loftis,J.M.)，和布萊克威爾，A.D.(Blackwell,A.D.)(2006)照單血清素：補(bǔ)充血清素前體5-羥基色氨酸(Serotonin a la carte:supplementation with the serotonin precursor 5-hydroxytryptophan)，藥理學(xué)與治療學(xué)(Pharmacol.Ther.)109，325-338。

4.博德塞奧，T.C.(Birdsall,T.C.)(1998)5-羥基色胺酸：一種臨床有效的血清素前體(5-Hydroxytryptophan:a clinically-effective serotonin precursor)，替代醫(yī)學(xué)評(píng)論(Altern.Med.Rev.)3，271-280。

5.阿吉庫(kù)瑪，P.K.(Ajikumar,P.K.)，肖，W.H.(Xiao,W.H.)，東京，K.E.J.(Tyo,K.E.J.)，王，Y.(Wang,Y.)，西蒙，F(xiàn).(Simeon,F.)，萊納德，E.(Leonard,E.)，穆莎，O.(Mucha,O.)，方，T.H.(Phon,T.H.)，普法依費(fèi)爾，B.(Pfeifer,B.)，和斯特凡諾普洛斯，G.(Stephanopoulos,G.)(2010)類(lèi)異戊二烯途徑優(yōu)化用于在大腸桿菌中紫杉醇前體的過(guò)度生產(chǎn)(Isoprenoid Pathway Optimization for Taxol Precursor Overproduction in Escherichia coli)，科學(xué)(Science)330，70-74。

6.萊納德，E.(Leonard,E.)，阿吉庫(kù)瑪，P.K.(Ajikumar,P.K.)，塞耶，K.(Thayer,K.)，肖，W.H.(Xiao,W.H.)，墨，J.D.(Mo,J.D.)，都鐸，B.(Tidor,B.)，斯特凡諾普洛斯，G.(Stephanopoulos,G.)，和普拉瑟，K.L.J.(Prather,K.L.J.)(2010)萜類(lèi)化合物生物合成途徑的組合代謝和蛋白質(zhì)工程用以用于過(guò)度生產(chǎn)和選擇性控制(Combining metabolic and protein engineering of a terpenoid biosynthetic pathway for overproduction and selectivity control)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)107，13654-13659。

7.安東尼，J.R.(Anthony,J.R.)，安東尼，L.C.(Anthony,L.C.)，諾阿伍茲，F(xiàn).(Nowroozi,F.)，科溫，G.(Kwon,G)，紐曼，J.D.(Newman,J.D.)，和凱瑟琳，J.D.(Keasling,J.D.)(2009)基于甲羥戊酸的類(lèi)異戊二烯生物合成途徑在大腸桿菌中的優(yōu)化用以生產(chǎn)抗瘧疾藥物前體紫穗槐-4,11-二烯(Optimization of the mevalonate-based isoprenoid biosynthetic pathway in Escherichia coli for production of the anti-malarial drug precursor amorpha-4,11-diene)，代謝工程(Metab.Eng.)11，13-19。

8.茹，R.A.(Ro,D.K.)，派爾戴茲，E.M.(Paradise,E.M.)，歐萊特，M.(Ouellet,M.)，費(fèi)希爾，K.J.(Fisher,K.J.,)，紐曼，J.D.(Newman,J.D.)，恩當(dāng)沽，J.M(Ndungu,J.M.)，候，K.A.(Ho,K.A.)，伊修絲，R.A.(Eachus,R.A.)，漢姆，T.S.(Ham,T.S.)，克爾拜，J.(Kirby,J.)，常，M.C.(Chang,M.C.,)，威瑟斯，S.T.(Withers,S.T.)，施巴，T.(Shiba,Y.)，薩爾蓬，R.(Sarpong,R.)，和凱瑟琳，J.D.(Keasling,J.D.)(2006)抗瘧疾藥前體青蒿酸在工程化的酵母中的生產(chǎn)(Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast)，自然(Nature)440，940-943。

9.張，K.(Zhang,K.)，李，H.(Li,H.)，趙，K.M.(Cho,K.M.)，和廖，J.C.(Liao,J.C.)(2010)用于非自然氨基酸L-均聚丙氨酸的全生物合成的延伸代謝(Expanding metabolism for total biosynthesis of the nonnatural amino acid L-homoalanine)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)107，6234-6239。

10.利姆，C.G.(Lim,C.G.)，福勒，Z.L.(Fowler,Z.L.)，懷勒，T.(Hueller,T.)，謝弗，S.(Schaffer,S.)，和卡夫斯，M.A.G.(Koffas,M.A.G.)(2011)在工程化的大腸桿菌中高產(chǎn)量白藜蘆醇生產(chǎn)(High-Yield Resveratrol Production in Engineered Escherichia coli)，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)77，3451-3460。

11.林，Y.(Lin,Y.)，沈，X.(Shen,X.)，元，Q.(Yuan,Q.)，和閆，Y.(Yan,Y.)(2013)抗凝血?jiǎng)┣绑w4-羥基香豆素的微生物生物合成(Microbial biosynthesis of the anticoagulant precursor 4-hydroxycoumarin)，自然通訊(Nat.Commun.)4，2603。

12.泰根，K.(Teigen,K.)，麥金尼，J.A.(McKinney,J.A.)，哈威克，J.(Haavik,J.)，和馬丁內(nèi)斯，A.(Martinez,A.)(2007)用于配體結(jié)合到芳香族氨基酸羥化酶的選擇性和親和性決定物(Selectivity and affinity determinants for ligand binding to the aromatic amino acid hydroxylases)，當(dāng)代醫(yī)藥化學(xué)(Curr.Med.Chem.)14，455-467。

13.菲茨帕特里克，P.F.(Fitzpatrick,P.F.)(2003)芳香族氨基酸羥基化作用機(jī)制(Mechanism of aromatic amino acid hydroxylation)，生物化學(xué)(莫斯科)(Biochemistry(Mosc.))42，14083-14091。

14.麥金尼，J.(McKinney,J.)，卡納普斯科，P.M.(Knappskog,P.M.)，佩雷拉，J.(Pereira,J.)，厄爾，T.(Ekern,T.)，托斯卡，K.(Toska,K.)，科威特，B.B.(Kuitert,B.B.)，萊文，D.(Levine,D.)，格隆恩伯恩，A.M.(Gronenborn,A.M.)，馬丁內(nèi)斯，A.(Martinez,A.)，和海威克，J.(Haavik,J.)(2004)人類(lèi)色氨酸羥化酶從大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)和純化(Expression and purification of human tryptophan hydroxylase from Escherichia coli and Pichia pastoris)，蛋白表達(dá)純化(Protein Expr.Purif.)33，185-194。

15.馬丁內(nèi)斯，A.(Martinez,A.),卡納普斯科，P.M.(Knappskog,P.M.)，和哈威克，J.(Haavik,J.)(2001)人類(lèi)色氨酸羥化酶的結(jié)構(gòu)探討以及它對(duì)于血清素生物合成調(diào)控的影響(A structural approach into human tryptophan hydroxylase and its implications for the regulation of serotonin biosynthesis)，當(dāng)代醫(yī)藥化學(xué)(Curr.Med.Chem.)8，1077-1091。

16.奈特，E.M.(Knight,E.M.)，朱，J.(Zhu,J.)，福斯特，J.和羅，H.(Luo,H.)(2013)用于5-羥基色氨酸生產(chǎn)的微生物(Microorganisms for the production of 5-hydroxytryptophan)；Int’l.Pat.Pub.WO 2013/127914A1，6月9日，2013，用于5-羥基色氨酸生產(chǎn)的微生物(Microorganisms for the production of 5-hydroxytryptophan)。

17.中田，H.(Nakata,H.)，山內(nèi)，T.(Yamauchi,T.)，和藤澤，H.(Fujisawa,H.)(1979)來(lái)自紫色色桿菌的苯丙氨酸羥化酶.純化和表征(Phenylalanine hydroxylase from Chromobacterium violaceum.Purification and characterization)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)254，1829-1833。

18.趙，G.(Zhao,G.)，夏，T.(Xia,T.)，宋，J.(Song,J.)，和杰森，R.A.(Jensen,R.A.)(1994)銅綠假單胞菌具有作為一個(gè)三組分基因簇部分的哺乳動(dòng)物苯丙氨酸羥化酶和4α-甲醇胺脫水酶/DCoH的同系物(Pseudomonas aeruginosa possesses homologues of mammalian phenylalanine hydroxylase and 4alpha-carbinolamine dehydratase/DCoH as part of a three-component gene cluster)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)91，1366-1370。

19.吉納，K.(Kino,K.)，哈茹，R.(Hara,R.)，和野澤，A.(Nozawa,A.)(2009)通過(guò)來(lái)自紫色色桿菌的L-苯丙氨酸4-羥化酶的基于結(jié)構(gòu)的修飾來(lái)增強(qiáng)L-色氨酸5-羥基化活性(Enhancement of L-tryptophan 5-hydroxylation activity by structure-based modification of L-phenylalanine 4-hydroxylase from Chromobacterium violaceum)，生物科學(xué)和生物工程雜志(Journal of bioscience and bioengineering)108，184-189。

20.普瑞拜特，A.(Pribat,A.)，布萊比，I.K.(Blaby,I.K.)，拉瑞-努涅斯，A.(Lara-Nunez,A.)，格雷戈里，J.F.(Gregory,J.F.)，3rd，帝克雷西-加達(dá)，V.(3rd,de Crecy-Lagard,V.)，和漢森，A.D.(Hanson,A.D.)(2010)FolX和FolM對(duì)于四氫單喋呤在大腸桿菌和銅綠假單胞菌中的合成是至關(guān)重要的(FolX and FolM are essential for tetrahydromonapterin synthesis in Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa)，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)192，475-482。

21.埃蘭森，H.(Erlandsen,H.)，吉米，J.Y.(Kim,J.Y.)，派弛，M.G(Patch,M.G.).，韓，A.(Han,A.)，瓦爾內(nèi)，A.(Volner,A.)，阿布-歐瑪，M.M.(Abu-Omar,M.M.)，和斯蒂文，R.C.(Stevens,R.C.)(2002)細(xì)菌和人類(lèi)離子依賴(lài)型苯丙氨酸羥化酶的結(jié)構(gòu)比較：相似的折疊，不同的穩(wěn)定性和反應(yīng)速率(Structural comparison of bacterial and human iron-dependent phenylalanine hydroxylases:similar fold,different stability and reaction rates)，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)28,2731-2739。

22.塔穆拉，K.(Tamura,K.)，皮特森，D.(Peterson,D.)，皮特森，N.(Peterson,N.)，斯特克，G.(Stecher,G.)，奈，M.(Nei,M.)，和庫(kù)瑪，S.(Kumar,S.)(2011)MEGA5：使用最大似然、進(jìn)化距離和最大簡(jiǎn)約法的分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析(MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods)，分子生物學(xué)進(jìn)化(Mol.Biol.Evol.)28，2731-2739。

23.曹，J.(Cao,J.)，史，F(xiàn).(Shi,F.)，劉，X.(Liu,X.)，黃，G.(Huang,G.)，和周，M.(Zhou,M.)(2010)芳香族氨基酸羥化酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析和進(jìn)化(Phylogenetic analysis and evolution of aromatic amino acid hydroxylase)，歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBS Lett.)584，4775-4782。

24.埃克斯特龍，F(xiàn).(Ekstrom,F.)，斯特，G.(Stier,G.)，伊頓，J.T.(Eaton,J.T.)，和索爾，U.H.(Sauer,U.H.)(2003)來(lái)自于革蘭氏陰性機(jī)會(huì)致病菌銅綠假單胞菌的包含細(xì)菌非血紅素離子的苯丙氨酸羥化酶的晶體結(jié)構(gòu)和X射線(xiàn)分析(Crystallization and X-ray analysis of a bacterial non-haem iron-containing phenylalanine hydroxylase from the Gram-negative opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa)，晶體學(xué)報(bào)D部分生物晶體學(xué)(Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.)59，1310-1312。

25.鞏，F(xiàn).(Gong,F.)，伊藤，K.(Ito,K.)，中村，Y.(Nakamura,Y.)，和亞諾夫斯基，C.(Yanofsky,C.)(2001)色氨酸酶操縱子表達(dá)的色氨酸誘導(dǎo)機(jī)制：色氨酸抑制釋放因子介導(dǎo)的TnaC-肽基-tRNA(Pro)的裂解(The mechanism of tryptophan induction of tryptophanase operon expression:tryptophan inhibits release factor-mediated cleavage of TnaC-peptidyl-tRNA(Pro),)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)98，8997-9001。

26.宋，J.(Song,J.)，夏，T.(Xia,T.)，和杰森，R.A.(Jensen,R.A.)(1999)PhhB，哺乳動(dòng)物蝶呤4a-甲醇胺脫水酶/DCoH的銅綠假單胞菌同系物，沒(méi)有在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)苯丙氨酸羥化酶的表達(dá)(PhhB,a Pseudomonas aeruginosa homolog of mammalian pterin 4a-carbinolamine dehydratase/DCoH,does not regulate expression of phenylalanine hydroxylase at the transcriptional level)，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)181，2789-2796。

27.趙，Z.J.(Zhao,Z.J.)，鄒，C.(Zou,C.)，朱，Y.X.(Zhu,Y.X.)，戴，J.(Dai,J.)，陳，S.(Chen,S.)，武，D.(Wu,D.)，武，J.(Wu,J.)和陳，J.(Chen,J.)(2011)通過(guò)大腸桿菌內(nèi)限定的基因改造來(lái)開(kāi)發(fā)L-色氨酸生產(chǎn)菌株(Development of L-tryptophan production strains by defined genetic modification in Escherichia coli)，工業(yè)微生物學(xué)和生物技術(shù)雜志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)38，1921-1929。

28.斯瑪特，T.J.(Simat,T.J.)，和斯坦哈特，H.(Steinhart,H.)(1998)在肽和蛋白質(zhì)中游離色氨酸以及色氨酸殘基的氧化(Oxidation of Free Tryptophan and Tryptophan Residues in Peptides and Proteins)，農(nóng)業(yè)食品化學(xué)雜志(J.Agric.Food Chem.)46，490-498。

29.黃，Q.(Huang,Q.)，林，Y.(Lin,Y.)，和閆，Y.(Yan,Y.)(2013)通過(guò)改造過(guò)度生產(chǎn)苯丙氨酸的大腸桿菌菌株增強(qiáng)咖啡酸生產(chǎn)(Caffeic acid production enhancement by engineering a phenylalanine over-producing Escherichia coli strain)，生物技術(shù)和生物工程(Biotechnol.Bioeng.)110，3188-3196。

30.林，Y.(Lin,Y.)，孫，Y.(Sun,X.)，元，Q.(Yuan,Q.)，和閆，Y.(Yan,Y.)(2014)用于在大腸桿菌中生產(chǎn)己二烯二酸和它的前體水楊酸的延伸莽草酸途徑(Extending shikimate pathway for the production of muconic acid and its precursor salicylic acid in Escherichia coli)，代謝工程(Metab.Eng.)23C，62-69。

31.莫拉-派勒，M.(Mora-Pale,M.)，桑切斯-羅德里格斯，S.P.(Sanchez-Rodriguez,S.P.)，林哈特，R.J.(Linhardt,R.J.)，多迪克，J.S.(Dordick,J.S.)，和卡夫斯，M.A.G.(Koffas,M.A.G.)(2014)用于增強(qiáng)具有藥效潛力的天然產(chǎn)品的體內(nèi)生產(chǎn)的生物化學(xué)策略(Biochemical strategies for enhancing the in vivo production of natural products with pharmaceutical potential)，當(dāng)代生物技術(shù)觀點(diǎn)(Curr.Opin.Biotechnol.)25C，86-94。

32.希金斯，C.A.(Higgins,C.A.)，弗米爾，L.M.(Vermeer,L.M.)，多倫，J.A.(Doorn,J.A.)，和羅馬，D.L.(Roman,D.L.)(2012)作為在大腸桿菌內(nèi)的融合蛋白的重組人類(lèi)酪氨酸羥化酶的表達(dá)和純化(Expression and purification of recombinant human tyrosine hydroxylase as a fusion protein in Escherichia coli)，蛋白表達(dá)純化(Protein Expr.Purif.)84，219-223。

33.多布內(nèi)，S.C.(Daubner,S.C.)，勞里亞諾，C.(Lauriano,C.)，嗨克可，J.W.(Haycock,J.W.)，和菲茨帕特里克，P.F.(Fitzpatrick,P.F.)(1992)大鼠酪氨酸羥化酶的絲氨酸40的定點(diǎn)突變.多巴胺和cAMP依賴(lài)性磷酸化對(duì)于酶活性的影響(Site-directed mutagenesis of serine 40of rat tyrosine hydroxylase.Effects of dopamine and cAMP-dependent phosphorylation on enzyme activity)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)267，12639-12646。

34.馬爾凱斯基，R.J.(Marcheschi,R.J.)，格羅恩格伯，L.S.(Gronenberg,L.S.)，和廖，J.C.(Liao,J.C.)(2013)用于代謝工程的蛋白質(zhì)工程：當(dāng)下和下一代工具(Protein engineering for metabolic engineering:current and next-generation tools)，生物技術(shù)雜志(Biotechnol.J.)8，545-555。

35.哈茹，R.(Hara,R.)，和吉納，K.(Kino,K.)(2013)通過(guò)四氫喋呤再生來(lái)增強(qiáng)5-羥基-l-色氨酸的合成(Enhanced synthesis of 5-hydroxy-l-tryptophan through tetrahydropterin regeneration)，AMB出版(AMB Express)3，70。

36.佐藤，Y.(Satoh,Y.)，田島，K.(Tajima,K.)，麥秋，M.(Munekata,M.)，凱瑟琳，J.D.(Keasling,J.D.)，和李，T.S.(Lee,T.S.)(2012)在大腸桿菌中L-酪氨酸氧化和羥基酪醇的微生物生產(chǎn)的工程化(Engineering of L-tyrosine oxidation in Escherichia coli and microbial production of hydroxytyrosol)，代謝工程(Metab.Eng)14，603-610。

37.王，J.(Wang,J.)，程，L.K.(Cheng,L.K.)，王，J.(Wang,J.)，劉，Q.(Liu,Q.)，沈，T.(Shen,T.)，和陳，N.(Chen,N.)(2013)大腸桿菌的基因工程以增強(qiáng)L-色氨酸的生產(chǎn)(Genetic engineering of Escherichia coli to enhance production of L-tryptophan)，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.)97，7587-7596。

38.達(dá)森口，K.A.(Datsenko,K.A.)，和萬(wàn)納，B.L.(Wanner,B.L.)(2000)使用PCR產(chǎn)物在大腸桿菌K-12中將染色體基因一步敲除(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)97，6640-6645。

39.林，Y.(Lin,Y.)和閆，Y.(Yan,Y.)(2012)將咖啡酸使用其內(nèi)源的羥化酶復(fù)合物在大腸桿菌中進(jìn)行生物合成(Biosynthesis of caffeic acid in Escherichia coli using its endogenous hydroxylase complex)，微生物細(xì)胞工廠(chǎng)(Microb Cell Fact)42。

40.沈，X.(Shen,X.)，林，Y.(Lin,Y.)，杰恩，R.(Jain,R.)，元，Q.(Yuan,Q.)，和閆，Y.(Yan,Y.)(2012)乙酸積累的抑制導(dǎo)致增強(qiáng)的大腸桿菌內(nèi)的(R,R)-2,3-丁二醇從甘油的生產(chǎn)(Inhibition of acetate accumulation leads to enhanced production of(R,R)-2,3-butanediol from glycerol in Escherichia coli)，工業(yè)微生物學(xué)和生物技術(shù)雜志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)39，1725-1729。

實(shí)例II。5-羥基色氨酸作為動(dòng)物飼料補(bǔ)充物

產(chǎn)乳熱(又名臨產(chǎn)低血鈣癥)是一種代謝障礙，經(jīng)常在產(chǎn)犢時(shí)期左右頻繁地發(fā)生在農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物中。大約0-10％的奶牛經(jīng)歷產(chǎn)乳熱(臨床低血鈣癥)，然而這個(gè)數(shù)字可在產(chǎn)犢母牛中增至25％(迪格瑞斯(DeGaris)等人，2008，獸醫(yī)雜志(Vet.J.)176,58-69)。此外，大部分奶牛展現(xiàn)不同程度的亞臨床低血鈣癥。產(chǎn)乳熱對(duì)奶農(nóng)造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，包括母牛死亡(大約5％的受到影響的母牛)、生產(chǎn)生命期的減少(每個(gè)受影響的母牛3.4年)、牛奶產(chǎn)量的下降、繁殖性能的退化以及預(yù)防和治療該疾病的花費(fèi)。平均起來(lái)，與產(chǎn)乳熱相關(guān)的花費(fèi)被評(píng)估為大約每次發(fā)生為334美元(高夫(Goff)等人，2003，中國(guó)獸醫(yī)雜志增刊(Acta Vet.Scand.Suppl.)97,145-147)。聯(lián)合國(guó)食品和農(nóng)業(yè)組織(FAO)已經(jīng)報(bào)道在2011年世界上有2.6億奶牛(世界奶牛數(shù)量，2014，可在萬(wàn)維網(wǎng)dairyco.org.uk/market-information/farming-data/cow-numbers/world-cow-numbers/#.VH0dds6wXxr獲得)。相應(yīng)地，評(píng)估的由產(chǎn)乳熱引起的損失在全球?yàn)榇蠹s43.4億美元(假定嚴(yán)重的產(chǎn)乳熱的發(fā)生率是5％)。相比之下，通過(guò)過(guò)渡期沒(méi)有疾病的母牛通常示出更高的機(jī)會(huì)以具有生產(chǎn)泌乳期、以及更好的繁殖性能(赫爾南德斯(Hernandez)，2011，在過(guò)渡期奶牛中的鈣穩(wěn)態(tài)，可在萬(wàn)維網(wǎng)reeis.usda.gov/web/crisprojectpages/0227299-calcium-homeostasis-in-transition-dairy-cattle.html獲得)。

廣泛的研究已經(jīng)示出在干乳期血清素水平的升高可以增加鈣水平并且預(yù)防產(chǎn)乳熱。目前實(shí)踐主要集中于在不產(chǎn)奶的母牛的飲食中飲食的陰陽(yáng)離子差異的操縱。然而，這些飲食對(duì)于動(dòng)物來(lái)說(shuō)是不好吃的且花費(fèi)非常多(Id.)。因此，令人希望的是開(kāi)發(fā)新的策略以控制產(chǎn)乳熱，該策略既對(duì)動(dòng)物來(lái)說(shuō)是好吃的又對(duì)大規(guī)模實(shí)踐來(lái)說(shuō)是廉價(jià)的。一項(xiàng)最近的USDA資助的標(biāo)題為“過(guò)渡期奶牛中的鈣穩(wěn)態(tài)”研究揭示5-HTP的補(bǔ)充導(dǎo)致從妊娠到泌乳過(guò)渡的動(dòng)物體內(nèi)的提高的鈣動(dòng)員，這是可以有效預(yù)防產(chǎn)乳熱的機(jī)制(Id.)。豪斯曼(Horseman)等人稱(chēng)5-HTP的補(bǔ)充對(duì)于臨產(chǎn)低血鈣癥在泌乳的雌性哺乳動(dòng)物中的預(yù)防和/或治療是有效的(WO 2013112873A2)。應(yīng)注意的是產(chǎn)乳熱不僅在母牛中發(fā)生也在許多其他農(nóng)場(chǎng)哺乳動(dòng)物中發(fā)生。然而，通過(guò)當(dāng)前植物提取生產(chǎn)的5-HTP的高價(jià)格和限制性供應(yīng)妨礙了它在農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物飼料中的使用。我們的新技術(shù)將減少生產(chǎn)成本多達(dá)90％，這將使得使用5-HTP作為動(dòng)物飼料添加劑或補(bǔ)充物以預(yù)防產(chǎn)乳熱在經(jīng)濟(jì)上是可行的。

僅出于清楚理解起見(jiàn)給出以上詳細(xì)說(shuō)明和實(shí)例。不應(yīng)將其理解成不必要的限制。本發(fā)明不限于所示和所述的精確細(xì)節(jié)，因?yàn)閷⒃跈?quán)利要求書(shū)限定的本發(fā)明內(nèi)包含對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的變體。

除非另外指明，所有表示組分、分子量的數(shù)字，以及在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的等要理解為在所有情況下由術(shù)語(yǔ)“約”進(jìn)行修飾。因此，除非另外相反地指明，在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中闡述的數(shù)值參數(shù)是近似值，這些近似值可以取決于本發(fā)明所尋求獲得的所希望的特性而不同。最低限度并且不試圖限制等效物原則應(yīng)用到本權(quán)利要求書(shū)的范圍，每一個(gè)數(shù)值參數(shù)至少應(yīng)該按照?qǐng)?bào)告的有效數(shù)字的數(shù)量以及通過(guò)應(yīng)用普通的舍入方法來(lái)解釋。

雖然闡述本發(fā)明的廣泛范圍的數(shù)字范圍和參數(shù)是近似值，但是在具體實(shí)例中闡述的數(shù)值被盡可能地精確地報(bào)道。然而，全部數(shù)值內(nèi)在地含有因其相應(yīng)的檢驗(yàn)度量中存在的標(biāo)準(zhǔn)偏差而必然產(chǎn)生的范圍。

在本申請(qǐng)的披露內(nèi)容和通過(guò)引用方式結(jié)合在此的任何文獻(xiàn)的披露內(nèi)容之間存在任何不一致性的情況下，本申請(qǐng)的披露內(nèi)容應(yīng)當(dāng)占據(jù)主導(dǎo)。

全部標(biāo)題旨在方便讀者并且不應(yīng)當(dāng)用來(lái)限制該標(biāo)題后續(xù)文本的意思，除非如此說(shuō)明。

在此引用的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)(包括臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng))、以及出版物(包括專(zhuān)利出版物和非專(zhuān)利出版物)和電子可得材料(包括，例如，提交到例如，GenBank和RefSeq中的核苷酸序列，以及提交到例如，SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列，以及來(lái)自GenBank和RefSeq中的注釋編碼區(qū)的翻譯)的完整披露通過(guò)引用結(jié)合。

序列表

<110> 喬治亞大學(xué)研究基金公司（UNIVERSITY OF GEORGIA RESEARCH FOUNDATION, INC.）

閆亞軍（YAN, Yajun）

林宇恒（LIN, Yuheng）

<120> 用于產(chǎn)生5-羥基色氨酸的微生物途徑

<130> 235.02480201

<150> US 61/994,413

<151> 2014-05-16

<160> 17

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 296

<212> PRT

<213> 野油菜黃單胞菌

<400> 1

Met Asn Thr Ala Pro Arg Arg Val Glu Asn Gln Leu Thr Asp Lys Gly

1 5 10 15

Tyr Val Pro Val Tyr Thr Thr Ala Val Val Glu Gln Pro Trp Asp Gly

20 25 30

Tyr Ser Ala Asp Asp His Ala Thr Trp Gly Thr Leu Tyr Arg Arg Gln

35 40 45

Arg Ala Leu Leu Val Gly Arg Ala Cys Asp Glu Phe Leu Gln Ala Gln

50 55 60

Asp Ala Met Gly Met Asp Asp Thr Gln Ile Pro Arg Phe Asp Ala Leu

65 70 75 80

Asn Ala Val Leu Gln Ala Thr Thr Gly Trp Thr Leu Val Gly Val Glu

85 90 95

Gly Leu Leu Pro Glu Leu Asp Phe Phe Asp His Leu Ala Asn Arg Arg

100 105 110

Phe Pro Val Thr Trp Trp Ile Arg Arg Pro Asp Gln Ile Asp Tyr Ile

115 120 125

Ala Glu Pro Asp Leu Phe His Asp Leu Phe Gly His Val Pro Leu Leu

130 135 140

Met Asn Pro Leu Phe Ala Asp Phe Met Gln Ala Tyr Gly Arg Gly Gly

145 150 155 160

Val Lys Ala His Gly Ile Gly Pro Asp Ala Leu Gln Asn Leu Thr Arg

165 170 175

Leu Tyr Trp Tyr Thr Val Glu Phe Gly Leu Ile Ala Thr Pro Gln Gly

180 185 190

Leu Arg Ile Tyr Gly Ala Gly Ile Val Ser Ser Lys Gly Glu Ser Leu

195 200 205

His Ser Leu Glu Ser Ala Ala Pro Asn Arg Val Gly Phe Asp Leu Gln

210 215 220

Arg Val Met Arg Thr Arg Tyr Arg Ile Asp Ser Phe Gln Lys Thr Tyr

225 230 235 240

Phe Val Ile Asp Ser Phe Thr Gln Leu Met Asp Ala Thr Ala Pro Asp

245 250 255

Phe Thr Pro Ile Tyr Ala Ala Leu Ala Gln Gln Pro Gln Val Pro Ala

260 265 270

Gly Glu Val Leu Ala Thr Asp His Val Leu Gln Arg Gly Ser Gly Glu

275 280 285

Gly Trp Ser Arg Asp Gly Asp Val

290 295

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213> 銅綠假單胞菌

<400> 2

Met Lys Thr Thr Gln Tyr Val Ala Arg Gln Pro Asp Asp Asn Gly Phe

1 5 10 15

Ile His Tyr Pro Glu Thr Glu His Gln Val Trp Asn Thr Leu Ile Thr

20 25 30

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Leu Gly Leu Lys Ala Ser Lys Glu Glu Arg Val Phe Leu Ala Arg Leu

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Tyr Trp Met Thr Ile Glu Phe Gly Leu Val Glu Thr Asp Gln Gly Lys

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Arg Ile Tyr Gly Gly Gly Ile Leu Ser Ser Pro Lys Glu Thr Val Tyr

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260

<210> 3

<211> 263

<212> PRT

<213> 熒光假單胞菌

<400> 3

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Gly Ile Asp Lys Leu Gly Leu Pro His Asp Arg Ile Pro Gln Leu Gly

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65 70 75 80

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165 170 175

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210 215 220

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245 250 255

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260

<210> 4

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<212> PRT

<213> 惡臭假單胞菌

<400> 4

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Pro Pro Lys Val Ala Ala

260

<210> 5

<211> 309

<212> PRT

<213> 富養(yǎng)羅爾斯通氏菌

<400> 5

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195 200 205

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<212> PRT

<213> 智人

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165 170 175

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<210> 7

<211> 488

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 7

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485

<210> 8

<211> 489

<212> PRT

<213> 原雞

<400> 8

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1 5 10 15

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Thr Ile Asn Arg Ser Ser Ser Gly Lys Asn Glu Asp Lys Lys Gly Asn

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Lys Gly Asn Gly Lys Gly Glu Ser Val Ser Glu Gly Gly Lys Thr Ala

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485

<210> 9

<211> 444

<212> PRT

<213> 家牛

<400> 9

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<210> 10

<211> 444

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

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<210> 11

<211> 447

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 11

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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275 280 285

Phe Ala Gln Phe Ser Gln Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser

290 295 300

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Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asp Gly Gln Leu Arg Val Phe Gly Ala Gly

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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<213> 原雞

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<212> PRT

<213> 智人

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<211> 466

<212> PRT

<213> 家兔

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Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln

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<211> 453

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 15

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Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Glu Ile Asn Leu Thr His

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Lys Glu Lys Asn Thr Val Pro Trp Phe Pro Arg Thr Ile Gln Glu Leu

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Asp Arg Phe Ala Asn Gln Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Leu Asp Ala

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Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln

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Gln Lys Ile Lys Ser

450

<210> 16

<211> 451

<212> PRT

<213> 家牛

<400> 16

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<212> PRT

<213> 原雞

<400> 17

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50 55 60

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Asn Val Pro Ala Leu Asp Lys Ile Ile Lys Ser Leu Arg Asn Asp Ile

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Gly Val Thr Val His Glu Leu Ser Arg Thr Lys Lys Lys Asp Thr Val

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Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Leu Arg Lys Phe Ala Gln Thr Ile

385 390 395 400

Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asn Pro Tyr Thr Gln Arg Ile Glu

405 410 415

Val Leu Asp Asn Ala Lys Gln Leu Lys Asn Leu Ala Asp Thr Ile Asn

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435 440 445