專利名稱：一種4-硝基酚-4-單加氧酶基因及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種4-硝基酚-4-單加氧酶基因，同時(shí)還涉及該基因的制備方法，該基因編碼的酶能夠催化環(huán)境污染物4-硝基酚和4-硝基鄰苯二酚的降解，能夠分解代謝環(huán)境中的有毒污染物4-硝基酚和4-硝基鄰苯二酚。本發(fā)明還涉及一種利用該基因表達(dá)有活性的4-硝基酚-4-單加氧酶的方法，以及4-硝基酚-4-單加氧酶在環(huán)境污染物微生物分解代謝中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
硝基酚是最廣泛使用的芳香烴化合物之一，也是研究芳香烴微生物代謝途徑和機(jī)理的模式化合物。其中^硝基酚(/7wa-nitropheno1， 4-nitrophenolPNP)是一種重要的化工原料，常作為醫(yī)藥、染料、農(nóng)藥等合成的前體，同時(shí)在使用有機(jī)磷殺蟲劑的環(huán)境中由于有機(jī)磷的水解也可導(dǎo)致硝基酚的積累。這類化合物常在生產(chǎn)和使用過(guò)程中被釋放到環(huán)境中，它們難以降解，能在環(huán)境中長(zhǎng)期殘留。4-硝基酚能夠影響人體的物質(zhì)代謝，并且在食物鏈中有富集和放大效應(yīng)，具有致畸、致突變、引發(fā)癌癥等危險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅人類的健康和生存。因此已經(jīng)被美國(guó)環(huán)保局列為優(yōu)先環(huán)境污染物(PriorityPollutant List)(http:〃oaspub.epa.gov/wqsdatabase/)。
進(jìn)入環(huán)境中的硝基酚及其它有機(jī)污染物，自然界中起初并不存在利用它們的微生物和酶系，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，微生物有的自然突變成新的變種，有的通過(guò)產(chǎn)生誘導(dǎo)酶以適應(yīng)新的環(huán)境條件，從而能夠利用這些污染物
作為碳源、氮源或能源進(jìn)行生長(zhǎng)，同時(shí)使污染物得以降解或轉(zhuǎn)化。4-硝基酚的代謝研究一直受到人們的關(guān)注，已經(jīng)有多株能夠完全代謝硝基酚的細(xì)菌純培養(yǎng)物的報(bào)道。相對(duì)于其它硝基芳香烴化合物，4-硝基酚的代謝途徑最為多樣。4-硝基酚的氧化代謝途徑是目前報(bào)道的最主要的代謝途徑，根據(jù)中間產(chǎn)物的不同，可以分為對(duì)苯二酚途徑和苯三酚途徑。
4-硝基酚的對(duì)苯二酚代謝途徑廣泛存在于革蘭氏陰性菌中，在該途徑中，4-硝基酚首先被氧化為對(duì)苯二醌(p-benzoquinone),對(duì)苯二醌在還原酶作用下還原為對(duì)苯二酚(hydroquinone)，然后進(jìn)入開環(huán)途徑。對(duì)苯二酚在雙加氧酶的作用下開環(huán)生成y-羥基粘康酸半醛(Y-hydroxymuconicsemialdehyde ， HMSA )，后者在脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為馬來(lái)酰乙酸(maleylacetate ， MA ) 。 MA在MA還原酶作用下生成p-酮己二酸
((3-ketoadipate)并最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle, TCA)，[Spain JC & Gibson DT (1991) Pathway for biodegradation of p-nitrophenol in aMoraxe〃fl sp. Appl. Environ. Microbiol. 57: 812-819.]。
另一條經(jīng)典的4-硝基酚代謝途徑是苯三酚途徑，這種代謝途徑在革蘭氏陽(yáng)性菌中廣泛存在。在該途徑中4-硝基酚在2-和3-位羥化形成苯三酚
(1，2，4-benzenetrio1， hydroxyquinol)，代謝過(guò)程中可能有中間產(chǎn)物4-石肖基鄰苯二酚(4-nitrocatechol)的產(chǎn)生。苯三酚在雙加氧酶的作用下被開環(huán)生成馬來(lái)酰乙酸，然后還原成p-酮己二酸[Jain RK, Dreisbach JH & Spain JC(1994) Biodegradation of p-nitrophenol via l，2，4-benzenetriol by an ^W/^o6a"er sp.Appl, Environ. Microbiol. 60: 3030-3032.]。
雖然4-硒基酚代謝菌株的分離及代謝途徑的研究已經(jīng)開展了半個(gè)世紀(jì)，但關(guān)于4-硝基酚代謝途徑在分子生物學(xué)水平上的研究很少。目前，已經(jīng)從兩個(gè)菌株中報(bào)道了參與4-硝基酚代謝的基因及操縱子，這兩株菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌，都是經(jīng)1,2,4-苯三酚途徑降解4-硝基酚。分別來(lái)自i /zo(iococci^ opacws SAO101 [Kitagawa W, Kimura N & Kamagata Y (2004) Anovel ，nitrophenol degradation gene cluster from a Gram-positive bacterium,i 力ot/ococcM o/wcwa SAOlOl. J. Bacteriol. 186: 4894-4902.]禾口」W/zr6^""er sp.JS443菌株[Perry LL & Zylstra GJ (2007) Cloning of a gene cluster involved in thecatabolism of _p-nitrophenol by ^4rt/zn 6a"e/" sp. strain JS443 and characterization ofthe p-nitrophenol monooxygenase. J. Bacteriol. 189: 7563-7572.]。其代謝過(guò)程中的最關(guān)鍵的酶一一4-硝基酚單加氧酶也分別得到了克隆和鑒定。這兩種4-硝基酚單加氧酶均屬于雙組分的黃素單加氧酶，包括一個(gè)依賴NAD(P)H的還原酶組分和一個(gè)依賴黃素的單加氧酶組分，而且其蛋白序列具有較高的一致性(72%)。參與4-硝基酚代謝的基因簇在在國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)
(GenBank)中的序列登錄號(hào)分別為EF052871和AY131335。
4-硝基酚經(jīng)對(duì)苯二酚途徑代謝的分子生物學(xué)研究一直未見(jiàn)報(bào)道，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中也沒(méi)有相應(yīng)的基因序列的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種4-硝基-4-單加氧酶的基因序列，該序列來(lái)自環(huán)境中的4-硝基酚降解細(xì)菌，該基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中的其它基因沒(méi)有明顯的序列相似性，是一種全新的基因。本發(fā)明對(duì)于充分利用微生物代謝污染物能力的多樣性、為解決硝基酚環(huán)境污染問(wèn)題具有著重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。
4本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種4-硝基-4-單加氧酶的基因序列制備方法，該方法易行，操作簡(jiǎn)便，該方法采用PCR技術(shù)和染色體步移技術(shù)，能夠快速的獲得目的基因片段，尤其是長(zhǎng)片段。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種4-硝基酚-4-單加氧酶基因在芳香烴環(huán)境污染物降解中的應(yīng)用。4-硝基-4-單加氧酶能夠分解代謝4-硝基酚等環(huán)境污染物，在硝基芳香烴污染物的環(huán)境處理中具有研究與應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)之一是4-硝基酚降解微生物的分離和鑒定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中提供了一種分離鑒定4-硝基酚降解細(xì)菌的方法。該菌株是從有4-硝基酚污染歷史的樣品中分離獲得的，篩選方法是"選擇性培養(yǎng)富集法"，即在基本培養(yǎng)基中只加入4-硝基酚作為唯一碳源、氮源和能源，只有能夠利用4-硝基酚作為碳源、氮源和能源的細(xì)菌才能繁殖，以此達(dá)到富集和純化的目的。最后通過(guò)單菌落分離鑒定，獲得一株細(xì)菌純培養(yǎng)物，經(jīng)鑒定為惡臭假單胞菌，命名為NyZ402(/^^/owomw;w"^NyZ402)。該菌能夠利用4-硝基酚作為碳源、氮源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，能夠完全轉(zhuǎn)化、降解污染物4-硝基酚和4-硝基鄰苯二酚，實(shí)現(xiàn)有毒污染物的完全脫毒。
本發(fā)明所涉及的微生物菌株包括但不僅限于惡臭假單胞菌屬，由于微生物間水平基因轉(zhuǎn)移的廣泛存在，所有環(huán)境中的細(xì)菌種群，包括可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物，都可以獲得、遺傳本發(fā)明所涉及的芳香烴代謝基因。
本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)之二是克隆獲得參與4-硝基酚代謝的基因簇序列，尤其是4-硝基酚-4-單加氧酶的基因(簇)序列。
如背景技術(shù)中所述，目前還沒(méi)有關(guān)于4-硝基酚經(jīng)對(duì)苯二酚途徑代謝的公開文獻(xiàn)報(bào)道，在國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中也沒(méi)有相關(guān)序列的登錄。而4-硝基酚經(jīng)對(duì)苯二酚代謝途徑與苯三酚代謝途徑完全不同，其編碼控制的基因序列，尤其是4-硝基酚單加氧酶的基因序列也不相同。因此，很難以同源序列為基礎(chǔ)，通過(guò)PCR或者Southern雜交的方法來(lái)獲取參與4-硝基酚經(jīng)對(duì)苯二酚途徑代謝的4-硝基酚-4-單加氧酶的基因(簇)序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種克隆獲得4-硝基酚-4-單加氧酶的基因序列、以及參與4-硝基酚的對(duì)苯二酚代謝途徑的基因簇序列方法，一種4-硝基-4-單加氧酶的基因序列制備方法，其步驟是
(1)對(duì)苯二酚雙加氧酶基因的擴(kuò)增。首先以惡臭假單胞菌NyZ402菌株(從土壤中分離，方法如實(shí)施例l)的基因組為模板，利用PCR的方法擴(kuò)增獲得一段對(duì)苯二酚雙加氧酶基因(pwC)片段，該基因編碼的對(duì)苯二酚雙加氧酶可能催化對(duì)苯二酚的開環(huán)，參與4-硝基酚的下游代謝途徑。
(2) 克隆獲得參與4-硝基酚代謝的基因簇。通過(guò)染色體步移的方法(BD公司GenomeWalker試劑盒)，就可以獲得； w;7C基因附近的其它基
因簇序列。因?yàn)閰⑴c芳香烴代謝的基因簇往往是連鎖的，是在基因組中緊密排列的。因此，戶"pC基因的上下游基因序列中可能就包括催化4-硝基酚經(jīng)對(duì)苯二酚代謝的最關(guān)鍵的酶一_4-硝基酚-4-單加氧酶的基因序列。
(3) 序列分析獲取4-硝基酚-4-單加氧酶基因。對(duì)獲得的基因簇序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，在國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中，與本發(fā)明所涉及的4-硝基酚-4-單加氧酶蛋白質(zhì)序列最為相似的是來(lái)源于A^wg///^/扁/ga^^Af293的單加氧酶的序列(登錄號(hào)為XP—754665)，但相似性僅為38%，這就說(shuō)明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的基因是一個(gè)全新的基因，能夠編碼一種全新的參與4-硝基酚代謝的酶——4-硝基酚-4-單加氧酶。 一種分離的多肽，其序列為SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。 一種分離的多肽，其序列為SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明所涉及的4-硝基酚-4-單加氧酶由1233個(gè)核苷酸組成，其中1231-1233位是終止密碼子TAG。
4-硝基酚-4-單加氧酶核苷酸序列 (SEQ ID NO:l )ATGGGCGCATAG
該基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如下。4-硝基酚-4-單加氧酶的氨基酸序列 (SEQ IDNO:2)
DPAQRARDNAMFDHAGKDLKVMREILLDFEKLNGRRVIAPR(3YAQALESMGA.
本發(fā)明涉及的纖4-硝基酚-4-單加氧酶由410個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為45.5 kD,等電點(diǎn)為6.5。
本發(fā)明所涉及4-硝基-4-單加氧酶基因序列的獲取方法包括但不僅限于上述方法。本發(fā)明涉及的4-硝基-4-單加氧酶基因還可以通過(guò)以下方法獲得(1)亞克隆以本發(fā)明所涉及的基因片段為模板，或者以含有本發(fā)明所涉及的基因片段的重組質(zhì)粒為模板，或者以含有本發(fā)明所涉及的基因片段的基因工程菌株DNA為模板，通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)操作方法(如PCR)，亞克隆得到相應(yīng)基因片段，這些片段可以包括全部的或者部分的本發(fā)明所涉及基因序列，這些片段可在細(xì)菌、酵母、動(dòng)植物細(xì)胞或其它真核、原核生物中表達(dá)，得到蛋白質(zhì)或多肽片段，這些蛋白質(zhì)或多肽片段與本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì)有相同的生物學(xué)功能；(2)人工合成根據(jù)本發(fā)明所涉及的氨基酸或者核苷酸序列，可以通過(guò)化學(xué)合成的方法合成DNA片段，這些片段可以包括全部的或者部分的本發(fā)明所涉及基因序列，可以克隆到相應(yīng)的載體中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽與本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì)有相同的生物學(xué)功能。
本發(fā)明所涉及的基因片段可以進(jìn)行修飾，比如突變基因的某些核苷酸序列，但并不影響其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列；可以增加、缺失本發(fā)明所涉及的氨基酸或者核苷酸序列，這些修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物化學(xué)特性、高級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。比如可以在蛋白質(zhì)或多肽N-端或C-端加上分泌信號(hào)肽，還可以加上適當(dāng)?shù)慕宇^(如6個(gè)組氨酸)便于蛋白質(zhì)提取、純化。
本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)之三是4-硝基酚-4-單加氧酶基因的功能驗(yàn)證。如背景技術(shù)中所述，本發(fā)明所涉及的4-硝基酚-4-單加氧酶基因尚未有公開的報(bào)道，驗(yàn)證本發(fā)明所涉及的基因的功能是進(jìn)一步開發(fā)利用該基因的前提。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例(實(shí)施例4)中提供了一種鑒定4-硝基酚-4-單
加氧酶基因及其編碼蛋白功能的鑒定方法。該方法包括(1)4-硝基酚-4-
單加氧酶基因的PCR擴(kuò)增。具體方法為，提取惡臭假單胞菌NyZ402菌株的基因組，以其為模板PCR擴(kuò)增4-硝基酚-4-單加氧酶基因，所用引物為，Pl: 5'ATT GAA TTC ATA TGG GCC GTG ATA GGA GA3'(帶下劃線的堿基為EcoRI和Ndel的識(shí)別位點(diǎn)，引物包含了 SD序列)和P2:5'AGT TGA ATT CAC TCC TAC GAC GAAAGATCG3'(帶下劃線的堿基為EcoRI的識(shí)別位點(diǎn))。PCR反應(yīng)體系為模板(30ng/fi1) lpl;dNTP(每種10mM) 2^1;引物(各10pM) 2^1; IOX緩沖液5pl; ddH20 39.5pl;Pyrobest DNA Polymerase 0.5|il。其中IOX緩沖液和Pyrobest DNAPolymerase均來(lái)自Takaka公司。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5 min; 30個(gè)循環(huán)的94。C變性45 s， 57。C退火45 s， 72°C延伸1.5min;再72°C延伸7 min。 (2)目的基因片段的回收、克隆入載體。具體方法為，將PCR產(chǎn)物用1%(重量體積比)瓊脂糖凝膠電泳，獲得一條大小約為1300bp的片段，回收片段，用EcoRI酶切并克隆至pUC19 (Takaka公司)載體中，測(cè)序并進(jìn)行序列分析，結(jié)果證明擴(kuò)增得到的序列與預(yù)期的4-硝基酚_4-單加氧酶基因一致，在PCR過(guò)程中無(wú)突變產(chǎn)生。(3)在大腸桿菌(E.co//)中表達(dá)4-硝基酚-4-單加氧酶，具體方法為，利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Ndel將PCR產(chǎn)物克隆至經(jīng)過(guò)相應(yīng)酶切的pET5a (Novagen公司)表達(dá)載體中，在含有氨芐青霉素(100pg/ml)的LB平板上篩選陽(yáng)性克隆子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子置于含有氨芐青霉素(終濃度100pg/ml)的100mlLB中，在37°C、 200 rpm (轉(zhuǎn)/分鐘)條件下培養(yǎng)到OD6oo值約為0.6，力口入0.1 mMIPTG (Isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside)至U培養(yǎng)液中繼續(xù)誘導(dǎo)3-4h。將誘導(dǎo)表達(dá)好的菌體12，000g離心收集，在冰浴中超聲波破碎10分鐘，4°C、 200,000g離心1小時(shí)，所得上清即為粗酶液用于后繼的研究。(4)通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定該基因編碼蛋白產(chǎn)物的4-硝基酚-4-單加氧酶的活性。反應(yīng)以加入底物起始，底物4-硝基酚(420 nm摩爾消光系數(shù)為7,000 M"cm'1)的消耗通過(guò)400 nm的降低來(lái)確定。反應(yīng)體系包括底物4-硝基酚0.05 mM， NADPH 0.2 mM， FAD 0.04 mM，蛋白粗酶液2pg。反應(yīng)在20mM磷酸緩沖液中(pH7.0)室溫(20-25°C以下相同)下進(jìn)行，比活測(cè)定以340 nm處輔酶NADPH特征吸收峰(Xmax二340 nm，摩爾消光系數(shù)為6,220 M"cm—1)的減少來(lái)測(cè)定。酶活單位的定義為室溫(20-25°C以下相同)下，每分鐘1 pmol底物的減少或產(chǎn)物的增加所需的酶量，酶的比活為每克蛋白酶活單位的多少。(5)4-硝基酚-4-單加氧酶催化產(chǎn)物的鑒定。具體方法為，將含有4-硝基酚-4-單加氧酶基因的轉(zhuǎn)化子置于含有氨芐青霉素(終濃度100pg/ml)的100ml LB中，在37°C、 200rpm (轉(zhuǎn)/分鐘)條件下培養(yǎng)到0D6(K)值約為0.6，加入0.1 mM IPTG到培養(yǎng)液中繼續(xù)誘導(dǎo)3 — 4h。將誘導(dǎo)表達(dá)好的培養(yǎng)物12,000g離心收集，菌體用20mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗兩次后，重懸于相同的緩沖液中，加入0.5 mM的4-硝基酚，30°C、 200 rpm溫浴10分鐘取樣置于冰上直接進(jìn)行HPLC (高效液相色譜)分析。檢測(cè)條件為Gilson色譜儀Discover chromatograph (SupelcoTM HPLC Columns, USA) C-18(250 x 4.6 mm)，每次進(jìn)樣量為2 pl，流動(dòng)相為30%甲醇和70%水(體積比)，流速1 m/min，在290 rnn處用119 UV/VIS檢測(cè)儀檢測(cè)產(chǎn)物，檢測(cè)結(jié)果顯示反應(yīng)液中有對(duì)苯二酚生成(保留時(shí)間為4.0 min)，說(shuō)明4-硝基酚經(jīng)過(guò)4-硝基酚-4-單加氧酶催化后可檢測(cè)到產(chǎn)物對(duì)苯二酚。
本發(fā)明所涉及的基因-表達(dá)系統(tǒng)包括但不僅限于五.co"-pET5a系統(tǒng)，應(yīng)用于本發(fā)明的克隆、表達(dá)載體包括但不僅限于下列載體pUC系列載體(Takaka公司)、pGEM-T (Progema公司)、pET系列載體(Novagen公司)。載體特征及克隆方法可參見(jiàn)冷泉港實(shí)驗(yàn)室編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手
冊(cè)》。應(yīng)用于本發(fā)明的宿主一一載體系統(tǒng)包括但不僅限于下列系統(tǒng)細(xì)菌一一噬菌體系統(tǒng)，細(xì)菌一一質(zhì)粒載體系統(tǒng)，酵母一一酵母載體系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物一一病毒系統(tǒng)(牛痘病毒、腺病毒等)，昆蟲細(xì)胞一一桿狀病毒系統(tǒng)。本發(fā)明所涉及的基因與載體連接后可以克隆到相應(yīng)的宿主中，以便于基因的保存、擴(kuò)增和表達(dá)，還可以直接或間接的應(yīng)用于4-硝基酚等環(huán)境污染物的生物降解處理。
本發(fā)明所涉及的4-硝基酚-4-單加氧酶基因的功能驗(yàn)證方法包括但不僅限于紫外分光光度法、氣相色譜(GC)或高壓液相色譜(HPLC)分析法，其它能夠證明該蛋白活性的酶學(xué)研究的常規(guī)方法都可以應(yīng)用與本發(fā)明。
本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)之四是4-硝基酚-4-單加氧酶在4-硝基酚環(huán)境污染物生物降解中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一個(gè)證明4-硝基酚-4-單加氧酶能夠降解環(huán)境污染物4-硝基酚的方法_—基因工程菌株生物降解方法。該方法是利用表達(dá)4-硝基酚-4-單加氧酶的￡丄0//菌株(Novagen公司)，在實(shí)驗(yàn)室可控制環(huán)境中完全降解4-硝基酚。
本發(fā)明所涉及的4-硝基酚-4-單加氧酶在環(huán)境污染物生物降解中應(yīng)用
9方法包括但不僅限于基因工程菌株生物降解法，應(yīng)用本發(fā)明所涉及基因進(jìn)行環(huán)境污染物處理的方法包括但不僅限于將本發(fā)明所涉及的基因直接或克隆至各種宿主一載體系統(tǒng)，然后釋放到污染環(huán)境中；利用本發(fā)明所涉及的基因構(gòu)建基因工程菌株，直接釋放到污染環(huán)境中；利用含有本發(fā)明所涉及基因的基因工程菌株表達(dá)的有活性的蛋白，然后直接應(yīng)用于環(huán)境污染物的處理。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果(1)本發(fā)明所涉及的4-硝基酚-4-單加氧酶基因是一種全新的4-硝基酚降解基因，能夠編碼產(chǎn)生4-硝基酚-4-單加氧酶，該酶能夠催化4-硝基酚和4-硝基鄰苯二酚的降解，實(shí)現(xiàn)這類污染物的脫毒處理，處理過(guò)程無(wú)毒無(wú)害，不會(huì)產(chǎn)生"二次污染"，遺留問(wèn)題少，在環(huán)境污染物的生物降解中有著巨大的應(yīng)用前景。(2)在污染物的降解過(guò)程中不需要添加任何輔助的物質(zhì)，不破壞植物生長(zhǎng)所需的土壤環(huán)境，最大限度的降低污染物處理過(guò)程對(duì)環(huán)境的影響。(3)操作簡(jiǎn)便，成本低，利于推廣使用。(4)污染物降解速度快，對(duì)周圍環(huán)境干擾少，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種降解4-硝基酚的方法，經(jīng)過(guò)14個(gè)小時(shí)就能完成污染物的完全去除。


圖1. 4-硝基酚-4-單加氧酶降解轉(zhuǎn)化4-硝基酚
將含有4-硝基酚-4-單加氧酶基因的菌株接種到4-硝基酚污染物中(起始濃度160pM)，每小時(shí)取樣，檢測(cè)4-硝基酚的降解情況。橫坐標(biāo)為時(shí)間(單位小時(shí))，縱座標(biāo)為4-硝基酚濃度(單位pM)。圖2菌株NyZ402分解代謝污染物4-硝基酚
4-硝基酚初始濃度為0.5mM，接種菌體為L(zhǎng)B清洗細(xì)胞。(■)培養(yǎng)物吸光值(0D6。。)； ("4-NP濃度；(▲)亞硝酸根離子濃度。4-硝基酚代謝的同時(shí)伴隨著亞硝酸根離子的釋放。
具體實(shí)施例方式
所有實(shí)施例中的培養(yǎng)基及分子生物學(xué)操作方法為該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉，可以參考Sambrook等"分子克隆"(實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港，1989)及"精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南"(美/F.奧斯伯等著，顏?zhàn)臃f等譯，北京，科學(xué)出版社，1998)。下面結(jié)合附圖及實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但并不作為對(duì)本發(fā)明權(quán)利范圍的限制。實(shí)施例1.惡臭假單胞菌NyZ402的分離和鑒定
從生產(chǎn)硝基酚等化合物的化工廠(任何化合物工廠)污水處理沉淀池中采集活性污泥樣品。取lg樣品加入100 ml富集培養(yǎng)基中(基本培養(yǎng)基UOg蛋白胨，10g酵母粉，10g氯化鈉。12rC滅菌，20min)。加入4-硝基酚作為唯一碳、氮源)，30。C富集培養(yǎng)3天，然后連續(xù)3次轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)基，逐漸提高培養(yǎng)基中4-硝基酚濃度，直至培養(yǎng)基中4-硝基酚濃度提高到2mM。然后用固體富集培養(yǎng)基劃線分離單菌落，選擇生長(zhǎng)好、傳代穩(wěn)定、降解能力好的一株單菌落進(jìn)行研究。16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示該菌株屬于惡臭假單胞菌屬，命名為NyZ402 ( i^ei^owonwNyZ術(shù))。
實(shí)施例2. 4-硝基酚-4-單加氧酶基因的獲得
1) 對(duì)苯二酚雙加氧酶基因的擴(kuò)增
將分離到的惡臭假單胞菌NyZ402菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，30。C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集細(xì)菌細(xì)胞，提取基因組DNA。
根據(jù)GenBank中的苯三酚雙加氧酶基因的保守序列設(shè)計(jì)兩條引物，以NyZ402菌株的基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增該菌株的苯三酚雙加氧酶基因。引物序列為上游，GTC GAC ATA TGA CCG ATC AAG ACAAAG CCA TC ,下游AAG CTT GGA TTC ATG ACT CAC TCT GCC TCCATGACGA。 50|al PCR反應(yīng)體系含有模板(30ng/|al)dNTP (每種10mM) 2|il;引物(各lOpM) 2^1; IOX緩沖液5^1; ddH20 39.5^1; rTaq0.5pl。其中IOX緩沖液和rTaq均來(lái)自Takaka公司。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5 min; 30個(gè)循環(huán)的94°C變性45 s， 53°C退火45 s， 72°C延伸lmin;再72。C延伸7min。 PCR擴(kuò)增獲得一條大小為800 bp的條帶，回收該片段并測(cè)序，結(jié)果表明該片段與GenBank中的苯三酚雙加氧酶基因有較高的相似性(DNA序列一致性90%)，表明該片段可能為NyZ402菌株中參與4-硝基酚代謝的對(duì)苯二酚開環(huán)酶(雙加氧酶)基因(z^pC)片段。
2) 克隆獲得參與4-硝基酚代謝的基因簇
以該片段為出發(fā)點(diǎn)，用染色體步移(genomic walking)的方法可以獲得該片段上游和下游的基因序列，方法參見(jiàn)文獻(xiàn)進(jìn)行[Siebert PD， et al.，(1995) An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucl.Acids Res. 23: 1087-1088.]。通過(guò)3次連續(xù)的步移，共獲得包括戶"; C基因在內(nèi)的15kb的片段。
3)序列分析獲取4-硝基酚-4-單加氧酶基因
用DNAstar軟件(DNAstar公司產(chǎn)品)對(duì)獲得的序列進(jìn)行分析，推測(cè)可能的開放閱讀框(ORF)，將其翻譯為相應(yīng)的氨基酸序列，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明該片段包括了可能參與4-硝基酚代謝途徑的全部基因。其中催化4-硝基酚代謝的關(guān)鍵酶——4-硝基酚—4-單加氧酶基因(p";^4)，與來(lái)源于爿^erg〃/w/ww/ga^w Af293的單加氧酶的序列(登錄號(hào)為XP—754665)相似性為38%;與來(lái)源于Fra"h'asp. EANlpec的FAD依賴的單加氧酶序列(登錄號(hào)為YP一001507373 )相似性為33%。這也表明該基因與GenBank中功能已知的基因無(wú)明顯的序列相似性，為一個(gè)全新的基因，編碼一種新的蛋白——4-硝基酚-4-單加氧酶。通過(guò)序列比對(duì)分析證明，已經(jīng)克隆獲得參與4-硝基酚代謝的基因簇序列，包括4-硝基酚-4-單加氧酶。
實(shí)施例3. 4-硝基酚-4-單加氧酶在大腸桿菌(五."http://)中的表達(dá)
提取惡臭假單胞菌NyZ402菌株的基因組，以其為模板PCR擴(kuò)增4-硝基酚-4-單加氧酶基因，所用引物為，Pl: 5'ATT GAA TTC ATA TGGGCC GTG ATA GGA GA3'(帶下劃線的堿基為EcoRI和Ndel的識(shí)別位點(diǎn)，引物包含了 SD序列)禾tl P2: 5'AGT TGA ATT CAC TCC TAC GACGAA AGA TCG3'(帶下劃線的堿基為EcoRI的識(shí)別位點(diǎn))。PCR反應(yīng)體系為模板OOng/pl) lpl;dNTP (每種10mM) 2pl;引物(各lO(iM)2nl; IOX緩沖液5pl; ddH20 39.5|al; Pyrobest DNA Polymerase 0，。其中10 X緩沖液和Pyrobest DNA Polymerase均來(lái)自Takaka公司。PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min; 30個(gè)循環(huán)的94°C變性45 s， 57°C退火45s， 72。C延伸1.5min;再72°C延伸7 min。將PCR產(chǎn)物用1% (重量體積比)瓊脂糖凝膠電泳，獲得一條大小約為1300 bp的片段，回收片段，用EcoRI酶切并克隆至pUC19 (Takaka公司)載體中，測(cè)序并進(jìn)行序列分析，結(jié)果證明擴(kuò)增得到的序列與預(yù)期的4-硝基酚-4-單加氧酶基因一致，在PCR過(guò)程中無(wú)突變產(chǎn)生。
利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Ndel將PCR產(chǎn)物克隆至經(jīng)過(guò)相應(yīng)酶切的pET5a (Novagen公司)表達(dá)載體中，得到的重組質(zhì)粒pZWWQ001轉(zhuǎn)化至BL21(DE3) (Novagen公司)中，在含有氨節(jié)青霉素(100pg/ml)的LB平板上篩選陽(yáng)性克隆子，用引物P1和P2驗(yàn)證篩選到的陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子置于含有氨芐青霉素(終濃度100 pg/ml)的100mlLB中，在37。C、 200 rpm (轉(zhuǎn)/分鐘)條件下培養(yǎng)到OD綱值約為0.6，加入0.1mMIPTG (Isopropyl-卩-D-thiogalactopyranoside)到培養(yǎng)液中繼續(xù)誘導(dǎo)3-4h。將誘導(dǎo)表達(dá)好的菌體12,000g離心收集，菌體用冰浴的20mM磷酸緩沖液(pH 7.0)清洗兩次后，重懸于相同的緩沖液中。在冰浴中超聲波破碎10分鐘，4°C、 200,000g離心1小時(shí)，所得上清即為粗酶液用于后繼的研究。
實(shí)施例4. 4-硝基酚-4-單加氧酶基因的功能鑒定
1) 4-硝基酚-4-單加氧酶酶活測(cè)定
以在大腸桿菌(五.co/0 (Novagen公司)中表達(dá)得到的4-硝基酚-4-單加氧酶粗酶液做酶催化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。4-硝基酚-4-單加氧酶的活性測(cè)定通過(guò)紫外分光光度法檢測(cè)。反應(yīng)以加入底物起始，底物4-硝基酚(420 nm摩爾消光系數(shù)為7,000 M"cm")的消耗通過(guò)400 nm的降低來(lái)確定。反應(yīng)體系包括底物4-硝基酚0.05 mM， NADPH (還原型輔酶II ) 0.2 mM，F(xiàn)AD (黃素腺嘌呤二核苷酸)0.04 mM，蛋白粗酶液2pg。反應(yīng)在20mM磷酸緩沖液中(pH 7.0)室溫下進(jìn)行，比活測(cè)定以340 nm處輔酶NADPH特征吸收峰(Xmax二340 nm，摩爾消光系數(shù)為6,220 M"cm—1 )的減少來(lái)測(cè)定。酶活單位的定義為室溫(20-25°C以下相同)下，每分鐘1 pmol底物的減少或產(chǎn)物的增加所需的酶量，酶的比活為每克蛋白酶活單位的多少。測(cè)定結(jié)果為該4-硝基酚-4-單加氧酶比活性為49.6U/g。
2) 4-硝基酚-4-單加氧酶催化產(chǎn)物的鑒定
通過(guò)生物轉(zhuǎn)化的方法鑒定4-硝基酚-4-單加氧酶催化4-硝基酚產(chǎn)物，具體做法如下將含有4-硝基酚-4-單加氧酶基因的轉(zhuǎn)化子置于含有氨芐青霉素(終濃度100嗎/ml)的100mlLB中，在37°C、 200rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)條件下培養(yǎng)到OD6oo值約為0.6，加入O.lmMIPTG到培養(yǎng)液中繼續(xù)誘導(dǎo)3 — 4h。將誘導(dǎo)表達(dá)好的培養(yǎng)物12,000g離心收集，菌體用20 mM磷酸緩沖液(pH 7.0)清洗兩次后，重懸于相同的緩沖液中，加入0.5 mM的4-硝基酚，30°C、 200 rpm溫浴10分鐘取樣置于冰上直接進(jìn)行HPLC (高效液相色譜)分析。檢測(cè)條件為Gilson色譜儀Discover chromatograph(SupelcoTM HPLC Columns, USA) C-18 (250 x 4.6 mm)，每次進(jìn)樣量為2|ul，流動(dòng)相為30%甲醇和70%水(體積比)，流速1 ml/min，在290 nm處用119 UV/VIS檢測(cè)儀檢測(cè)產(chǎn)物，檢測(cè)結(jié)果顯示反應(yīng)液中有對(duì)苯二酚生成(保留時(shí)間為4.0min)，說(shuō)明4-硝基酚經(jīng)過(guò)4-硝基酚-4-單加氧酶催
化后可檢測(cè)到產(chǎn)物對(duì)苯二酚。
3) 4-硝基酚-4-單加氧酶酶學(xué)特性研究
分別以4-硝基酚、2-硝基酚、3-硝基酚、4-硝基鄰苯二酚為底物進(jìn)行4-硝基酚-4-單加氧酶的酶活測(cè)定。結(jié)果顯示，4-硝基酚-4-單加氧酶只對(duì)4-硝基酚和4-硝基鄰苯二酚作用，具有較強(qiáng)的底物專一性，且4-硝基酚-4-單加氧酶對(duì)其天然底物4-硝基酚的催化速度明顯大于4-硝基鄰苯二酚，如下表所示。最終證明4-硝基酚-4-單加氧酶基因編碼的酶能夠分解代謝4-硝基酚和4-硝基鄰苯二酚。
4-硝基酚-4-單加氧酶底物范圍和相對(duì)酶活
底物酶比活()amol/min/g protein)相對(duì)活力(％)
4-硝基酚49.6100
4-硝基鄰苯二酚13.327
實(shí)施例5. 4-硝基酚-4-單加氧酶在污染物降解中的應(yīng)用
將含有4-硝基酚-4-單加氧酶基因的大腸桿菌(五.co/Z， Takara公司產(chǎn)品)基因工程菌株(如實(shí)施例3中構(gòu)建)接種到含有氨節(jié)青霉素(終濃度100)ag/ml)的100mlLB中，在37°C、 200 rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)條件下培養(yǎng)到OD6oo值約為0.6，加入O.l mM IPTG到培養(yǎng)液中繼續(xù)誘導(dǎo)3 —4h。將誘導(dǎo)表達(dá)好的培養(yǎng)物12,000g離心收集，重懸于20 mM磷酸緩沖液(pH7.0)中，加入160 (^M的4-硝基酚，每小時(shí)取樣，用HPLC檢測(cè)底物降解情況，結(jié)果顯示，含有4-硝基酚-4-單加氧酶基因的工程菌能夠在14小時(shí)內(nèi)完全降解轉(zhuǎn)化4-硝基酚，降解率達(dá)到99%，如附圖1所示。
實(shí)施例6.菌株NyZ402在4-硝基酚污染物降解中的應(yīng)用
將在液體LB中生長(zhǎng)過(guò)夜的惡臭假單胞菌NyZ402菌株用基本培養(yǎng)基(MM)清洗后以1% (重量體積比)的接種量接種進(jìn)50ml的MM培養(yǎng)基中，加入0.5mM底物4-硝基酚作為唯一的碳、氮源供菌株生長(zhǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定底物濃度和菌體濃度(OD6oq)的變化。結(jié)果附圖2所示，菌株NyZ402能夠以4-硝基酚作為唯一碳、氮源生長(zhǎng)，4-硝基酚降低同時(shí)伴隨著亞硝酸根離子的釋放，這表明菌株NyZ402通過(guò)氧化途徑代謝4-硝基酚。以單菌落接種菌體至MM培養(yǎng)基中，分別用濃度梯度為0.5mM， lmM， 1.5mM， 2mM禾B 2.5mM的4-石肖基酚作為菌株NyZ402生長(zhǎng)的唯一碳、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，及過(guò)表明NyZ402對(duì)4-硝基酚的耐受濃度可以達(dá)到2mM，當(dāng)4-硝基酚濃度高于2mM時(shí)，NyZ402不再生長(zhǎng)。另外，NyZ402能夠利用底物4-硝基酚、鄰苯二酚和對(duì)苯二酚生長(zhǎng)，但不能利用底物4-硝基鄰苯二酚、2-硝基酚、3-硝基酚、偏苯三酚、2，6-二硝基酚、對(duì)硝基苯甲酸、硝基苯、間二硝基苯、2,4-二硝基甲苯、2,4,6-三硝基酚生長(zhǎng)。
SEQUENCE LISTING
<110〉中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所
<120> —種4-硝基酚-4-單加氧酶基因及制備方法和用途<130> —種4-硝基酚-4-單加氧酶基因及制備方法和用途<160〉 1
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
<211> 1233
<212> Type : DNA
<213> Pseudomonas putida
<400> 1
atgga雄aa ttgatggcgt agtggttgtc ggcggaggcc cggttgggtt gcttacagca 60ttgaaacttg gcaaggccgg tgtgcgggta gttgtcctgg agtccgaatc gggcgtttca 120ccctcaccgc gggcggttgc ctatatgcca cccactgctg cggcactgga ccgtttcggg 180ttgctcgacg acattcgcaa acgtgctgtg tggtgccctg atttcgctta ccgtcacggt 240aatggcgaac tgatcgcgaa aatggactgg gctgttctgg cacaggacac tgattacccc 300tatatgctgt tgctggcgca aaaccatgtg tccaatgtaa tcgtggagca tcttcgcaaa 360ctctccaatg tcgaaattcg ctggaatcac gcggtcgaag acattgagca ggacgacgac 420
tatgtgacca tggaaaccag cggccctgcc ggaaaagcac gtttgcgggc gaaatgggtt 480
gctgccaccg acggtgcacg cagtaccgta cgaggaaaaa tcgggctgtc ctttgatggt 540
attacttggt cggaacgcct ggttgcgaca aacgtgttct atgacttttc cctgcacggc 600
tactctcggg ccaacttcgt tcacgacccg gtagactggg ccgtcgtcgt tcagctcgac 660
aaaaccggcc tgtggcgtgt gtgctatggc gaagatcctg agatctccga ggctgaagtc 720
cgccgccgct tgccggagcg tttcaagcgc ctgctgccgg gagcgccgac gcccgatcag 780
tatcgggtcg actacctcaa tccttaccgt gtccaccagc gttgcgccgc cgagttccgc 840
cgtggacggg tgatcctggc cggagatgct gcccatgcga ccaacccgat gggggggctg 900
ggactgtcgg ggggcgtact tgatgccgag catttggccg aggcgttgat tgcggtgatc 960
aaagaaggcg cttctaccaa ggtgctggat gagtactcta tcgatcggcg caaagtcttc 1020
ctcgagttca cgtccccgac cgcgactgcc aacttcacct ggatgaaaga aagtgaccct 1080
gcccagcgtg ctcgtgataa cgcaatgttt gatcatgcgg gcaaggactt gaaagtcatg 1140
cgtgaaattc ttctggactt cgagaagctc aacggccggc gcgtgatcgc tccacgacaa 1200
tatgcgcaag cgcttgaaag tatgggcgca tag 123權(quán)利要求
1、一種分離的多肽，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2、 一種分離的多肽，其序列為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
3、 一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的4-硝基酚-4-單加氧酶基因的制備方 法，其步驟是(1) 對(duì)苯二酚雙加氧酶基因的擴(kuò)增，以惡臭假單胞菌NyZ402菌株的 基因組為模板，利用PCR的方法擴(kuò)增獲得一段對(duì)苯二酚雙加氧酶基因片 段，該基因編碼的對(duì)苯二酚雙加氧酶可能催化對(duì)苯二酚的開環(huán)，參與4-硝 基酚的下游代謝途徑；(2) 克隆獲得參與4-硝基酚代謝的基因簇，通過(guò)染色體步移的方法， 就獲得/7^C基因附近的基因簇序列，p^C基因的上下游基因序列中就包 括催化4-硝基酚經(jīng)對(duì)苯二酚代謝的酶一一4-硝基-4-單加氧酶的基因序列；(3) 序列分析獲取4-硝基酚-4-單加氧酶基因，對(duì)獲得的基因簇序列 進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，在國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，與所涉及的4-硝基酚-4-單加氧酶蛋白質(zhì)序列最為相似的是來(lái)源于j^ergz7/^ Af293的 單加氧酶的序列，證明獲得的基因編碼的就是參與4-硝基酚代謝的酶一一 4-硝基酚-4-單加氧酶。
4、 權(quán)利要求1所述的一種4-硝基酚-4-單加氧酶基因在芳香烴環(huán)境污染物降解中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種4-硝基酚-4-單加氧酶基因及制備方法和用途，一種分離的多肽，序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。其步驟是首先以惡臭假單胞菌NyZ402菌株的基因組為模板，利用PCR的方法擴(kuò)增獲得一段對(duì)苯二酚雙加氧酶基因片段；其次是通過(guò)染色體步移的方法克隆獲得參與4-硝基酚代謝的基因簇，獲得pnpC基因附近的基因；第三是對(duì)獲得的基因簇序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲取4-硝基酚-4-單加氧酶基因，在國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，與所涉及的4-硝基酚-4-單加氧酶蛋白質(zhì)序列無(wú)明顯相似性。4-硝基酚-4-單加氧酶基因在芳香烴環(huán)境污染物降解中的應(yīng)用。該方法易行，操作簡(jiǎn)便，能夠快速的獲得目的基因片段，尤其是長(zhǎng)片段。為解決硝基酚環(huán)境污染問(wèn)題具有著重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/40GK101597597SQ20091006288
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者虹 劉, 周寧一, 張俊杰, 王松鶴, 王淑君, 清 韋 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所