專利名稱：具有類酚氧化酶活性的培養(yǎng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到具有類酚氧化酶活性的培養(yǎng)物及其制造方法，染色方法及染色組合物。更詳細地講，涉及到對纖維或毛發(fā)的染色、紙漿和纖維的漂白、廢液中酚化合物的去除、內(nèi)分泌紊亂物質(zhì)的分解、酚醛樹脂的制造、人工漆涂料的制造、木質(zhì)的改善等有用的培養(yǎng)物，以及可以簡便、廉價而且大量獲得該培養(yǎng)物的制造方法，通過各種染料可進行染色的纖維或毛發(fā)等的染色方法以及對該染色有用的染色用組合物。
背景技術(shù)：
對酚化合物、多酚化合物等各種底物表現(xiàn)出氧化作用的氧化酶主要分為過氧化物酶類和酚氧化酶類兩類。
上述的過氧化物酶類催化各種底物的氧化，作為通用的底物，反應體系中需要有過氧化氫存在。而酚氧化酶類催化各種底物的氧化，作為通用的底物需要有分子狀態(tài)的氧存在。因此，在已知的氧化酶類中，上述的酚氧化酶類由于在大氣中氧的存在可以催化各種底物的氧化，所以適用于在氧存在下由作為中間體的基團的生成引起的發(fā)色、脫色、聚合、分解等多種化學反應。
上述酚氧化酶類具有依據(jù)作為反應中間體生成的基團種類的作用而具有多種催化能力。例如，據(jù)報道，作為介質(zhì)使用吩噻嗪-10-丙酸時，可以有效通過作為酚氧化酶類的漆酶進行靛藍的分解反應(平成13年度 福井大學地域共同研究中心 高度技術(shù)研修資料集、第55頁)。
上述氧化酶很早就在各種植物、細菌類以及真菌類等中被發(fā)現(xiàn)。例如，在植物中，在漆樹科(Anacardiaceae)的分泌性導管、桃類、栗類、羅漢松科(Podocarpaceae)科等中發(fā)現(xiàn)了上述氧化酶。在真菌類中，屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)的曲霉屬(Aspergillus)、葡萄孢屬(Botrytis)、漆斑菌屬(Myrothecium)、青霉屬(Penicillium)、盤多毛菌屬(Pestalotia)、絲核菌屬(Rhizoctonia)等；屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)的灰側(cè)耳菌屬(Pleurotus)、香菇屬(Lentinus)、多孔菌屬(Polyporus)、栓菌屬(Trametes)、革蓋菌屬(Coriolus)等；屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)的束丙霉屬(Podospora)、鏈孢霉屬(Neurospora)、Monocillium等中，發(fā)現(xiàn)了上述氧化酶。在細菌中，在芽孢桿菌(Bacillus)、Azospirillum、鏈霉菌(Streptomyces)、產(chǎn)氣桿菌(Aerobacter)等中發(fā)現(xiàn)了上述氧化酶。另外在作為擔子菌的食用菌中，例如群交裂褶菌(Schizophyllum Commune)、雜色革蓋屬(Coriolusversicolor)、Pycnoporus coccineus、Pleurotus octreatus、Fomitella fraxinea等發(fā)現(xiàn)了上述氧化酶。
然而，由于很多酚氧化酶的最適pH在酸性附近，所以存在著使用用途被限定的缺點。另外，在具有最適pH中性或堿性的酚氧化酶中，由于使用的底物不同，最適pH有很大變動，存在著在中性附近不能有效作用于各種底物的缺點。
另外，F(xiàn)lammulin velutipes通過在pH6.0的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出漆酶活性(特開昭60-156386)。
然而，上述漆酶是在具有最適pH酸性側(cè)的酶，存在著在中性或堿性區(qū)域的pH下活性低下的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供可以應用以各種化合物、特別是酚類化合物、氨基苯酚化合物以及二氨基苯酚化合物為底物的反應，在纖維或毛發(fā)的有效染色、紙漿和纖維的漂白、廢液中的酚化合物的去除、內(nèi)分泌紊亂物質(zhì)的分解、酚醛樹脂的制造、人工漆涂料的制造、木質(zhì)的改善等方面應用性優(yōu)越的來自屬于Flammulina屬的菌類的培養(yǎng)物。另外，本發(fā)明的目的在于提供可以簡便、廉價而且大量獲得上述培養(yǎng)物的制造方法。另外，本發(fā)明的目的在于提供可以通過各種染料、具體來說如酚類化合物、氨基苯酚化合物以及二氨基苯酚化合物、天然物(類黃酮等)、動植物的黑色色素構(gòu)成物等高效、簡便地進行染色的染色方法。另外，本發(fā)明的目的還在于提供可通過各種染料、具體來說如酚類化合物、氨基苯酚化合物以及二氨基苯酚化合物、天然物(類黃酮等)、動植物的黑色色素構(gòu)成物等進行染色、處理簡便的染色用組合物。
即本發(fā)明的要點如下[1]一種具有類酚氧化酶活性、來自屬于Flammulina屬的菌類培養(yǎng)物，所述的培養(yǎng)物具有選自下面①～⑤中的至少一種底物特異性的，這5個反應是①催化式(I) 所示的伊文思藍(Evans’Blue)、式(II) 所示的Acid Blue 80、式(III)
所示的Remazol Brilliant Blue R以及式(IV) 所示的Acid Violet 17分別進行氧化脫色反應[脫色活性]、②催化對木質(zhì)素的氧化分解反應[氧化分解活性]、③催化式(V)
所示的靛藍胭脂紅(インデイゴカルミン)、以及式(VI) 所示的Natural Orange 6的氧化聚合反應[氧化聚合活性]④催化4-氨基安替比林與從酚類化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及雜環(huán)化合物中選擇出來的一種化合物的氧化偶聯(lián)反應[氧化偶聯(lián)活性]、⑤催化對從酚類化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及雜環(huán)化合物中選擇出來的一種化合物的直接氧化反應[直接氧化活性]。
上述[1]所述的培養(yǎng)物，其中屬于Flammulina屬的菌類是Flammulina velutipes。
上述[2]所述的培養(yǎng)物，其中Flammulina velutipes是Flammulina velutipes IFO 30601。
上述[1]～[3]中任意一項所述的培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物可以通過在pH大于7.0的條件下對屬于Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)液中除去菌絲體得到。
一種具有類酚氧化酶活性的來自Flammulina屬的菌類的培養(yǎng)物，所述的培養(yǎng)物是通過在pH大于7.0的條件下對屬于Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)液中除去菌絲體得到的。
上述[1]～[5]中任意一項所述的來自屬于Flammulina屬的菌類的培養(yǎng)物的制造方法，其特征是對屬于Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)液中除去菌絲體后得到培養(yǎng)物。
上述[6]所述的制造方法，其中屬于Flammulina屬的菌類是Flammulina velutipes。
上述[7]所述的制造方法，其中Flammulina velutipes是Flammulina velutipes IFO 30601。
一種染色方法，其特征是在上述[1]～[5]中任意一項所述的培養(yǎng)物存在下，使染色對象物和染料接觸。
一種含有上述[1]～[5]中任意一項所述培養(yǎng)物的染色用組合物。
附圖的簡單說明

圖1是表示研究本發(fā)明的培養(yǎng)物的最適溫度的結(jié)果的圖。圖A表示以2，6-二甲氧基苯酚作為底物的情形。圖B表示以o-氨基苯酚作為底物的情形。
圖2是表示研究本發(fā)明的培養(yǎng)物的熱穩(wěn)定性的結(jié)果的圖。圖A表示以2，6-二甲氧基苯酚作為底物的情形。圖B表示以o-氨基苯酚作為底物的情形。
圖3是表示研究本發(fā)明的培養(yǎng)物的最適pH的結(jié)果的圖。圖3中的圖A表示以2，6-二甲氧基苯酚作為底物的情形，圖B表示以o-氨基苯酚作為底物的情形，圖C表示以p-苯二胺為底物的情況。
圖4是表示研究本發(fā)明的培養(yǎng)物的pH穩(wěn)定性的結(jié)果的圖。圖4中的圖A以及B表示以2，6-二甲氧基苯酚作為底物的情形，圖C和D表示以o-氨基苯酚作為底物的情形。另外，圖A和C表示1小時后的pH穩(wěn)定性，圖B和D表示20小時后的pH穩(wěn)定性。
圖5是表示用本發(fā)明的培養(yǎng)物對牦牛毛線以及羊毛織物進行染色的結(jié)果的圖。在圖5中，圖A表示使用牦牛毛線的結(jié)果，圖B表示使用羊毛織物的結(jié)果。
圖6是表示研究依賴培養(yǎng)pH條件的活性誘導的變化的結(jié)果圖。
圖7表示對本發(fā)明的培養(yǎng)物以及在pH6.0培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物的類酚氧化酶活性的最適pH進行比較的結(jié)果圖。圖A和B表示在pH6.0下培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物的最適pH、圖C和D是本發(fā)明培養(yǎng)物的最適pH。另外，圖A和C表示以2，6-二甲氧基苯酚作為底物的情形，圖B和D表示以p-苯二胺作為底物的情形。
用于上述發(fā)明的最好方式本發(fā)明的培養(yǎng)物由于具有類酚氧化酶活性，所以在氧存在下，可以通過催化進行由于作為反應中間體的基團類的生成引起的多種化學反應，另外，由于使用的底物不同所引起的最適pH變動小，在中性附近具有高的活性。因此，本發(fā)明的培養(yǎng)物可以發(fā)揮能夠在應用于纖維或毛發(fā)的染色、紙漿和纖維的漂白、廢液中的酚類化合物的去除、內(nèi)分泌紊亂物質(zhì)的分解、酚醛樹脂的制造、人工漆涂料的制造、粘合劑的制造等時產(chǎn)生優(yōu)越效果。另外，本發(fā)明培養(yǎng)物因為是來自作為食用的下述以Flammulina velutipes為代表的Flammulina屬的菌類，因此培養(yǎng)物能夠容易地釋放到菌絲體外，容易從培養(yǎng)生成物中獲得，具有優(yōu)異的效果。
作為上述屬于Flammulina屬的菌類，具體來說如Flammulinavelutipes，更具體講如Flammulina velutipes IFO 30601。
在本說明書中，所謂類酚氧化酶活性指的是在氧存在下，對酚類化合物、氨基苯酚化合物、苯二胺化合物等進行催化氧化的活性。這樣的類酚氧化酶活性可以用通過例如將酚、苯胺衍生物等作為氫供體，通過使氧分子還原的發(fā)色反應進行測定。作為上述氫供體，如酚化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及雜環(huán)化合物等。
本發(fā)明的培養(yǎng)物至少具有下面①～⑤中的一個底物特異性，這5個反應是①催化式(I) 所示的伊文思藍(Evans’Blue)、式(II)
所示的Acid Blue 80、式(III) 所示的Remazol Brilliant Blue R以及式(IV)
所示的Acid Violet 17分別進行氧化脫色反應(脫色活性)、②催化對木質(zhì)素的氧化分解反應[氧化分解活性]、③催化式(V) 所示的靛藍胭脂紅、以及式(VI) 所示的Natural Orange 6的氧化聚合反應[氧化聚合活性]④催化4-氨基安替比林與從酚化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及雜環(huán)化合物中選擇出來的一種化合物的氧化偶聯(lián)反應[氧化偶聯(lián)活性]、⑤催化對從酚化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及雜環(huán)化合物中選擇出來的一種化合物的直接氧化反應[直接氧化活性]。
作為上述酚化合物、如酚、2-甲氧苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、氫醌、鄰苯三酚、沒食子酸、棓酸丙酯、1-萘酚、兒茶酸等。而作為上述的氨基苯酚化合物如o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、p-氨基苯酚等。另外作為二氨基苯酚，如o-苯二胺、m-苯二胺、p-苯二胺等。作為上述的雜環(huán)化合物，如5-羥基吲哚、2，6-二氨基吡啶。
另外關(guān)于上述底物特異性，上述①的脫色活性、上述②的氧化分解活性以及上述③的氧化聚合活性可以通過下面步驟確定a)將含有底物(染料、木質(zhì)素等)的105.3mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)950μl于25℃下預溫育5分鐘，獲得底物溶液的步驟，b)將上述步驟a)得到的底物溶液和含有本發(fā)明培養(yǎng)物的培養(yǎng)溶液50μl混合，于25℃下溫育60分鐘的步驟，以及c)對于上述步驟b)得到的產(chǎn)物測定對應于底物的波長的吸光度的步驟。
其中，作為染料對于伊文思藍(Evans’Blue)、Acid Blue 80、Remazol Brilliant Blue R以及Acid Violet 17，在上述步驟c)中通過分別測定600nm、600nm、600nm以及550nm的吸光度，可以評價對各個染料的脫色活性。另外，對于上述木質(zhì)素，在上述步驟c)中通過測定450nm的吸光度，可以評價對各個染料的氧化分解活性。另外，作為上述染料，對于靛藍胭脂紅以及Natural Orange 6，在上述步驟c)中可以通過分別測定600nm以及450nm的吸光度，評價對各個染料的氧化聚合活性。
另外，上述④的氧化偶聯(lián)活性是通過以下步驟確定的。
a)將含有0.4μmol的氫供體和4.0μmol的4-氨基安替比林的105.3mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)190μl于25℃下預溫育1分鐘，獲得底物溶液的步驟，b)將上述步驟a)得到的底物溶液和含有本發(fā)明的培養(yǎng)物的培養(yǎng)溶液10μl混合，于25℃下溫育60分鐘的步驟，以及
c)對于上述步驟b)得到的產(chǎn)物測定對應于氫供體的波長的吸光度的步驟，其中以酚化合物、二氨基苯酚化合物和雜環(huán)化合物作為底物時，測定490nm的吸光度變化，當以氨基苯酚作為底物時測定450nm的吸光度變化。
另外⑤的直接氧化活性是通過以下步驟確定的。
a)將含有0.1mmol的底物的0.89mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)180μl于25℃下預溫育1分鐘，獲得底物溶液的步驟，b)將上述步驟a)得到的底物溶液和含有本發(fā)明的培養(yǎng)物的培養(yǎng)溶液20μl混合，于25℃下溫育60分鐘的步驟，以及c)對于上述步驟b)得到的產(chǎn)物，根據(jù)底物不同，測定490nm、450nm或405nm的波長的吸光度的步驟。
本發(fā)明的培養(yǎng)物在pH6.0～pH8.0范圍表現(xiàn)出高的類酚氧化酶活性。本發(fā)明的培養(yǎng)物由于在上述pH范圍對各種酚化合物都表現(xiàn)出高的類酚氧化酶活性，所以表現(xiàn)出不必進行特別的pH調(diào)整，就可以進行有效反應的優(yōu)點。
本發(fā)明的培養(yǎng)物在20～60℃范圍表現(xiàn)出高的類酚氧化酶活性。本發(fā)明的培養(yǎng)物由于在上述溫度范圍都表現(xiàn)出高的類酚氧化酶活性，所以表現(xiàn)出不必調(diào)節(jié)到特別的溫度，就可以在日常的生活溫度(室溫、水溫、體溫、氣溫等)下表現(xiàn)出高的活性。因此可以簡便地進行染色、廢液處理、高分子合成等。
另外，本發(fā)明的培養(yǎng)物在pH5.0～pH9.5，于30℃下溫育1小時時，與溫育前的活性進行比較，保持約75％以上的相對剩余活性，在pH4.0～pH10.5，于30℃下溫育1小時的情況下，與溫育前的活性進行比較，保持約40％以上的相對剩余活性。另外本發(fā)明的酚氧化酶化合物的pH穩(wěn)定性當在30℃下溫育20小時的情況下，與溫育前的活性進行比較，在pH7.0～pH9.0，保持約75％以上的相對剩余活性。本發(fā)明的培養(yǎng)物由于在上述pH范圍都表現(xiàn)出好的pH穩(wěn)定性，所以表現(xiàn)出不必進行特別的pH調(diào)整，就可以使用基于水反應溶液的優(yōu)點。
本發(fā)明的培養(yǎng)物在0～40℃，pH6.0溫育1小時的情況下，與溫育前的活性進行比較，保持約75％以上的相對剩余活性。本發(fā)明的培養(yǎng)物由于在上述溫度范圍都表現(xiàn)出優(yōu)越的熱穩(wěn)定性，所以不必調(diào)節(jié)到特別的溫度條件，就可以發(fā)揮在日常溫度使用和保存的優(yōu)越效果。因此可以發(fā)揮廉價而且簡便地進行染色、廢液處理、高分子合成等的優(yōu)越效果。
本發(fā)明的培養(yǎng)物的一大特征是，它是在pH大于7.0的條件下，對屬于Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)液中除去菌絲體后得到培養(yǎng)物。
本發(fā)明的培養(yǎng)物是在pH大于7.0的條件下，對屬于Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物，表現(xiàn)出在pH6.0～8.0范圍顯示出高的類酚氧化酶活性的優(yōu)越性質(zhì)。
另外在本說明書中，所謂“pH大于7.0的條件”是pH大于7.0，且pH13.0以下的條件，優(yōu)選pH7.5～11.0，更優(yōu)選pH8.0～10.0的條件。
本發(fā)明的培養(yǎng)物可以是對屬于Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)液，也可以是從該培養(yǎng)液中除去菌絲體后得到培養(yǎng)物。因此，對Flammulina屬菌類在培養(yǎng)基中進行適當培養(yǎng)，可以由菌絲體外的培養(yǎng)生成物簡便供給所述培養(yǎng)物。另外通過將除去的菌絲體在新的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，可以得到本發(fā)明的培養(yǎng)物，由此可以使該菌絲體再循環(huán)。在本發(fā)明中也包括本發(fā)明的培養(yǎng)物的制造方法。
本發(fā)明的制造方法的一大特征是通過對Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)液中除去菌絲體后可得到培養(yǎng)物。
如果利用本發(fā)明的制造方法通過對Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)，可以發(fā)揮簡便、而且大量獲得具有類酚氧化酶活性的培養(yǎng)物的優(yōu)越效果。另外通過將除去的菌絲體在新的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，再循環(huán)，可以發(fā)揮廉價而且簡便獲得具有類酚氧化酶活性的培養(yǎng)物的優(yōu)越效果。
在對Flammulina屬菌類的培養(yǎng)中，可以使用液體培養(yǎng)基、或固體培養(yǎng)基中的任一種。
作為在本發(fā)明的制造方法中使用的培養(yǎng)基的碳源，例如只要是屬于Flammulina屬菌類可以同化的都可以，如葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉等糖類、麥糠、柑桔渣等，上述碳源可以單獨、或?qū)?種以上碳源組合后使用。另外，作為氮源，如豆腐渣、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白水解物、酵母提取物、麥芽提取物、脫脂大豆粉、玉米漿、尿素等有機氮源；硝酸鉀、硫酸銨等無機氮等，上述氮源可以單獨，也可以2種以上組合使用。在本發(fā)明制造方法使用的培養(yǎng)基中，根據(jù)需要也可以添加磷酸鹽、硫酸鎂、碳酸鎂、碳酸鈉、鉀、鈣、鐵、銅、鋅、錳、等無機鹽類、維生素類等。培養(yǎng)基中的上述碳源、氮源等的濃度只要是適合使生產(chǎn)本發(fā)明培養(yǎng)物的擔子菌、特別是屬于Flammulina屬菌類充分增殖，使類酚氧化酶活性表達的濃度就可以，具體來說，碳源為0.1～20重量％、優(yōu)選1～10重量％，氮源為0.1～10重量％，優(yōu)選1～5重量％。
上述培養(yǎng)基的pH只要是適合使屬于Flammulina屬菌類充分增殖，使類酚氧化酶活性、特別是與上述基質(zhì)特異性相伴的類酚氧化酶活性以及與上述反應最適pH相稱的類酚氧化酶活性表達的pH就可以，從使與上述性質(zhì)(例如、底物特異性、反應最適pH)相稱的類酚氧化酶活性充分表達的觀點考慮，希望pH大于7.0的pH(初期pH)、優(yōu)選pH7.5～11.0，最優(yōu)選是pH8.0～10.0。因此，希望將培養(yǎng)基調(diào)整到這樣的pH，滅菌后使用。
培養(yǎng)溫度只要是絲狀體增殖的溫度就可以，實用上10～40℃為好，優(yōu)選20～35℃。
另外，對屬于Flammulina屬菌類進行液體培養(yǎng)時，最好是通氣培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)。
培養(yǎng)時間隨各種培養(yǎng)條件不同而不同，通氣培養(yǎng)時，通常為2～10天。另外，上述培養(yǎng)時間也可以以培養(yǎng)液的活性值達到最大時作為指標進行設(shè)定。
本發(fā)明的培養(yǎng)物可以分泌生產(chǎn)到菌體外，蓄積在培養(yǎng)液中。因此，可以直接使用上述培養(yǎng)液，也可以在培養(yǎng)后，通過離心分離、濾紙或濾布等過濾除去菌體等不需要的物質(zhì)，作為培養(yǎng)上清液獲得。
另外，在本發(fā)明中，對于以上述培養(yǎng)液得到的培養(yǎng)物和以培養(yǎng)上清液得到的培養(yǎng)物，如果可以使類酚氧化酶活性進一步提高，或從配合在化妝品、非醫(yī)藥品等制品的觀點考慮，也可以進行脫色、濃縮、冷凍干燥、透析、鹽析等。
另外，通過將本發(fā)明的培養(yǎng)物與各種染料、色素等一起使用，可以進行角蛋白纖維的染色。因此，本發(fā)明提供染色方法。
本發(fā)明的染色方法其一大特征是在培養(yǎng)物存在下，使染色對象物和染料接觸。按照本發(fā)明的染色方法，由于使用本發(fā)明的培養(yǎng)物，通過各種染料可以廉價而且簡便地對染色對象物進行染色。另外，按照本發(fā)明的染色方法由于使用本發(fā)明的培養(yǎng)物，不需進行特別的溫度條件、pH條件的調(diào)節(jié)，可以在外界環(huán)境條件下進行。
作為上述染色對象物，如棉、乙酰醋酸酯、亞麻、亞麻布、liocel、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、苧麻、laen、tencel、三乙酸酯、毛皮、獸皮、皮革、絹或毛制布、絲、纖維、衣料、木材、毛發(fā)、膜等。
作為上述染料，可以將例如二氫吲哚以及二氫吲哚化合物、吲哚化合物、按照非醫(yī)藥品原料規(guī)格記載的氧化染料等作為底物進行氧化，也可以使用偶聯(lián)劑。
作為二氫吲哚以及二氫吲哚化合物，具體例子如二氫吲哚、5，6-二羥基二氫吲哚、N-甲基-5，6-二羥基二氫吲哚、N-乙基-5，6-二羥基二氫吲哚、N-丁基-5，6-二羥基二氫吲哚、4-羥基-5-甲氧基二氫吲哚、6-羥基-7-甲氧基二氫吲哚、6，7-二羥基二氫吲哚、4，5-二羥基二氫吲哚、4-甲氧基-6-羥基二氫吲哚、N-己基-5，6-二羥基二氫吲哚、2-甲基-5，6-二羥基二氫吲哚、3-甲基-5，6-二羥基二氫吲哚、4-羥基二氫吲哚、2，3-二甲基-5，6-二羥基二氫吲哚、2-甲基-5-乙基-6-羥基二氫吲哚、2-甲基-5-羥基-6-β-羥基乙基二氫吲哚、4-羥基丙基二氫吲哚、2-羥基-3-甲氧基二氫吲哚、6-羥基-5-甲氧基二氫吲哚、6-羥基二氫吲哚、5-羥基二氫吲哚、7-羥基二氫吲哚、7-氨基二氫吲哚、5-氨基二氫吲哚、4-氨基二氫吲哚、5，6-二羥基二氫吲哚羧酸、1-二甲基-5，6-二羥基二氫吲哚、以及他們的鹽類等。
作為吲哚化合物，具體例子如4-羥基吲哚、5-羥基吲哚、5，6-二羥基吲哚、5，6-二羥基吲哚-2-羧酸、5，6-三(t-丁氧基羰酰氧基)吲哚、5，6-二(t-丁氧基羰酰氧基)吲哚、5-t-丁氧基羰酰氧基-6-羥基吲哚、6-t-丁氧基羰酰氧基-5-羥基吲哚、5，6-二(乙氧基羰酰氧基)吲哚、5，6-二(t-乙基氨甲酰氧基)吲哚、1-三甲基乙?；?5-(三甲基乙酰氧甲氧基)-6-三甲基乙酰氧吲哚、1-三甲基乙?；?5-三甲基乙?；跫籽趸?6-羥基吲哚、5，6-(氧羰酰甲氧基)吲哚等。
作為按照非醫(yī)藥品原料規(guī)格記載的氧化染料，具體例子如5-氨基-o-甲酚、o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、p-氨基苯酚、2，6-二氨基吡啶、5-(2-羥基乙基氨基)-2-甲基苯酚、N，N-二(β-羥基)-p-苯二胺·硫酸鹽、p-硝基-o-苯二胺、p-硝基-2’，4’-二氨基偶氮苯·硫酸鈉、甲苯-2，5-二胺、5-氨基-o-甲酚·硫酸鹽、p-氨基苯酚·硫酸鹽、o-氯-p-苯二胺·硫酸鹽、4，4’-二氨基二苯胺·硫酸鹽、p-甲基氨基苯酚·硫酸鹽、p-苯二胺·硫酸鹽、m-苯二胺·硫酸鹽、甲苯-2，5-二胺·硫酸鹽、2，4-二氨基苯氧基乙醇·鹽酸鹽、甲苯2，5-二胺·鹽酸鹽、m-苯二胺·鹽酸鹽、2，4-二氨基苯酚·鹽酸鹽、3，3-亞氨基二苯酚、p-苯二胺·鹽酸鹽、N-苯基-p-苯二胺·鹽酸鹽、N-苯基-p-苯二胺·醋酸鹽、1，5-二羥基萘、甲苯-3，4-二胺、p-甲基氨基苯酚、N，N’-二(4-氨基苯基)-2，5-二氨基-1，4-醌二亞胺、o-氨基苯酚·硫酸鹽、2，4-二氨基苯酚·硫酸鹽、m-氨基苯酚·硫酸鹽等。
在本發(fā)明中也可以使用2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、1-氨基-4-甲基氨基蒽醌、硝基-p-苯二胺鹽酸鹽、1，4-二氨基蒽醌、硝基-p-苯二胺、苦氨酸、苦氨酸鈉、2-氨基-5-硝基苯酚·硫酸鹽、間苯二酚、硝基-p-苯二胺·硫酸鹽、p-硝基-o-苯二胺·硫酸鹽、p-硝基-m-苯二胺·硫酸鹽等直接染料。
在培養(yǎng)物的存在下，染色對象物與染料的接觸可以通過例如在使用時將染料和培養(yǎng)物混合后與染色對象物接觸，或在使用時在大氣中使在厭氧條件下保存的染料和培養(yǎng)物的混合物與染色對象物接觸進行。
另外，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)物，提供染色用組合物。
本發(fā)明的染色組合物其一大特征在于含有本發(fā)明的培養(yǎng)物。因此，根據(jù)本發(fā)明的染色用組合物，于氧氣存在下、在外界環(huán)境條件下對各種染料、特別是苯酚化合物、氨基苯酚化合物、苯二胺化合物中的任一個，對最適pH無需做大的變動，發(fā)揮在中性附近的pH可以進行高效染色的優(yōu)越效果。
在本發(fā)明的組合物中，本發(fā)明的培養(yǎng)物的含量從實用的染色時間的觀點考慮，例如對毛發(fā)染色用組合物100g，類酚氧化酶活性為0.05～100KU，更好為0.5～25KU。而上述類酚氧化酶活性是用30mM的p-苯二胺作為底物，在25℃條件下，于pH7.0在1分鐘內(nèi)使490nm的吸光度增加1的量定義為1單位(Uunit)的值。
對本發(fā)明的染色用組合物其染料或色素具體可以使用上述的二氫吲哚以及二氫吲哚化合物、吲哚化合物、按照非醫(yī)藥品原料規(guī)格記載的氧化染料等，也可以使用偶聯(lián)劑。另外，也可以使用上述的直接染料。
在本發(fā)明的染色用組合物中，染料或色素的含量從實用的染色時間的觀點考慮，染色用組合物中為0.0005～12重量％，優(yōu)選0.005～6重量％。
另外，本發(fā)明的染色用組合物也可以通過用表現(xiàn)本發(fā)明培養(yǎng)物的生理活性的染色用酸、堿、他們的緩沖液等調(diào)整pH。具體例子如鹽酸、硫酸等無機酸；膦酸、醋酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、磺酸等有機酸；氨；單異丙醇胺、單乙醇胺等胺類；碳酸銨等碳酸鹽類；氫氧化鈉、氫氧化鉀等氫氧化物鹽等。
在本發(fā)明的染色用組合物中在不損害類酚氧化酶活性的范圍內(nèi)，可以配合硫代乳酸、亞硫酸鈉、N-乙酰-L-半胱氨酸等還原劑。另外，在不損害本發(fā)明效果的范圍內(nèi)，除了上述成分之外，也可以適當配合表面活性劑、油性成分、硅氧烷類、增粘劑、溶劑、水、螯合劑、香料等。
另外，在將本發(fā)明的染色用組合物作為毛發(fā)用的染色用組合物時，例如可以在厭氧條件下，作為含有染料和培養(yǎng)物的一個包裝式染色用組合物，通過使用時涂布于毛發(fā)上，與空氣接觸，進行毛發(fā)染色。另外，作為在含有培養(yǎng)物的組合物和含有染料的組合物的多包裝式染色用組合物，也可以在使用時，將兩個組合物混合后涂布于毛發(fā)上進行毛發(fā)染色。另外，本發(fā)明的染色用組合物可以做成液劑、膏劑、凝膠劑等各種適于各種染色的劑型使用。
本發(fā)明的培養(yǎng)物由于具有類酚氧化酶活性，所以除了上述的纖維和毛發(fā)的染色之外，對于紙漿和纖維的漂白、廢液中的酚化合物的去除、內(nèi)分泌紊亂物質(zhì)的分解、酚醛樹脂的制造、人工漆涂料的制造、木質(zhì)的改善等的利用也是有用的。
以下通過實施例對本發(fā)明進一步進行詳細說明，但本發(fā)明并不受這些實施例的任何限定。
實施例1 Flammulina velutipes(IFO 30601)的培養(yǎng)物的制備(1)培養(yǎng)物的制備1在凈化臺內(nèi)進行以下操作。
在含有固體培養(yǎng)用瓊脂培養(yǎng)基[組成2.4重量％土豆葡萄糖培養(yǎng)液[Difco公司生產(chǎn)]、2.0重量％瓊脂、其余為水]10ml的滅菌培養(yǎng)皿中接種相當于1白金環(huán)量的Flammulina velutipes(IFO 30601)，于25℃下培養(yǎng)10天。然后，用滅菌的白金環(huán)將在瓊脂培養(yǎng)基整體中成長的菌絲體切成每邊5mm的四方小片。
將上述小片10片接種到液體培養(yǎng)用培養(yǎng)基1[組成2.4重量％土豆葡萄糖培養(yǎng)液[Difco公司生產(chǎn)]、其余為水(pH5.2)；于121℃下滅菌15分鐘]，于25℃下反復振蕩培養(yǎng)(反復150次/分)7天。
將得到的培養(yǎng)液全量都添加到2L的三角燒瓶中的500ml的上述液體培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，于25℃下反復振蕩培養(yǎng)(反復100次/分)3周。
然后，使成長的片狀菌絲體靜置沉淀，除去培養(yǎng)液，向剩下的菌絲體中添加液體培養(yǎng)用培養(yǎng)基2[組成1.0重量％葡萄糖、0.1重量％酵母提取液、0.14重量％(NH4)2SO4、0.36重量％K2HPO4、0.02重量％MgSO4·7H2O、0.1％無機混合物(組成1.0重量％CuSO4·5H2O、1.0重量％ZnCl2、0.7重量％FeCl3·6H2O、0.5重量％CoSO4·7H2O、0.5重量％MnCl2·4H2O)、pH9.2；于121℃下滅菌15分鐘]500ml，再于25℃下培養(yǎng)3天。
然后，使成長的片狀菌絲體靜置沉淀，通過傾析回收培養(yǎng)物。得到的培養(yǎng)物是淡黃色、或黃褐色的清澄或混濁的液體。
(2)培養(yǎng)物的制備2將上述(1)得到的Flammulina velutipes IFO 30601的培養(yǎng)物進行減壓過濾后得到濾液。
將上述濾液的pH用氫氧化鈉調(diào)整到7.5。對于1L得到的混合物，添加5g的DEAE-cellulose[Sigma公司生產(chǎn)]載體，于4℃下振蕩攪拌30分鐘。然后，靜置10分鐘，除去上清。
向得到的DEAE-cellulose載體中添加含有該載體3倍容量的1M氯化鈉的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.5)。對得到的混合物進行5分鐘振蕩攪拌，將吸附在DEAE-cellulose載體上的蛋白質(zhì)洗脫下來。對得到的洗脫液進行減壓過濾后回收，于4℃下對去離子水進行透析，將得到的的產(chǎn)物進行冷凍干燥，作為冷凍干燥產(chǎn)物得到培養(yǎng)物。
實施例2 本發(fā)明的培養(yǎng)物的反應最適溫度使上述實施例1的(2)中得到的培養(yǎng)物(冷凍干燥產(chǎn)物)102mg(蛋白質(zhì)質(zhì)量23mg、比活性15U/mg蛋白質(zhì))溶解(終濃度為0.02mg蛋白質(zhì)/ml)，得到培養(yǎng)物。
就得到的培養(yǎng)物在各種溫度條件(0、20、30、40、50、60、70以及80℃)下測定類酚氧化酶活性。具體來說，當以o-氨基苯酚作為底物時，在微量離心管[PorexBioProducts Inc.公司生產(chǎn)]中，將100mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)0.89ml、50m的Mo-氨基苯酚的二甲基亞砜溶液0.1ml和培養(yǎng)物溶液0.01ml混合，對得到的混合物于各個反應溫度下進行10分鐘反應。然后，通過向反應液添加2M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3.0)0.1ml，使反應停止。另外當以2，6-二甲氧基苯酚作為底物時，除了在上述的o-氨基苯酚作為底物時取代o-氨基苯酚，使用50mM 2，6-二甲氧基苯酚水溶液外，其他都進行同樣的操作。
然后，對于得到的各個反應產(chǎn)物通過分光光度計[Jasco公司生產(chǎn)，商品名V-530]測定，當以o-氨基苯酚作為底物時，通過測定420nm的吸光度，評價活性，當以2，6-二甲氧基苯酚作為底物時，通過測定470nm的吸光度，評價活性。上述活性是以在1分鐘內(nèi)使吸光度增加1的量作為1單位(Uunit)。結(jié)果如圖1所示。在圖1中，以最大活性作為100，活性用相對活性表示。其中圖A表示以2，6-二甲氧基苯酚作為底物的情形，圖B表示以o-氨基苯酚作為底物的情形。
就象圖1所表示的那樣，可知本發(fā)明的培養(yǎng)物的反應最適溫度在20～60℃。
實施例3 本發(fā)明的培養(yǎng)物的熱穩(wěn)定性將與上述實施例2同樣的培養(yǎng)物溶液在各種溫度條件(0、20、30、40、50、60、70以及80℃)下，于0.18ml的100mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中溫育60分鐘，進行前處理。
當以o-氨基苯酚作為底物時，在微量離心管中，將得到的產(chǎn)物0.05ml、100mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)0.85ml、50mM o-氨基苯酚的二甲基亞砜溶液0.1ml充分混合，通過分光光度計[Jasco公司生產(chǎn)，商品名V-530]測定420nm下所得的混合物吸光度的變化，評價活性。另外當以2，6-二甲氧基苯酚作為底物時，在與上述以o-氨基苯酚作為底物的情況相比，除了用50mM 2，6-二甲氧基苯酚水溶液取代50mM的o-氨基苯酚二甲亞砜溶液外，其他進行同樣的操作，通過測定470nm吸光度的變化，評價活性。而上述活性是以在1分鐘內(nèi)使吸光度增加1的量作為1單位(Uunit)。結(jié)果如圖2所示。在圖2中，以最大活性作為100，活性用相對剩余活性表示。其中圖A表示以2，6-二甲氧基苯酚作為底物的情形，圖B表示以o-氨基苯酚作為底物的情形。
就象圖2所表示的那樣，本發(fā)明的培養(yǎng)物，對于2，6-二甲氧基苯酚，一直到40℃仍表現(xiàn)出84％的相對剩余活性，在50℃，表現(xiàn)出45％的剩余活性，在60℃表現(xiàn)出22％的相對剩余活性。對于o-氨基苯酚，本發(fā)明的培養(yǎng)物一直到40℃還表現(xiàn)出91％的相對剩余活性，在50℃表現(xiàn)出62％的剩余活性，在60℃表現(xiàn)出40％的相對剩余活性。
實施例4 本發(fā)明的培養(yǎng)物的最適pH在本發(fā)明的培養(yǎng)物和各個底物反應時，作為緩沖液，根據(jù)pH使用0.2M甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH11.5、pH10.5、pH9.5)、0.2M Tris-HCl緩沖液(pH10.0、pH9.0、pH8.0、pH7.0)、0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.5、pH7.0、pH6.5、pH6.0、pH5.5)、0.2M醋酸鈉緩沖液(pH5.5、pH5.0、pH4.5、pH4.0、pH3.5)以及0.2M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH4.0、pH3.5、pH3.0、pH2.0)。
當以o-氨基苯酚作為底物時，在微量離心管中，將與實施例2同樣的培養(yǎng)物溶液0.02ml、上述各緩沖液0.88ml、50mM的o-氨基苯酚的二甲基亞砜溶液0.1ml充分混合，對于得到的混合物通過分光光度計[Jasco公司生產(chǎn)，商品名V-530]測定420nm吸光度的變化，評價活性。另外當以2，6-二甲氧基苯酚作為底物時，與上述以o-氨基苯酚作為底物的情況相比，除了用50mM 2，6-二甲氧基苯酚水溶液取代50mM o-氨基苯酚二甲亞砜溶液外，其他進行同樣的操作，通過測定470nm的吸光度的變化，評價活性。
當以p-苯二胺作為底物時，在反應時，作為緩沖液，根據(jù)pH使用0.1M Tris-HCl緩沖液(pH9.0、pH8.0、pH7.5、pH7.0)、0.1M磷酸鈉緩沖液(pH9.0、8.5、8.0、pH7.5、pH7.0、pH6.5、pH6.0)、0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH8.0、pH7.5、pH7.0、pH6.5、pH6.0、pH5.0、pH4.0、pH3.0)。在微量離心管中，將上述培養(yǎng)物溶液5μl、上述各緩沖液0.895ml、100mM p-苯二胺水溶液充分混合，對于得到的混合物通過分光光度計[Jasco公司生產(chǎn)，商品名V-530]測定490nm吸光度的變化，評價活性。
而上述活性是以在1分鐘內(nèi)使吸光度增加1的量作為1單位(Uunit)。結(jié)果如圖3所示。在圖3中，以最大活性作為100，活性用相對活性表示。其中圖A表示以2，6-二甲氧基苯酚作為底物的情形，圖B表示以o-氨基苯酚作為底物的情形，圖C表示以p-苯二胺作為底物的情形。
就象圖3所表示的那樣，可知本發(fā)明的培養(yǎng)物，在以2，6-二甲氧基苯酚作為底物的情形中，最適pH約6.0；在以o-氨基苯酚作為底物的情形中，最適pH約6.0；在以p-苯二胺作為底物的情形中，最適pH約6.5～8.0。
實施例5 本發(fā)明的培養(yǎng)物的pH穩(wěn)定性將與上述實施例2同樣的培養(yǎng)物溶液0.02ml與pH2～11.5的各種緩沖液0.18ml混合后，通過于30℃下溫育1小時或20小時，進行前處理。在進行前處理時，作為緩沖液，根據(jù)pH使用0.2M甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH11.5、pH10.5、pH9.5)、0.2M Tris-HCl緩沖液(pH9.0、pH8.0)、0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.0、pH6.0)、0.2M醋酸鈉緩沖液(pH5.0、pH4.0)以及0.2M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3.0、pH2.0)。
然后在微量離心管中，將前處理后的培養(yǎng)物溶液0.02ml、上述緩沖液0.88ml、50mM o-氨基苯酚的二甲基亞砜溶液0.1ml充分混合，對于得到的混合物通過分光光度計[Jasco公司生產(chǎn)，商品名V-530]測定420nm吸光度的變化，評價活性。另外當以2，6-二甲氧基苯酚作為底物時，與以上述o-氨基苯酚作為底物的實驗相比，除了用50mM 2，6-二甲氧基苯酚水溶液取代50mM o-氨基苯酚二甲亞砜溶液外，其他進行同樣的操作，通過測定470nm的吸光度的變化，評價活性。而上述活性是以在1分鐘內(nèi)使吸光度增加1的量作為1單位(Uunit)。結(jié)果如圖4所示。在圖4中，以最大活性作為100，用相對剩余活性表示。其中圖A和B表示以2，6-二甲氧基苯酚作為底物的情形，圖C和D表示以o-氨基苯酚作為底物的情形。另外圖A和C表示1小時后的pH穩(wěn)定性，圖B和D表示20小時后的pH穩(wěn)定性。
就象圖4所表示的那樣，本發(fā)明的培養(yǎng)物在處理1小時的情況下在pH6.0～10.0穩(wěn)定，保持75％的相對剩余活性。另外在處理20小時的情況下在pH7.0～9.0穩(wěn)定，保持75％的相對剩余活性。
實施例6 本發(fā)明的培養(yǎng)物的底物特異性為了研究培養(yǎng)物的底物特異性，使用p-苯二胺、4-羥基吲哚、2-甲氧基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、鄰苯二酚、p-氨基苯酚、o-氨基苯酚、ABTS、シリンガルダジン、L-酪氨酸作為底物，具體來說是在微量離心管中將上述培養(yǎng)物溶液0.05ml、0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)0.85ml、底物溶液(使用1mM濃度的L-酪氨酸、1.1mM濃度的シリンガルダジン，其他為50mM的濃度)0.1ml充分混合，對于得到的混合物通過分光光度計[Jasco公司生產(chǎn)，商品名V-530]測定420nm吸光度的變化，評價活性。而上述活性是以在1分鐘內(nèi)使吸光度增加1的量作為1單位(Uunit)。結(jié)果如表1所示。
表1

由表1的結(jié)果可知，本發(fā)明的培養(yǎng)物具有類酚氧化酶活性。
以下，就實施例1的(2)中得到的培養(yǎng)物的底物特異性通過測定含有各個底物的緩沖液的吸光度的變化研究由于培養(yǎng)物的作用發(fā)生的各種底物的化學變化。
作為底物，使用市售的色素(Evans’Blue、Acid Blue 80、RemazolBrilliant Blue R、靛蘭胭脂紅、Acid Violet 17、Natural Orange6)、以及木質(zhì)素(商品名Lignin Allkali、東京化成公司生產(chǎn))。
表2給出了對于各個底物的終濃度以及測定波長。
表2

具體來說，將含有調(diào)整到表2所示終濃度的底物的105.3mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)950μl于25℃下預溫育5分鐘，然后向得到的產(chǎn)物添加培養(yǎng)溶液50μl，使其在比色杯內(nèi)反應，用分光光度計(島津制作所生產(chǎn)、商品名UV-2450)測定于各個底物的測定波長下的吸光度。為了進行比較，將上述的緩沖液換成105.3mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，也對來漆斑菌屬菌類的膽紅素氧化酶進行同樣研究。
而活性的1個單位[U(unit)]定為在1分鐘內(nèi)使吸光度減少1的量。對于來自培養(yǎng)物的活性，表3給出了各個底物的比活性(U/mg蛋白質(zhì))。在表3中，沒有符號標記的比活性表示分解活性或脫色活性，-(負號)表示的比活性表示聚合活性。
表3

就象表3所表示的那樣，可知本發(fā)明的培養(yǎng)物催化在中性條件下偶氮系色素、蒽醌系色素以及Acid Violet 17的氧化脫色反應、木質(zhì)素的氧化分解反應、靛蘭胭脂紅以及Natural Orange 6的氧化聚合反應。特別是能激烈催化Remazol Brilliant Blue R的氧化脫色反應以及木質(zhì)素的氧化分解反應。另外，本發(fā)明的培養(yǎng)物與用于比較的來自Myrothecium屬菌類的膽紅素氧化酶對Remazol Brilliant BlueR、靛蘭胭脂紅以及Acid Violet 17的特異性有很大不同。
以下，就在上述實施例1的(2)得到的培養(yǎng)物的氧化偶聯(lián)反應以本發(fā)明的培養(yǎng)物催化的由底物(氫供體)和4-氨基安替比林的氧化縮合引起的發(fā)色作為指標進行測定。
作為氫供體，使用酚化合物(酚、2-甲氧苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、鄰苯二酚、澡苯二酚、對苯二酚、鄰苯三酚、沒食子酸、沒食子酸丙酯、1-萘酚、兒茶酸)、氨基苯酚化合物(o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、p-氨基苯酚)、二氨基苯酚化合物(o-苯二胺、m-苯二胺、p-苯二胺)以及雜環(huán)化合物(5-羥基吲哚、2，6-二氨基吡啶)。
向含有4-氨基安替比林和任意氫供體的反應體系添加上述培養(yǎng)溶液后，對于酚化合物、二氨基苯酚化合物以及雜環(huán)化合物通過測定490nm的吸光度的變化，對于氨基苯酚通過測定450nm的吸光度的變化，測定本發(fā)明的培養(yǎng)物的活性。另外，對于難溶于水的底物，可以使用使該底物溶解于少量的二甲基亞砜，用去離子水稀釋到目的濃度后的溶液。表4給出了各個底物的測定波長和終濃度。另外，表4中，DMSO是二甲基亞砜的略稱。
表4

表中，「％」表示體積/體積％。
具體來說，在96孔的微滴定板[Corning公司生產(chǎn)，Costor(登錄商標)3368]的孔內(nèi)將含有0.4μmol的底物和4μmol 4-氨基安替比林的105.3mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)190μl于25℃下預溫育5分鐘。然后向得到的產(chǎn)物添加上述培養(yǎng)溶液10μl，溫育1小時。對得到的產(chǎn)物測定490nm或450nm的吸光度的變化。關(guān)于氧化偶聯(lián)反應的活性以在1分鐘內(nèi)使吸光度增加1的量作為1個單位(Uunit)。
另外，為了進行比較，將上述的緩沖液換成105.3mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)也對來自漆斑菌屬菌類的膽紅素氧化酶進行同樣研究。表5給出了對各個底物的比活性(U/mg蛋白質(zhì))。
表5

就象表5所表示的那樣，本發(fā)明的培養(yǎng)物催化在中性條件下各種酚化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物和苯胺化合物的4-氨基安替比林的氧化偶聯(lián)反應。對于酚化合物，本發(fā)明的培養(yǎng)物對沒食子酸以及沒食子酸丙酯以外的化合物表現(xiàn)出高活性。其中，對2-甲氧苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、鄰苯二酚、1-萘酚、兒茶酸的活性特別高。對于氨基苯酚化合物，本發(fā)明的培養(yǎng)物對所有的化合物都表現(xiàn)出高活性。其中，對o-氨基苯酚以及p-氨基苯酚活性特別高。對于二氨基苯酚化合物，本發(fā)明的培養(yǎng)物對全部化合物都表現(xiàn)出高活性。對于雜環(huán)化合物，本發(fā)明的培養(yǎng)物對全部的化合物都表現(xiàn)出高活性。其中對2，6-二氨基吡啶活性特別高。
就象表5所表示的那樣，可知本發(fā)明的培養(yǎng)物與來自漆斑菌屬菌類的膽紅素氧化酶底物特異性有很大不同，比活性也高。
另外，對于上述實施例中得到的培養(yǎng)物的直接氧化反應，通過以本發(fā)明的培養(yǎng)物直接作用于底物產(chǎn)生的、由于底物氧化聚合生成的發(fā)色作為指標進行測定。
作為底物，使用二氨基苯酚化合物(2-氯-1，4-苯二胺、p-苯二胺、2，5-二氨基甲苯、N-苯基-p-苯二胺、二苯乙烯-3，4-二胺、m-苯二胺)、氨基苯酚化合物(o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、5-氨基-o-甲基苯酚、p-氨基苯酚、p-甲基氨基苯酚)、以及酚化合物(2，6-二甲氧基苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚、鄰苯三酚、沒食子酸、沒食子酸丙酯、1-萘酚、1，5-二氫萘、2，3，4-三羥基苯酮、2，3，4，4-四羥基苯酮)。對于難溶于水的底物，可以使用使該底物溶解于少量的二甲基亞砜，用去離子水稀釋到目的濃度后的溶液。表6給出了各個底物的測定波長和終濃度。另外，表6中，「％」表示體積/體積％。
表6

具體來說，在96孔的微滴定板[Corning公司生產(chǎn)，Costor(登錄商標)3368]的孔內(nèi)將含有0.1mmol的底物的0.89mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)180μl于25℃下預溫育1分鐘。然后向得到的產(chǎn)物添加上述培養(yǎng)溶液20μl。對得到的產(chǎn)物測定490nm、450nm或405nm的吸光度的變化。關(guān)于直接氧化反應的活性以在1分鐘內(nèi)使吸光度增加1的量作為1個單位(Uunit)。
另外，為了進行比較，對來自漆樹的漆酶以及來自漆斑菌屬菌類的膽紅素氧化酶也同樣研究在pH7.0的底物特異性。
表7給出了將代表性的化學染料2-氯-1，4-苯二胺作為底物時的測定值定為100的有關(guān)各個底物的相對活性(％)。
表7

就象表7所表示的那樣，本發(fā)明的培養(yǎng)物催化在中性條件(pH7.0)下各種二氨基苯酚化合物、氨基苯酚化合物和酚化合物直接氧化反應。至于二氨基苯酚化合物，對除了m-苯二胺以外的化合物都表現(xiàn)出了高活性。其中，對p-苯二胺以及N-苯基-p-苯二胺的活性特別高。至于氨基苯酚化合物，對除了m-氨基苯酚以外的化合物都表現(xiàn)出了高活性。其中，對o-氨基苯酚、p-氨基苯酚以及p-甲基氨基苯酚的活性特別高。至于酚化合物，對2，6-二甲氧基苯酚、間苯二酚、2，3，4-三羥基苯酮以及2，3，4，4-四羥基苯酮的活性特別高。其中，2，3，4-三羥基苯酮以及2，3，4，4-四羥基苯酮的活性更特別高。
另外，本發(fā)明的培養(yǎng)物與來自漆樹的漆酶比較，對p-苯二胺、m-苯二胺、o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、5-氨基-o-甲基苯酚、p-氨基苯酚、以及2，6-二甲氧基苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚、沒食子酸、沒食子酸丙酯、2，3，4-三羥基苯酮以及2，3，4，4-四羥基苯酮的活性更高，其中對m-苯二胺、o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、5-氨基-o-甲基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、鄰苯二酚、對苯二酚、沒食子酸的活性更高。
另外，本發(fā)明的培養(yǎng)物與來自漆斑菌屬菌類的膽紅素氧化酶比較，對p-苯二胺、2，5-二氨基甲苯、二苯乙烯-3，4-二胺、o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、5-氨基-o-甲基苯酚、p-氨基苯酚、p-甲基氨基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、鄰苯二酚、對苯二酚、沒食子酸丙酯、1-萘酚、2，3，4-三羥基苯酮以及2，3，4，4-四羥基苯酮活性更高，其中對o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、5-氨基-o-甲基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、對苯二酚、1-萘酚、2，3，4-三羥基苯酮以及2，3，4，4-四羥基苯酮活性更高。
實施例7 利用本發(fā)明的培養(yǎng)物進行染色(1)本發(fā)明的培養(yǎng)物的染色性利用上述實施例1得到的培養(yǎng)物進行染色試驗。利用上述培養(yǎng)物通過氧化聚合，用染料(p-苯二胺以及o-氨基苯酚)對牦牛毛線和羊毛織物進行染色。即，將染料0.5g(使用兩種染料時，合計1.0g)、作為增粘劑的羥乙基纖維素(HEC)0.75g、作為表面活性劑的聚氧乙烯(20)硬化蓖麻油(HC-20)1.0g、乳酸0.5g混合，用單乙醇胺將pH調(diào)整到7，用離子交換水將重量調(diào)到50g，得到基材。
將上述基材2g和上述培養(yǎng)物溶液(相當于3.5U的量)混合，將得到的混合物涂布在牦牛毛線1g和羊毛織物1塊(2×3cm)。涂布后的牦牛毛線和羊毛織物于30℃下保持1小時。上述培養(yǎng)物溶液中的活性是以p-苯二胺作為底物，于pH7.0、25℃的條件下的活性。
對被染色的牦牛毛線和羊毛織物，使用色差計(Minolta公司生產(chǎn)、商品名Chromometer CM-3610d)，測定L值、a值、b值。然后根據(jù)上述的L值、a值、b值，利用式1ΔE=(ΔL)2+(Δa)2+(Δb)2]]>算出ΔE值，通過這個ΔE值評價染色性。另外，上述ΔE值表示染色前的牦牛毛線和羊毛織物的色調(diào)和染色后的牦牛毛線和羊毛織物的色調(diào)色差。為了進行比較，對于來自漆樹的漆酶也進行同樣的染色試驗。
表8給出了對于各個底物的ΔE值。
表8

就象表8所表示的那樣，利用本發(fā)明的培養(yǎng)物對于牦牛毛線和羊毛織物，無論哪一個染料的組合都證實明顯的染色性。另外，本發(fā)明的培養(yǎng)物與用于比較的來自漆樹的漆酶進行比較，雖然在p-苯二胺單獨、o-氨基苯酚+p-苯二胺中染色性稍微差些，但在單獨的o-氨基苯酚以及o-氨基苯酚+m-苯二胺中，卻明顯地表現(xiàn)出染色性方面的優(yōu)越性。
(2)本發(fā)明的培養(yǎng)物的使用量的研究改變在上述實施例1中得到的培養(yǎng)物的使用量，利用本發(fā)明的培養(yǎng)物進行染色試驗。使用本發(fā)明的培養(yǎng)物氧化的染料(o-氨基苯酚)，通過氧化聚合對牦牛毛線和羊毛織物進行染色，用色差計測定L值、a值、b值。
具體來說，將作為染料(底物)的o-氨基苯酚0.5g、作為偶聯(lián)劑的m-苯二胺0.5g、作為增粘劑的羥乙基纖維素(HEC)0.75g，作為表面活性劑的聚氧乙烯(20)蓖麻油(HC-20)1.0g和乳酸0.5g混合，用單乙醇胺將pH調(diào)整到7，用離子交換水將重量調(diào)到50g，得到基材。
對于牦牛毛線1g和羊毛織物1塊(2×3cm)，將上述基材2g和作為蛋白質(zhì)量的調(diào)整到0至0.8mg的培養(yǎng)物溶液混合，將得到的混合物涂布在牦牛毛線1g和羊毛織物1塊(2×3cm)。涂布后的牦牛毛線和羊毛織物于30℃下保持1小時。
對被染色的牦牛毛線和羊毛織物，使用色差計(Minolta公司生產(chǎn)、商品名Chromometer CM-3610d)，測定L值、a值、b值。然后根據(jù)上述的L值、a值、b值，算出ΔE值，通過這個ΔE值評價染色性。圖5給出了因本發(fā)明的培養(yǎng)物的使用量不同，ΔE值的變化。圖5的圖A是使用牦牛毛線的結(jié)果，而圖B表示使用羊毛織物時的結(jié)果。
就象圖5所表示的那樣，在牦牛毛線和羊毛織物中，通過使本發(fā)明的培養(yǎng)物的使用量增加，ΔE值增加，在牦牛毛線中的ΔE值使用相當于0.2mg蛋白質(zhì)的量的本發(fā)明的培養(yǎng)物時達到一定值，在羊毛織物中的ΔE值使用相當于0.5mg蛋白質(zhì)的量的本發(fā)明的培養(yǎng)物時達到一定值。
實施例8 類酚氧化酶活性的誘導條件的研究
(1)菌體的培養(yǎng)將在上述實施例1(1)中得到的培養(yǎng)物(液體培養(yǎng)物)于弱酸性至弱堿性范圍的5個培養(yǎng)pH(初期pHpH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0)條件的液體培養(yǎng)液培養(yǎng)基2(實施例1所述的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，研究氧化活性(類酚氧化酶活性誘導)的差異。
對上述液體培養(yǎng)物充分攪拌，將得到的培養(yǎng)物0.5ml添加到100ml的活性誘導培養(yǎng)基中，于28℃的恒溫槽內(nèi)振蕩培養(yǎng)(振蕩速度130次/分)10天。
每天，取1ml培養(yǎng)物，于4℃、12,000rpm下離心分離5分鐘，將上清液通過用DISMIC-25cs(0.20μm)過濾，除去菌體。
將得到的樣品保存在4℃下。
(2)通過培養(yǎng)pH條件不同引起活性誘導的變化的研究通過測定上述(1)中得到的各個樣品的類酚氧化酶活性，研究因培養(yǎng)pH條件不同引起活性誘導的變化。
類酚氧化酶活性的測定作為底物使用2，6-二甲氧基苯酚、在pH6.0的反應pH條件下，測定類酚氧化酶活性。
將500mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)0.20ml、去離子蒸餾水0.65ml、50mM上述底物溶液0.10ml和培養(yǎng)物0.05ml添加到半微量比色杯中，攪拌，于室溫下用商品名UV-2400(島津制作所生產(chǎn))測定0～30秒的470nm的吸光度的變化。圖6給出了因培養(yǎng)pH條件不同引起活性誘導的變化。
由上述結(jié)果可知，就象圖6所表示的那樣，使用的培養(yǎng)基的pH越高，在2，6-二甲氧基苯酚的反應最適pH，即pH6.0中的酶活性越高。特別是當使用的培養(yǎng)基的pH大于7.0(培養(yǎng)時在pH7.3前后)時，在2，6-二甲氧基苯酚的反應最適pH的pH6.0中的酶活性變高。
另外，當使用的培養(yǎng)基的pH為pH5.0時，即使對菌體培養(yǎng)10天，也檢測不到對2，6-二甲氧基苯酚的酶活性。
另外就象圖6所表示的那樣，當使用的培養(yǎng)基的pH為pH9.0時，培養(yǎng)到第10天的活性與使用的培養(yǎng)基的pH為pH6.0時，培養(yǎng)到第10天的活性比，可知活性大約高10倍(0.283/0.027)。
因此，可知培養(yǎng)物中的類酚氧化酶活性通過使用pH大于7.0的pH培養(yǎng)基，可以進一步被誘導。
試驗例(1)菌體的培養(yǎng)用攪拌器將250g大豆破碎，將得到的破碎物加入到1L容量茄型燒瓶中，再添加750ml己烷。將得到的混合物用玻璃棒攪拌到己烷變?yōu)榈S色后，通過油浴在85℃加熱。加熱開始后1小時停止加熱，將得到的產(chǎn)物用ADVATEC公司生產(chǎn)的No.2濾紙過濾。
然后將得到的過濾物再進行抽濾過濾。于通風廚內(nèi)放置24小時，使己烷蒸發(fā)，使得到的大豆粕干燥。
然后，制備培養(yǎng)基(組成2.0重量％葡萄糖、1.0重量％蔗糖、2.0重量％大豆粕、0.5重量％玉米漿、0.1重量％K2HPO4、0.05重量％MgSO4·7H2O、10γ/ml，F(xiàn)eCl2·6H2O、pH6.0)。這樣的培養(yǎng)基就是特開昭60-156385號公報所述的培養(yǎng)基。
將上述實施例1(1)得到的培養(yǎng)物(液體培養(yǎng)物)0.2ml添加到加了上述培養(yǎng)基30ml的300ml容量的三角燒瓶中，于28℃的恒溫槽內(nèi)振蕩培養(yǎng)(振蕩速度130次/分)4天。然后，將得到的培養(yǎng)液添加到加了上述培養(yǎng)基300ml的2L容量的三角燒瓶中，于20～25℃的室溫條件下，振蕩培養(yǎng)(振蕩速度130次/分)4天。
培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液用ADVATEC公司生產(chǎn)的No.2濾紙，抽濾過濾，除去菌體。然后，將得到的濾液于4℃、14,800rpm(30,000×g)下離心分離30分鐘，將得到的上清液作為培養(yǎng)物。得到的培養(yǎng)物保存在4℃下。
(2)因反應pH條件不同引起的酶活性變化在類酚氧化酶活性的測定中，作為底物分別使用2，6-二甲氧基苯酚以及p-苯二胺。另外在類酚氧化酶活性的測定中，在pH2.5～4.0范圍使用甘氨酸鹽酸緩沖液、在pH4.0～5.5范圍使用醋酸鈉緩沖液、在pH5.5～7.5范圍使用磷酸鈉緩沖液、在pH7.5～8.5范圍使用Tris-HCl鹽酸緩沖液、在pH8.5～11.0范圍使用甘氨酸氫氧化鈉緩沖液。另外，使用p-苯二胺作為底物時，在類酚氧化酶活性的測定時，在pH3.0～7.0也可以使用檸檬酸鈉緩沖液進行測定。
將500mM上述緩沖液0.20ml、去離子蒸餾水0.65ml、50mM上述底物溶液0.10ml和培養(yǎng)物0.05ml添加到半微量比色杯中，攪拌，于室溫下用商品名UV-2400(島津制作所生產(chǎn))測定0～30秒的470nm的吸光度的變化。另外，對于上述實施例1中得到的本發(fā)明的培養(yǎng)物也同樣測定類酚氧化酶活性。圖7給出了這些測定結(jié)果。
結(jié)果表明，與實施例1得到的本發(fā)明的培養(yǎng)物(圖7圖C和圖D)情形相比，上述(1)中得到的培養(yǎng)物(圖7的圖A和B)，無論使用哪一種底物在酸性一側(cè)都有最適pH。
由此可知，本發(fā)明的培養(yǎng)物中的類酚氧化酶活性與通過在pH6.0的條件下培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物的類酚氧化酶活性明顯不同。
處方例以下給出本發(fā)明涉及到的染色用組合物的處方例。將以下的組合物運用于白發(fā)，可以將白發(fā)染成黑色。配合量為重量％。
處方例1(凝膠型)p-苯二胺 1.5間苯二酚 0.3m-間氨基苯酚 0.1實施例1(2)的培養(yǎng)物 0.1抗壞血酸鈉 1.0羥乙基纖維素 1.0檸檬酸 適量單乙醇胺 調(diào)整到pH7.0精制水 余下部分合計 100.0處方例2(膏型)p-苯二胺 1.0p-氨基苯酚 0.8m-氨基苯酚 0.1十六醇 6.0
實施例1(2)的培養(yǎng)物 0.05聚氧乙烯(20)十六醚 4.0硬脂?；谆然@1.0L-半胱氨酸鹽酸鹽0.2檸檬酸 適量單乙醇胺調(diào)整到pH7.0精制水 余下部分合計100.0處方例3(膏型)5，6-二羥基二氫吲哚 1.05，6-二羥基吲哚-2-羧酸 0.5o-氨基苯酚 0.5乙醇5.0十八醇 1.5實施例1(2)的培養(yǎng)物 0.2聚氧乙烯(40)硬化蓖麻油 3.0聚甘油脂肪酸酯 4.0N-乙酰半胱氨酸 0.1黃原酸膠0.5ACCULIN(注冊商標)22 0.1羥乙基纖維素0.1單異丙醇胺 適量單乙醇胺適量精制水 余下部分合計100.0處方例4(氣溶膠型)甲苯-2，5-二胺 1.5p-氨基苯酚 0.2間苯二酚0.1m-氨基苯酚 0.1
聚氧乙烯(15)十六醚 2.0丙二醇 5.0亞硫酸鈉0.3單乙醇胺適量檸檬酸 適量實施例1(2)的培養(yǎng)物 0.3液化石油氣 4.0精制水 余下部分合計100.0產(chǎn)業(yè)上利用可能性利用本發(fā)明的培養(yǎng)物可用于纖維毛發(fā)的染色、紙漿和纖維的漂白、廢液中的酚化合物的去除、內(nèi)分泌紊亂物質(zhì)的分解、酚醛樹脂的制造、人工漆涂料的制造、木質(zhì)的改善等，并可廉價、而且簡便地進行。利用本發(fā)明的培養(yǎng)物的制造方法可以簡便、廉價、而且大量獲得上述培養(yǎng)物。另外，利用本發(fā)明的染色方法以及染色用組合物，在外界環(huán)境條件下對各種染料、特別是苯酚化合物、氨基苯酚化合物、苯二胺化合物中的任一種最適pH無需做大的變動，在中性附近的pH可以高效地、廉價、而且簡便地對染色對象物進行染色，在纖維和毛發(fā)的染色中也有用。
權(quán)利要求
1.一種具有類酚氧化酶活性、來自Flammulina屬的菌類的培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物具有選自下述①-⑤中的至少一種底物特異性①催化式(I)所示的伊文思藍(Evans’Blue) 式(II)所示的Acid Blue 80 式(III)所示的Remazol Brilliant Blue R， 以及式(IV)所示的Acid Violet 17 分別進行氧化脫色反應[脫色活性]、②催化對木質(zhì)素的氧化分解反應[氧化分解活性]、③催化式(V) 所示的靛藍胭脂紅(インデイゴカルミン)、以及式(VI) 所示的Natural Orange 6的氧化聚合反應[氧化聚合活性]④催化選自4-氨基安替比林與選自酚類化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及雜環(huán)化合物中的一種化合物的氧化偶聯(lián)反應[氧化偶聯(lián)活性]、⑤催化對選自從酚類化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及雜環(huán)化合物中的一種化合物的直接氧化反應[直接氧化活性]。
2.權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物，其特征在于所述的Flammulina屬的菌類是Flammulina velutipes。
3.權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)物，其特征在于所述的Flammulinavelutipes是Flammulina velutipes IFO 30601。
4.權(quán)利要求1～3中任意一項所述的培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物可以通過在pH大于7.0的條件下對所述的Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)，再從得到的培養(yǎng)液中除去菌絲體得到。
5.一種具有類酚氧化酶活性的來自Flammulina屬的菌類的培養(yǎng)物，所述的培養(yǎng)物是通過在pH大于7.0的條件下對Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)液中除去菌絲體得到的。
6.權(quán)利要求1～5中任意一項所述的來自屬于Flammulina屬的菌類的培養(yǎng)物的制造方法，其特征是對所述的Flammulina屬菌類進行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)液中除去菌絲體后得到培養(yǎng)物。
7.權(quán)利要求6所述的制造方法，其特征在于所述的Flammulina屬的菌類是Flammulina velutipes。
8.權(quán)利要求7所述的制造方法，其特征在于Flammulinavelutipes是Flammulina velutipes IFO 30601。
9.一種染色方法，其特征是在權(quán)利要求1～5中任意一項所述的培養(yǎng)物存在下，使染色對象物和染料接觸。
10.一種含有權(quán)利要求1～5中任意一項所述的培養(yǎng)物的染色用組合物。
全文摘要
提供有效、廉價、而且簡便進行纖維或毛發(fā)的染色、紙漿和纖維的漂白、廢液中的酚化合物的去除、內(nèi)分泌紊亂物質(zhì)的分解、酚醛樹脂的制造、人工漆涂料的制造、木質(zhì)的改善等的手段。屬于Flammulina屬菌類的培養(yǎng)物通過在pH大于7.0的條件下對該菌類進行培養(yǎng)可獲得其培養(yǎng)物，而且還公開了具有類酚氧化酶活性的、來自該菌類的培養(yǎng)物、該培養(yǎng)物的制造方法、在該培養(yǎng)物存在下使染色對象物與染料接觸的染色方法、以及含有該培養(yǎng)物的染色用組合物。
文檔編號C12R1/645GK1723279SQ03815660
公開日2006年1月18日 申請日期2003年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月29日
發(fā)明者辻野義雄, 圓藤勝義, A·K·M·Q·哈桑 申請人:株式會社漫丹