專利名稱：編碼參與淀粉合成的酶的植物核酸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中編碼參與淀粉合成的酶的核酸分子。該酶是新的淀粉合成酶同工型。
本發(fā)明還涉及載體和用所述核酸分子或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，尤其是植物細(xì)胞和能夠從這些細(xì)胞再生的植物。
而且，本發(fā)明描述了用于產(chǎn)生如下轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物的方法，該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物由于編碼淀粉合成酶的DNA分子的引入而合成性質(zhì)發(fā)生改變的淀粉。本發(fā)明還涉及能夠從根據(jù)本發(fā)明的這些植物細(xì)胞和植物中獲得的淀粉，和產(chǎn)生該淀粉的方法。
由于注意到近來(lái)植物成分作為可再生原材料其重要性正日益增加，生物技術(shù)研究的任務(wù)之一是努力使這些植物原材料適合于加工工業(yè)的要求。因此，為了使可再生原材料可以應(yīng)用到盡可能多的應(yīng)用領(lǐng)域中，必須獲得多種多樣的材料。
油類、脂肪和蛋白質(zhì)，以及多糖，構(gòu)成了來(lái)自植物的重要可再生原材料。除了纖維素外，高等植物中最重要的貯藏物質(zhì)之一，淀粉，起著重要的作用。在這方面，玉米是最令人感興趣的植物之一，因?yàn)樗侨蜃钪匾牡矸凵a(chǎn)作物。
多糖淀粉是化學(xué)上一致的基本單元葡萄糖分子的聚合物。然而，它是由聚合程度和葡萄糖鏈中分支發(fā)生程度不相同的不同形式分子組成的高度復(fù)雜混合物。因此淀粉不是均一的原材料。具體地，我們區(qū)分了直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉是由α-1，4-糖苷鍵連接的葡萄糖分子形成的基本上不分支的聚合物，而支鏈淀粉是具有不同分支的葡萄糖鏈的復(fù)雜混合物。這些分支是通過(guò)額外α-1，6-糖苷鍵的出現(xiàn)產(chǎn)生的。在用于淀粉生產(chǎn)的典型植物例如玉米或馬鈴薯中，所合成的淀粉由約20％-25％的直鏈淀粉和約75％-80％的支鏈淀粉組成。
為了使淀粉盡可能廣泛地得到應(yīng)用，提供能夠合成尤其適合于多種目的的改性淀粉的植物顯然是理想的。除了植物育種方法外，提供此類植物的一種可能方式是，通過(guò)重組方法定向遺傳改變產(chǎn)淀粉植物的淀粉代謝。然而，這樣做的前提條件是鑒定和表征參與淀粉合成和/或淀粉修飾的酶，并分離編碼這些酶的相關(guān)DNA分子。
導(dǎo)致淀粉合成的生物化學(xué)合成途徑基本上是已知的。在植物細(xì)胞中，淀粉合成發(fā)生在質(zhì)體中。在光合作用活躍的組織中，它們是葉綠體，在光合作用不活躍的淀粉貯藏組織中是造粉體。
最重要的參與淀粉合成的酶是淀粉合成酶和分支酶。在淀粉合成酶中，已經(jīng)有多種同工型的描述，所有這些同工型均通過(guò)將ADP-葡萄糖的葡糖殘基轉(zhuǎn)移至α-1，4-葡聚糖上催化聚合反應(yīng)。分支酶催化在線性α-1，4-葡聚糖中引入α-1，6-分支。
可以區(qū)分出兩類淀粉合成酶顆粒結(jié)合性淀粉合成酶(GBSS)和可溶性淀粉合成酶(SS)。然而，這種區(qū)別并不是在每種情況下都是涇渭分明的，因?yàn)橐恍┑矸酆铣擅讣纫灶w粒結(jié)合形式存在又以可溶性形式存在(Denyer等，Plant J.4(1993)，191-198；Mu等，Plant J.6(1994)，151-159)。
除了顆粒結(jié)合性淀粉合成酶GBSSI類型外，基于cDNA和氨基酸序列比較，至今在玉米植物中描述了屬于可溶性淀粉合成酶類型的至少3種不同的同工型。
淀粉合成酶同工型I(SSI)包括在玉米中編碼約76kDa蛋白質(zhì)zSSI(Mu等，Plant J 6，(1994)，151-159)和至今僅在單子葉植物例如水稻(Baba等，Plant Physiol.103，(1993)，565-573)中描述過(guò)的基因，該同工型主要在胚乳中表達(dá)。通常，這些蛋白質(zhì)可以受到檸檬酸鹽的刺激，并且不依賴所謂的引發(fā)分子(primer molecules)。
相反，淀粉合成酶同工型II(＝SSII)通常依賴于引發(fā)分子，并表現(xiàn)出與豌豆(Dry等，Plant J.2，(1992)，193-202)和馬鈴薯(Edwards等，Plant J.8，(1995)，283-294)的SSII同工型(其中一些過(guò)去被命名為GBSSII)具有最大的序列同源性。
當(dāng)考慮玉米的SSII時(shí)，必須將文獻(xiàn)中稱作zSSIIa和zSSIIb的基因或cDNA(Harn等，Plant Mol.Biol.37，(1998)，639-649；Imparl-Radosevich，Arch.Biochem.Biophys，362，(1999)，131-138)，與基于較早生化研究命名的(Boyer和Preiss，Plant Physiol.67，(1981)，1141-1145；Mu等，Plant J.6，(1994)，151-159)、來(lái)自玉米胚乳約180kDa的所謂SSII蛋白質(zhì)(分子量是通過(guò)凝膠過(guò)濾確定的(Mu等，Plant J.6，(1994)，151-159))區(qū)分開(kāi)來(lái)。實(shí)際上哪個(gè)基因相應(yīng)于這個(gè)180 kDa蛋白質(zhì)的問(wèn)題目前仍沒(méi)有結(jié)論性的答案(Imparl-Radosevich，Arch.Biochem.Biophys.362，(1999)，131-138)。Cao等(Plant Physiol.120，(1999)，205-215)認(rèn)為所謂的du1基因是相應(yīng)于該180kDa蛋白質(zhì)的基因。
目前已描述過(guò)的稱作SSIII的第三類淀粉合成酶基因，在馬鈴薯中編碼一個(gè)139kDa的蛋白質(zhì)(Abel等，Plant J.10，(1996)，981-991；Marshall等，植物細(xì)胞(Plant Cell)8，(1996)，1121-1135)，在馬鈴薯的塊莖中占總淀粉合成酶活性的80％。由于與馬鈴薯SSIII氨基酸序列的比較中該C端某些序列區(qū)域具有高度保守性，因此原先稱作du1基因的該玉米基因被提議重新命名為“zSSIII”(Cao等，Plant Physiol.120，(1999)，205-215)，前綴“z”代表其生物來(lái)源是玉蜀黍(Zea mays)。
至今僅確定了同工型GBSSI在淀粉合成中的詳細(xì)功能。該酶活性極大地或完全地降低的植物合成不被淀粉酶消化的“蠟樣”淀粉(Shure等，細(xì)胞(Cell)35(1983)，225-233；Visser等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，289-296；WO9211376A1)，因此該酶在直鏈淀粉合成中起著重要作用。在雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的細(xì)胞中同樣觀察到該現(xiàn)象(Delrue等，J.Bacteriol.174(1992)，3612-3620)。此外在衣藻屬(Chlamydomonas)中，還可以證明GBSSI不僅參與直鏈淀粉合成，還影響支鏈淀粉合成。不具有GBSSI活性的突變體缺少通常合成的含有較長(zhǎng)葡聚糖鏈的支鏈淀粉特定部分。
可溶性淀粉合成酶同工型的功能仍不清楚，推測(cè)這些可溶性淀粉合成酶與分支酶一起參與支鏈淀粉的合成(見(jiàn)例如Ponstein等，Plant Physiol.92(1990)，234-241)，并且在淀粉合成速率的調(diào)節(jié)中起著重要作用。
除了玉米外，還在一系列其它植物物種中鑒定到可溶性淀粉合成酶。例如，已經(jīng)從豌豆(Denyer和Smith，Planta 186(1992)，609-617)和馬鈴薯(Edwards等，Plant J.8(1995)，283-294)中分離到均質(zhì)的可溶性淀粉合成酶。發(fā)現(xiàn)在這些情況中鑒定為SSII的該可溶性淀粉合成酶同工型與顆粒結(jié)合性淀粉合成酶GBSSII是相同的(Denyer等，Plant J.4(1993)，191-198；Edwards等，Plant J.8(1995)，283-294)。借助層析方法已經(jīng)描述了一些其它的植物種類，例如大麥(Tyynela和Schulman，Physiologia Plantarum 89(1993)，835-841；Kreis，Planta 148(1980)，412-416)和小麥(Rijven，Plant Physiol.81(1986)，448-453)中，存在多種SS同工型。編碼這些蛋白質(zhì)的DNA序列也已有描述(見(jiàn)例如GenBankAcc.No.U48227；Vrinten等，Mol.Gen.Genet.261(3)，(1999)，463-471)。
為了提供關(guān)于改變?nèi)魏蔚矸圪A藏植物以便使它們合成改性淀粉的更多選擇，必須鑒定在各種情況中編碼這些淀粉合成酶的其它同工型的DNA序列。
因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供編碼參與淀粉生物合成的酶的核酸分子，借助于這些核酸分子可以制備這些酶的活性表現(xiàn)出增加或降低的重組植物，由此導(dǎo)致在這些植物中合成具有改變的化學(xué)和/或物理性質(zhì)的淀粉，從而更好地適合于一般和/或特殊目的。
通過(guò)提供本專利申請(qǐng)中描述的實(shí)施方案可實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)。
因此，本發(fā)明涉及編碼具有淀粉合成酶生物活性的蛋白質(zhì)或該蛋白質(zhì)的生物活性片段的核酸分子，這些分子優(yōu)選編碼具有Seq ID No.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
具體地，本發(fā)明涉及含有Seq ID No.1所示核苷酸序列或其部分的核酸分子，優(yōu)選含有Seq ID No.1中所示編碼區(qū)或相應(yīng)的核糖核苷酸序列的分子。
本發(fā)明還涉及具有與Seq ID No.1中所示序列的全部或部分互補(bǔ)的序列的核酸分子。
本發(fā)明主題還有編碼淀粉合成酶或其生物活性片段、并/或由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性其序列不同于上述分子的核苷酸序列的核酸分子。
本發(fā)明還涉及編碼淀粉合成酶或其生物活性片段、并且與上述分子之一雜交的核酸分子。
根據(jù)本發(fā)明的核酸分子既可以是DNA又可以是RNA分子。適合的DNA分子是例如基因組或cDNA分子。RNA分子可以是例如mRNA或反義RNA分子。
因此，本發(fā)明還涉及相應(yīng)于SEQ ID NO.1所示cDNA序列的基因組序列的內(nèi)含子部分的核苷酸序列。適合的內(nèi)含子序列可以例如采用SEQ IDNO.1所示核酸分子，通過(guò)例如篩選基因組DNA文庫(kù)來(lái)分離和鑒定。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“雜交”是指在常規(guī)雜交條件下，優(yōu)選在例如Sambrook等(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)，第2版(1989)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)所描述的嚴(yán)緊條件下進(jìn)行的雜交?！半s交”尤其優(yōu)選指在以下條件下發(fā)生的雜交雜交緩沖液2×SSC；10×Denhardt溶液(Ficoll 400+PEG+BSA；比例為1∶1∶1)；0.1％ SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鮭精DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸鈉緩沖液pH7.2；1mM EDTA7％SDS雜交溫度 T＝65-68℃洗滌緩沖液 0.2×SSC；0.1％SDS洗滌溫度 T＝40-68℃原則上，與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子雜交的核酸分子可以來(lái)源于任何具有此類分子的生物(即原核生物或真核生物，尤其是細(xì)菌、真菌、藻類、植物或動(dòng)物生物)。它們優(yōu)選來(lái)源于單子葉或雙子葉植物，尤其是有用的植物，特別優(yōu)選來(lái)源于淀粉貯藏植物，尤其是玉米。
與根據(jù)本發(fā)明的分子雜交的核酸分子可以從例如各種生物的基因組或cDNA文庫(kù)中分離獲得?；蛘?，它們可以通過(guò)重組方法或化學(xué)合成法來(lái)制備。
這些核酸分子可以采用根據(jù)本發(fā)明的分子或這些分子的部分或這些分子的反向互補(bǔ)分子，通過(guò)例如按標(biāo)準(zhǔn)方法(見(jiàn)例如Sambrook等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)進(jìn)行雜交，從植物或其它生物體中獲得鑒定和分離。
可以采用的雜交探針有例如完全或基本上具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或該序列的部分的核酸分子。用作雜交探針的片段還可以是借助常規(guī)合成技術(shù)制備的、其序列基本上與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的序列一致的合成片段。一旦鑒定和分離了與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子雜交的基因后，必須進(jìn)行序列測(cè)定并分析該序列編碼的蛋白質(zhì)的性質(zhì)。
本發(fā)明還涉及1999年8月5日保藏在德國(guó)Braunschweig的德意志微生物保藏中心、具有保藏號(hào)DSM 12970的質(zhì)粒IR 65/87，并涉及包含在質(zhì)粒IR 65/87插入片段中編碼具有淀粉合成酶酶活性的蛋白質(zhì)的核酸分子。此外，本發(fā)明還涉及包含在質(zhì)粒IR 65/87插入片段中的核酸分子的片段，優(yōu)選含有該編碼區(qū)或其部分的片段。而且，本發(fā)明還涉及與質(zhì)粒IR 65/87插入片段中包含的核酸分子雜交的核酸分子，并涉及具有與質(zhì)粒IR 65/87中所包含核酸分子插入片段的全部或部分互補(bǔ)的序列的核酸分子。此外，本發(fā)明還涉及與質(zhì)粒IR 65/87的插入核酸分子相比較，其核苷酸序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而發(fā)生偏離的核酸分子。
本發(fā)明還涉及上述根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的片段和等位變體。
在本文中，片段是根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的部分，其編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或該蛋白質(zhì)的部分，而且通常是由根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的約25-150個(gè)，優(yōu)選至少150個(gè)，特別優(yōu)選至少500個(gè)，尤其是至少1000個(gè)，特別優(yōu)選至少3500個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸或多核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“片段”在本文中是指編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的部分、并具有功能活性的本發(fā)明核酸分子的部分。而且，該片段還可以編碼反義mRNA，或包含在介導(dǎo)共抑制效應(yīng)或體內(nèi)誘變效應(yīng)的分子中?！熬哂泄δ芑钚浴痹诒疚闹惺侵副景l(fā)明核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的生物活性在根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞中發(fā)生增加或降低。
所述等位變體不僅可以是天然存在的變體，還可以是合成的變體或通過(guò)重組DNA技術(shù)制備的變體。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的上述核酸分子的衍生物。術(shù)語(yǔ)“衍生物”在本文中是指這些分子的序列在一或多個(gè)位置上不同于上述核酸分子，但與這些序列，尤其是SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的編碼區(qū)有高度同源性。本文中同源性是指至少50％的序列一致性，尤其是至少70％、優(yōu)選85％以上、特別優(yōu)選95％以上的一致性。與上述核酸分子的偏離可能是由于缺失、替代、插入或重組造成的。
為了本發(fā)明的目的，“同源性”是指所討論的核酸分子之間和它們編碼的蛋白質(zhì)之間存在功能和/或結(jié)構(gòu)等同性。與上述分子同源并且構(gòu)成這些分子的衍生物的核酸分子，通常是執(zhí)行相同生物學(xué)功能、含有修飾的這些分子的變體。它們可以是天然存在的變體，例如來(lái)自其它生物體的序列，或是突變體，這些突變可以是天然存在的或可以通過(guò)定向誘變引入。
由本發(fā)明核酸分子的不同變體(片段、衍生物、等位變體)編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO.2中定義的氨基酸序列共同具有某些特征。這些特征可以包括例如酶活性、分子量、免疫學(xué)反應(yīng)性、構(gòu)象等，和物理性質(zhì)例如凝膠電泳中的遷移行為、層析行為、沉淀系數(shù)、可溶性、光譜性質(zhì)、穩(wěn)定性、最適pH、最適溫度等。
淀粉合成酶的重要特征是1)其定位在植物細(xì)胞質(zhì)體的基質(zhì)中；ii)其能夠采用ADP-葡萄糖作為底物合成線性α-1，4-連接的葡聚糖。該活性可以按Denyer和Smith(Planta 186(1992)，609-617)所述方法測(cè)定。
根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以來(lái)源于表達(dá)所述基因的原核或真核生物，優(yōu)選來(lái)源于植物，尤其是來(lái)源于淀粉合成或淀粉貯藏植物。這些植物可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。在本文中特別優(yōu)選例如谷類植物物種(例如大麥、黑麥、燕麥、小麥等)、玉米、稻、豌豆、木薯、馬鈴薯等。
根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)是至今從未進(jìn)行過(guò)鑒定和性質(zhì)分析的植物淀粉合成酶同工型。這些蛋白質(zhì)具有淀粉合成酶的酶活性，并在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第740位-第1170位氨基酸區(qū)域中表現(xiàn)出與馬鈴薯SSIII(Marshall等，Plant Cell 8，(1996)，1121-1135)和稱作zSSIII的玉米同工型(du1)(Cao等，PLant Physiol.120，(1999)，205-215)顯著同源。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與馬鈴薯SSIII和玉米zSSIII在N端顯著不同。而且，SEQ ID NO.2所示蛋白質(zhì)的計(jì)算等電點(diǎn)也與馬鈴薯SSIII和玉米zSSIII的計(jì)算等電點(diǎn)顯著不同。而且，SEQ ID NO.2所示蛋白質(zhì)與zSSIII(計(jì)算的分子量為約188kDa)相比具有明顯低的約132kDa的計(jì)算分子量。與zSSIII不同，根據(jù)本發(fā)明的同工型的基因表達(dá)在幼葉中比在胚乳中高。
因此，在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼具有淀粉合成酶生物活性的蛋白質(zhì)的上述根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，這些分子優(yōu)選編碼在N端區(qū)域與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少50％、優(yōu)選至少65％、尤其是至少80％、特別優(yōu)選至少95％同源性的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“N端”在本文中是指SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第1-150位氨基酸、優(yōu)選第1-300位氨基酸、特別優(yōu)選第1-480位氨基酸。
在本發(fā)明的再一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼具有淀粉合成酶生物活性的蛋白質(zhì)，這些分子編碼的蛋白質(zhì)具有6.95pH±1.00pH、優(yōu)選6.95pH±0.75pH、特別優(yōu)選6.95pH±0.50pH的計(jì)算等電點(diǎn)pI。
在再一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼具有淀粉合成酶生物活性的蛋白質(zhì)，而且這些蛋白質(zhì)在Cao等(Plant Physiol.120，(1999)，205-215)描述的淀粉合成酶特征性的8個(gè)序列基序的至少一個(gè)中具有至少一個(gè)缺失。該缺失基序優(yōu)選是Cao等(Plant Physiol.120，(1999)，205-215)命名的序列基序VII。因此，在再一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼具有淀粉合成酶生物活性、且在一或多個(gè)選自下組的序列基序VII中含有至少一個(gè)缺失的蛋白質(zhì)SHTIYAASDLFIIPSIFEPCGLTQMIAMRYGS(Seq ID No.3)；SHLIYAGADFILVPSIFEPCGLTQLTAMRYGS(Seq ID No.4)；SHLIYAGSDFILVPSIFEPCGLTQLVAMRYGT(Seq ID No.5)；AHQMMAGADVLAVTSRFEPCGLIQLQGMRYGT(Seq ID No.6)；AHQMMAGADVLAVTSRFEPCGLIQLQGMRYGT(Seq ID No.7)；AHMITAGADFMLIPSRFEPCGLIQLHAMRYGT(Seq ID No.8)；AHMITAGADFMLVPSRFEPCGLIQLHAMRYGT(Seq ID No.9)；AHLIMAGADVLAVPSRFEPCGLIQLQGMRYGT(Seq ID No.10)；AHKIIAGADFIVIPSRFEPCGLVQLHAMPYGT(Seq ID No.11)；AHHIMAGADLLAVTSRFEPCGLIQLQGMRYGT(Seq ID No.12)；AHHIMAGADVLAVTSRFEPCGLIQLQGMRYGT(Seq ID No.13)；SHRITAGCDILLMPSRFEPCGLNQLYAMQYGT(Seq ID No.14)；AHRITAGSDILLMPSRFEPCGLNQLYAMSYGT(Seq ID No.15)；SHRITAGCDILLMPSRFEPCGLNQLYAMRYGT(Seq ID No.16)；SHRITAGADILLMPSRFEPCALNQLYAMKYGT(Seq ID No.17)；AHRITAGADIALMPSRFEPCGLNQLYAMAYGT(Seq ID No.18)；SHRITAGCDILLMPSRFEPCGLNQLYAMQYGT(Seq ID No.19)；SHRITAGCDILLMPSRFEPCGLNQLYAMQYGT(Seq ID No.20)；AHRITAGADVLVMPSRFEPCGLNQLYAMAYGT(Seq ID No.21)；AHRITAGADILLMPSRFEPCGLNQLYAMAYGT(Seq ID No.22)；ARKLYASSDFILMPSYFEPCGLTQMIGMRYGC(Seq ID No.23)；AHQIYAGSDMFLMPSKFEPCGLTQLYALRYGC(Seq ID No.24)；AHQIYAGADLFLIPSLFEPCGLSQMIALRYGT(Seq ID No.25)；AHQIYAGADLFLIPSLFEPCGLGQLIALQYGA(Seq ID No.26)；SHRIMGGADVILVPSRFEPCGLTQLYGSKYGT(Seq ID No.27)；SHLMVAGGDVILVPSRFEPCGLTQLYGLQYGT(Seq ID No.28)和AHLIYGAADIIVVPSNYEPCGLTQMIGLRYGA(Seq ID No.29)(參照Cao等，PlantPhysiol.120，(1999)，第207頁(yè)，表1中定義的序列基序VII)。
鑒定所述序列基序的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可以基于與Cao等(見(jiàn)上)所述特征性序列基序VII的氨基酸序列比較進(jìn)行。
在本發(fā)明的再一優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼具有淀粉合成酶功能、且在Seq ID No.3-29所示一或多個(gè)基序中具有至少2個(gè)氨基酸、特別優(yōu)選至少5個(gè)氨基酸、尤其是至少10個(gè)氨基酸、尤其優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸的缺失的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明再一尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的上述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的所述序列基序VII具有以下氨基酸序列(1)SH---AMRYG-(11)，該基序的第3、4、5和11位可以被任何氨基酸占據(jù)。在Seq ID No.2中，序列基序VII起始于第1067位氨基酸(＝S)并終止于第1077位氨基酸(＝S)。
在第3位，特別優(yōu)選選自T、L、M、Q或R的氨基酸。在第4位，優(yōu)選I、L或M的氨基酸。在第5位，優(yōu)選選自I、Y、M、T或V的氨基酸。在第11位，優(yōu)選選自S、T、C或A的氨基酸。
本發(fā)明還涉及上述根據(jù)本發(fā)明的核酸分子在篩選核酸文庫(kù)，尤其是cDNA和基因組文庫(kù)中的應(yīng)用和/或作為雜交探針的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還涉及上述根據(jù)本發(fā)明的核酸分子在制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。而且，本發(fā)明還涉及含有上述根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體，尤其是質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體和其它通常在遺傳工程中使用的載體。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些載體中包含的核酸分子與在原核或真核細(xì)胞中或在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中確保轉(zhuǎn)錄和合成可翻譯RNA的調(diào)節(jié)元件連接。用于在微生物(例如大腸桿菌(E.coli.)、釀酒酵母(S.cerevisiae))中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的調(diào)節(jié)元件已在文獻(xiàn)中有大量的描述。允許下游基因獲得尤其強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子有例如T7啟動(dòng)子(Studier等，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)185，(1990)，60-89)、lacuv5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等，Rodriguez和Chamberlin(編)，《啟動(dòng)子、結(jié)構(gòu)和功能》(Promoters，Structure and Function)；Praeger，紐約，(1982)，462-481；DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)，21-25)、lpl、rac(Boros等，基因(Gene)42(1986)，97-100)。通常，蛋白質(zhì)的量從微生物生長(zhǎng)周期的對(duì)數(shù)中期至對(duì)數(shù)末期達(dá)到最大。因此，優(yōu)選采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)合成蛋白質(zhì)。這些啟動(dòng)子經(jīng)常比組成型啟動(dòng)子導(dǎo)致更高的蛋白產(chǎn)量。由于克隆基因的持繼轉(zhuǎn)錄和翻譯，強(qiáng)組成型啟動(dòng)子的使用時(shí)常導(dǎo)致用于其它必需細(xì)胞功能的能量喪失，由此使細(xì)胞生長(zhǎng)變慢(Bernard R.Glick/Jack J.Pasternak，Molekulare Biotechnologie(1995)，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg Berlin Oxford，第342頁(yè))。因此，為了獲得最佳的蛋白量，通常采用兩步驟法。首先，在最佳條件下使宿主細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到相對(duì)高的細(xì)胞密度。然后在第二步中，依據(jù)所采用的啟動(dòng)子類型，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。在本文中尤其適合的是乳糖或IPTG(＝異丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷)誘導(dǎo)型tac啟動(dòng)子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)，21-25)。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)在文獻(xiàn)中也已有描述。
用于在植物細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的調(diào)節(jié)元件與根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行描述。
根據(jù)本發(fā)明的核酸分子在原核細(xì)胞例如大腸桿菌(Escherichia coli)中的表達(dá)是重要的，因?yàn)檫@使得可以對(duì)這些分子編碼的酶的酶活性進(jìn)行更為詳細(xì)的表征。尤其是，可以在缺少植物細(xì)胞中參與淀粉合成的其它酶時(shí)對(duì)所討論的酶合成的產(chǎn)物進(jìn)行性質(zhì)分析。這就使得可以對(duì)所討論蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞的淀粉合成過(guò)程中具有的功能作出推斷。
此外，還可以通過(guò)分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù)(見(jiàn)例如Sambrook等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)將各種突變引入根據(jù)本發(fā)明的核酸分子中，這就導(dǎo)致合成生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生潛在改變的蛋白質(zhì)。一方面，可以產(chǎn)生缺失突變體，其核酸分子通過(guò)從該編碼DNA序列的5’或3’末端開(kāi)始的漸進(jìn)缺失來(lái)制備，這就導(dǎo)致合成適合的縮短蛋白質(zhì)。例如，在該核苷酸序列5’末端的缺失使得可以鑒定出負(fù)責(zé)將該酶運(yùn)輸至質(zhì)體的氨基酸序列(轉(zhuǎn)運(yùn)肽(transit peptides))。這就使得可以定向產(chǎn)生由于除去了所述序列而不再定位于質(zhì)體而定位于細(xì)胞質(zhì)中的酶，或定向產(chǎn)生由于加入其它信號(hào)序列而定位在其它區(qū)室中的酶。
還可以將原來(lái)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)換為介導(dǎo)在質(zhì)體中定位的另一轉(zhuǎn)運(yùn)肽?？梢圆捎玫馁|(zhì)體信號(hào)序列有例如菠菜鐵氧還蛋白NADP+氧化還原酶(ferrodoxinNADP+oxidoreductase)(FNR)。該序列含有質(zhì)體蛋白質(zhì)菠菜鐵氧還蛋白NADP+氧化還原酶cDNA的5’非翻譯區(qū)和側(cè)翼轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(核苷酸第-171位-第+165位；Jansen等，當(dāng)代遺傳學(xué)(Current Genetics)13，(1988)，517-522)。
可以采用的另一質(zhì)體信號(hào)序列是例如玉米蠟質(zhì)蛋白(waxy protein)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽加上該成熟蠟質(zhì)蛋白的頭34個(gè)氨基酸(Klosgen等，Mol.Gen.Genet.217，(1989)，155-161)。此外，還可以采用不帶該成熟蠟質(zhì)蛋白頭34個(gè)氨基酸的該玉米蠟質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(見(jiàn)上)。
另一方面，還可以在根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的特定位置中引入點(diǎn)突變，以便改變的氨基酸序列對(duì)例如酶活性或酶調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響。這使得可以產(chǎn)生具有改變的Kcat和/或Km值的突變體，或產(chǎn)生不再接受細(xì)胞中正常存在的通過(guò)變構(gòu)調(diào)節(jié)或共價(jià)修飾進(jìn)行的調(diào)節(jié)機(jī)制的突變體。
而且，還可以制備具有改變的底物或產(chǎn)物特異性的突變體，例如采用ADP-葡萄糖-6-磷酸而非ADP-葡萄糖作為底物的突變體。還可以制備具有改變的活性-溫度曲線的突變體。
為了在原核細(xì)胞中進(jìn)行重組操作，可以將根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或這些分子的部分引入允許通過(guò)DNA序列重組發(fā)生誘變或序列修飾的質(zhì)粒中?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行堿基替換，或添加天然或合成序列(參見(jiàn)Sambrook等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY，USA)。為了將這些DNA片段彼此連接在一起，可以在這些片段上加上轉(zhuǎn)接器(adapter)或接頭(linker)。而且，可以進(jìn)行操作以提供適合的限制性切割位點(diǎn)或除去多余的DNA或限制性切割位點(diǎn)。如果適合進(jìn)行插入、缺失或替代，則可以采用體外誘變、引物修復(fù)、限制性酶切或連接。一般采用的分析方法是序列分析、限制性分析和其它生化和分子生物學(xué)方法。
而且，本發(fā)明涉及含有根據(jù)本發(fā)明的上述核酸分子的載體，該核酸分子與保證在原核或真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和合成可翻譯RNA的調(diào)節(jié)元件按有義方向連接。術(shù)語(yǔ)“有義方向”的意義是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的上述核酸分子或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，尤其是原核或真核細(xì)胞，以及來(lái)源于這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞并含有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或根據(jù)本發(fā)明的載體的細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選是細(xì)菌細(xì)胞、尤其優(yōu)選是植物細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及制備宿主細(xì)胞的方法，其中通過(guò)引入根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和/或根據(jù)本發(fā)明的載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。該宿主細(xì)胞可以是原核或真核生物來(lái)源的。該細(xì)胞優(yōu)選是細(xì)菌細(xì)胞，尤其優(yōu)選是植物細(xì)胞。
本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾”是指通過(guò)引入根據(jù)本發(fā)明的核酸分子改變宿主細(xì)胞、尤其是植物細(xì)胞的遺傳信息，而且根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的存在或表達(dá)導(dǎo)致表型的改變。在本文中表型改變優(yōu)選是指一或多項(xiàng)細(xì)胞功能的可測(cè)量到的改變。例如，根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾植物細(xì)胞表現(xiàn)出根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性降低，或根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性增加。
本發(fā)明的主題還有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或其生物活性片段，以及它們的制備方法，其中在允許該蛋白質(zhì)合成的條件下培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，隨后從該培養(yǎng)細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離該蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的特征性特性已結(jié)合相應(yīng)的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子在上面進(jìn)行了描述。
現(xiàn)在通過(guò)提供根據(jù)本發(fā)明的核酸分子使得可以借助重組方法以一種前所未有的方式影響植物的淀粉代謝，和改變此代謝以致合成與野生型植物中合成的淀粉相比在例如其物理化學(xué)性質(zhì)方面發(fā)生改變的改性淀粉，這些物理化學(xué)性質(zhì)尤其是指直鏈淀粉/支鏈淀粉比率、分支程度、平均鏈長(zhǎng)度、磷酸含量、糊化性能、和淀粉顆粒的大小和/或形狀(淀粉顆粒的形態(tài))。由于例如通過(guò)超量表達(dá)適合的核酸分子，或通過(guò)提供不再接受細(xì)胞中天然調(diào)節(jié)機(jī)制作用、和/或?qū)τ谄浠钚远跃哂胁煌瑴囟纫蕾囆缘耐蛔凅w，造成根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性增加，由此可以增加適當(dāng)遺傳改造的植物中的產(chǎn)量。
僅是影響玉米中淀粉合成這一可能性就具有明顯的經(jīng)濟(jì)重要性玉米是全球最重要的淀粉植物。全球每年生產(chǎn)的淀粉大約80％來(lái)自玉米。
因此，為了增加所述淀粉合成酶的活性，可以在植物細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。而且可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法修飾根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，以便獲得不再接受細(xì)胞中天然存在的調(diào)節(jié)機(jī)制作用、或表現(xiàn)出改變的溫度依賴性或底物或產(chǎn)物特異性的根據(jù)本發(fā)明的淀粉合成酶。
當(dāng)在植物中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子時(shí)，原則上可以使合成的蛋白質(zhì)定位在植物細(xì)胞的任何區(qū)室中。為了實(shí)現(xiàn)在特定區(qū)室中的定位，必須缺失掉保證質(zhì)體定位的序列，并任選地將剩余的編碼區(qū)與確保在所指定的區(qū)室中定位的DNA序列連接。這些序列是已知的(見(jiàn)例如Braun等，EMBOJ.11(1992)，3219-3227；Wolter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，846-850；Sonnewald等，Plant J.1(1991)，95-106)。質(zhì)體信號(hào)序列的例子已在上面不同部分中提及過(guò)了。
因此本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、和來(lái)源于這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。這些細(xì)胞含有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，該核酸分子優(yōu)選與確保在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA元件，尤其是啟動(dòng)子連接。
有多種技術(shù)可以用于將DNA引入植物宿主細(xì)胞中。這些技術(shù)包括采用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)作為轉(zhuǎn)化手段通過(guò)T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、利用聚乙二醇轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體、注射、DNA的電穿孔、利用生物轟擊法(biolistic approach)引入DNA、和其它可能的方法。
對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化已經(jīng)有深入的研究，并充分描述于EP-A2-0120516；Hoekema，《二元植物載體系統(tǒng)》(The Binary Plant VectorSystem)，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第V章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.4，1-46和An等，EMBO J.4，(1985)，277-287。關(guān)于馬鈴薯的轉(zhuǎn)化，見(jiàn)例如Rocha-Sosa等(EMBO J.8，(1989)，29-33)。
通過(guò)基于農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的載體進(jìn)行的單子葉植物轉(zhuǎn)化也已有描述(Chan等，Plant Mol.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等，Plant J.6，(1994)271-282；Deng等，Science in China 33，(1990)，28-34；Wilmink等，Plant Cell Reports 11，(1992)，76-80；May等，Bio/Technology 13，(1995)，486-492；Conner和Domisse，Int.J.PlantSci.153(1992)，550-555；Ritchie等，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的另一系統(tǒng)是通過(guò)生物轟擊方法轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux，Plant Physiol. 104，(1994)，37-48；Vasil等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等，Plant Mol.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、部分透化細(xì)胞的電穿孔、和利用玻璃纖維引入DNA。尤其是玉米的轉(zhuǎn)化已在文獻(xiàn)中有多次描述(參照例如WO9506128A2、EP-A2-0513849、EP-A1-0465875、EP-A1-292435；Fromm等，生物技術(shù)(Biotechnology)8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等，植物細(xì)胞(Plant Cell)2，(1990)，603-618；Koziel等，生物技術(shù)11(1993)，194-200；Moroc等，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。
其它谷類物種的成功轉(zhuǎn)化也已有描述，例如大麥(Wan和Lemaux，見(jiàn)上；Ritala等，見(jiàn)上；Krens等，自然(Nature)296，(1982)，72-74)和小麥(Nehra等，Plant J.5，(1994)，285-297)。
原則上，用于在植物細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的調(diào)節(jié)元件可以是在植物細(xì)胞有活性的任何啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等。可以選擇啟動(dòng)子以使在根據(jù)本發(fā)明的植物中的表達(dá)組成型發(fā)生，或僅在特定組織、植物發(fā)育的特定時(shí)間點(diǎn)或外部因素確定的時(shí)間點(diǎn)發(fā)生。相對(duì)于該植物而言，該啟動(dòng)子可以是同源的或異源的。
適合啟動(dòng)子的例子有用于組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒35S RNA的啟動(dòng)子(見(jiàn)例如US5352605)和泛素啟動(dòng)子(見(jiàn)例如US5614399)，用于在馬鈴薯中塊莖特異性表達(dá)的patatin基因啟動(dòng)子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)，或保證僅在光合作用活躍組織中表達(dá)的啟動(dòng)子例如ST-LS1啟動(dòng)子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stochhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-2451)、Ca/b啟動(dòng)子(見(jiàn)例如US 5656496；US 5639952；Bansal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，(1992)，3654-3658)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶SSU啟動(dòng)子(見(jiàn)例如US 5034322、US 4962028)。然而，也可以使用僅在外來(lái)因素確定的時(shí)間點(diǎn)上激活的啟動(dòng)子(見(jiàn)例如WO9307279A1)。在本文中，特別感興趣的是允許簡(jiǎn)單誘導(dǎo)的熱激蛋白啟動(dòng)子。而且，種子特異性啟動(dòng)子例如蠶豆(Vicia faba)USP啟動(dòng)子保證了在蠶豆和其它植物中的種子特異性表達(dá)(Fiedler等，Plant Mol.Biol.22，(1993)，669-679；Baumlein等，Mol.Gen.Genet.225，(1991)，459-467)?？梢允褂玫钠渌鼏?dòng)子有果實(shí)特異性啟動(dòng)子，例如描述在WO9101373A1中的那些。
尤其優(yōu)選使用的啟動(dòng)子是用于胚乳特異性表達(dá)的那些啟動(dòng)子，例如谷蛋白啟動(dòng)子(leisy等，Plant Mol.Biol.14，(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4，(1993)，357-366)、小麥HMG啟動(dòng)子、USP啟動(dòng)子、菜豆蛋白啟動(dòng)子、或玉米的玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子(Pedersen等，細(xì)胞(Cell)29，(1982)，1015-1026；Quatroccio等，Plant Mol.Biol.15(1990)，81-93)。借助于胚乳特異性啟動(dòng)子，可以使根據(jù)本發(fā)明的核酸分子在胚乳中的轉(zhuǎn)錄本量與相應(yīng)野生型植物的胚乳相比獲得增加。
尤其優(yōu)選使用玉米shrunken-1啟動(dòng)子(sh-1)(Werr等，EMBO J.4，(1985)，1373-1380)。
還可以存在用于正確終止轉(zhuǎn)錄和在轉(zhuǎn)錄本上添加據(jù)認(rèn)為具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本功能的polyA尾的終止序列。這些元件在文獻(xiàn)中已有描述(參見(jiàn)例如Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)并且可以隨意地互換。
此外，借助根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，還可以制備其中本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性降低的植物細(xì)胞和植物。這就導(dǎo)致合成與來(lái)自野生型植物細(xì)胞的淀粉相比具有改變的化學(xué)和/或物理性質(zhì)的淀粉。
由此本發(fā)明的另一主題是與野生型植物的相應(yīng)非遺傳修飾植物細(xì)胞相比其中本發(fā)明蛋白質(zhì)活性降低的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“野生型植物”/“野生型植物細(xì)胞”是指用作產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的植物/植物細(xì)胞的起始材料的植物/植物細(xì)胞，即除了引入的遺傳修飾外，其遺傳信息與根據(jù)本發(fā)明的植物/植物細(xì)胞的遺傳信息相符。
例如，可以通過(guò)表達(dá)相應(yīng)的反義RNA、或通過(guò)表達(dá)適當(dāng)構(gòu)建的特異切割編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)之一的轉(zhuǎn)錄本的核酶，成功地產(chǎn)生其中根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性降低的植物細(xì)胞。而且，還可以通過(guò)引入借助共抑制效應(yīng)導(dǎo)致編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因表達(dá)降低的DNA分子，實(shí)現(xiàn)活性的降低。而且，還可以通過(guò)體內(nèi)誘變制備具有降低活性的本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物細(xì)胞。為此，可以通過(guò)同源重組在編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因中引入突變或插入。該突變或插入導(dǎo)致編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因的表達(dá)降低，或?qū)е潞铣蔁o(wú)活性的根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
為了降低植物細(xì)胞中根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性，優(yōu)選表達(dá)反義RNA。
為此，一方面，可以采用含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的完整序列的DNA分子，包括存在的任何側(cè)翼序列在內(nèi)，另一方面，可以采用僅含有編碼序列的部分的DNA分子，但這些部分必須足夠長(zhǎng)以在細(xì)胞中引起反義效應(yīng)。然而，也可以使用編碼例如內(nèi)含子的基因組DNA分子。一般，為了獲得有效的反義抑制，可以采用最小長(zhǎng)度到15bp的序列，優(yōu)選長(zhǎng)100-500bp的序列，尤其是長(zhǎng)度大于500bp的序列。通常，采用短于5000bp的DNA分子，優(yōu)選短于2500bp的序列。優(yōu)選采用與待轉(zhuǎn)化的植物物種同源的DNA分子。
還可以采用表現(xiàn)出與根據(jù)本發(fā)明的DNA分子的序列高度同源，但又不完全一致的DNA序列。最小同源性應(yīng)大于約65％。優(yōu)選采用具有95％-100％同源性的序列。
或者，還可以通過(guò)共抑制效應(yīng)實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中的活性降低。該方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，描述于例如Jorgensen(Trends Biotechnol.8(1990)，340-344)、Niebel等(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，91-103)、Flavell等(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，43-46)、Palaqui和Vaucheret(PlantMol.Biol.29(1995)，149-159)、Vaucheret等(Mol.Gen.Genet.248(1995)，311-317)、de Borne等(Mol.Gen.Genet.243(1994)，613-621)和其它文獻(xiàn)中。
同樣，如同在上述反義技術(shù)中所述的一樣，在本文中既可以采用包括根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的完整編碼區(qū)的DNA分子，也可以采用僅包括該編碼序列的部分的DNA分子。還可以使用內(nèi)含子。
表達(dá)核酶以降低細(xì)胞中某些酶的活性是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，描述于例如EP-B1-0321201中。植物細(xì)胞中核酶的表達(dá)描述于例如Feyter等(Mol.Gen.Genet.250，(1996)，329-338)。
而且，還可以通過(guò)“體內(nèi)誘變”，即通過(guò)轉(zhuǎn)化細(xì)胞在細(xì)胞中引入雜合RNA-DNA寡核苷酸(“嵌合體(chimeroplast)”)，實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子在植物細(xì)胞中的活性降低(Kipp，P.B.等，第5屆國(guó)際植物分子生物學(xué)大會(huì)的海報(bào)部分，1997年9月21-27，新加坡；R.A.Dixon和C.J.Arntzen，關(guān)于“轉(zhuǎn)基因植物中代謝改造”的會(huì)議報(bào)告，KeystoneSymposia，Copper Mountain，CO，USA，TIBTECH 15，(1997)，441-447；國(guó)際專利申請(qǐng)WO 9515972A1；Kren等，肝病學(xué)(Hepatology)25，(1997)，1462-1468；Cole-Strauss等，科學(xué)(Science)273，(1996)，1386-1389)。
該RNA-DNA寡核苷酸的一部分DNA成分與編碼根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的內(nèi)源性基因的核酸序列同源，但與該內(nèi)源性基因的核酸序列相比具有突變，或者含有同源區(qū)包圍的異源區(qū)。
該RNA-DNA寡核苷酸和該內(nèi)源性核酸分子在同源區(qū)域的堿基配對(duì)，以及之后的同源重組，使得存在于該RNA-DNA寡核苷酸的DNA成分中的突變或異源區(qū)域可以被轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的該內(nèi)源性基因中。這就導(dǎo)致根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性降低。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道，可以通過(guò)表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的無(wú)功能衍生物，尤其是反顯性(transdominant)突變體，和/或表達(dá)這些蛋白質(zhì)的拮抗劑/抑制劑，實(shí)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的活性。這些蛋白質(zhì)的拮抗劑/抑制劑包括例如抗體、抗體片段或具有相似結(jié)合性質(zhì)的分子。例如，細(xì)胞質(zhì)scFv抗體被用于在遺傳修飾的煙草植物中調(diào)節(jié)植物光敏素A蛋白質(zhì)的活性(Owen，Bio/Technology 10，(1992)，790-794；綜述Franken，E.，Teuschel，U.和Hain，R.，生物技術(shù)當(dāng)代見(jiàn)解(Current Opinion in Biotechnology)8，(1997)，411-416；Whitelam，Trends Plant Sci.1，(1996)，268-272)。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“活性降低”是指細(xì)胞中編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因的表達(dá)降低和/或根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的量減少，尤其是指細(xì)胞中根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的酶活性降低。
表達(dá)的降低可以通過(guò)例如借助Northern印跡分析測(cè)量編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本的量來(lái)確定。在此“降低”優(yōu)選指與相應(yīng)的非遺傳修飾細(xì)胞相比轉(zhuǎn)錄本的量降低至少50％、優(yōu)選至少70％、特別優(yōu)選至少85％、極為特別地優(yōu)選至少95％。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的量的減少可以例如通過(guò)Western印跡分析來(lái)確定。在此“減少”優(yōu)選指與相應(yīng)的非遺傳修飾細(xì)胞相比，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的量減少至少50％、優(yōu)選至少70％、特別優(yōu)選至少85％、極為特別地優(yōu)選至少95％。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的酶活性降低可以例如按Denyer和Smith(Planta 186(1992)，609-617)所描述的方法進(jìn)行測(cè)定。在本文中，與相應(yīng)的非遺傳修飾細(xì)胞相比，酶活性的降低優(yōu)選指至少50％、優(yōu)選至少70％、特別優(yōu)選至少85％、極為特別優(yōu)選至少95％的降低。
以上在不同部分提及的關(guān)于術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾”的說(shuō)明也適用于此處。
因此，特別地，本發(fā)明的主題還有轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
a) 其含有導(dǎo)致合成至少一種反義RNA的至少一個(gè)DNA分子，其中該反義RNA可以引起編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因表達(dá)降低；b) 其含有至少一個(gè)DNA分子，該DNA分子通過(guò)共抑制效應(yīng)導(dǎo)致編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因表達(dá)降低；c) 其含有導(dǎo)致合成至少一種核酶的至少一個(gè)DNA分子，所述核酶可以特異切割編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄本；和/或d) 由于體內(nèi)誘變，其在編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的至少一個(gè)內(nèi)源性基因中含有突變或異源DNA插入，該突變或插入引起該基因的表達(dá)降低，或合成無(wú)活性的根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
而且，借助根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，還可以制備其中根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性增加的植物細(xì)胞和植物。這就導(dǎo)致合成與來(lái)自野生型植物細(xì)胞和野生型植物的淀粉相比較具有改變的化學(xué)和/或物理性質(zhì)的淀粉。
本發(fā)明的另一主題是與野生型植物的相應(yīng)非遺傳修飾植物細(xì)胞相比其中根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性增加的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
為了制備與相應(yīng)的非遺傳修飾野生型植物細(xì)胞相比具有增加活性的本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物細(xì)胞，按有義方向使用含有根據(jù)本發(fā)明的淀粉合成酶編碼區(qū)的本發(fā)明核酸分子。在再一實(shí)施方案中，還可以使用該編碼區(qū)的部分，條件是它們編碼具有催化活性的淀粉合成酶蛋白質(zhì)。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用Seq ID No.1所示核酸分子。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“活性增加”是指細(xì)胞中編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因的表達(dá)增加，和/或根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的量增加，尤其是指細(xì)胞中根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的酶活性增加。
表達(dá)的增加可以通過(guò)例如借助Northern印跡分析測(cè)量編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本的量來(lái)確定。在此“增加”優(yōu)選指與相應(yīng)的非遺傳修飾細(xì)胞相比較轉(zhuǎn)錄本的量增加至少50％、優(yōu)選至少100％、尤其優(yōu)選至少500％、特別地優(yōu)選至少1500％。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的量的增加可以例如通過(guò)Western印跡分析來(lái)確定。在此“增加”優(yōu)選指與相應(yīng)的非遺傳修飾細(xì)胞相比，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的量增加至少50％、優(yōu)選至少100％、尤其優(yōu)選至少500％、特別地優(yōu)選至少1500％。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的酶活性的增加可以例如按Denyer和Smith(見(jiàn)上)所描述的方法進(jìn)行測(cè)定。與相應(yīng)的非遺傳修飾細(xì)胞相比，酶活性的增加在此優(yōu)選指至少50％、優(yōu)選至少100％、尤其優(yōu)選至少500％、特別地優(yōu)選至少1500％的增加。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與野生型植物的植物細(xì)胞相比具有增加活性的本發(fā)明蛋白質(zhì)的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是來(lái)源于淀粉貯藏組織、優(yōu)選塊莖和胚乳、尤其是玉米植物的胚乳的植物細(xì)胞。
令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)的野生型植物相比其中根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性增加的植物細(xì)胞，尤其是胚乳的植物細(xì)胞，合成與野生型植物中，尤其是胚乳中合成的淀粉相比其物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變的淀粉，以致該淀粉可以更好地適用于特定目的。
根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞可以屬于任何植物物種，即單子葉植物或者雙子葉植物。它們優(yōu)選是來(lái)自農(nóng)業(yè)上有用植物(即為了營(yíng)養(yǎng)目的或技術(shù)目的，尤其是工業(yè)目的人為栽培的植物)的植物細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選涉及纖維形成植物(例如亞麻、大麻、棉)、儲(chǔ)油植物(例如油菜、向日葵、大豆)、儲(chǔ)糖植物(例如甜菜、甘蔗、糖粟(sugar millet)、香蕉)和儲(chǔ)蛋白植物(例如豆科植物)。
在再一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及飼料植物(例如用作動(dòng)物飼料的草、牧草、紫花苜蓿、三葉草等)、蔬菜植物(例如番茄、萵苣、苣荬菜)的植物細(xì)胞。
在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及淀粉貯藏植物(例如小麥、大麥、燕麥、黑麥、馬鈴薯、玉米、稻、豌豆、木薯、綠豆)的植物細(xì)胞，尤其優(yōu)選玉米、稻、小麥和馬鈴薯的植物細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞可以用于再生全株。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的再生可以獲得的植物也是本發(fā)明的主題。
本發(fā)明的主題還有含有根據(jù)本發(fā)明的上述植物細(xì)胞的植物。原則上，根據(jù)本發(fā)明的植物可以是任何植物物種的植物，即單子葉植物或雙子葉植物。它們優(yōu)選是來(lái)自農(nóng)業(yè)上有用植物(即為了營(yíng)養(yǎng)目的或技術(shù)目的，尤其是工業(yè)目的人為栽培的植物)的植物細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選涉及纖維形成植物(例如亞麻、大麻、棉)、儲(chǔ)油植物(例如油菜、向日葵、大豆)、儲(chǔ)糖植物(例如甜菜、甘蔗、糖粟、香蕉)和儲(chǔ)蛋白植物(例如豆科植物)的植物細(xì)胞。
在再一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及飼料植物(例如牧草和飼用牧草、紫花苜蓿、三葉草等)、蔬菜植物(例如番茄、萵苣、苣荬菜)。
在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及淀粉貯藏植物(例如小麥、大麥、燕麥、黑麥、馬鈴薯、玉米、水稻、豌豆、木薯、綠豆)，尤其優(yōu)選玉米、水稻、小麥和馬鈴薯植物。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物在淀粉貯藏組織的植物細(xì)胞中，優(yōu)選在塊莖或胚乳的植物細(xì)胞中，尤其優(yōu)選在玉米植物的胚乳植物細(xì)胞中，與來(lái)自野生型植物的相應(yīng)非遺傳修飾植物細(xì)胞相比，表現(xiàn)出增加活性的根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的再一實(shí)施方案中，含有其中本發(fā)明蛋白質(zhì)活性增加的本發(fā)明植物細(xì)胞的植物，與非修飾野生型植物相比，表現(xiàn)出更高的產(chǎn)量和/或更高的淀粉含量。
術(shù)語(yǔ)“更高的產(chǎn)量”在此優(yōu)選指組分，尤其是淀粉，和/或生物質(zhì)的產(chǎn)量增加，尤其是在后者按每株植物鮮重測(cè)量時(shí)如此。
術(shù)語(yǔ)“增加的淀粉含量”在此是指與未修飾的野生型植物的植物細(xì)胞相比，根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞中淀粉含量高出至少10％、優(yōu)選至少20％、尤其是至少30％、特別優(yōu)選至少40％。
測(cè)定淀粉含量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在產(chǎn)量和/或淀粉含量上的這種增加優(yōu)選涉及可收獲的植物器官例如種子、果實(shí)、儲(chǔ)藏根、塊莖、根、花、芽、枝條、莖或木材。
根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在相同條件下生長(zhǎng)時(shí)，與相同基因型的相應(yīng)非轉(zhuǎn)化植物相比較，基于該生物質(zhì)和/或組分的產(chǎn)量增加至少3％，優(yōu)選與野生型植物相比增加至少5％、尤其是至少10％、特別優(yōu)選至少20％或甚至40％。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中a) 通過(guò)引入根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和/或根據(jù)本發(fā)明的載體，對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾；并且b) 從細(xì)胞再生植物；并任選地，c) 從b)的植物產(chǎn)生更多的植物。
在以上不同部分已經(jīng)解釋過(guò)的遺傳修飾的說(shuō)明也適用于步驟a)中所述引入的遺傳修飾。例如，遺傳修飾的植物細(xì)胞表現(xiàn)出根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性降低，或根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性增加。
可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法根據(jù)步驟b)再生出植物。
依據(jù)本發(fā)明方法的步驟c)，通過(guò)例如無(wú)性繁殖(如采用插條、塊莖，或通過(guò)愈傷組織培養(yǎng)和再生全株)或有性繁殖可以產(chǎn)生更多的植物。有性繁殖優(yōu)選在受控條件下進(jìn)行，即在具有特定性狀的所選植株之間互相進(jìn)行雜交并繁殖。
本發(fā)明還涉及通過(guò)根據(jù)本發(fā)明方法可以獲得的植物。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的植物的繁殖材料，和依據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖材料。術(shù)語(yǔ)繁殖材料包括適合于通過(guò)無(wú)性或有性繁殖途徑產(chǎn)生后代的那些植物部分。適合于無(wú)性繁殖的例子有插條、愈傷組織培養(yǎng)物、根莖或塊莖。其它繁殖材料包括例如果實(shí)、種子、幼苗、原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物等。優(yōu)選地，該繁殖材料是塊莖和種子。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的植物的可收獲部分，例如果實(shí)、儲(chǔ)藏根、根、花、芽、枝條或莖，優(yōu)選種子或塊莖，并涉及含有這些植物可收獲部分，優(yōu)選種子或塊莖的食物。根據(jù)本發(fā)明的植物的可收獲部分，優(yōu)選種子或塊莖，和/或食物可以用改變的能量值，優(yōu)選增加的能量值來(lái)表征。
術(shù)語(yǔ)“能量值”在本文中尤其是指“可消化的能量”。術(shù)語(yǔ)“可消化的能量”定義為可消化的能量＝供給的總能量-排泄物的熱量值(Landwirtschaftliches Lehrbuch 2Tierzucht，Ed.D.Schmidt，第5版，1982，Eugen Ulmer GmbH & Co，第244頁(yè))?？偰芰渴侵缚梢詼y(cè)量到的以焦耳為單位的食物總熱量值。確定“能量值”或“可消化的能量”的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
根據(jù)本發(fā)明，該能量值增加至少3％、優(yōu)選至少10％、尤其是至少30％、特別優(yōu)選至少60％。
由于根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)或額外表達(dá)，和/或由于根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性增加或降低，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物合成的淀粉與野生型植物合成的淀粉相比，在例如其物理化學(xué)性質(zhì)方面，尤其是直鏈淀粉/支鏈淀粉比例、分支程度、平均鏈長(zhǎng)度、磷酸含量、糊化性能、淀粉顆粒大小和/或淀粉顆粒形狀方面，發(fā)生改變。尤其是，與野生型淀粉相比，該淀粉可以在該淀粉膠料所具有的粘度和/或膠體形成性質(zhì)方面發(fā)生改變。
本發(fā)明的主題還有可從根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和/或根據(jù)本發(fā)明的植物和/或根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料獲得的淀粉。
由于改變的理化性質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明的淀粉表現(xiàn)出改變的功能性質(zhì)。淀粉或其水溶液的重要功能性質(zhì)有退化性能、膜形成性質(zhì)、膠體強(qiáng)度、粘度、顏色的穩(wěn)定性、酶可消化性、凍融穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性、剪切穩(wěn)定性、透明度、水結(jié)合能力、糊化性質(zhì)、和結(jié)合與粘著性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的淀粉可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行修飾，并以其未修飾或修飾的形式適合于食品或非食品部門中的多種應(yīng)用。
原則上，可以將淀粉的可能用途分為兩個(gè)重要方面。一個(gè)方面包括通過(guò)酶學(xué)或化學(xué)方法獲得的淀粉水解產(chǎn)物，主要是葡萄糖和葡聚糖單元。它們被用作其它化學(xué)修飾和加工例如發(fā)酵的起始材料。在此為了降低費(fèi)用重要的是水解方法的簡(jiǎn)單性和廉價(jià)設(shè)計(jì)。目前該方法基本上是采用淀粉葡萄糖苷酶通過(guò)酶學(xué)方法來(lái)進(jìn)行的。通過(guò)采用較少的酶來(lái)節(jié)省經(jīng)濟(jì)開(kāi)支將是合理的。這可以通過(guò)改變淀粉的結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)顆粒表面面積的增加、由較低的分支程度導(dǎo)致的更好的可降解性、或限制所用酶接近的立體結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一方面，淀粉由于其聚合結(jié)構(gòu)而以所謂天然淀粉的形式被應(yīng)用，該方面可以進(jìn)一步劃分為兩個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域1.食品工業(yè)淀粉是各種食品的典型添加物，其中它基本上用作水性粘合添加物或引起粘度的增加或膠體形成的增加。重要的特性有流動(dòng)和吸附性能、溶脹和糊化溫度、粘性和增稠性能、淀粉的溶解度、透明度和糊劑結(jié)構(gòu)、熱、剪切和酸抗性、退化傾向、膜形成能力、凍/融抗性、可消化性、以及與例如無(wú)機(jī)或有機(jī)離子形成復(fù)合物的能力。2.非食品工業(yè)在這個(gè)大領(lǐng)域中，淀粉可以在各種生產(chǎn)過(guò)程中用作輔助劑或在技術(shù)產(chǎn)品中用作添加劑。淀粉用作輔助劑的主要領(lǐng)域有紙和紙板工業(yè)。在該領(lǐng)域中，淀粉主要用于滯留(滯留固體)、對(duì)填充物和細(xì)微顆粒進(jìn)行大小分級(jí)、使物質(zhì)固化和脫水。此外，還利用淀粉在稠度、硬度、聲音、手感、光澤、平滑性、撕裂強(qiáng)度以及表面方面具有的有利性質(zhì)。2.1紙和紙板工業(yè)在紙生產(chǎn)過(guò)程中，可區(qū)分出4個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域，即表面、涂層、備料和噴霧。表面處理對(duì)淀粉的要求主要是高亮度、相應(yīng)粘性、高粘性穩(wěn)定性、良好的膜形成以及低產(chǎn)塵。當(dāng)用于固體內(nèi)容物涂層時(shí)，相應(yīng)粘性、高結(jié)合能力以及高色素親合力有重要作用。作為備料添加劑，在紙漿中快速、均一、不損耗的分散，高機(jī)械穩(wěn)定性和完全滯留是重要的。當(dāng)使用淀粉噴霧時(shí)，固體的相應(yīng)含量、高粘性和高結(jié)合能力也是重要的。2.2粘合劑工業(yè)一個(gè)主要應(yīng)用領(lǐng)域是例如在粘合劑工業(yè)中，其中淀粉應(yīng)用于4個(gè)方面用作純淀粉膠、在以特殊化學(xué)制品制備的淀粉凝膠中的應(yīng)用、使用淀粉作為合成樹(shù)脂和聚合分散相的添加劑以及使用淀粉作為合成粘合劑的增充劑。在所有基于淀粉的粘合劑中90％用于生產(chǎn)瓦楞紙板、各種紙袋、紙和鋁的復(fù)合材料、紙盒和信封、郵票等的濕膠。2.3紡織品和織物保養(yǎng)工業(yè)淀粉作為輔助劑和添加劑的另一可能用途是生產(chǎn)紡織品和織物保養(yǎng)品。在紡織品工業(yè)中，可區(qū)分出下列4個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒌矸塾米魃蠞{劑，即作為平滑處理和加強(qiáng)去毛刺性能的輔助劑以對(duì)抗紡織中牽引的張力以及提高紡織過(guò)程中的耐磨強(qiáng)度，主要在質(zhì)量降低性預(yù)處理如漂白、染色等之后用作紡織品的整理劑，在染料糊劑生產(chǎn)中用作增稠劑以避免染料擴(kuò)散，和用作縫紉紗線束縛劑的添加劑。2.4建筑業(yè)淀粉的第4個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是用作建筑材料中的添加劑。一個(gè)例子是石膏板板材的生產(chǎn)，其中在稀石膏漿中混合的淀粉與水一起糊化、在石膏板表面擴(kuò)散因而使紙板與該板粘合。其它應(yīng)用領(lǐng)域有將淀粉與泥灰和礦物纖維混合。在混合好的混凝土中，淀粉可用于減緩硬化過(guò)程。2.5土壤穩(wěn)定化而且，淀粉在生產(chǎn)土壤穩(wěn)定劑中是有利的，可用于在人工侵?jǐn)n土壤時(shí)臨時(shí)性保護(hù)土壤顆粒免于失水。根據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有知識(shí)，由淀粉和聚合物乳劑組成的混合產(chǎn)品可認(rèn)為具有與現(xiàn)有產(chǎn)品相同的降低沖蝕和結(jié)殼的作用；然而，它們便宜得多。2.6淀粉在植物保護(hù)劑和肥料中的應(yīng)用另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是淀粉用于植物保護(hù)劑中以改變這些制品的特定性質(zhì)。例如，可使用淀粉改善植物保護(hù)劑和肥料的可潤(rùn)濕性，定量釋放有效成分，將液體、揮發(fā)性和/或不良?xì)馕兜挠行С煞洲D(zhuǎn)換成微晶、穩(wěn)定、可變形的物質(zhì)，混合不相容組合物和由于分解減緩而延長(zhǎng)作用持續(xù)時(shí)間。2.7藥品、醫(yī)療和化妝品工業(yè)淀粉也可用于藥品、醫(yī)療和化妝品工業(yè)領(lǐng)域。在制藥工業(yè)中，淀粉可用作片劑粘合劑或用于膠囊粘合劑的稀釋。此外，淀粉適于用作片劑的崩解劑，因?yàn)橥谭笏找后w并在短時(shí)間后溶脹以致活性成分釋放。由于性質(zhì)上的原因，醫(yī)用潤(rùn)滑粉末和療傷用藥粉也以淀粉為基礎(chǔ)。
在化妝品領(lǐng)域，例如淀粉可用作粉末添加物如香水和水楊酸的載體。
淀粉的一個(gè)相當(dāng)廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域是牙膏。2.8淀粉作為煤和煤球的添加物淀粉也可用作煤和煤球的添加物。通過(guò)加入淀粉，煤可定量地成塊和/或形成高質(zhì)量的煤球，從而防止煤球過(guò)早分解。燒烤用煤添加了4％-6％淀粉，高熱煤含有約0.1％-0.5％淀粉。而且，淀粉作為結(jié)合劑變得愈來(lái)愈重要，因?yàn)樵诿汉兔呵蛑屑尤氲矸劭娠@著降低有害物質(zhì)的釋放。2.9礦石和煤漿的加工而且，淀粉可用作礦石和煤漿加工過(guò)程中的凝聚劑。2.10淀粉在鑄造過(guò)程中作為添加物另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是淀粉在鑄造過(guò)程中用作加工材料的添加物。對(duì)于各種鑄造工藝，需要從沙石混合粘合劑產(chǎn)生的核心。目前最常用的粘合劑是混合了改性淀粉、主要是溶脹淀粉的膨潤(rùn)土。加入淀粉的目的是增加流動(dòng)阻力以及改善結(jié)合強(qiáng)度。而且溶脹淀粉可符合該生產(chǎn)工藝的其它必要條件如冷水中的可分散性、再水合能力、與沙石的良好混合性和高度水結(jié)合能力。2.11淀粉在橡膠工業(yè)中的應(yīng)用在橡膠工業(yè)中淀粉可用于改善技術(shù)和光學(xué)質(zhì)量。其原因是改善表面光澤、手感和外觀。為此，在冷固化之前將淀粉分散在粘性的橡膠物質(zhì)的橡膠處理表面上。淀粉還可用于改善橡膠的可印刷性。2.12皮革替代品的生產(chǎn)改性淀粉的另一應(yīng)用領(lǐng)域是生產(chǎn)皮革替代品。2.13合成聚合物中的淀粉在塑料市場(chǎng)存在下列應(yīng)用領(lǐng)域淀粉產(chǎn)品在加工工藝中的應(yīng)用(淀粉只是填充劑，合成聚合物和淀粉之間沒(méi)有直接鍵合)，或淀粉產(chǎn)物在聚合物生產(chǎn)中的應(yīng)用(淀粉和聚合物形成穩(wěn)定的鍵)。
使用淀粉作為純填充劑是不能與其它物質(zhì)如滑石競(jìng)爭(zhēng)的。當(dāng)特定淀粉性質(zhì)變得有效因而終產(chǎn)物的性質(zhì)明顯改變時(shí)這種情況就不同了。一個(gè)例子是淀粉產(chǎn)品在熱塑性材料如聚乙烯的加工過(guò)程中的應(yīng)用。由此，淀粉和合成聚合物可以通過(guò)共作用以1∶1的比例結(jié)合形成“母材料”，由此使用制成粒狀的聚乙烯采用常規(guī)技術(shù)可生產(chǎn)各種產(chǎn)品。淀粉在聚乙烯膜中的整合可造成空心體中物質(zhì)通透性的增加，水蒸氣通透性的改善，抗靜電性能的改善，抗阻塞性能的改善以及水性染料可印刷性的提高。
另一種可能是淀粉在聚氨酯泡沫膠中的應(yīng)用。由于淀粉衍生物的適應(yīng)性以及加工技術(shù)的優(yōu)化，有可能特異地控制合成聚合物和淀粉羥基之間的反應(yīng)。結(jié)果是由于淀粉的使用，聚氨酯膜獲得下列特性降低的熱膨脹系數(shù)、減少的收縮性能、改善的壓力/張力性能、增加的水蒸氣通透性而又不改變對(duì)水的吸收、降低的可燃性和破裂密度、可燃部分無(wú)液滴形成、無(wú)鹵化物和老化的減緩。目前仍然存在的缺點(diǎn)是壓力和沖擊強(qiáng)度的降低。
膜產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)不再是唯一的選擇。也可以生產(chǎn)具有50％以上淀粉含量的固體塑料產(chǎn)品如罐、盤和碗。而且，淀粉/聚合物混合物具有在更大程度上可被生物降解的優(yōu)點(diǎn)。
而且，由于它們極易與水結(jié)合，淀粉接枝聚合物已經(jīng)具有了極大的重要性。這些產(chǎn)品具有淀粉骨架和根據(jù)自由基鏈反應(yīng)機(jī)制在其上接枝的合成單體的側(cè)鏈。目前已有的淀粉接枝聚合物的特征是改善的水結(jié)合和保持能力，在高粘度時(shí)每克淀粉結(jié)合和保持高達(dá)1000g的水。在過(guò)去的幾年，這些超吸收劑已獲得了更為廣泛的應(yīng)用-主要應(yīng)用于衛(wèi)生領(lǐng)域，如尿布和床單等產(chǎn)品，以及農(nóng)業(yè)部門如種子小球。
應(yīng)用重組DNA技術(shù)修飾的新淀粉的決定性因素，一方面是結(jié)構(gòu)、含水量、蛋白含量、脂含量、纖維含量、灰/磷酸含量、直鏈淀粉/支鏈淀粉比、相對(duì)摩爾質(zhì)量的分布、支化度、顆粒大小和形狀以及結(jié)晶性，另一方面是導(dǎo)致下列性質(zhì)的特性流動(dòng)和吸附性能、糊化溫度、粘度、增稠性能、溶解度、糊狀結(jié)構(gòu)和透明性、熱、剪切和酸的耐受性、退化傾向、凝膠形成能力、凍/融抗性、復(fù)合物形成能力、碘結(jié)合能力、膜形成能力、粘合強(qiáng)度、酶穩(wěn)定性、可消化性和反應(yīng)性。
通過(guò)采用轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行遺傳操作產(chǎn)生改性淀粉，可以改變從該植物獲得的淀粉的性質(zhì)，以致不再需要通過(guò)化學(xué)或物理方法進(jìn)行進(jìn)一步修飾。另一方面，可對(duì)通過(guò)重組DNA技術(shù)修飾的淀粉進(jìn)行進(jìn)一步化學(xué)修飾，這將為某些上述應(yīng)用領(lǐng)域產(chǎn)生進(jìn)一步的質(zhì)量改善。原則上，這些化學(xué)修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些修飾尤其是指通過(guò)下列方法進(jìn)行的修飾-熱處理-酸處理-氧化和-酯化作用這些修飾導(dǎo)致形成磷酸、硝酸、硫酸、黃原酸、乙酸和檸檬酸淀粉。其它有機(jī)酸也可用于酯化-形成淀粉醚淀粉烷基醚、O-烯丙基醚、羥烷基醚、O-羧甲基醚、含氮淀粉醚、含磷淀粉醚和含硫淀粉醚。
-形成分支淀粉-形成淀粉接枝聚合物。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生改性淀粉的方法，包括步驟從根據(jù)本發(fā)明的上述植物(植物細(xì)胞)中和/或從該植物的淀粉貯藏部分中提取淀粉。該方法優(yōu)選還包括步驟在提取淀粉前收獲已成熟的植物，和/或這些植物的淀粉貯藏部分，尤其優(yōu)選還包括步驟在收獲前栽培根據(jù)本發(fā)明的植物。從植物或植物的淀粉貯藏部分中提取淀粉的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。而且，從各種淀粉貯藏植物中提取淀粉的方法已有描述，見(jiàn)例如，“淀粉化學(xué)性質(zhì)和技術(shù)(StarchChemistry and Technology)(編者Whistler，BeMiller和Paschall(1994)，第2版，Academic Press Inc.London Ltd；ISBN 0-12-746270-8；見(jiàn)例如第XII章，第412-468頁(yè)玉米和高粱的淀粉制備(Watson著)；第XIII章，第469-479頁(yè)木薯、竹芋和西米淀粉制備(Corbishley和Miller著)；第XIV章，第479-490頁(yè)馬鈴薯淀粉制備和應(yīng)用(Mitch著)；第XV章，第491-506頁(yè)小麥淀粉制備、修飾和應(yīng)用(Knight和Oson著)；以及第XVI章，第507-528頁(yè)水稻淀粉制備和應(yīng)用(Rohmer和Klem著)；玉米淀粉Echhoff等，Cereal Chem.73(1996)54-57，通過(guò)濕磨在工業(yè)水平上常規(guī)提取玉米淀粉。)。通常在從植物材料中提取淀粉的方法中應(yīng)用到的裝置有分離器、傾析器、水力旋流器、噴射干燥器和流化床干燥器。
本發(fā)明的主題還有通過(guò)上述根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的淀粉。
本發(fā)明還涉及從根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞和/或根據(jù)本發(fā)明的植物可獲得的淀粉，以及從根據(jù)本發(fā)明的植物的淀粉貯藏組織，尤其是塊莖和核仁可獲得的淀粉。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的淀粉在工業(yè)領(lǐng)域，尤其是在食品、飼料和紙張的生產(chǎn)中的應(yīng)用。


圖1質(zhì)粒圖譜IR 65/87LBT-DNA的左邊界35S-T35S終止子(Frank等，細(xì)胞21，(1980)，285-294)PAT膦絲菌素抗性，EP-A2-027595735S-PCaMV 35 S啟動(dòng)子(Frank等，細(xì)胞21，(1980)，285-294)泛素P泛素啟動(dòng)子(Christensen等，Plant Mol.Biol.18，(1992)，675-689)Ubi.內(nèi)含子泛素內(nèi)含子(Christensen等，Plant Mol.Biol.18，(1992)，675-689)SS6SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的編碼區(qū)NOSnos終止子(Depicker等，J.Mol.Appl.Genet.1，(1982)，561-573)RBT-DNA的右邊界氨芐青霉素氨芐青霉素抗性基因(Yanisch-Perron等，基因(Gene)33，(1985)，103-119)。
實(shí)施例中所用培養(yǎng)基和溶液20×SSC 175.3g NaCl88.2g檸檬酸鈉加至1000ml雙蒸水用10N NaOH調(diào)節(jié)至pH7.0YT 8g細(xì)菌用酵母提取物5g細(xì)菌用蛋白胨5g NaCl加至1000ml雙蒸水原生質(zhì)體分離介質(zhì)(100ml)纖維素酶Onozuka R S(Meiji Seika，日本) 800mg果膠分解酶Y 23 40mgKNO3200mgKH2PO4136mgK2HPO447mgCaCl22H2O 147mgMgSO47H2O 250mg牛血清白蛋白(BSA) 20mg葡萄糖 4000mg果糖4000mg蔗糖1000mgpH 5.8重量摩爾滲透壓濃度 660mosm原生質(zhì)體洗滌溶液1同原生質(zhì)體分離溶液，但沒(méi)有纖維素酶、果膠分解酶和BSA轉(zhuǎn)化緩沖液a) 葡萄糖 0.5MMES 0.1％MgCl26H2O25mMpH 5.8調(diào)節(jié)至600mosmb) PEG 6000溶液葡萄糖 0.5MMgCl26H2O 100mMHepes 20mMpH 6.5在使用該溶液前在上述b)的緩沖液中加入PEG 6000(按重量計(jì)PEG為40％)。該溶液通過(guò)0.45μm無(wú)菌濾器進(jìn)行過(guò)濾。W5溶液CaCl2125mMNaCl150mMKCl 5mM葡萄糖 50mM原生質(zhì)體培養(yǎng)基(數(shù)據(jù)單位mg/l)KNO33000(NH4)2SO4500MgSO47H2O 350KH2PO4400CaCl22H2O 300Fe-EDTA和痕量元素與Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Physiol.Plant，15(1962)，472)的相同m-肌醇 100鹽酸硫胺素 1.0煙酰胺 0.5鹽酸吡哆醇 0.5甘氨酸 2.0葡糖醛酸 750半乳糖醛酸 750半乳糖 500麥芽糖 500葡萄糖 36,000果糖 36,000蔗糖 30,000天冬酰胺 500谷氨酰胺 100脯氨酸 300酪蛋白水解物 5002，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.5pH 5.8重量摩爾滲透壓濃度 600mosm以下方法為本實(shí)施例中所用1.玉米的轉(zhuǎn)化(a)細(xì)胞系DSM 6009原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體分離在最后一次更換原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基后2-4天，優(yōu)選3天，將該液體培養(yǎng)基吸出，用500ml原生質(zhì)體洗滌溶液1洗滌留下的細(xì)胞，并通過(guò)吸出該洗滌溶液作再一次干燥。在每個(gè)收獲的2g細(xì)胞生物質(zhì)中加入10ml原生質(zhì)體分離介質(zhì)。將該重懸細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)聚體在暗處于27±2℃孵育4-6小時(shí)，此過(guò)程中伴隨輕柔振搖(30-40rpm)。原生質(zhì)體純化當(dāng)每ml已釋放了1百萬(wàn)個(gè)原生質(zhì)體(顯微鏡下觀察)時(shí)，將該懸浮液通過(guò)網(wǎng)目大小分別為200μm和45μm的不銹鋼篩和尼龍篩。將一個(gè)100m和一個(gè)60μm的篩組合在一起也同樣適合于除去細(xì)胞團(tuán)聚體。在顯微鏡下評(píng)價(jià)含有原生質(zhì)體的濾出液。通常，該濾出液含有98-99％的原生質(zhì)體。其余是未消化的單細(xì)胞。此純度的原生質(zhì)體制備物無(wú)需額外的梯度離心即可用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。通過(guò)離心(在吊桶式轉(zhuǎn)頭中100rpm(100×g，3min))沉淀原生質(zhì)體。丟棄上清液并將原生質(zhì)體重懸在洗滌溶液1中。重復(fù)該離心步驟，然后將原生質(zhì)體重懸在轉(zhuǎn)化緩沖液中。(b)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將重懸在轉(zhuǎn)化緩沖液中的原生質(zhì)體以10ml為一份的量分裝在50ml同質(zhì)異晶聚合物管中，滴度為0.5-1×106個(gè)原生質(zhì)體/ml。將用于轉(zhuǎn)化的DNA溶解在Tris-EDTA(TE)緩沖液中。向每ml原生質(zhì)體懸浮物中加入20μg質(zhì)粒DNA。所用載體為介導(dǎo)膦絲菌素抗性的質(zhì)粒(參見(jiàn)例如EP-A2-0513 849)。加入DNA后，小心搖動(dòng)該原生質(zhì)體懸浮物，以使DNA均勻地分散在該溶液中。之后立即滴加5mlPEG溶液。小心地轉(zhuǎn)動(dòng)管子以使該P(yáng)EG溶液均勻分布。然后，再加入5ml PEG溶液，并重復(fù)該混合步驟以獲得均一化。將原生質(zhì)體在該P(yáng)EG溶液中于25±2℃保持20分鐘。然后通過(guò)離心3分鐘(100g；1000rpm)沉淀原生質(zhì)體。丟棄上清液。通過(guò)在20ml W5溶液中小心振搖對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行洗滌，之后再次離心。然后將它們重懸在20ml原生質(zhì)體培養(yǎng)基中，再次離心并再次重懸在培養(yǎng)基中。將滴度調(diào)節(jié)至6-8×105個(gè)原生質(zhì)體/ml，并將這些原生質(zhì)體以3ml為一部分培養(yǎng)在培養(yǎng)皿(φ60mm，高15mm)中。用Parafilm密封這些培養(yǎng)皿，然后將其于25±2℃置于暗處。(c)原生質(zhì)體培養(yǎng)在分離和轉(zhuǎn)化后的頭2-3周內(nèi)，在不添加新鮮培養(yǎng)基的情況下培養(yǎng)原生質(zhì)體。一旦從原生質(zhì)體再生出的細(xì)胞發(fā)育成超過(guò)20-50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)聚體后，添加含有蔗糖(90g/l)、滲透壓相同的1ml新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基。(d)篩選轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞，和植株的再生加入新鮮培養(yǎng)基后3-10天，可以將從原生質(zhì)體形成的細(xì)胞團(tuán)聚體接種在補(bǔ)加了100mg/l L-膦絲菌素的瓊脂培養(yǎng)基上。含有原生質(zhì)體培養(yǎng)基中的維生素、90g/l蔗糖和1.0mg/l 2，4-D的N6培養(yǎng)基，與例如MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog(1962)，見(jiàn)上)中的大量和微量元素一起，同樣地適合作為類似培養(yǎng)基。來(lái)源于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的愈傷組織可以在該選擇培養(yǎng)基上無(wú)阻礙地持續(xù)生長(zhǎng)。3-5周，優(yōu)選4周后，可以將該轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移至同樣含有100mg/l L-膦絲菌素、但不再含有任何生長(zhǎng)素的新鮮選擇培養(yǎng)基中。在3-5周的期間內(nèi)，50％在其基因組中整合有L-膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織在含有L-膦絲菌素的該培養(yǎng)基上分化出第1批植物。(e)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因再生植株在含有5×10-4M L-膦絲菌素的無(wú)激素N5培養(yǎng)基(Chu C.C.等，Sci.Sin.16(1975)，659)上培養(yǎng)胚胎發(fā)生的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因玉米組織。在該培養(yǎng)基上，充分表達(dá)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(PAT基因)的玉米胚發(fā)育成植株。未轉(zhuǎn)化的胚、或僅具有很弱的PAT活性的胚將死亡。當(dāng)體外植物的葉達(dá)到4-6cm長(zhǎng)時(shí)，可將它們轉(zhuǎn)移至土壤中。將根上的瓊脂殘余物洗掉后，將植株種植在壤土、沙、蛭石和標(biāo)準(zhǔn)土壤的3∶1∶1∶1混合物中，并在移植到90-100％相對(duì)空氣濕度中后頭3天中使其適應(yīng)土壤培養(yǎng)。在具有14小時(shí)光周期、按植物水平約25,000Lux的人工氣候室中，以23±1/17±1℃的日/夜溫度，對(duì)這些植株進(jìn)行培養(yǎng)。將這些適應(yīng)植物培植在65±5％的空氣濕度中。4.DNA片段的放射性標(biāo)記利用Boehringer(德國(guó))的DNA隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，按照廠家說(shuō)明書對(duì)DNA片段進(jìn)行放射性標(biāo)記。以下實(shí)施例在于舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不構(gòu)成任何形式的限制實(shí)施例1鑒定、分離和表征編碼新的玉蜀黍(Zea mays)淀粉合成酶同工型的cDNA為了鑒定編碼新的玉米淀粉合成酶同工型的cDNA，首先按照Logemann等(Anal.Biochem.163，(1987)，21-26)的方法，從玉米仁(授粉后15-20天)中分離總RNA。然后利用Oligotex-mRNA純化試劑盒(Quiagen)，按照廠家說(shuō)明書，將1mg總RNA用以制備polyA+-RNA。
然后利用Stratagene的ZAP cDNA合成試劑盒從5μg polyA+-RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)。該文庫(kù)含有約9×105個(gè)獨(dú)立的重組噬菌體，cDNA插入片段的平均大小為約1.3kb。
然后對(duì)約4×105個(gè)噬菌體進(jìn)行菌斑影印(plaque-lifting)。為此，采用Hybond N濾膜(Amersham)。在緩沖液A(5×SSC，0.5％BSA，5×Denhardt，1％SDS，40mM磷酸緩沖液，pH7.2；100mg/l鮭精DNA，25％甲酰胺)中42℃預(yù)雜交4個(gè)小時(shí)，然后采用放射性標(biāo)記(隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒，Boehringer Mannheim)的馬鈴薯(Solanum tuberosum)SSIII cDNA(GenBank登錄號(hào)X 94400)的EcoRI/XhoI片段(總cDNA)對(duì)該濾膜進(jìn)行雜交。12小時(shí)后，在含有3×SSC、0.5％SDS的緩沖液中55℃20分鐘洗滌該濾膜3次。然后，在其上放置一張X光片約14個(gè)小時(shí)。
分離強(qiáng)雜交噬菌斑，并將其稀釋、更新并轉(zhuǎn)移至濾膜上。按上述再次進(jìn)行雜交和洗滌。按照廠家說(shuō)明書(Stratagene)體內(nèi)切割這些分離的噬菌體后，分離各種質(zhì)粒，并通過(guò)限制性分析對(duì)它們進(jìn)行表征。然后確定具有最長(zhǎng)的cDNA插入片段的質(zhì)粒DNA序列。其中一個(gè)質(zhì)粒命名為pZm_SS6，含有SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列。實(shí)施例2制備用于轉(zhuǎn)化植物的載體從含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列完整編碼區(qū)的pZm_SS6質(zhì)粒的NotI/Bsp 120I片段起始，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建載體IR65/87(見(jiàn)圖1)，該載體尤其適合于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明具有增加活性(過(guò)量表達(dá)方案)或降低活性(共抑制解決方案)的淀粉合成酶的轉(zhuǎn)基因玉米植物，并于1999年8月5日被保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung fürMikroorganismen)，保藏號(hào)為DSM 12970。
根據(jù)上述方法采用載體IR65/87轉(zhuǎn)化玉米植物。
然后篩選與相應(yīng)未轉(zhuǎn)化玉米植物相比表現(xiàn)出本發(fā)明蛋白質(zhì)活性增加或活性降低的轉(zhuǎn)基因植物。
權(quán)利要求
1.編碼具有淀粉合成酶生物活性的蛋白質(zhì)或該蛋白質(zhì)的生物活性片段的核酸分子，其選自(a)編碼具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子；(b)含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子；(c)含有質(zhì)粒IR 65/87(保藏號(hào)DSM 12970)中所存在的cDNA核苷酸序列的編碼區(qū)、或其互補(bǔ)序列的核酸分子；(d)其核苷酸序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于(a)、(b)或(c)所述核酸分子的序列的核酸分子；和(e)構(gòu)成(a)、(b)、(c)或(d)所述核酸分子的片段、等位變體和/或衍生物的核酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子，其是DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子，其是RNA分子。
4.含有根據(jù)權(quán)利要求1-3之一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的載體，其含有在原核和/或真核細(xì)胞中保證轉(zhuǎn)錄所述核酸分子和/或合成可翻譯RNA的一或多個(gè)調(diào)節(jié)元件。
6.根據(jù)權(quán)利要求4-5之一項(xiàng)或多項(xiàng)的載體，其中所述核酸分子以有義方向和在原核和/或真核細(xì)胞中保證可翻譯RNA轉(zhuǎn)錄和合成的調(diào)節(jié)元件相連接，或其中所述核酸分子以反義方向和在原核和/或真核細(xì)胞中保證非可翻譯RNA轉(zhuǎn)錄和合成的調(diào)節(jié)元件相連接。
7.用根據(jù)權(quán)利要求1-3之一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求4-6之一項(xiàng)或多項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或來(lái)源于該細(xì)胞的細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，其是植物細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或其生物活性片段。
10.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求9的蛋白質(zhì)或其生物活性片段的方法，其中在允許合成該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求7-8之一項(xiàng)或多項(xiàng)的宿主細(xì)胞，并從該培養(yǎng)細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離該蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中編碼具有淀粉合成酶生物活性的蛋白質(zhì)或其生物活性片段的所述核酸分子處于允許在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄可翻譯mRNA的調(diào)節(jié)元件的控制之下。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中根據(jù)權(quán)利要求9的蛋白質(zhì)或其生物活性片段的活性在該植物細(xì)胞中與在來(lái)自野生型植物的相應(yīng)非遺傳修飾植物細(xì)胞中相比發(fā)生降低。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中根據(jù)權(quán)利要求9的蛋白質(zhì)或其生物活性片段的活性在該植物細(xì)胞中與在來(lái)自野生型植物的相應(yīng)非遺傳修飾植物細(xì)胞中相比發(fā)生增加。
14.含有根據(jù)權(quán)利要求8和11-13之一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物細(xì)胞的植物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的植物，其是作物植物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14-15之一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物，其是淀粉貯藏植物。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16之一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物，其是玉米植物。
18.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，其中通過(guò)引入根據(jù)權(quán)利要求1-3之一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子和/或根據(jù)權(quán)利要求4-6之一項(xiàng)或多項(xiàng)的載體，對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。
19.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中(a)通過(guò)引入根據(jù)權(quán)利要求1-3之一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子和/或根據(jù)權(quán)利要求4-6之一項(xiàng)或多項(xiàng)的載體，對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾；并且(b)從該細(xì)胞再生植物；并任選地，(c)從(b)的植物產(chǎn)生更多的植物。
20.根據(jù)權(quán)利要求14-17之一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物的繁殖材料，其含有根據(jù)權(quán)利要求8和11-13之一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物細(xì)胞。
21.從根據(jù)權(quán)利要求8和11-13之一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求14-17之一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物、或根據(jù)權(quán)利要求20的繁殖材料中獲得的淀粉。
22.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求21的改性淀粉的方法，包括步驟從根據(jù)權(quán)利要求8和11-14之一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求14-17之一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物和/或根據(jù)權(quán)利要求20的繁殖材料中提取淀粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼植物中參與淀粉合成的酶的核酸分子。所述酶是新的淀粉合成酶同工型。本發(fā)明還公開(kāi)了用于產(chǎn)生合成改性淀粉的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物的載體。此外,還公開(kāi)了產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物的方法,和制備改性淀粉的方法。
文檔編號(hào)C08B31/00GK1378600SQ00809585
公開(kāi)日2002年11月6日 申請(qǐng)日期2000年8月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月11日
發(fā)明者C·福羅伯格 申請(qǐng)人:阿溫提斯作物科學(xué)有限公司