專利名稱：編碼參與淀粉合成的小麥酶的核酸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼參與植物體內(nèi)淀粉合成的小麥酶的核酸分子。這種酶為一種異淀粉酶。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明中的核酸分子的載體、宿主細(xì)胞以及植物細(xì)胞和植物。
另外，本發(fā)明描述了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，由于導(dǎo)入了本發(fā)明的核酸分子，這種轉(zhuǎn)基因植物合成特征發(fā)生變化的淀粉。
鑒于近來將植物成分作為可更新原料的重要性越來越大，作為生物技術(shù)研究的主題之一，正努力使植物原料適應(yīng)加工工業(yè)的要求。為了在盡可能多的應(yīng)用領(lǐng)域使用可更新原料，必需產(chǎn)生多種多樣的材料。
除了油、脂肪和蛋白質(zhì)外，多糖也是植物的重要可更新原料。多糖中占主要地位的除了纖維素外就是淀粉，它是高等植物體內(nèi)最重要的儲(chǔ)存物質(zhì)。在此，小麥?zhǔn)亲钪匾霓r(nóng)作物之一，因?yàn)闅W共體的淀粉產(chǎn)量中大約20％是從小麥獲取的。
多糖淀粉是化學(xué)上相同的基本結(jié)構(gòu)單元-葡萄糖分子-的聚合物。但是這里，涉及的是由不同分子形式組成的很復(fù)雜的混合物，這些分子在聚合度、葡萄糖鏈的支化及其鏈長方面不同，此外還可能衍生化，例如磷酰化。因此，淀粉不能構(gòu)成均一的原料。人們特別區(qū)別了直鏈淀粉，一種由α-1,4-葡萄糖苷鍵連接的葡萄糖分子形成的基本上無支化的聚合物，與支鏈淀粉，它是由不同支化的葡萄糖鏈的復(fù)雜的混合物構(gòu)成。這里，支化是通過發(fā)生附加的α-1,6-葡萄糖苷鍵連接而產(chǎn)生的。小麥中合成的淀粉含有約11-37％的直鏈淀粉。
為了將合適的淀粉盡可能多樣性地應(yīng)用于不同的工業(yè)需求，希望提供這樣的植物，其能夠合成特別適于不同應(yīng)用目的的改性淀粉。提供這種植物的一種可能性是植物育種措施。但由于小麥?zhǔn)嵌啾扼w性狀(四倍體和六倍體)，已證明植物育種很難施加影響。最近才通過自然出現(xiàn)的突變體的雜交生產(chǎn)了“蠟態(tài)”(無直鏈淀粉)的小麥(Nakamura等，Mol.Gen.Genet.248(1995),253-259)。
替代植物育種方法，可通過重組方法實(shí)現(xiàn)生淀粉植物的特異性改變。但是對(duì)此，前提是識(shí)別和表征參與淀粉合成和/或淀粉改性的酶以及分離編碼這些酶的核酸分子。
導(dǎo)致淀粉合成的生化途徑基本上是已知的。植物細(xì)胞中淀粉的合成在質(zhì)體中進(jìn)行。在光合成活性的組織中，這些質(zhì)體是葉綠體，在無光合成活性的組織中淀粉儲(chǔ)存組織是造粉體。
借助重組方法實(shí)現(xiàn)植物體內(nèi)合成淀粉支化度的進(jìn)一步控制改變，仍然要求識(shí)別編碼參與淀粉代謝、特別是淀粉分子內(nèi)引入和降解支化的酶的DNA序列。
除了在淀粉分子中引入支化的所謂Q-酶以外，在植物酶中還有能夠解除支化的酶。這些酶稱為脫支酶，根據(jù)其底物特異性分為三組a)支鏈淀粉酶，它們除了普魯蘭外，還利用支鏈淀粉作為底物，出現(xiàn)在微生物如克雷伯氏桿菌屬和植物體中。植物體中這些酶也稱為R-酶。b)異淀粉酶，它不利用普魯蘭，而是利用糖原和支鏈淀粉作為底物，同樣出現(xiàn)在微生物和植物體中。例如，異淀粉酶已在玉米(Manners ＆ Carbohydr.Res.9(1969),107)和馬鈴薯(Ishizaki等，Agric.Biol.Chem.47(1983),771-779)中報(bào)道過。c)淀粉-1,6-葡萄糖苷酶，據(jù)報(bào)道存在于哺乳動(dòng)物和酵母體內(nèi)，利用臨界糊精作底物。
Li等證明，在甜菜中除了5種內(nèi)淀粉酶和2種外淀粉酶以外，只有一種支鏈淀粉菌酶型的脫支酶(Plant Physiol.98(1992),1277-1284)。該酶的大小為約100kD，最適pH值是5.5，位于葉綠體中。據(jù)報(bào)道菠菜中也含有脫支酶，它利用普魯蘭作底物。菠菜和甜菜中的脫支酶在與支鏈淀粉底物反應(yīng)時(shí)的活性都比與普魯蘭底物反應(yīng)時(shí)的活性小5倍(Ludwig等，Plant Physiol.74(1984),856-861;Li等，Plant Physiol.98(1992),1277-1284)。
在農(nóng)業(yè)中重要的儲(chǔ)存淀粉的農(nóng)作物－馬鈴薯方面，Hobson等研究了脫支酶的活性(J.Chem.Soc.,(1951),1451)。成功地證明，與Q-酶不同，該酶不具有鏈增長活性，而只是水解α-1,6-葡萄糖苷鍵。但是這種酶至今還未能準(zhǔn)確加以表征。就馬鈴薯來說，已經(jīng)提出了脫支酶的提純方法以及提純蛋白質(zhì)的部分肽序列(WO95/04826)。在此期間報(bào)道了菠菜中脫支酶的提純以及相應(yīng)的cDNA的分離(Renz等，Plant Physiol.108(1995),1342)。
對(duì)于玉米，目前在文獻(xiàn)中只報(bào)道了一種脫支酶的存在。根據(jù)其底物的特異性，該酶被列入異淀粉酶一類(參見例如Hannah等，Scientia Horticulturae 55(1993),177-197或Garwood(1984),Starch Chemistry and Teehnology,Whistler,R.L.,BeMiller,J.N.,Puschall,E.F.(編者),AcademicPress San Diego,New York,Boston,25-86)。相應(yīng)的突變體稱為“糖樣的”。最近克隆了糖樣基因座的基因(參見James等，Plant Cell 7(1995),417-429)。目前在玉米中除了糖樣基因座外，還不知道其它的編碼具有脫支酶活性的蛋白質(zhì)的基因座。至今還沒有任何說明在玉米中存在其它形式脫支酶的報(bào)道。如果希望生產(chǎn)不再具有任何脫支酶活性的轉(zhuǎn)基因玉米植株，例如為了增加支鏈淀粉的支化度，需要鑒別玉米中存在的所有脫支酶形式，分離相應(yīng)的基因或cDNA序列。
為提供改變?nèi)魏蝺?chǔ)存淀粉的植物，優(yōu)選谷類，特別優(yōu)選小麥，使其合成改性的淀粉的其它途徑，都要求識(shí)別編碼支化酶其它的同工型的DNA序列。
因此，本發(fā)明的目的是提供編碼參與淀粉合成的酶的核酸分子，由此可能生產(chǎn)遺傳改性的植物，它們能產(chǎn)生化學(xué)和/或物理特性改變的植物淀粉。
這一目的通過權(quán)利要求書中定義的應(yīng)用形式來達(dá)到。
因此，本發(fā)明涉及編碼具有小麥異淀粉酶功能的蛋白質(zhì)的核酸分子，優(yōu)選編碼基本如Seq ID No.3或7所述氨基酸序列定義的蛋白質(zhì)的核酸分子。本發(fā)明特別涉及核酸分子包含Seq ID No.1、2或6所述核苷酸序列或其一部分的核酸分子，優(yōu)選含有Seq ID No.1、2或6所述編碼區(qū)以及相應(yīng)的核糖核苷酸序列的分子。更特別優(yōu)選另外含有調(diào)節(jié)基因元件的核酸分子，這些元件保證上述的核酸分子的轉(zhuǎn)錄以及可能的翻譯。此外，本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的核酸分子雜交的核酸分子。
本發(fā)明還涉及一種編碼小麥異淀粉酶的核酸分子，它的序列由遺傳密碼子的簡并性而與上述分子的核苷酸序列不同。
本發(fā)明也涉及一種序列與上述序列的全部或部分互補(bǔ)的核酸分子。
術(shù)語“雜交”在本發(fā)明范圍內(nèi)是指在傳統(tǒng)雜交條件，優(yōu)選在嚴(yán)格的條件下的雜交，例如參見Sambrook,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中所述。
“雜交”特別優(yōu)選在下列條件下進(jìn)行雜交緩沖液2×SSC；10×Denhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA；比例為1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鯡魚精子DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸鈉緩沖液pH為7.2；1mM EDTA；7％SDS雜交溫度 T=65～70℃洗滌緩沖液0.2×SSC；0.1％SDS洗滌溫度 T=40～75℃與本發(fā)明的核酸分子雜交的核酸分子原則上能編碼任何表達(dá)這種蛋白的小麥植物中的異淀粉酶。
與本發(fā)明的分子雜交的核酸分子例如可從小麥或小麥植物組織的基因組或cDNA文庫中分離。還可選擇通過重組方法或通過化學(xué)合成的方法來生產(chǎn)。
這類核酸分子的識(shí)別和分離可以應(yīng)用本發(fā)明的分子或這種分子的一部分或者這種分子的反向互補(bǔ)部分來完成，例如借助于按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的雜交(參見Sambrook,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第二版Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY中所述)。
雜交探針例如應(yīng)用嚴(yán)格或基本上具有Seq ID No.1、2或6所述核苷序列或此序列的一部分的核酸分子。用作雜交探針的片段也可以是合成片段，借助于常規(guī)合成技術(shù)來生產(chǎn)，它們的序列基本上與本發(fā)明的核酸分子的序列一致。
與本發(fā)明的核酸分子雜交的分子還包括上述編碼本發(fā)明的小麥異淀粉酶的核酸分子的片段、衍生物以及等位變體。所謂的片段這里指核酸分子的一部分，它的長度足以編碼上述一種蛋白質(zhì)。本文中的衍生物是指這種分子的序列與上述核酸分子的序列在一個(gè)或多個(gè)位置不同，并與這些序列具有高度同源性。同源性這里指至少40％序列相同，特別是至少60％的序列相同，優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選超過90％的序列相同。與上述核酸分子的偏差可能由缺失、取代、插入或重組造成。
同源性還意味著，在涉及的核酸分子或它們編碼的蛋白之間存在功能和/或結(jié)構(gòu)相當(dāng)性。與上述分子同源的并構(gòu)成這些分子的衍生物的核酸分子，一般涉及這些分子的變化，即所謂的改性，它們發(fā)揮同樣的生物功能。這里涉及自然發(fā)生的變化，例如來自其它有機(jī)體的序列，或可能自然產(chǎn)生的突變或通過定位誘變形成產(chǎn)生的突變。對(duì)于這種變化還可能涉及合成產(chǎn)生的序列。等位變體不僅涉及到自然產(chǎn)生的變體，還涉及到合成產(chǎn)生的或通過DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的變體。
由本發(fā)明的核酸分子的不同變體編碼的異淀粉酶具有一定的共同特征。對(duì)此可能有酶活性、分子量、免疫活性、構(gòu)型等以及物理特性，例如在凝膠電泳中的遷移性能、色譜性能、沉降系數(shù)、溶解性、光譜特性、電荷特征、穩(wěn)定性；最適pH值、最適溫度等。
本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)為小麥異淀粉酶。這些蛋白質(zhì)與目前已知的其它種植物中的異淀粉酶具有一定的同源性范圍。
本發(fā)明的核酸分子可以是DNA分子，特別是cDNA或基因組分子。本發(fā)明的核酸分子還可以是RNA分子，它可通過本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)錄得到。本發(fā)明的核酸分子可以從天然來源獲得或通過重組技術(shù)或合成來生產(chǎn)。
本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的核酸分子專一性雜交的寡核苷酸。這類寡核苷酸優(yōu)選的長度至少含10個(gè)，特別是至少15個(gè)，更優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸與本發(fā)明的核酸分子專一性雜交，也就是說，沒有或只有極少量編碼其它蛋白質(zhì)的核酸序列，特別是編碼其它異淀粉酶的核酸序列。本發(fā)明的寡聚糖苷酸可以用作PCR反應(yīng)的引物或分離相關(guān)基因的雜交探針。它們同樣也可以是反義結(jié)構(gòu)的組分，或編碼合適的核酶的DNA分子的組分。
本發(fā)明還涉及含有上述本發(fā)明核酸分子的載體，特別是質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒、噬菌體和其它在遺傳工程中常規(guī)使用的載體。這類載體適于原核或真核細(xì)胞、優(yōu)選植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
該載體特別優(yōu)選允許在植物細(xì)胞的基因組中整合本發(fā)明的核酸分子，適當(dāng)時(shí)一并帶有位于兩側(cè)的調(diào)節(jié)區(qū)域。載體的實(shí)例有可農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移中使用的二元載體。優(yōu)選本發(fā)明的核酸分子以有義或反義方向整合，以保證在轉(zhuǎn)化的原核或真核細(xì)胞中合成可翻譯或不可翻譯的RNA。
術(shù)語“載體”一般代表一種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的合適助劑，它能實(shí)現(xiàn)單鏈或雙鏈核酸分子向宿主細(xì)胞中的指定轉(zhuǎn)移，例如DNA-或RNA-病毒、病毒片段、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，它們?cè)谟谢驘o調(diào)節(jié)元件存在下適于核酸分子向細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)，或載體材料如玻璃纖維或在“粒子槍”方法中可使用的金屬粒子，但是還可能包括可通過化學(xué)或物理方法直接導(dǎo)入細(xì)胞的核酸分子。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體中的核酸分子與調(diào)節(jié)元件連接，這些元件保證在原核或真核細(xì)胞中可翻譯RNA的轉(zhuǎn)錄和合成，或如必要進(jìn)一步保證不可翻譯RNA的合成。
本發(fā)明的核酸分子在原核細(xì)胞如在大腸桿菌中的表達(dá)對(duì)更詳細(xì)地表征這些分子編碼的酶的酶活性來說很重要。特別是可能表征在植物細(xì)胞中其它參與淀粉合成的酶不存在的情況下，由相應(yīng)的酶合成的產(chǎn)物。這樣就可以得出結(jié)論，植物細(xì)胞中淀粉合成時(shí)相應(yīng)的蛋白質(zhì)是否起了作用。
此外，可以能借助分子生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)(參見Sambrook等，1989年，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spting Harbor,NY)在本發(fā)明的核酸分子中引導(dǎo)各種類型的突變，由此合成具有可能改變的生物特性的蛋白質(zhì)。這里，可能產(chǎn)生缺失突變體，其中通過DNA編碼序列在5’-端或3’-端的逐漸缺失產(chǎn)生核酸分子，它們合成相應(yīng)的較短的蛋白質(zhì)。例如可能通過這種核苷序列在5’-端的缺失來識(shí)別負(fù)責(zé)質(zhì)體中酶易位的氨基酸序列(轉(zhuǎn)運(yùn)肽)。這允許定向生產(chǎn)通過去除相應(yīng)的序列而不再位于質(zhì)體內(nèi)而在細(xì)胞液中的酶，或由于其他信號(hào)序列的加入而定位于其它的區(qū)室的酶。
另一方面還能在那些氨基酸序列的改變對(duì)例如酶活性或酶調(diào)節(jié)有影響的位置引發(fā)點(diǎn)突變。通過這種方法可能生產(chǎn)Km值改變或不再受細(xì)胞中正常存在的別構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制或共價(jià)修飾調(diào)節(jié)的突變體。
此外還能生產(chǎn)改變本發(fā)明蛋白質(zhì)的底物專一性或產(chǎn)物專一性改變的突變體。另外還能生產(chǎn)改變了本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性-溫度特性的突變體。
對(duì)于原核細(xì)胞的重組修飾，可將本發(fā)明的核酸分子或這些分子的一部分引入質(zhì)粒中，它們?cè)试S發(fā)生誘變或通過DNA序列的重組改變序列。借助標(biāo)準(zhǔn)方法(參看Sambrook等，1989,MolecularClonign:A Laboratory manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,USA)，可對(duì)天然或合成序進(jìn)行堿基交換。對(duì)于DNA片段彼此的連接，可以使用片段接頭或連接子。此外還可采取控制適當(dāng)措施限制切割位點(diǎn)或除去多余的DNA或限制切割位點(diǎn)。對(duì)于插入、缺失或取代，可應(yīng)用體外誘變、引物修補(bǔ)、限制性切割或連接。常用的分析方法是序列分析、限制位點(diǎn)分析或其它生化和分子生物學(xué)方法。
另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用上述本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，特別是原核或真核細(xì)胞，以及從如此轉(zhuǎn)化的細(xì)胞衍生并含有本發(fā)明的核酸分子或載體的細(xì)胞。這里優(yōu)選涉及原核或真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及可重組生產(chǎn)的由本發(fā)明的核酸分子編碼的具有異淀粉酶活性的蛋白質(zhì)，以及它們的生產(chǎn)方法，其中本發(fā)明的細(xì)胞在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的允許本發(fā)明蛋白質(zhì)合成的合適條件下培養(yǎng)，然后從宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基分離。
利用本發(fā)明的核酸現(xiàn)可能借助重組方法定向干預(yù)植物的淀粉代謝，將其作如下改變以得到理化性質(zhì)改變的改性淀粉，例如直鏈淀粉/支鏈淀粉比、支化度、平均鏈長、磷酸含量、膠凝特性、成凝膠或成膜性能、淀粉顆粒大小和/或淀粉顆粒形狀等與已知淀粉相比有所改變。
因此，可能在植物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸分子，以便提高相應(yīng)的異淀粉酶活性或?qū)⑺鼈円氩槐磉_(dá)該酶的細(xì)胞中。通過本發(fā)明核酸分子的表達(dá)還可能降低植物細(xì)胞中本發(fā)明異淀粉酶的天然活性。還可能將本發(fā)明的核酸分子按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法改變，以得到本發(fā)明的異淀粉酶，它們不再經(jīng)受細(xì)胞固有的調(diào)節(jié)機(jī)制，或具有改變了的溫度-活性特征或者底物或產(chǎn)物專一性。
本發(fā)明的核酸分子在植物中表達(dá)時(shí)原則上有可能將合成的蛋白質(zhì)定位在植物細(xì)胞的任何區(qū)室中。為實(shí)現(xiàn)在特定區(qū)室中的定位，必需缺失保證在質(zhì)體中定位的序列，留下的編碼區(qū)域需要時(shí)必需與保證在各自的區(qū)室中定位的DNA序列連接。這類序列是已知的(參見Braun等，EMBO J.11(1992),3219-3227;wolter等，Proc.Natl.Acal.Sci.USA 85(1988),846-850;Sonnewald等，Plant J.1(1991),95-106)。
所以本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其中本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的載體被整合在植物細(xì)胞的基因組中，還涉及用本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞以及由如此轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的核酸分子或載體，它們優(yōu)選與能保證植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)性DNA元件連接，特別是與合適的啟動(dòng)子連接。這類細(xì)胞與天然細(xì)胞的不同之處特別在于，它們含有本發(fā)明的核酸分子而這在天然細(xì)胞中不存在，或者這種分子整合在細(xì)胞基因組內(nèi)中的不同位置(原本沒有)，即處于不同的基因組環(huán)境內(nèi)。此外，這類本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞與天然植物細(xì)胞的不同之處可在于，它們含有穩(wěn)定整合在基因組內(nèi)的至少一拷貝本發(fā)明核酸分子，同時(shí)可能還有細(xì)胞中自然存在的這種分子的幾個(gè)拷貝。如果在細(xì)胞中天然存在的分子拷貝基礎(chǔ)上在細(xì)胞中引導(dǎo)額外的核酸分子，本發(fā)明的植物細(xì)胞與天然植物細(xì)胞特別不同之處是，這些額外的拷貝位于基因組內(nèi)天然不存在該拷貝的位置。這可例如借助Southern印跡分析來檢查。
如果引入的本發(fā)明的核酸分子對(duì)于植物細(xì)胞是異源的，該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞含有本發(fā)明分子的轉(zhuǎn)錄本，這可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法如Southern印跡分析簡單地檢測。
如果引入的本發(fā)明的核酸分子對(duì)于植物細(xì)胞是同源的，本發(fā)明的細(xì)胞與天然細(xì)胞例如基于本發(fā)明核酸分子的額外表達(dá)而不同。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞優(yōu)選含有更多的本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)錄本。這可以例如通過Northern印跡分析來檢測。“更多”這里指比相應(yīng)的未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞優(yōu)選至少多10％，更優(yōu)選至少多20％，特別優(yōu)選至少多50％的轉(zhuǎn)錄本。此外優(yōu)選這些細(xì)胞提高相應(yīng)的活性(至少10％，20％或50％)或同樣可能降低本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)再生為全植株。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的核酸分子或載體整合在植物細(xì)胞的基因組內(nèi)，由所述細(xì)胞再生為完整的植株。此外本發(fā)明還涉及含有上述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的植物。在轉(zhuǎn)基因植物方面，原則上涉及任何植物物種的植物，也就是既涉及單子葉植物，又涉及雙子葉植物。優(yōu)選涉及有用的植物，更優(yōu)選合成淀粉或儲(chǔ)存淀粉的植物，更優(yōu)選黑麥、大麥、燕麥、小麥、高粱和小米、西米、玉米、水稻、豌豆、大豌豆、木薯、馬鈴薯、番茄、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵，豇豆或竹芋，特別是小麥、玉米、水稻和馬鈴薯。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明植物的繁殖材料，例如果實(shí)、種子、塊莖、根莖、幼苗、插條、愈傷組織、原生質(zhì)，細(xì)胞培養(yǎng)物等。
本發(fā)明還涉及改性淀粉的生產(chǎn)方法，包括從上述本發(fā)明植物和/或這種植物的儲(chǔ)存淀粉部分提取淀粉的步驟。
從植物特別是小麥或植物儲(chǔ)存淀粉的部分中提取淀粉的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，參見Eckhoff等(Cereal Chem.73(1996)54-57),“Starch:Chemistry and Technology(編者Whistler,BeMiller and PaSchall(1994),第二版，Academic Press Inc.London Ltd;ISBN 0-12-746270-8；參見第十二章第412-468頁；玉米和高梁淀粉；生產(chǎn)；Watson；第十三章，第469-479頁；木薯、竹芋和西米淀粉生產(chǎn)；Corbi hley和Miller；第十四章，第479-490頁；馬鈴薯淀粉生產(chǎn)和應(yīng)用；Mitch；第十五章；第491-506頁；小麥淀粉生產(chǎn)，改性和應(yīng)用；Knight和Oson；第十六章，第507-528頁；水稻淀粉生產(chǎn)和應(yīng)用；Rohmer和Klem)。從植物材料中抽提淀粉的工藝中一般應(yīng)用的設(shè)備是分離器，傾析器，水力旋流器，噴霧干燥器和流化床干燥器。
由于本發(fā)明核酸分子的表達(dá)，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物合成如下物理-化學(xué)性能與野生植物合成的淀粉相比有所改變的淀粉，例如直鏈淀粉/支鏈淀粉比、支化度、平均鏈長、磷酸含量、膠凝性能、淀粉顆粒大小和/或淀粉顆粒形狀。特別是，這種淀粉與已知的淀粉相比，其粘度和/或成膜或成膠特性方面也可改變。
本發(fā)明還涉及一種可由本發(fā)明植物細(xì)胞、植物以及它們的繁殖材料中得到的淀粉和可通過上述本發(fā)明方法得到的淀粉。
此外，還可能借助本發(fā)明的核酸分子生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性減小的植物細(xì)胞和植物。這同樣導(dǎo)致具有與野生植物細(xì)胞合成的淀粉相比有所改變的化學(xué)和/或物理性能的淀粉合成。
所以，本發(fā)明的進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，它們含有本發(fā)明的核酸分子且其中異淀粉酶活性比未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞減小。
異淀粉酶活性降低的植物細(xì)胞的生產(chǎn)可以例如通過按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法表達(dá)適宜的反義RNA、用于實(shí)現(xiàn)共抑制效果的有義RNA，或表達(dá)適當(dāng)構(gòu)建的特異性切割編碼異淀粉酶的轉(zhuǎn)錄本的核酶，應(yīng)用本發(fā)明的核酸來完成，參見Jorgensen(TrendsBiotechnol.8(1990),340-344),Niebel等(Curr.Top.Microbiol. Immunol.197(1995),91-103),Flavell等(Curr.Top.Microbiol.197(1995),43-46),Palaqui和Vaucheret(Plant.Mol.Biol.29(1995),149-159),Vaucheret等(Mol.Gen.Genet.248(1995),311-317),deBorne等(Mol.Gen.Genet.243(1994),613-621)。
為了降低植物細(xì)胞中本發(fā)明異淀粉酶的活性，優(yōu)選例如通過反義RNA的表達(dá)來減少編碼異淀粉酶的轉(zhuǎn)錄本的總數(shù)。
對(duì)此，一方面可用包含，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)包括任何可能存在的位于兩側(cè)的序列的總序列的DNA分子，也可應(yīng)用只包括部分編碼序列的DNA分子，這些部分序列必需具有足夠的長度以在細(xì)胞中起到反義作用。一般來說，可以應(yīng)用最小長度為15bp，優(yōu)選100-500bp長的序列，為實(shí)現(xiàn)有效的反義抑制作用，特別優(yōu)選長度為500bp以上的序列。一般應(yīng)用的DNA分子比5000bp短，優(yōu)選比2500bp短的序列。
也可以應(yīng)用與本發(fā)明的DNA分子序列有高度同源性但不完全相同的DNA序列。最小同源性應(yīng)該大于約65％。優(yōu)選應(yīng)用同源性為95-100％的序列。
本發(fā)明還涉及包括從本發(fā)明的細(xì)胞或植物和/或從這種植物的儲(chǔ)存淀粉的部分中提取淀粉步驟的生產(chǎn)改性淀粉的方法。
本發(fā)明的主題物還有從本發(fā)明的細(xì)胞、植物以及繁殖材料或它們的一部分中可得的淀粉以及通過本發(fā)明的方法可得到的淀粉。
本發(fā)明的淀粉可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法改性，未改性或改性形式適合于在食品或非食品領(lǐng)域的不同應(yīng)用。
原則上，本發(fā)明淀粉的使用可分為兩個(gè)大的方面。一個(gè)方面包括淀粉的水解產(chǎn)物，主要是葡萄糖和葡聚糖單元，它們通過酶或化學(xué)方法得到。它們用作其它化學(xué)改性和工藝如發(fā)酵的原料。這里為了降低成本，水解方法的簡單性和經(jīng)濟(jì)性設(shè)計(jì)有重要的意義。目前基本上應(yīng)用淀粉葡糖苷酶由酶催化進(jìn)行。通過減少酶的用量可節(jié)約成本。淀粉的結(jié)構(gòu)改變，例如顆粒的表面積增大，由于例如較小的支化度或限制所用酶的可接近性的立體結(jié)構(gòu)較少而較易消化，這些可引起酶用量的減少。
另一個(gè)應(yīng)用本發(fā)明淀粉的方面是使用所謂的天然淀粉(由于其聚合物結(jié)構(gòu))，這又劃分為兩個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域1．食品工業(yè)淀粉是許多食品的傳統(tǒng)增加劑，其功能基本上是與水性添加劑的粘合作用或是提高粘度或是提高成膠作用。重要的性能特征是流動(dòng)性和吸附性，溶脹溫度和膠凝溫度，粘度和增稠效力，淀粉的溶解性，透明性和凝膠結(jié)構(gòu)，熱、剪切和酸穩(wěn)定性，退化趨勢，成膜能力，凍-熔穩(wěn)定性，鹽溶液中的粘度穩(wěn)定性，可消化性以及與例如無機(jī)或有機(jī)離子形成復(fù)合物的能力。2．非食品工業(yè)在這個(gè)大領(lǐng)域內(nèi)，淀粉用作不同生產(chǎn)工藝的助劑或用作工業(yè)產(chǎn)品的添加劑。在用淀粉作助劑時(shí)這里必需特別提到紙和紙板工業(yè)。這里，淀粉主要用于阻滯目的(保持固體材料)，粘合填料和細(xì)小材料作為加固材料以及用于除水。此外，還可利用淀粉的如下有利特性硬度、強(qiáng)度、聲音、手感、光澤、光潔度、粘合強(qiáng)度以及表面。2.1紙和紙板林業(yè)造紙工藝中區(qū)別為四個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域，即表面、涂層、備料和噴霧。表面處理方面要求淀粉基本上有白度高、有合適的粘度、高粘度穩(wěn)定性、良好的成膜性以及弱成塵性。在涂層的應(yīng)用方面，固體含量、合適的粘度、高粘合能力以及高顏料親和性起著重要的作用。作為備料的添加劑，重要的是快速、均勻、無損耗地分布、高度機(jī)械強(qiáng)度和紙流中完全保持。淀粉在噴霧領(lǐng)域使用，重要的同樣是適當(dāng)?shù)墓腆w含量、高粘度以及高粘合能力。2.2粘合劑工業(yè)淀粉的一個(gè)重要使用領(lǐng)域是粘合劑工業(yè)，其中這種應(yīng)用可以劃分為四個(gè)分領(lǐng)域作為純淀粉漿使用，用專門的化學(xué)物質(zhì)預(yù)處理的淀粉漿的應(yīng)用，淀粉作為合成樹脂和聚合物分散的添加劑的應(yīng)用以及淀粉作為合成粘合劑的增充劑的應(yīng)用。90％的淀粉基黏合劑用在下列領(lǐng)域波紋紙板的生產(chǎn)、紙袋和包的生產(chǎn)、紙和鋁的復(fù)合材料的生產(chǎn)、紙箱的生產(chǎn)和用于信封、郵票等的潤濕膠的生產(chǎn)等。2.3紡織工業(yè)和織物保養(yǎng)劑工業(yè)淀粉用作助劑和添加劑的一個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域是紡織品和織物保養(yǎng)劑產(chǎn)品領(lǐng)域。在紡織品工業(yè)中必需區(qū)別下面4種領(lǐng)域淀粉用作上漿劑，也就是作為平滑和增滑的助劑用于抵抗編織時(shí)牽引的張力以及提高編織時(shí)的耐磨強(qiáng)度，淀粉用作織物整理劑，特別是降低質(zhì)量的預(yù)處理如漂白、染色等之后使用，淀粉用作染料漿生產(chǎn)時(shí)的增稠劑以防止染料滲出以及淀粉用作針線束縛劑的添加劑。2.4建材工業(yè)第四個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是淀粉用作建材添加劑。例如石膏板板材的生產(chǎn)，其中在石膏漿中混合的淀粉與水膠凝，滲到石膏芯的表面并在那兒將板材與芯粘合。另一個(gè)使用領(lǐng)域是與灰底纖維和礦物纖維的混合。在即用的混凝土中使用淀粉產(chǎn)品減慢其硬化。2.4土壤穩(wěn)定劑淀粉產(chǎn)品的另一個(gè)市場是土壤穩(wěn)定劑的生產(chǎn)，它們可在土壤受人工侵?jǐn)_時(shí)暫時(shí)保護(hù)土壤顆粒避免失水。淀粉和聚合物乳液相結(jié)合的產(chǎn)物據(jù)目前了解，在減少腐蝕和銹蝕的作用方面可與以前使用的產(chǎn)品相提并論，但是價(jià)格明顯比它們低。2.6作物保護(hù)劑和肥料方面的應(yīng)用淀粉應(yīng)用的一個(gè)領(lǐng)域是用于改變制劑的特定特性的植物保護(hù)產(chǎn)品。因此，淀粉可用于改善植物保護(hù)劑和肥料的可潤濕性，活性成分的控制釋放，轉(zhuǎn)換液態(tài)、揮發(fā)性和/或不良?xì)馕兜挠行镔|(zhì)為微晶、穩(wěn)定、可塑的物質(zhì)，以及通過減少分解而延長作用時(shí)間。2.7藥物、醫(yī)療和化妝品工業(yè)此外，應(yīng)用領(lǐng)域還有藥物、醫(yī)療和化妝品工業(yè)方面。在制藥工業(yè)，淀粉可用作片劑的粘合劑或用于膠囊內(nèi)粘合劑的稀釋。另外，淀粉能用作片劑崩解劑，因?yàn)樗鼈冊(cè)谕萄屎蠹次找后w并在短時(shí)間內(nèi)溶脹，從而釋放有效物質(zhì)。醫(yī)用的潤滑粉和傷口外用藥粉從定性角度都基于淀粉?；瘖y品領(lǐng)域中淀粉例如可用作粉添加劑如香精和水揚(yáng)酸的載體。淀粉的一個(gè)更大的應(yīng)用領(lǐng)域是牙膏。2.8淀粉用于煤和煤球淀粉用于煤和煤球的添加劑領(lǐng)域。添加淀粉后煤可以大量聚集或壓制成為煤磚，由此防止煤磚過早地崩解。淀粉添加劑在焦煤中含量為4-6％，在高熱煤中為0.1-0.5％。以淀粉作粘接劑還有別的重要意義，通過向煤和煤球中添加淀粉，減少了有害物質(zhì)的發(fā)散。2.9礦砂和煤的洗選淀粉還可在礦砂和煤的洗選時(shí)用作凝聚劑。2.10鑄造業(yè)助劑另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是作為鑄造業(yè)助劑的添加劑。在不同鑄造方法中都需要由粘合劑處理的砂子作為核。粘合劑目前主要使用膨潤土，其用改性淀粉、主要是可溶脹淀粉處理。
添加淀粉的目的是提高流動(dòng)性以及改善粘合強(qiáng)度。此外，可溶脹淀粉還可滿足其它生產(chǎn)技術(shù)方面的要求，如在冷水中可分散、可重水化、與砂子可很好混合以及高水結(jié)合能力。2.11橡膠工業(yè)中的應(yīng)用橡膠工業(yè)中淀粉可用于改善技術(shù)和視覺質(zhì)量。這里的原因是為改善表面光澤，改善手感和外觀，為此淀粉在冷固化前分散到橡膠材料粘性、涂膠的面上，以及改善橡膠的可印花性。2.12皮革替代品的生產(chǎn)改性淀粉還可能用于生產(chǎn)皮革替代品。2.13合成聚合物中的淀粉在聚合物領(lǐng)域，可以想象下列應(yīng)用領(lǐng)域在加工工藝中淀粉降解產(chǎn)物的應(yīng)用(淀粉只是填料，合成聚合物和淀粉之間沒有直接鍵合)或在聚合物生產(chǎn)中淀粉降解產(chǎn)物的應(yīng)用(淀粉和聚合物形成穩(wěn)定的鍵)。
淀粉用作純填料時(shí)與其它材料如滑石相比，并不具有競爭力。但如果淀粉的某一專一特性產(chǎn)生影響，由此明顯改變終產(chǎn)物的性能特征時(shí)情況就不同了。對(duì)此例如，淀粉產(chǎn)品用于熱塑性聚合物如聚乙烯的加工。這里，淀粉和合成聚合物通過共同作用以1∶1的比例結(jié)合成母材料，由此用慣用的方法技術(shù)從聚乙烯粒子可生產(chǎn)各種產(chǎn)品。聚乙烯薄膜中使用淀粉可提高空心孔體的物質(zhì)通透性，改善水蒸汽透過性，改善抗靜電性，改善抗堵塞性以及改善用水性染料的印花性。
淀粉還可能用于聚氨酯泡沫中。采用淀粉衍生物以及通過工藝技術(shù)的優(yōu)化可能定向控制合成聚合物和淀粉羥基的反應(yīng)。結(jié)果得到通過使用淀粉而具有下列特征的聚氨酯薄膜熱膨脹系數(shù)減小，收縮減少，改善壓力-應(yīng)力行為，增加水蒸汽透過率同時(shí)不改變水的吸收，減小可燃性和終抗拉強(qiáng)度，可燃部分無液滴形成，無鹵素，老化減慢。目前還存在的缺點(diǎn)是可印花性減小以及沖擊強(qiáng)度減小。
產(chǎn)品開發(fā)不再限制于薄膜?？缮a(chǎn)淀粉含量50％以上的固體聚合物產(chǎn)品，如盆，盤和碗。此外，淀粉/聚合物的混合物被認(rèn)為是有利的，因?yàn)樗鼈兙哂懈叩枚嗟纳锟山到庑浴?br> 越來越重要的是基于極高水結(jié)合能力的淀粉接枝聚合物。它們是淀粉為骨架和按自由基機(jī)理的原理由合成單體接枝作側(cè)鏈的產(chǎn)物。目前可用的淀粉接枝聚合物的特征是，較好的粘合能力和每克高粘度淀粉直到1000克水的保留能力。這種超吸收劑的反應(yīng)領(lǐng)域在近年來大幅度變寬，在衛(wèi)生領(lǐng)域有產(chǎn)品如尿褲和底布，以及在農(nóng)業(yè)方面，例如在種子包衣方面。
對(duì)于這種新型的遺傳改造的淀粉十分重要的是結(jié)構(gòu)、含水量、蛋白質(zhì)含量、脂含量、纖維含量、灰份/磷酸含量、直鏈淀粉/支鏈淀粉比、分子量分布、支化度、顆粒大小和形狀以及結(jié)晶性，另外還有影響下列性能的特征流動(dòng)和吸附行為、膠凝溫度、粘度、鹽溶液中粘度穩(wěn)定性、增稠效率、溶解性、凝膠結(jié)構(gòu)和凝膠透明性、熱、剪切和酸穩(wěn)定性、退化趨勢、成膠性、凍-熔穩(wěn)定性、復(fù)合物形成、碘結(jié)合、成膜性、粘接力、酶穩(wěn)定性、可消化性和反應(yīng)性。
借助重組方法生產(chǎn)改性淀粉可改變植物中獲得的淀粉的性能，從而不再需要借助化學(xué)或物理方法的其它改性。另外，通過重組方法改變的淀粉進(jìn)行其它化學(xué)改性，這會(huì)進(jìn)一步改善某種上述應(yīng)用領(lǐng)域的質(zhì)量。這些化學(xué)改性基本上是已知的。這特別包括通過熱處理、用有機(jī)或無機(jī)酸處理、氧化和酯化等的改性，導(dǎo)致例如形成磷酸淀粉、硝酸淀粉、硫酸淀粉、黃原酸淀粉、醋酸淀粉和檸檬酸淀粉。此外還可在強(qiáng)酸存在下加入一元或多元醇產(chǎn)生淀粉醚，得到淀粉-烷基醚，O-烯丙基醚，羥基烷基醚，O-羧甲基醚，含N的淀粉醚，含P的淀粉醚，含S的淀粉醚，交聯(lián)淀粉或淀粉接枝聚合物。
本發(fā)明淀粉優(yōu)選的應(yīng)用是在生產(chǎn)包裝材料和一次性物品方面以及作食品和食品初產(chǎn)品方面。
為了本發(fā)明的核酸分子在植物細(xì)胞中以有義和反義方向上表達(dá)，將它們與保證在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)性DNA元件相連接。這特別包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止子。一般對(duì)于植物細(xì)胞有活性的任何啟動(dòng)子都適于表達(dá)。
可選擇啟動(dòng)子使表達(dá)組成性的或只在特定組織中、在植物生長的某一時(shí)刻或外界因素決定的某一時(shí)刻發(fā)生。對(duì)植物而言，啟動(dòng)子可以是同源的或異源的。合適的啟動(dòng)子例如有花椰菜花葉病毒的35SRNA啟動(dòng)子和玉米中的遍在蛋白啟動(dòng)子用于組成性表達(dá)，Patatin的B33啟動(dòng)子(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989),23-29)用于塊莖專一性表達(dá)，或保證只在光合成活性組織中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如ST-LSI啟動(dòng)子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987),7943-7947;Stockhaus,EMBO J.8(1989),2445-2451)，或用于胚乳專一性表達(dá)的啟動(dòng)子，小麥的AMG啟動(dòng)子，USP啟動(dòng)子，菜豆蛋白啟動(dòng)子或玉米中玉米蛋白基因的啟動(dòng)子。
此外還可存在終止序列，它用于正確地終止轉(zhuǎn)錄以及在轉(zhuǎn)錄本上添加Poly-A尾端，后者被認(rèn)為具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本的作用。這類元件在文獻(xiàn)中已報(bào)道(參見Gielen等，EMBO J.8(1989),23-29),并在必要時(shí)可互換。
本發(fā)明提供編碼具有小麥異淀粉酶作用的蛋白質(zhì)的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子允許生產(chǎn)已鑒定其在淀粉生物合成中之功能的酶，生產(chǎn)重組技術(shù)改變的其中酶活性改變的植物，因此可能在這類改性植物中合成結(jié)構(gòu)改變和物理化學(xué)特性改變的淀粉。
本發(fā)明的核酸分子原則上也可用于生產(chǎn)其中本發(fā)明的異淀粉酶的活性提高或降低而同時(shí)其它參與淀粉合成的酶的活性也改變的植物。通過改變植物中異淀粉酶的活性導(dǎo)致合成結(jié)構(gòu)改變的淀粉。此外還可向內(nèi)源性淀粉合成酶或支化酶的合成已被抑制的植物細(xì)胞中引入編碼異淀粉酶或適當(dāng)?shù)姆戳x結(jié)構(gòu)的核酸分子(例如，WO92/14827中或Shannon和Garwood 1984,Whistler,BeMiller和Paschall,Starch:Chemistry and Technology,AcademicPress,London,第2版25-86)。
如果希望抑制被轉(zhuǎn)化植物中的多種參與淀粉生物合成的酶的合成，可能將在合適的啟動(dòng)子控制下同時(shí)含有反義方向的數(shù)種酶編碼區(qū)域的DNA分子用于轉(zhuǎn)換。這里每個(gè)序列都可以在自己的啟動(dòng)子控制下，或多個(gè)序列作為融合體在共同的啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)錄或在共同啟動(dòng)子的控制之下。上述最后形式一般是優(yōu)選的，因?yàn)檫@種情況下相應(yīng)的多種蛋白質(zhì)的合成應(yīng)以約同樣的程度被阻止。對(duì)于在這類結(jié)構(gòu)中應(yīng)用的各編碼區(qū)域的長度，上面用于反義結(jié)構(gòu)生產(chǎn)的描述在這里也適用。從一種啟動(dòng)子開始的這種DNA分子中轉(zhuǎn)錄的反義片段的數(shù)目一般沒有上限。但是所形成的的轉(zhuǎn)錄本優(yōu)選不超過10kb的長度、特別優(yōu)選5kb的長度。
適當(dāng)啟動(dòng)子后的這類DNA分子中的編碼區(qū)域和其它反義方向的編碼區(qū)域相，可來源于為下列蛋白質(zhì)的編碼DNA序列淀粉顆粒結(jié)合形淀粉合成酶(GBSSⅠ和Ⅱ)和可溶性淀粉合成酶(SSSⅠ和Ⅱ)，支化酶(異淀粉酶，支鏈淀粉酶，R-酶，支化酶，脫支酶)，淀粉磷酸化酶和歧化酶。這只是舉例說明。也可設(shè)想在此類結(jié)合中應(yīng)用其它DNA序列。
借助這類結(jié)構(gòu)可以同時(shí)抑制隨之轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中多種酶的合成。
此外，這些結(jié)構(gòu)可能被引入植物突變體中，后者中淀粉生物合成的一種或多種基因來是缺陷的(Shannon和Garwood,1984,在Whistler,BeMiller和Paschall,Starch:Chemistry andTechnology,Academic Press,London,第2版25-86)。這些缺陷可能涉及下列蛋白質(zhì)淀粉顆粒結(jié)合性淀粉合成酶(GBSSⅠ和Ⅱ),可溶性淀粉合成酶(SSSⅠ和Ⅱ)，支化酶(BEⅠ和Ⅱ)，脫支酶(R-酶)，歧化酶和淀粉磷酸化酶。這只是舉例說明。
借助這類方法還可同時(shí)抑制隨之轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中多種酶的合成。
為向高等植物中引入外來基因，已有大量的含有大腸桿菌復(fù)制信號(hào)和挑選轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞的標(biāo)記基因的克隆載體。這類載體的例子有pBR322,pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。希望的序列可以引入在載體中合適的限制酶剪切位點(diǎn)上。得到的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后收獲和溶解?；厥召|(zhì)粒。作為用于表征所得質(zhì)粒DNA的分析方法一般使用限制酶分析，凝膠電泳和其它生化-分子生物學(xué)方法。每種操作后，質(zhì)粒DNA都可被切割，所得到的DNA片段與其它DNA序列連接。每個(gè)質(zhì)粒DNA序列都可在同樣或不同質(zhì)粒中克隆。
已有向植物宿主細(xì)胞中引入DNA的大量技術(shù)。這些技術(shù)包括在應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化試劑用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，原生質(zhì)體融合，注射，DNA的電穿孔，基因搶方法引入DNA，以及其他方法。
植物細(xì)胞中DNA的注射和電穿孔本身對(duì)所用的質(zhì)粒沒有特別的要求。可以應(yīng)用簡單的質(zhì)粒，例如pUC衍生物。但是如果要從這類轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出完整的植物，一般要求有可挑選的標(biāo)記基因。
按照向植物細(xì)胞引入目標(biāo)基因的方法，可能還需要其它DNA序列。例如如果應(yīng)用Ti-或Ri-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，至少Ti-和Ri-質(zhì)粒T-DNA的右邊界，然而經(jīng)常是右邊界和左邊界，作為側(cè)翼區(qū)必需與引入的基因連接。
如果農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化，所要引入的DNA必須克隆在特定的質(zhì)粒中，或者在中間載體或二元載體中。中間載體可基于與T-DNA中序列的同源性，通過同源重組而整合在農(nóng)桿菌Ti-或Ri-質(zhì)粒中。它除此外還含有T-DNA轉(zhuǎn)移必需的vir-區(qū)域。中間載體不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制。借助于輔助質(zhì)粒，中間載體可被轉(zhuǎn)移(接合)到農(nóng)桿菌中。二元載體既可在大腸桿菌中也可在農(nóng)桿菌中復(fù)制。它們含有(在T-DNA的左右邊界區(qū)域之間)選擇標(biāo)記基因或多接頭。它們可以直接轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中(Holsters等，Mol.Gen.Genet.163(1978),181-187)。這種作為宿主細(xì)胞用的農(nóng)桿菌應(yīng)含有帶vir-區(qū)域的質(zhì)粒。vir-區(qū)域?qū)-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中是必要的。可存在附加的T-DNA。如此轉(zhuǎn)化的膿桿菌可用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
對(duì)T-DNA用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化進(jìn)行了深入研究，并在EP120516;Hoekema,The Binary Plant Vector System OffsetdrukkerijKarters B.V.,Alblasserdam(1985),第5章；Fraley等，Crit.Rev.Plant.Sci.,4,1-46和An等，EMBO J.4(1985),277-287中有記載。
對(duì)于DNA向植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移，可以方便地將植物外植體與根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)。由這種被感染的植物材料(例如葉塊，莖節(jié)，根，但也有原生質(zhì)或懸浮培養(yǎng)的植物細(xì)胞)在合適的培養(yǎng)若中再生為完整的植物，培養(yǎng)基中含有一定的糖、氨基酸、抗生素或殺生物劑以挑選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。所得的植物可用于檢查所引入DNA的存在。其他使用基因搶方法或通過原生質(zhì)轉(zhuǎn)化引入外來DNA的可能性是已知的(參見例如willmitzer,L.,1993 Transgenic plants.InBiotechnology, A Multi-Volume ComprehensiveTreatise(H.J.Rehm,G.Reed,A.Pühler,P.Stadler編)，第2卷，627-659,VCH WEINHEIM-New York-Basel-Cambridge)。
借助根癌農(nóng)桿菌通過Ti-質(zhì)粒載體系統(tǒng)對(duì)雙子葉植物的轉(zhuǎn)化已成熟，新的工作指明，借助根癌農(nóng)桿菌載體的轉(zhuǎn)化即時(shí)對(duì)于單子葉植物也很可能達(dá)到(Chan等，Plant Mol.Biol.22(1993),491-506;Hiei等，Plant J.6(1994),271-282)。
單子葉植物的轉(zhuǎn)化的替換方法有借助于基因搶方法的轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或物理或化學(xué)誘導(dǎo)的原生質(zhì)體中DNA的攝入，例如通過部分通透化細(xì)胞的電穿孔，借助于玻璃纖維進(jìn)行的DNA轉(zhuǎn)移，花序中DNA的注射，在小孢子或原胚中DNA的微注射，通過萌發(fā)的花粉的DNA攝入和通過腫脹在胚胎中DNA的攝入(綜述Potrykus,Physiol,Plant(1990),269-273)。
過去已對(duì)各種谷物建立了三種上述的轉(zhuǎn)化體系組織的電穿孔，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，和在可再生組織和細(xì)胞中通過粒子轟擊進(jìn)行的DNA轉(zhuǎn)移(綜述Jhne等，Euphytica 85(1995),35-44)。
在文獻(xiàn)中已描述了小麥的不同轉(zhuǎn)化方法(綜述Maheshwari等，Critical Reviews in Plant Science 14(2)(1995),149～178)Hess等(Plant Sci.72(1990),233)應(yīng)用宏觀注射方法，將花粉和農(nóng)桿菌直接接近。含有nptⅡ基因作為可挑選標(biāo)記的質(zhì)粒的移動(dòng)，借助Southern Blot分析和NPTⅡ試驗(yàn)來檢測。轉(zhuǎn)化子顯示正常表型并且可育.在連續(xù)兩代中檢測卡那霉素抗性.
第一個(gè)可育的轉(zhuǎn)基因小麥植株，用結(jié)合在微發(fā)射顆粒上的DNA轟擊后再生而成，由Vasil等(Bio/Technology 10(1992),667-674)報(bào)道。轟擊的目標(biāo)組織是胚胎發(fā)生性愈傷組織培養(yǎng)物(C型愈傷組織)。作為挑選標(biāo)記使用bar基因，它編碼膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶，因此介導(dǎo)對(duì)除草劑膦絲菌素的抗性。另一個(gè)體系由Weeks等(PlantPhysiol.102(1993),1077-1084)以及Becker等(PlantJ.5(2)(1994),299-307)報(bào)道。這里用于DNA轉(zhuǎn)化的目標(biāo)組織是不成熟胚的胚鱗，它在預(yù)先在體外被刺激以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚。轉(zhuǎn)化的效率在Becker等(loc cit.)發(fā)展的體系中為每83個(gè)“Florida”品種胚1個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，明顯高于Weeks等所建立體系的每1000個(gè)“Bohwhite”品種胚1至2個(gè)轉(zhuǎn)基因植株。Becker等(Ioc.Cit)發(fā)展的體系是實(shí)施例中所述的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
一旦引入的DNA整合在植物細(xì)胞的基因組中，它一般很穩(wěn)定，也保留在原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代中。它正常情況下含有上面提及的選擇標(biāo)記之一，該選擇標(biāo)記介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞例如對(duì)殺生物劑如膦絲菌素或抗生素如卡那霉素，G418，博來霉素或濕霉素的抗性，允許通過某種糖或氨基酸的存在與否來選擇。因此每個(gè)選擇的標(biāo)記都應(yīng)該允許從未導(dǎo)入DNA的細(xì)胞中挑選相轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在植物體內(nèi)按常規(guī)方式生長(參見McCormick等，Plant Cell Reports 5(1986),81-84)。得到的植物可正常生長，與具有相同轉(zhuǎn)化種質(zhì)或其它種質(zhì)的植物雜交。由此形成的雜交個(gè)體具有相應(yīng)的表型特征。從植物細(xì)胞可獲得種子。應(yīng)該培養(yǎng)兩代或多代以保證這種表型特征保持穩(wěn)定并遺傳。也應(yīng)取得種子以保證保持相應(yīng)的表型或其它特征。
下列實(shí)施例將舉例說明本發(fā)明，并不構(gòu)成任何限制。1．克隆方法應(yīng)用載體pBluescriptⅡSK(Stratagene)在大腸桿菌中克隆。2．細(xì)菌菌株對(duì)于Bluescript載體和反義結(jié)構(gòu)，應(yīng)用大腸桿菌菌株DH5α(Bethesda Research Laboratories,Gaitherburg,USA)。對(duì)于體內(nèi)切割應(yīng)用大腸桿菌菌株xL1-Blue。3．未成熟小麥胚的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基MS100ml/l宏觀鹽(D.Becker和H.Lorz,Plant Tissue1ml/l微觀鹽 Culture Manual(1996),B121-20)2ml/lFe/NaEDTA30g/l蔗糖#30MS+2,4-D(2mg/l)#31MS+2,4-D(2ml/l)+膦絲菌素(PPT,除草劑BASTA的活性組分(2mg/l))#32MS+2,4-D(0.1mg/l)+PPT(2mg/l)#39MS+2,4-D(2mg/ml)+每次0.5N甘露醇/山梨醇所給出的培養(yǎng)基用KOH調(diào)節(jié)到pH值為5.6,并用0.3％Gelrite固化。
用于轉(zhuǎn)化小麥的不成熟胚的方法由Becker和Lorz(D.Becker和H.Lrz.Plant Tissue Culture Manual(1996),B121-20)發(fā)展和優(yōu)化。
下面描述的實(shí)驗(yàn)是根據(jù)Becker和Lrz(Ioc.Cit)開發(fā)的方法進(jìn)行的。
用于轉(zhuǎn)化，收取開花期后12-14天成長階段的小穎果的穗狀花序，并表面消毒。分離出的胚鱗以胚軸面對(duì)培養(yǎng)基鋪到誘導(dǎo)培養(yǎng)基#30上面。
在2-4天預(yù)培養(yǎng)(26℃，暗)后，將外植體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基#39上進(jìn)行滲透預(yù)培養(yǎng)(2-4h，26℃，暗)。
對(duì)于基因槍轉(zhuǎn)化，每次發(fā)射使用約29μg金粒子，在其上面沉積有幾μg的目標(biāo)DNA。因?yàn)檫M(jìn)行的是共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)DNA以1∶1的比例由目標(biāo)基因和抗性標(biāo)記基因(bar基因)組成，添加到沉積層。4．DNA片段的DIG標(biāo)記用作篩選探針的DNA片段，通過特定的PCR使用DIG標(biāo)記的dUTP(Boehringer Mannheim，德國)來標(biāo)記。
實(shí)施例中應(yīng)用的培養(yǎng)基和溶液20×SSC175.3 g NaCl88.2g 檸檬酸鈉用雙蒸水加至1000ml用10N NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0質(zhì)粒pTaSU 8A根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號(hào)DSM12795保藏在德國Braunschweig的DSMZ，質(zhì)粒pTaSU19的保藏號(hào)為DSM12796.實(shí)施例1識(shí)別，分離和鑒定編碼小麥(Triticum aestivum L.,cvFlorida)異淀粉酶(糖樣同系物)的cDNA為了識(shí)編碼小麥異淀粉酶(糖樣)的同工型的cDNA，采用了異源篩選的策略。為此，將小麥的cDNA文庫用玉米的糖樣探針篩選。
探針(糖樣探針)是從玉米cDNA文庫借助特異引物通過PCR擴(kuò)增而分離的。玉米cDNA文庫按生產(chǎn)廠家的說明(λZAPⅡ-cDNA合成試劑盒，Stratagene GmbH,Heidelberg，德國)克隆自λZapⅡ載體中的等量13,17,19,20,22,25和28天齡(DAP)穎果混合物的poly(A)+RNA。在所用的所有穎果中，除了13天齡的核外都在RNA分離前去除了胚。
作為探針用于篩選小麥cDNA文庫的DNA片段用下面的引物擴(kuò)增sulp-15’AAAGGCCCAATATTATCCTTTAGG 3’(SEQ ID No.4)sulp-25’GCCATTTCAACCGTTCTGAAGTCGGGAAGTC 3’(SEQ ID No.5)
作為PCR反應(yīng)的模板，使用2μl擴(kuò)增的玉米cDNA文庫。PCR反應(yīng)還含有1.5-3mM的MgCl2,20mM Tris-HCl(pH為8.4),50mM KCl,0.8mM dNTP混合物，1μM引物sulp-1a,1μM引物sulp-2和2.5單位Taq聚合酶(重組，Life Technologies)。擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)使用Biometra公司的Trioblock按照以下方案進(jìn)行4’(分鐘)/95℃;1’/95℃；45″(秒)/58℃；1’15″/72℃；30個(gè)循環(huán)5’/72℃。約990bp的擴(kuò)增DNA帶在瓊脂糖凝膠中分離并切下。由這個(gè)片段按上述同樣的方案進(jìn)行第二次擴(kuò)增。由第二次擴(kuò)增得到的990bp片段用限制酶BAM HI切割為220bp和770bp的片段。在糖樣片段在瓊脂糖凝膠中再次分離，切下條帶并分離片段后，探針用DIG標(biāo)記。對(duì)于用地高辛配基的隨機(jī)引物標(biāo)記，使用500ng糖樣片段。為此將10μl隨機(jī)引物加入到欲標(biāo)記的片段中，反應(yīng)加熱至95-100℃5分鐘。加熱后，添加0.1mM dATP,0.1mM dGTP,0.1mM dCTP和0.065mM dTTP和0.035mM地高辛配基-11-dUTP(Boehringer Mannheim)，以及Klenow緩沖液(標(biāo)準(zhǔn))和1單位Klenow聚合酶。反應(yīng)在室溫下過夜進(jìn)行。為了檢查標(biāo)記情況，按生產(chǎn)廠家說明(德國Boehringer,Mannheim公司的“The DIG System User’s Guidefor Filter Hybridization”)進(jìn)行點(diǎn)雜交試驗(yàn)。
小麥cDNA文庫是按生產(chǎn)廠家的說明(λZAPⅡ-cDNA合成試劑盒，Stratagene GmbH,Heidelberg)從λZapⅡ載體中的約21天齡(淀粉樣胚乳)穎果的poly(A)+RNA合成的。測定cDNA文庫的滴度后，測得1.26×106pfu/ml的原滴度。
為篩選小麥cDNA文庫，約350,000噬菌體鋪板。噬菌體的鋪板和板的印跡按標(biāo)準(zhǔn)程序來完成。濾膜在5×SSC,3％包封劑(Boehringer,Mannheim)，0.2％SDS，0.1％月桂基肌氨酸鈉和50μg/ml的鯡魚精子DNA在55℃下進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。向雜交溶液中加入1ng/ml的標(biāo)記糖樣探針，將雜交混合物保溫過夜。濾膜的洗滌如下在2×SSC，1％SDS中在室溫下2×5分；在1×SSC中，0.5％SDS，55℃下2×10分；在0.5×SSC，0.2％SDS，55℃下2×10分。單個(gè)陽性克隆通過進(jìn)一步的篩選循環(huán)來分離。通過體內(nèi)切割得到作為pBluescript SK噬粒的單個(gè)克隆(按類似生產(chǎn)廠家的說明進(jìn)行；Stratagene,Heidelberg，德國)。
在通過小量制備和質(zhì)粒DNA的限制性分析之后，克隆pTaSU-19在DSMZ-德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlungfur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)以DSM 12796號(hào)保藏，并進(jìn)一步分析。實(shí)施例2質(zhì)粒pTaSU19的cDNA插入片段的序列分析從克隆pTaSU19中分離質(zhì)粒DNA，借助二脫氧核糖核苷酸方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977),5463-5467)測定cDNA插入片段的序列。
克隆TaSU-19的插入片段長度是2997bp,構(gòu)成部分cDNA。核苷酸序列示于Seq.ID No.1。與已發(fā)表的序列比較表明，Seq ID No.1所包含的編碼序列與其它生物體的異淀粉酶具有同源性。
序列分析還表明，在cDNA序列中位置297-396(內(nèi)含子1)和1618-2144(內(nèi)含子2)存在兩個(gè)內(nèi)含子。如果去除這兩個(gè)內(nèi)含子，可衍生出與其它生物體異淀粉酶的蛋白質(zhì)序列有同源性的蛋白質(zhì)序列。Seq ID No.1編碼區(qū)域相應(yīng)的氨基酸序列示于Seq ID No.3。實(shí)施例3植物轉(zhuǎn)化載體pTa-α-SU19的產(chǎn)生為了表達(dá)TaSU19-cDNA相應(yīng)的反義RNA，在基礎(chǔ)質(zhì)粒pUC19的基礎(chǔ)上構(gòu)建了植物轉(zhuǎn)化載體pTa-α-SU19，其中質(zhì)粒pTa-α-SU19的cDNA插入片段以反義方向與遍在蛋白啟動(dòng)子的3’端連接。該啟動(dòng)子由玉米遍在蛋白1基因的第一個(gè)不翻譯的外顯子和第一個(gè)內(nèi)含子組成(Christensen A.H.等，Plant Mo1ecular Bio1ogy 19(1992),675-689)。多接頭和NOS終止子部分來自質(zhì)粒pActl.cas(CAMBIA,TG0063；Cambia,GPO Box3200,Canberra ACT 2601，澳大利亞)。帶此終止子的載體結(jié)構(gòu)和基于pActl.cas的結(jié)構(gòu)由MCEIroy等有報(bào)道(Molecular Breeding 1(1995),27-37)。這樣得到的載體稱為pUbi.caS。
載體的克隆如下由克隆Ta-SU19用限制酶Xbal切下2kb片段，這個(gè)片段借助Klenow反應(yīng)填平末端，然后連接在表達(dá)載體pUbi.caS的Smal克隆位點(diǎn)。
產(chǎn)生的表達(dá)載體稱為Ta-α-SU19,用于按上述轉(zhuǎn)化小類。實(shí)施例4從小麥(Triticum aesivum L,,cv Florida)分離和鑒定其它編碼異淀粉酶(糖樣1-同系物)的cDNA小麥的cDNA文庫用代表克隆pTaSU19的一部分即Seq.ID No.1的489-1041位的糖樣探針篩選。
用于篩選cDNA文庫的小麥特異性地高辛配基標(biāo)記的糖樣探針，借助于PCR擴(kuò)增來制備。這個(gè)反應(yīng)中使用的引物是SUS015’-GCT TTA CGG GTA CAG GTT CG-3’(Seq.ID No.8)和SUS025’-AAT TCC CCG TTT GTG AGC-3’(Seq.ID No.9)作為模板，在反應(yīng)中使用1ng pTaSU19質(zhì)粒。另外，PCR反應(yīng)含有各300nM的引物SUS01和SUS02，各100μM的核苷酸dATP,dGTP,dCTP，65μM TTP，35μM的地高辛配基-11-dUTP(BoehringerMannheim)，1.5mM MgCl2,以及2.5U(單位)Taq聚合酶和10μl 10倍濃度的Taq聚合酶反應(yīng)緩沖液(兩者均來自Life Technologies)。反應(yīng)的終體積為100μl。擴(kuò)增在下列溫度程序下在PCR儀(TRIOThermoblock,Biometra)上完成在95℃，3分(一次)；在95℃，45秒-在55℃，45秒-在72℃，2分(30個(gè)循環(huán))；在72℃，5分(1次)。得到553bp的DNA片段。地高辛配基-11-dUTP加入PCR產(chǎn)品中與沒有地高辛配基-11-dUTP的對(duì)照反應(yīng)的產(chǎn)物相比，顯示出在瓊脂糖凝膠中較小的遷移率。
實(shí)施例1中的穎果特異性小麥cDNA文庫用得到的地高辛配基標(biāo)記的探針篩選。
雜交一步在5xSSC，0.2％SDS，0.1％月桂基肌氨酸鈉和50μg/ml鯡油精子DNA中，在68℃下，在1ng/ml的地高辛配基標(biāo)記的探針存在下完成。雜交后，將濾膜如下洗滌在2xSSC，1％SDS中室溫下2x5分，在1xSSC，0.5％SDS中68℃下2x10分；在0.5xSSC，0.2％SDS中68℃下2×10分。單個(gè)陽性克隆通過至少另兩個(gè)篩選循環(huán)而挑選出。通過體內(nèi)切割從噬菌體克隆pBluescript SK獲得質(zhì)粒(按生產(chǎn)廠家的說明；Stratagene,Heidelberg，德國)。限制性分析得到的克隆后，克隆pTaSU8A以DSM12795保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)并進(jìn)一步研究。實(shí)施例5質(zhì)粒pTaSU8A中cDNA插入片段的序列分析質(zhì)粒pTaSU8A中cDNA插入片段的核苷酸序列借助二脫氧核糖核苷酸方法測定(Seq.ID No.6)。
克隆pTaSU8A的插入片段長度為2437bp,構(gòu)成部分cDNA。與已經(jīng)發(fā)表的序列相比表明，Seq.ID No.6所示序列包括與其它生物體異淀粉酶具有同源性的編碼區(qū)。同樣，由克隆pTaSUSA的編碼區(qū)推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列(如Seq.ID No.7所示)與其它生物體的異淀粉酶的蛋白質(zhì)序列具有同源性。比較克隆pTaSU19(Seq.ID No.1)和pTaSU8A(Seq.ID No.6)的序列，得到的相似性為96.8％。大多數(shù)序列差別位于cDNA的3’非翻譯區(qū)。其余在編碼區(qū)中的序列差別導(dǎo)致推導(dǎo)的蛋白序列(Seq.ID No.3和7)中共12個(gè)位置上的氨基酸不同。pTaSU19和pTaSU8A含有的cDNA不完全相同，都編碼小麥異淀粉酶的同工形式。實(shí)施例6植物轉(zhuǎn)化載體pTa-α-SU8A的生產(chǎn)為了表達(dá)相應(yīng)于TaSUSA cDNA的反義RNA，基于基礎(chǔ)質(zhì)粒pUC19構(gòu)建了植物轉(zhuǎn)化載體pTa-α-SU8A，其中通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的TSU8A cDNA的一部分以反義方向和遍在蛋白啟動(dòng)子的3’端連接。該啟動(dòng)子由玉米遍在蛋白1基因的第一個(gè)非翻譯外顯子和第一個(gè)內(nèi)含子組成(Christensen A.H.等，Plant Mol.Biol.18(1992),675-689)。多接頭和NOS終止子部分來自質(zhì)粒pAct1.cas(CAMBIA,TG0063；Cambia，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，澳大利亞)。帶有該終止子的載體結(jié)構(gòu)以及基于pActl.cas的結(jié)構(gòu)，由McElroy等(Molecular Breeding 1(1995),27-37)報(bào)道。帶有遍在蛋白啟動(dòng)子、多接頭和NOS終止子并基于pUC19的載體稱為pUbi.cas。
對(duì)于pTa-α-SU8A的克隆，借助PCR擴(kuò)增TaSU8A-cDNA的約2.2kb部分，即Seq.ID No.6的140-2304位。
本反應(yīng)中使用的引物是SUEX35’-GCG GTA CCT CTA GAA GGA GAT ATA CAT ATG GCGGAG GAC AGG TAC GCG CTC-3’(Seq.ID No.10)和SUEX45’-GCT CGA GTC GAC TCA AAC ATC AGG GCG CAA TAC-3’(Seq.ID No.11)。
作為模板，反應(yīng)中使用1ng質(zhì)粒pTaSU8A。此外PCR反應(yīng)含有各300nM的引物SUEX3和SUEX4，各200μM的核苷酸dATP、dGTP、dCTP和dTTP，1.6mM MgCl2，60mM Tris-SO4(pH為9.1)，18mM(NH4)2SO4以及1μl Elongase酶混合物(Taq聚合酶和DNA聚合酶的混合物，Life Technologies)。反應(yīng)的終體積為50μl。在PCR儀上(TRIOThermoblock Biometra)在下列溫度程序下進(jìn)行擴(kuò)增94℃,1分(1次)；95℃，30秒-55℃，30秒-68℃，2分30秒(30個(gè)循環(huán))；68℃，10分(1次)。反應(yīng)得到長度為2205bp的DNA片段。
2.2kb的產(chǎn)物用KpnI和Sal Ⅰ限制性酶切,與預(yù)先用Kpn 1和Sal Ⅰ切割的表達(dá)載體pUbi.cas連接。這樣得到的植物轉(zhuǎn)化載體稱為pTa-α-SU8A，如上所述用于小麥的轉(zhuǎn)化。
序列表<110>Hoechst Schering AgrEvo GmbH<120>編碼參與淀粉合成的小麥酶的核酸分子<150> DE 198 20 608.9<151> 1998-05-08<160> 11<210> 1<211> 2997<212> DNA<213> Triticum aestivum L.cv. Florida<220><221> CDS<222> (3) … (296)；(397) … (1617)； (2145) … (2960)GG TCG GGG CCG GCG CCG CGC CTG CGA CGG TGG CGA CCC AAT GCG ACG 47Ser G1y Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala Thr1 5 10 15GCG GGG AAG GGG GTC GGC GAG GTG TGC GCC GCG GTT GTC GAG GCG GCG 95Ala Gly Lys Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Ala Ala20 25 30ACG AAG GTA GAG GAC GAG GGG GAG GAG GAC GAG CCG GTG GCG GAG GAC 143Thr Lys Val Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu Asp35 40 45AGG TAC GCG CTC GGC GGC GCG TGC AGG GTG CTC GCC GGA ATG CCC GCG 191Arg Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro Ala50 55 60CCG CTG GGC GCC ACC GCG CTC GCC GGC GGG GTC AAT TTC GCC GTC TAT 239Pro Leu Gly Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala Val Tyr65 70 75TCC GGC GGA GCC ACC GCC GCG GCG CTC TGC CTC TTC ACG CCA GAA GAT 287Ser Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu Asp80 85 90 95CTC AAG GCG GTGGGGTTGC CTCCCGAGTA GAGTTCATCA GCTTTGCGTG 336Leu Lys AlaCGCCGCGCGC CCCTTTTTTG GGCCTGCAAT TTAAGTTTTG TACTGGGGCA AATGCTGCAG 396GAT AGG GTG ACC GAG GAG GTT CCC CTT GAC CCC CTG ATG AAT CGG ACC 444Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu Met Asn Arg Thr1 5 10 15GGG AAC GTG TGG CAT GTC TTC ATC GAA GGC GAG CTG CAC AAC ATG CTT 492Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu His Asn Met Leu20 25 30TAC GGG TAC AGG TTC GAC GGC ACC TTT GCT CCT CAC TGC GGG CAC TAC540Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His Cys Gly His Tyr35 40 45CTT GAT GTT TCC AAT GTC GTG GTG GAT CCT TAT GCT AAG GCA GTG ATA588Leu Asp Val Ser Asn val Val Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Val Ile50 55 60AGC CGA GGG GAG TAT GGT GTT CCA GCG CGT GGT AAC AAT TGC TGG CCT636Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly Asn Asn Cys Trp Pro65 70 75 80CAG ATG GCT GGC ATG ATC CCT CTT CCA TAT AGC ACG TTT GAT TGG GAA684Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp Trp Glu85 90 95GGC GAC CTA CCT CTA AGA TAT CCT CAA AAG GAC CTG GTA ATA TAT GAG732Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile Tyr Glu100 105 110ATG CAC TTG CGT GGA TTC ACG AAG CAT GAT TCA AGC AAT GTA GAA CAT780Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser Asn Val Glu His115 120 125CCG GGT ACT TTC ATT GGA GCT GTG TCG AAG CTT GAC TAT TTG AAG GAG 828Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Glu130 135 140CTT GGA GTT AAT TGT ATT GAA TTA ATG CCC TGC CAT GAG TTC AAC GAG 876Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His Glu Phe Asn Glu145 150 155 160CTG GAG TAC TCA ACC TCT TCT TCC AAG ATG AAC TTT TGG GGA TAT TCT 924Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn Phe Trp Gly Tyr Ser165 170 175ACC ATA AAC TTC TTT TCA CCA ATG ACA AGA TAC ACA TCA GGC GGG ATA 972Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr Ser Gly Gly Ile180 185 190AAA AAC TGT GGG CGT GAT GCC ATA AAT GAG TTC AAA ACT TTT GTA AGA 1020Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe Val Arg195 200 205GAG GCT CAC AAA CGG GGA ATT GAG GTG ATC CTG GAT GTT GTC TTC AAC 1068Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val Val Phe Ash210 215 220CAT ACA GCT GAG GGT AAT GAG AAT GGT CCA ATA TTA TCA TTT AAG GGG 1116His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu Ser Phe Lys Gly225 230 235 240GTC GAT AAT ACT ACA TAC TAT ATG CTT GCA CCC AAG GGA GAG TTT TAT 1164Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu Phe Tyr245 250 255AAC TAT TCT GGC TGT GGG AAT ACC TTC AAC TGT AAT CAT CCT GTG GTT1212Asn Tyr Ser Gly Cys Gly ASh Thr Phe Asn Cys Asn His Pro Val Val260 265 270CGT CAA TTC ATT GTA GAT TGT TTA AGA TAC TGG GTG ACG GAA ATG CAT1260Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His275 280 285GTT GAT GGT TTT CGT TTT GAT CTT GCA TCC ATA ATG ACC AGA GGT TCC1308Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg Gly Ser290 295 300AGT CTG TGG GAT CCA GTT AAC GTG TAT GGA GCT CCA ATA GAA GGT GAC1356Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro Ile Glu Gly Asp305 310 315 320ATG ATC ACA ACA GGG ACA CCT CTT GTT ACT CCA CCA CTT ATT GAC ATG1404Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro Leu Ile Asp Met325 330 335ATC AGC AAT GAC CCA ATT CTT GGA GGC GTC AAG CTC ATT GCT GAA GCA1452Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu Ile Ala Glu Ala340 345 350TGG GAT GCA GGA GGC CTC TAT CAA GTA GGT CAA TTC CCT CAC TGG AAT1500Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe Pro His Trp Asn355 360 365GTT TGG TCT GAG TGG AAT GGG AAG TAC CGG GAC ATT GTG CGT CAA TTC1548Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg Gln Phe370 375 380ATT AAA GGC ACT GAT GGA TTT GCT GGT GGT TTT GCC GAA TGT CTT TGT1596Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys Leu Cys385 390 395 400GGA AGT CCA CAC CTA TAC CAG GTAAGTTGTG GCAATACTTG TAAATGAGTT 1647Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln405GAGTGAATGT CACCTGGATT TTTTATATAT ACCACATGAT GATACACATC TAAATATATA 1707ACAATCATAG TGTATGCATA TGCATTTGGC TAAGAAGTAT TAGTGTATAC ACTAGTGCTA 1767TATATAGGTT TTAACACCCA ACTTGCCAAT GAAGGAACAT AGGGCTTTCT AGTTATCTTA 1827TTTATTTGTC CGGTGAATAA TCCACTGAAA AATTCCAGCC ATGTCATTTT TTAGGGGGGG 1887AGAAGAAACT ATATTGATTT GCCCCCCTAA AAGAAGCCAT CTCAGAATTC ATAGGTAAGT 1947TGCTTTTCTG TAAAGAAAGG AAAACGACTT CATACTTTCT ATCGGTGCTA ACTTAGCTCG 2007ATGTATATTT GTAAGATGAA TGCCAAATTT AATTTGTCGG ATAATTTGAT CTGTTATTCA 2067CAAATTTCTA TTTGGTTTCT CTAGAAATCA AACCAGTAAC TTGTTATTGG CACTGCAACT 2127TCTTATTGAT TAATCAG GCA GGA GGA AGG AAA CCT TGG CAC AGT ATC AAC 2177Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp His Ser Ile Ash1 5 10TTT GTA TGT GCA CAT GAT GGA TTT ACA CTG GCT GAT TTG GTA ACA TAT 2225Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp Leu Val Thr Tyr15 20 25AAT AAG AAG TAC AAT TTA CCA AAT GGG GAG AAC AAC AGA GAT GGA GAA 2273Asn Lys Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly Glu Asn Asn Arg Asp Gly Glu30 35 40AAT CAC AAT CTT AGC TGG AAT TGT GGG GAG GAA GGA GAA TTC GCA AGA 2321Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly Glu Phe Ala Arg45 50 55TTG TCT GTC AAA AGA TTG AGG AAG AGG CAG ATG CGC AAT TTC TTT GTT 2369Leu Ser Val Lys Arg Leu Arg Lys Arg Gln Met Arg Asn Phe Phe Val60 65 70 75TGT CTC ATG GTT TCT CAA GGA GTT CCA ATG TTC TAC ATG GGT GAT GAA 2417Cys Leu Met Val Ser Gln Gly Val Pro Met Phe Tyr Met Gly Asp Glu80 85 90TAT GGC CAC ACA AAA GGG GGC AAC AAC AAT ACA TAC TGC CAT GAT TCT 2465Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly Asn Asn Asn Thr Tyr Cys His Asp Ser95 100 105TAT GTC AAT TAT TTT CGC TGG GAT AAA AAA GAA CAA TAC TCT GAG TTG 2513Tyr Val Asn Tyr Phe Arg Trp Asp Lys Lys Glu Gln Tyr Ser Glu Leu110 115 120CAC CGA TTC TGC TGC CTC ATG ACC AAA TTC CGC AAG GAG TGC GAG GGT 2561His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys Glu Cys Glu Gly125 130 135CTT GGC CTT GAG GAC TTT CCA ACG GCC AAA CGG CTG CAG TGG CAT GGT 2609Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala Lys Arg Leu Gln Trp His Gly140 145 150 155CAT CAG CCT GGG AAG CCT GAT TGG TCT GAG AAT AGC CGA TTC GTT GCC 2657His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser Glu Asn Ser Arg Phe Val Ala160 165 170TTT TCC ATG AAA GAT GAA AGA CAG GGC GAG ATC TAT GTG GCC TTC AAC 2705Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly Glu Ile Tyr Val Ala Phe Asn175 180 185ACC AGC CAC TTA CCG GCC GTT GTT GAG CTC CCA GAG CGC GCA GGG CGC 2753Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu Leu Pro Glu Arg Ala Gly Arg190 195 200CGG TGG GAA CCG GTG GTG GAC ACA GGC AAG CCA GCA CCA TAC GAC TTC2801Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala Pro Tyr Asp Phe205 210 215CTC ACC GAC GAC TTA CCT GAT CGC GCT CTC ACC ATA C AC CAG TTC TCG 2849Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala Leu Thr Ile His Gln Phe Ser220 225 230 235CAT TTC CTC TAC TCC AAC CTC TAC CCC ATG CTC AGC TAC TCA TCG GTC2897His Phe Leu Tyr Ser Asn Leu Tyr Pro Met Leu Ser Tyr Ser Ser Val240 245 250ATC CTA GTA TTG CGC CCT GAT GTT TGA GAG ACC AAT ATA TAC AGT AAA2945Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val * Glu Thr Asn Ile Tyr Ser Lys255 260 265TAA TAT GTC TAT ATG TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 2997* Tyr Val Tyr Met270<210> 2<211> 2295<212> DNA<213> Triticum aestivum L. cv. Florida<220><223> cDNA<400> 2GGTCGGGGCC GGCGCCGCGC CTGCGACGGT GGCGACCCAA TGCGACGGCG GGGAAGGGGG 60TCGGCGAGGT GTGCGCCGCG GTTGTCGAGG CGGCGACGAA GGTAGAGGAC GAGGGGGAGG 120AGGACGAGCC GGTGGCGGAG GACAGGTACG CGCTCGGCGG CGCGTGCAGG GTGCTCGCCG 180GAATGCCCGC GCCGCTGGGC GCCACCGCGC TCGCCGGCGG GGTCAATTTC GCCGTCTATT 240CCGGCGGAGC CACCGCCGCG GCGCTCTGCC TCTTCACGCC AGAAGATCTC AAGGCGGTGG 300GGTTGCCTCC CGAGTAGAGT TCATCAGCTT TGCGTGCGCC GCGCGCCCCT TTTTTGGGCC 360TGCAATTTAA GTTTTGTACT GGGGCAAATG CTGCAGGATA GGGTGACCGA GGAGGTTCCC 420CTTGACCCCC TGATGAATCG GACCGGGAAC GTGTGGCATG TCTTCATCGA AGGCGAGCTG 480CACAACATGC TTTACGGGTA CAGGTTCGAC GGCACCTTTG CTCCTCACTG CGGGCACTAC 540CTTGATGTTT CCAATGTCGT GGTGGATCCT TATGCTAAGG CAGTGATAAG CCGAGGGGAG 600TATGGTGTTC CAGCGCGTGG TAACAATTGC TGGCCTCAGA TGGCTGGCAT GATCCCTCTT 660CCATATAGCA CGTTTGATTG GGAAGGCGAC CTACCTCTAA GATATCCTCA AAAGGACCTG 720GTAATATATG AGATGCACTT GCGTGGATTC ACGAAGCATG ATTCAAGCAA TGTAGAACAT 780CCGGGTACTT TCATTGGAGC TGTGTCGAAG CTTGACTATT TGAAGGAGCT TGGAGTTAAT 840TGTATTGAAT TAATGCCCTG CCATGAGTTC AACGAGCTGG AGTACTCAAC CTCTTCTTCC 900AAGATGAACT TTTGGGGATA TTCTACCATA AACTTCTTTT CACCAATGAC AAGATACACA 960TCAGGCGGGA TAAAAAACTG TGGGCGTGAT GCCATAAATG AGTTCAAAAC TTTTGTAAGA 1020GAGGCTCACA AACGGGGAAT TGAGGTGATC CTGGATGTTG TCTTCAACCA TACAGCTGAG 1080GGTAATGAGA ATGGTCCAAT ATTATCATTT AAGGGGGTCG ATAATACTAC ATACTATATG 1140CTTGCACCCA AGGGAGAGTT TTATAACTAT TCTGGCTGTG GGAATACCTT CAACTGTAAT 1200CATCCTGTGG TTCGTCAATT CATTGTAGAT TGTTTAAGAT ACTGGGTGAC GGAAATGCAT 1260GTTGATGGTT TTCGTTTTGA TCTTGCATCC ATAATGACCA GAGGTTCCAG TCTGTGGGAT 1320CCAGTTAACG TGTATGGAGC TCCAATAGAA GGTGACATGA TCACAACAGG GACACCTCTT 1380GTTACTCCAC CACTTATTGA CATGATCAGC AATGACCCAA TTCTTGGAGG CGTCAAGCTC 1440ATTGCTGAAG CATGGGATGC AGGAGGCCTC TATCAAGTAG GTCAATTCCC TCACTGGAAT 1500GTTTGGTCTG AGTGGAATGG GAAGTACCGG GACATTGTGC GTCAATTCAT TAAAGGCACT 1560GATGGATTTG CTGGTGGTTT TGCCGAATGT CTTTGTGGAA GTCCACACCT ATACCAGGTA 1620AGTTGTGGCA ATACTTGTAA ATGAGTTGAG TGAATGTCAC CTGGATTTTT TATATATACC 1680ACATGATGAT ACACATCTAA ATATATAACA ATCATAGTGT ATGCATATGC ATTTGGCTAA 1740GAAGTATTAG TGTATACACT AGTGCTATAT ATAGGTTTTA ACACCCAACT TGCCAATGAA 1800GGAACATAGG GCTAICTAGT TATCTTATTT ATTTGTCCGG TGAATAATCC ACTGAAAAAT 1860TCCAGCCATG TCATTTTTTA GGGGGGGAGA AGAAACTATA TTGATTTGCC CCCCTAAAAG 1920AAGCCATCTC AGAATTCATA GGTAAGTTGC TTTTCTGTAA AGAAAGGAAA ACGACTTCAT 1980ACTTTCTATC GGTGCTAACT TAGCTCGATG TATATTTGTA AGATGAATGC CAAATTTAAT 2040TTGTCGGATA ATTTGATCTG TTATTCACAA ATTTCTATTT GGTTTCTCTA GAAATCAAAC 2100CAGTAACTTG TTATTGGCAC TGCAACTTCT TATTGATTAA TCAGGCAGGA GGAAGGAAAC 2160CTTGGCACAG TATCAACTTT GTATGTGCAC ATGATGGATT TACACTGGCT GATTTGGTAA 2220CATATAATAA GAAGTACAAT TTACCAAATG GGGAGAACAA CAGAGATGGA GAAAATCACA 2280ATCTTAGCTG GAATTGTGGG GAGGAAGGAG AATTCGCAAG ATTGTCTGTC AAAAGATTGA 2340GGAAGAGGCA GATGCGCAAT TTCTTTGTTT GTCTCATGGT TTCTCAAGGA GTTCCAATGT 2400TCTACATGGG TGATGAATAT GGCCACACAA AAGGGGGCAA CAACAATACA TACTGCCATG 2460ATTCTTATGT CAATTATTTT CGCTGGGATA AAAAAGAACA ATACTCTGAG TTGCACCGAT 2520TCTGCTGCCT CATGACCAAA TTCCGCAAGG AGTGCGAGGG TCTTGGCCTT GAGGACTTTC 2580CAACGGCCAA ACGGCTGCAG TGGCATGGTC ATCAGCCTGG GAAGCCTGAT TGGTCTGAGA 2640ATAGCCGATT CGTTGCCTTT TCCATGAAAG ATGAAAGACA GGGCGAGATC TATGTGGTCT 2700TCAACACCAG CCACTTACCG GCCGTTGTTG AGCTCCCAGA GCGCGCAGGG CGCCGGTGGG 2760AACCGGTGGT GGACACAGGC AAGCCAGCAC CATACGACTT CCTCACCGAC GACTTACCTG 2820ATCGCGCTCT CACCATACAC CAGTTCTCGC ATTTCCTCTA CTCCAACCTC TACCCCATGC 2880TCAGCTACTC ATCGGTCATC CTAGTATTGC GCCCTGATGT TTGAGAGACC AATATATACA 2940GTAAATAATA TGTCTATATG TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 2997210>3<211> 764<212> PRT<213> Triticum aestivum L. cv. Florida<400> 3Ser Gly Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala Thr Ala1 5 10 15Gly Lys Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Ala Ala Thr20 25 30Lys Val Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu Asp Arg35 40 45Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro Ala Pro50 55 60Leu Gly Ala Thr Ala Leu Ala G1y G1y Val Asn Phe Ala Val Tyr Ser65 70 75 80Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu Asp Leu85 90 95Lys Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu Met Asn100 105 110Arg Thr Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu His Asn115 120 125Met Leu Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His Cys Gly130 135 140His Tyr Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala145 150 155 160Val Ile Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly ASn Asn Cys165 170 175Trp Pro Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp180 185 190Trp Glu Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile195 200 205Tyr Glu Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser Asn Val210 215 220Glu His Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp Tyr Leu225 230 235 240Lys Glu Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His Glu Phe245 250 255Asn Glu Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn Phe Trp Gly260 265 270Tyr Ser Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr Ser Gly275 280 285Gly Ile Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe290 295 300Val Arg Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val Val305 310 315 320Phe Asn His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu Ser Phe325 330 335Lys Gly Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu340 345 350Phe Tyr Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys Asn His Pro355 360 365Val Val Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp val Thr Glu370 375 380Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg385 390 395 400Gly Ser Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro Ile Glu405 410 415Gly Asp Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro Leu Ile420 425 430Asp Met Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu Ile Ala435 440 445Glu Ala Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe Pro His450 455 460Trp Asn Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg465 470 475 480Gln Phe Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys485 490 495Leu Cys Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp500 505 510His Ser Ile Asn Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp515 520 525Leu Val Thr Tyr Asn Lys Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly Glu Asn Asn530 535 540Arg Asp Gly Glu Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly545 550 555 560Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Lys Arg Leu Arg Lys Arg Gln Met Arg565 570 575Asn Phe Phe Val Cys Leu Met Val Ser Gln Gly Val Pro Met Phe Tyr580 585 590Met Gly Asp Glu Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly Asn Asn Asn Thr Tyr595 600 605Cys His Asp Ser Tyr Val Asn Tyr Phe Arg Trp Asp Lys Lys Glu Gln610 615 620Tyr Ser Glu Leu His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys625 630 635 640Glu Cys Glu Gly Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala Lys Arg Leu645 650 655Gln Trp His Gly His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser Glu Asn Ser660 665 670Arg Phe Val Ala Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly Glu Ile Tyr675 680 685Val Ala Phe Asn Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu Leu Pro Glu690 695 700Arg Ala Gly Arg Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala705 710 715 720Pro Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala Leu Thr Ile725 730 735His Gln Phe Ser His Phe Leu Tyr Ser Asn Leu Tyr Pro Met Leu Ser740 745 750Tyr Ser Ser Val Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val755 760<2l0><211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4AAAGGCCCAA TATTATCCTT TAGG24<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400> 5GCCATTTCAA CCGTTCTGAAGTCGGGAAGT C 31<210> 6<211> 2437<212> DNA<213> Triticum aestivum L. cv. Florida<220><222> CDS<223> (16) … (2304)<400> 6GAATTCGGCA CGAGG CCG GCG CCG CGC CTG CGA CGG TGG CGG CCC AAT GCG 51Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala1 5 10ACG GCG GGG AAG GGG GTC GGC GAG GTC TGC GCC GCG GTT GTC GAG GTG 99Thr Ala Gly Lys Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Val15 20 25GCG ACG AAG GCC GAG GAT GAG GGG GAG GAG GAC GAG CCG GTG GCG GAG 147Ala Thr Lys Ala Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu30 35 40GAC AGG TAC GCG CTC GGC GGC GCG TGC AGG GTG CTC GCC GGA ATG CCC 195Asp Arg Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro45 50 55 60ACG CCG CTG GGC GCC ACC GCG CTC GCC GGC GGG GTC AAT TTC GCC GTC 243Thr Pro Leu Gly Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala Val65 70 75TAC TCC GGC GGA GCC ACA GCC GCG GCG CTC TGC CTC TTC ACG CCA GAA 291Tyr Ser Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu80 85 90GAT CTC AAG GCG GAT AGG GTG ACG GAG GAG GTT CCC CTT GAC CCC CTG 339Asp Leu Lys Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu95 100 105ATG AAT CGG ACT GGG AAC GTA TGG CAT GTC TTC ATC GAA GGC GAG CTG 387Met Asn Arg Thr Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu110 115 120CAG GAC ATG CTT TAC GGG TAC AGG TTC GAC GGC ACC TTT GCT CCT CAC 435Gln Asp Met Leu Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His125 130 135 140TGC GGG CAC TAC CTT GAT GTT TCC AAT GTC GTG GTG GAT CCT TAT GCT 483Cys Gly His Tyr Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr Ala145 150 155AAG GCA GTG ATA AGC CGA GGG GAG TAT GGT GTT CCG GCG CGT GGT AAC 531Lys Ala Val Ile Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly Asn160 165 170AAT TGC TGG CCT CAG ATG GCT GGC ATG ATC CCT CTT CCA TAT AGC ACG 579Asn Cys Trp Pro Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr175 180 185TTT GAT TGG GAA GGC GAC CTA CCT CTA AGA TAT CCT CAA AAG GAC CTG 627Phe Asp Trp Glu Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu190 195 200GTA ATA TAT GAG ATG CAC TTG CGT GGA TTC ACG AAG CAT GAT TCA AGC 675Val Ile Tyr Glu Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser205 210 215 220AAT GTA GAA CAT CCC GGT ACT TTC ATT GGG GCT GTG TCG AAG CTT GAC 723Asn Val Glu His Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp225 230 235TAT TTG AAG GAG CTT GGA GTT AAT TGT ATT GAG TTA ATG CCC TGC CAT 771Tyr Leu Lys Glu Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His240 245 250GAG TTC AAC GAG CTG GAG TAC TCA ACC TCT TCT TCC AAG ATG AAC TTT 819Glu Phe Asn Glu Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn Phe255 260 265TGG GGA TAT TCT ACC ATA AAC TTC TTT TCA CCA ATG ACG AGA TAC ACA 867Trp Gly Tyr Ser Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr270 275 280TCA GGC GGG ATA AAA AAC TGT GGG CGT GAT GCC ATA AAT GAG TTC AAA 915Ser Gly Gly Ile Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys285 290 295 300ACT TTT GTA AGA GAG GCT CAC AAA CGG GGA ATT GAG GTG ATC CTG GAT 963Thr Phe Val Arg Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp305 310 315GTT GTC TTC AAC CAT ACA GCT GAG GGT AAT GAG AAT GGT CCA ATA TTA1011Val Val Phe Asn His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu320 325 330TCA TTT AGG GGG GTC GAT AAT ACT ACA TAC TAT ATG CTT GCA CCC AAG1059Ser Phe Arg Gly Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys335 340 345GGA GAG TTT TAT AAC TAT TCT GGC TGT GGG AAT ACC TTC AAC TGT AAT1107Gly Glu Phe Tyr Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys Asn350 355 360CAT CCT GTG GTT CGT CAATTC ATT GTA GAT TGT TTA AGA TAC TGG GTG 1155His Pro Val Val Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Val365 370 375 380ACG GAA ATG CAT GTT GAT GGT TTT CGT TTT GAT CTT GCA TCC ATA ATG1203Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met385 390 395ACC AGA GGT TCC AGT CTG TGG GAT CCA GTT AAC GTG TAT GGA GCT CCA1251Thr Arg Gly Ser Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro400 405 410ATA GAA GGT GAC ATG ATC ACA ACA GGG ACA CCT CTT GTT ACT CCA CCA1299Ile Glu Gly Asp Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro415 420 425CTT ATT GAC ATG ATC AGC AAT GAC CCA ATT CTT GGA GGC GTC AAG CTC1347Leu Ile Asp Met Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu430 435 440GTT GCT GAA GCA TGG GAT GCA GGA GGC CTC TAT CAA GTA GGT CAA TTC 1395Val Ala Glu Ala Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe445 450 455 460CCT CAC TGG AAT GTT TGG TCT GAG TGG AAT GGG AAG TAC CGG GAC ATT 1443Pro His Trp Asn Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile465 470 475GTG CGT CAA TTC ATT AAA GGC ACT GAT GGA TTT GCT GGT GGT TTT GCC 1491Val Arg Gln Phe Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala480 485 490GAA TGT CTT TGT GGA AGT CCA CAC CTA TAC CAG GCA GGA GGA AGG AAA 1539Glu Cys Leu Cys Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln Ala Gly Gly Arg Lys495 500 505CCT TGG CAC AGT ATC AAC TTT GTA TGT GCA CAC GAT GGA TTT ACA CTG 1587Pro Trp His Ser Ile Asn Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu510 515 520GCT GAT TTG GTA ACA TAT AAT AAC AAG TAC AAT TTA CCA AAT GGG GAG 1635Ala Asp Leu Val Thr Tyr Asn Asn Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly Glu525 530 535 540AAC AAC AGA GAT GGA GAA AAT CAC AAT CTT AGC TGG AAT TGT GGG GAG 1683Asn Asn Arg Asp Gly Glu Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu545 550 555GAA GGA 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764<212> PRT<213〉 Triticum aesTivum L.cv. Florida<400> 7Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala Thr Ala Gly Lys1 5 10 15Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Val Ala Thr Lys Ala20 25 30Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu Asp Arg Tyr Ala35 40 45Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro Thr Pro Leu Gly50 55 60Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala Val Tyr Ser Gly Gly65 70 75 80Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu Asp Leu Lys Ala85 90 95Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu Met Asn Arg Thr100 105 110Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu Gln Asp Met Leu115 120 125Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His Cys Gly His Tyr130 135 140Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Val Ile145 150 155 160Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly Asn Asn Cys Trp Pro165 170 175Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp Trp Glu180 185 190Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile Tyr Glu195 200 205Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser Asn Val Glu His210 215 220Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Glu225 230 235 240Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His Glu Phe Asn Glu245 250 255Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys MeT Asn Phe Trp Gly Tyr Ser260 265 270Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr Ser Gly Gly Ile275 280 285Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe Val Arg290 295 300Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val val Phe Asn305 310 315 320His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu Ser Phe Arg Gly325 330 335Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu Phe Tyr340 345 350Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys Asn His Pro val val355 360 365Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His370 375 380Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg Gly Ser385 390 395 400Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro Ile Glu Gly Asp405 410 415Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro Leu Ile Asp Met420 425 430Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu Val Ala Glu Ala435 440 445Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe Pro His Trp Asn450 455 460Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg Gln Phe465 470 475 480Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys Leu Cys485 490 495Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp His Ser500 505 510Ile Asn Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp Leu Val515 520 525Thr Tyr Asn Asn Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly Glu Asn Asn Arg Asp530 535 540Gly Glu Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly Glu Phe545 550 555 560Ala Arg Leu Ser Val Lys Arg Leu Arg Lys Arg Gln Met Arg Asn Phe565 570 575Phe Val Cys Leu Met Val Ser Gln Gly Val Pro Met Phe Tyr Met Gly580 585 590Asp Glu Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly Asn Asn Asn Thr Tyr Cys His595 600 605Asp Ser Tyr Val Asn Tyr Phe Arg Trp Asp Lys Lys Glu Gln Tyr Ser610 615 620Asp Leu His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys Glu Cys625 630 635 640Glu Gly Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala Glu Arg Leu Gln Trp645 650 655His Gly His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser Glu Asn Ser Arg Phe660 665 670Val Ala Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly Glu Ile Tyr Val Ala675 680 685Phe Asn Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu Leu Pro Glu Arg Thr690 695 700Gly Arg Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala Pro Tyr705 710 715 720Asp Phe Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala Leu Thr Ile His Gln725 730 735Phe Ser His Phe Leu Asn Ser Asn Leu Tyr Pro Met Leu Ser Tyr Ser740 745 750Ser Val Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val755 760<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8GCTTTACGGG TACAGGTTCG 20<210> 9<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<223> 引物<400> 9GCTTTACGGG TACAGGTT18<210>10<211>51<213>人工序列<220><223>引物<400>10GCGGTACCTC TAGAAGGAGA TArACATATG GCGGAGGACA GGTACGCGCT C51<210> 11<211> 33<212> DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11GCTCGAGTCG ACTCAAACAT CAGGGCGCAA TAC 3權(quán)利要求
1．一種編碼具有小麥異淀粉酶功能的蛋白質(zhì)的核酸分子，選自如下(a)編碼包含Seq ID No.3或Seq ID No.7所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子，(b)包含Seq ID No.1、Seq ID No.2或Seq ID No.6所示核苷酸序列或其一部分或其相應(yīng)的梳糖核苷酸序列的核酸分子，(c)與(a)或(b)所述核酸分子雜交或與之互補(bǔ)的核酸分子，和(d)核苷酸序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(a)，(b)或(c)所述核酸分子的序列不同的核酸分子。
2．權(quán)利要求1的核酸分子，其特征為，它是DNA分子。
3．權(quán)利要求2的DNA分子，其特征為，它是cDNA分子。
4．權(quán)利要求1至3中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子，它含有調(diào)節(jié)元件。
5．權(quán)利要求1的核酸分子，其特征為，它是RNA分子。
6．與權(quán)利要求1至5中之一的核酸分子特異性雜交的分子。
7．權(quán)利要求6的核酸分子，它是長度至少為15個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
8．含有權(quán)利1至5之一的DNA分子的載體。
9．權(quán)利要求8的載體，其中所述核酸分子以有義方向與調(diào)節(jié)元件相連接，這些調(diào)節(jié)元件可以保證在原核或真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和可翻譯RNA的合成。
10．權(quán)利要求8的載體，其中所述核酸分子以有義方向與調(diào)節(jié)元件連接，這些調(diào)節(jié)元件可以保證在原核或真核細(xì)胞中非翻譯性RNA的合成。
11．權(quán)利要求8的載體，其中所述核酸分子以反義方向與調(diào)節(jié)元件相連，這些調(diào)節(jié)元件保證在原核或真核細(xì)胞中非翻譯性RNA的合成。
12．一種用權(quán)利要求1至5中一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求8至11中一項(xiàng)或多項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或從這種細(xì)胞產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。
13．權(quán)利要求1至4中一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。
14．一種生產(chǎn)權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)的方法，其中權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞在允許所述蛋白質(zhì)合成的條件下培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離所述蛋白質(zhì)。
15．一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，其中將a)權(quán)利要求1至5中一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子，或b)權(quán)利要求8至11中一項(xiàng)或多項(xiàng)的載體整合在植物細(xì)胞的基因組中。
16．一種用權(quán)利要求1至5中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求8至11中一項(xiàng)或多項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或由這種細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞。
17．一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，其中a1)權(quán)利要求1至5中一項(xiàng)或多項(xiàng)的核酸分子，或a2)權(quán)利要求8至11中一項(xiàng)或多項(xiàng)的載體被整合在植物細(xì)胞的基因組中，和b)由所述植物細(xì)胞再生整株植物。
18．一種含有權(quán)利要求16的植物細(xì)胞的植物。
19．權(quán)利要求19的植物，它是單子葉或雙子葉植物。
20．權(quán)利要求19的植物，它是作物植物。
21．權(quán)利要求20的植物，它是儲(chǔ)存淀粉的植物。
22．權(quán)利要求21的植物，它是玉米，水稻，馬鈴薯或小麥植物。
23．權(quán)利要求18至22中一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物的繁殖材料。
24．一種可從權(quán)利要求16的植物細(xì)胞、權(quán)利要求18至22中一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物或從權(quán)利要求23的繁殖材料得到的淀粉。
25．權(quán)利要求24的淀粉在生產(chǎn)食品或食品半成品、優(yōu)選烘烤食品或膏狀食品的用途。
26．權(quán)利中要求24的淀粉在生產(chǎn)包裝材料或一次性物品中的用途。
全文摘要
本文公開了編碼參與植物淀粉合成的酶的核酸分子。這些酶是小麥異淀粉酶。此外,本發(fā)明涉及含有上述核酸分子的載體和宿主細(xì)胞,特別是轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞,以及可由它們?cè)偕谋景l(fā)明的異淀粉酶活性增加或降低的植物。
文檔編號(hào)A23L1/16GK1299416SQ99805921
公開日2001年6月13日 申請(qǐng)日期1999年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月8日
發(fā)明者H·羅爾茲, S·魯?shù)倏? G·阿貝爾, U·簡舍爾 申請(qǐng)人:阿溫提斯作物科學(xué)有限公司