本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種卵巢癌相關(guān)microRNA檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，通過堿基互補配對的方式識別靶miRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。但卵巢上皮癌死亡率卻占各類婦科腫瘤的首位，對婦女生命造成嚴(yán)重威脅。最近國外研究已經(jīng)得出卵巢癌的miRNA表達(dá)譜，盡管miRNA表達(dá)的變化和不同癌癥的生物學(xué)之間的功能性聯(lián)系仍值得進(jìn)一步研究，但miRNA的高度保守性、穩(wěn)定性使它成為一種腫瘤診斷、治療及檢測預(yù)后極具潛能的生物學(xué)指標(biāo)。研究表明，跟進(jìn)miRNA在正常卵巢與卵巢癌中的表達(dá)差異可以明確地區(qū)分它們，卵巢癌中表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最高的為miRNA-200家族(miR-200a、miR-141、miR-200c、miR-200b)，下調(diào)倍數(shù)最高的有miR-199a、miR-140、miR145和miR-125b。有研究者通過對55例晚期卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-200家族部分成員，包括miR-200a、miR-200b、miR-429，與卵巢癌的復(fù)發(fā)及生存率有關(guān)，其表達(dá)的增加可以抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移，且miR-200的低表達(dá)與卵巢癌患者低生存率相關(guān)。目前，針對miRNA的檢測方法主要有NorthernBlot、基因芯片、熒光定量探針法、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)。但NorthernBlot方法敏感度低、耗時長且RNA的用量較大，不適合高通量分析；基因芯片技術(shù)能實現(xiàn)miRNA的高通量分析，即在一塊芯片上同時檢測多個miRNA，但缺點是結(jié)果準(zhǔn)確性低，重復(fù)性差，實驗價格昂貴；熒光定量探針法檢測靈敏度高，但檢測費用昂貴；而基于微球的流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)將探針固定于微球上并置于液相中，更有利 于捕獲miRNA序列，因此提高了準(zhǔn)確性，但是由于miRNA同源性高，長度較短，細(xì)胞或組織內(nèi)含量低，針對它的高靈敏高選擇性檢測方法仍然有待進(jìn)一步完善。原位雜交技術(shù)是一種定位和形態(tài)學(xué)檢測保存的組織切片或細(xì)胞制備物中特異性miRNA序列的方法。然而目前現(xiàn)有技術(shù)中對miRNA的多重平行檢測仍存在許多困難。首先，需要分別制備各靶miRNA的標(biāo)記探針；其次，難以同時原位檢測多種靶miRNA的表達(dá)。因此，目前報道的對多種miRNA的檢測只能用不同的標(biāo)記方法，然而，用不同的標(biāo)記方法不能很好地控制探針與細(xì)胞中非特異性序列可能的交叉雜交。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高的卵巢癌相關(guān)microRNA檢測試劑盒。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種卵巢癌相關(guān)microRNA檢測試劑盒，包括有：針對每種待檢測的卵巢癌相關(guān)microRNA有至少一條一級信號放大探針、至少一條二級信號放大探針、和至少一條三級信號放大探針，以及捕獲探針，所述卵巢癌相關(guān)microRNA選自:hsa-miR-21-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-203a-3p、hsa-miR-205-5p以及hsa-miR-214-3p中的至少一種，其中：所述捕獲探針用于連接目標(biāo)核酸與一級信號放大探針，每條捕獲探針從5’端到3’端依次為特異性P1序列、間隔臂序列、P2序列，針對不同目標(biāo)基因的P2序列互不相同；所述一級信號放大探針從5’端到3’端依次為：P4序列、間隔臂序列、P3序列，P3序列與P2序列互補配對；所述二級信號放大探針從5’端到3’端依次為：P5序列、間隔臂序列、P6序列；所述P4序列含有至少一個與P5序列互補配對的堿基片段，且每個與P5序列互補配對的堿基片段之間設(shè)有間隔臂序列；所述三級信號放大探針從5’端到3’端依次為：P8序列、間隔臂序列、P7序列，所述P8序列5’端還修飾有熒光基團，針對不同目標(biāo)核酸的熒光基團的顏色互不相同或發(fā)射波長互不相同；所述P6序列含有至少一個與P7序列互補配對的堿基片段，且每個與P7序列互補配對的堿基片段之間設(shè)有間隔臂序列；所述P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列、P8序列均為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，各探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配，與整個檢測體系的其它核酸之間均不存在特異性結(jié)合的序列；所述待檢測的卵巢癌相關(guān)miRNA的捕獲探針的P1序列選自以下中的至少一種：針對hsa-miR-21-5p的SEQIDNO.1，針對hsa-miR-141-3p的SEQIDNO.2，針對hsa-miR-200a-3p的SEQIDNO.3，針對hsa-miR-200c-3p的SEQIDNO.4，針對hsa-miR-200b-3p的SEQIDNO.5，針對hsa-miR-203a-3p的SEQIDNO.6，針對hsa-miR-205-5p的SEQIDNO.7，針對hsa-miR-214-3p的SEQIDNO.8。在其中一個實施例中，所述P2序列選自：所述P2序列選自：SEQIDNO.9～SEQIDNO.18；所述P5序列選自：SEQIDNO.29～SEQIDNO.38，所述P7序列選自：SEQIDNO.49～SEQIDNO.58；所述P4序列中的所述間隔臂序列為3—10個T；所述P6序列的所述間隔臂序列為2—10個T；P8序列為polyT。在其中一個實施例中，所述polyT為3-10個T。在其中一個實施例中，所述P4序列選自：SEQIDNO.19～SEQIDNO.28，所述P6序列選自：SEQIDNO.39～SEQIDNO.48。在其中一個實施例中，所述一級信號放大探針中所述P4序列與P3序列之間的間隔臂序列選自5－20個T；二級信號放大探針中所述P5序列與P6序列之間的間隔臂序列選自5－10個T；三級信號放大探針中P7序列與P8序列之間的間隔臂序列選自3－10個T。在其中一個實施例中，所述熒光基團選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，且針對不同目標(biāo)核酸的熒光基團互不相同。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明提供一種卵巢癌相關(guān)microRNA的檢測捕獲探針，所述的捕獲采用的三明治結(jié)構(gòu)(與靶標(biāo)miRNA反向互補序列P1—間隔序列—與一級信號放大探針P3序列互補結(jié)合的P2序列)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，該設(shè)計更為簡單，更具有實用性。而且本技術(shù)方案所設(shè)計的捕獲探針能夠?qū)崿F(xiàn)特異性強、靈敏度高的特點。本發(fā)明所選擇的信號放大探針，是發(fā)明人經(jīng)過大量試驗進(jìn)行綜合評估、統(tǒng)計分析、多種參數(shù)的優(yōu)化組合而得出的。(2)原位雜交方法本身具有熒光信號靈敏度低的缺點，但是本發(fā)明采用新型的原位雜交方法，通過信號放大體系提高熒光信號強度。本發(fā)明檢測流程能夠在8h內(nèi)完成，單一拷貝的miRNA雜交探針通過信號放大系統(tǒng)，與相應(yīng)的熒光探針結(jié)合，顯著提高miRNA原位雜交的檢測靈敏度。(3)本發(fā)明所設(shè)計的各種探針，能夠在均一的反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，且各種探針之間不存在非特異性結(jié)合；所設(shè)計的探針在檢測中特異性好、信噪比高。同時，多種探針的組合使用使鑒定試劑盒和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統(tǒng)。(4)本發(fā)明使用的是卵巢癌相關(guān)microRNA的探針的多位點特異配對、級聯(lián)放大的方式來實現(xiàn)信號的放大，而不是PCR擴增的方法，提高了檢測信號，實現(xiàn)了檢測的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)的假陽性。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。實施例1卵巢癌相關(guān)miRNA檢測試劑盒本實施例提供一種卵巢癌相關(guān)miRNA檢測試劑盒，包括有捕獲探針以及信號放大探針，信號放大探針包括有，一級信號放大探針、二級信號放大探針、三級信號放大探針。以上探針具有特異性強、靈敏度高的特點。1、捕獲探針捕獲探針是連接靶核酸與一級信號放大探針，每條捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測的靶核酸結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、能與一級信號放大探針P3序列互補配對的P2序列，針對不同目標(biāo)基因的P2序列互不相同。所述間隔臂為用于將捕獲探針P2序列與特異性序列P1間隔開來，通過在探針內(nèi)部設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。本發(fā)明捕獲探針的間隔臂優(yōu)選為5－10個T，本實施例優(yōu)選為5個T。本實施例針對hsa-miR-21-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-203a-3p、hsa-miR-205-5p以及hsa-miR-214-3p設(shè)計捕獲探針，具體如表1、表2：表1捕獲探針的P1序列表2捕獲探針的P2序列SEQIDNO.P2序列(5’→3’)9TGAAGACTGA10ATTGATTGTG11GTCTATAGTG12GATTCAGTGA13TTGAGTAATG14TGTAATGAGT15GATTAGTGAT16GTAGATTAGT17GATGACAGTA18AGTACTTGTG2、信號放大探針1)一級信號放大探針針對每種待檢測的miRNA包括一條或以上的一級信號放大探針，所述每條一級信號放大探針從5’端到3’端依次為：與P2序列反向互補配對結(jié)合的P3序列、間隔臂序列、P4序列，P3序列通過與捕獲探針P2序列的結(jié)合實現(xiàn)目標(biāo)信號的級聯(lián)放大。本發(fā)明P3與P4序列之間的間隔臂序列可以選自5－20個T，本實施例使用的間隔臂為10個T。所述P4序列含有一個或以上與二級信號放大探針的P5序列反向互補的堿基片段，優(yōu)選含有2～5個與P2序列互補配對的堿基片段，本實施例中，P4含有3個與P5反向互補的堿基片段，相同堿基片段之間設(shè)有間隔臂序列，所述間隔臂序列優(yōu)選為3—10個T，本實施例中為設(shè)有3個T。表3一級信號放大探針的P4序列SEQIDNO.P4序列(5’→3’)19TACTACTTTTACTACTTTTACTAC20TGATACTTTTGATACTTTTGATAC21GATCTCTTTGATCTCTTTGATCTC22ATATCATTTATATCATTTATATCA23TATCTCTTTTATCTCTTTTATCTC24CACATCTTTCACATCTTTCACATC25TCACATTTTTCACATTTTTCACAT26ACATCATTTACATCATTTACATCA27CATCGATTTCATCGATTTCATCGA28TCGATCTTTTCGATCTTTTCGATC2)二級信號放大探針本發(fā)明含有一條或以上的二級信號放大探針，所述二級信號放大探針從5’端到3’端依次為：與P4序列反向互補結(jié)合的P5序列、間隔臂序列、P6序列，所述P4含有一個或以上的P5序列反向互補堿基序列。本發(fā)明P5與P6序列之間的間隔臂序列可以選自5－10個T，本實施例使用的間隔臂為6個T。表4二級信號放大探針的P5序列SEQIDNO.P5序列(5’→3’)29GTAGTA30GTATCA31GAGATC32TGATAT33GAGATA34GATGTG35ATGTGA36TGATGT37TCGATG38GATCGA所述P6序列含有一個或以上與三級信號放大探針的P7序列反向互補的堿基片段，優(yōu)選含有2-5個與P7序列互補配對的堿基片段，本實施例中，所述P6序列含有三個與P7序列反向互補片段，相同堿基序列之間設(shè)有間隔臂序列，間隔臂序列優(yōu)選為2—10個T，本實施例中為有2個T。表5二級信號放大探針的P6序列SEQIDNO.P6序列(5’→3’)39CAGTATTCAGTATTCAGTA40ACATGTTACATGTTACATG41AGCATTTAGCATTTAGCAT42CTCGATTCTCGATTCTCGA43ACGTGTTACGTGTTACGTG44GACGATTGACGATTGACGA45GCTGATTGCTGATTGCTGA46TCGAGTTTCGAGTTTCGAG47GTGACTTGTGACTTGTGAC48TCGACTTTCGACTTTCGAC3)三級信號放大探針本發(fā)明所述三級信號放大探針從5’端到3’端依次為：P8序列、間隔臂序列、P7序列，所述P6序列含有一個或以上與P7序列反向互補的堿基片段；所述P8序列5’端還修飾有熒光基團。本發(fā)明P7與P8序列之間的間隔臂序列可以選自3－10個T，本實施例使用的間隔臂為5個T。表6三級信號放大探針的P7序列SEQIDNO.P7序列(5’→3’)49TACTG50CATGT51ATGCT52TCGAG53CACGT54TCGTC55TCAGC56CTCGA57GTCAC58GTCGA本發(fā)明所設(shè)計的信號放大探針，除上述條件限定的特定探針反向互補完全匹配的情況以外，所述P3、P4、P5、P6、P7、P8序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配，與整個檢測體系的其它核酸之間均不存在特異性結(jié)合的序列。本發(fā)明所述P8序列為polyT，優(yōu)選為3-10個T。本實施例中，P8序列為5個堿基的polyT序列，其5’端帶有熒光基團標(biāo)記，熒光基團可以選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，針對不同目標(biāo)核酸的熒光基團互不相同，即所選擇的熒光基團的顏色互不相同或發(fā)射波長互不相同，以便于區(qū)分不同類型的目標(biāo)核酸。實施例2一種檢測卵巢癌相關(guān)miRNA檢測試劑盒本發(fā)明提供了一種卵巢癌相關(guān)miRNA檢測試劑盒，該試劑盒能夠檢測靶標(biāo)hsa-miR-21-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-203a-3p、hsa-miR-205-5p以及hsa-miR-214-3p中的一種或者多種任意組合的表達(dá)水平，在實際檢測中，能根據(jù)具體的需要，使用相應(yīng)的P1～P8序列，組成檢測試劑盒，即可實現(xiàn)檢測。本實施例所述卵巢癌相關(guān)miRNA檢測試劑盒在以下檢測中隨機分成2組進(jìn)行檢測。本實施例檢測試劑盒的組分包括有：捕獲探針、信號放大探針和熒光基團，具體探針組分見表7所示。表7針對具體目標(biāo)基因的檢測試劑盒(表格數(shù)字為SEQIDNO.)實施例3運用實施例2中的試劑盒對樣品進(jìn)行檢測本實施例將使用實施例2的試劑盒，對卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行檢測。卵巢癌細(xì)胞來源為：卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3，本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)細(xì)胞株名稱，即可在現(xiàn)有產(chǎn)品中獲得相關(guān)的細(xì)胞株。所述各種溶液的配方如下：本實施例中的信號放大探針混合液均使用實施例2相應(yīng)列表中的全部探針。一、樣本預(yù)處理，將CTCs過濾至濾膜上1.在樣本保存管中使用保存液保存血液樣本，600×g水平離心5min，棄上清。2.加入4mLPBS和1mL固定劑，渦旋混勻，室溫靜置8min。3.樣本過濾：將樣本保存管中的液體轉(zhuǎn)移至過濾器中，打開真空抽濾泵抽盡液體；在本保存管中加入4mLPBS，洗滌管壁后抽濾液體。4.將濾膜轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入400μL4％甲醛溶液，室溫固定1h。5.去除液體，每孔加入1mLPBS洗滌三次，每次浸泡2min。二、透化處理1.在新的24孔板中每孔加入50μL透化劑，將濾膜從PBS中取出，濾膜片邊緣接觸吸水紙，去除多余的液體，將濾膜倒扣在透化劑上，即濾膜鐵圈刻有編碼的一面向下貼近液體。室溫孵育5min。2.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌兩次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS中至下一步實驗操作。三、消化細(xì)胞，暴露miRNA，使其與探針雜交1.配制相應(yīng)濃度的消化酶工作液：試劑組分每個樣本用量消化酶1.25μLPBS48.75μL總體積50μL2.消化酶工作液渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。室溫靜置1h。4.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS緩沖液中至下一步實驗操作。四、探針雜交，探針特異性序列與目標(biāo)miRNA序列結(jié)合1.捕獲探針混合液、探針緩沖液使用前需40℃水浴預(yù)熱20min。2.配制捕獲探針工作液：試劑組分每個樣本用量捕獲探針混合液8μL探針緩沖液(40℃預(yù)熱)42μL總體積50.0μL渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中捕獲探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。5.去除液體，每孔加入1mlRI洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。五、目標(biāo)mRNA序列信號放大1.探針緩沖液使用前需40℃水浴預(yù)熱20min。2.配制探針工作液：試劑組分每個樣本用量信號放大探針混合液8μL探針緩沖液(40℃預(yù)熱)42μL總體積50.0μL渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。5.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。六、顯色，熒光標(biāo)記目標(biāo)信號1.顯色緩沖液(40℃預(yù)熱)避光渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中顯色緩沖液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。七、熒光顯微鏡觀察CTCs本發(fā)明的對照品使用DAPI作為細(xì)胞核熒光基團，其發(fā)射藍(lán)色熒光信號。1.將濾膜細(xì)胞面朝上置于載玻片上，沿鐵圈內(nèi)環(huán)將濾膜割下，加10μL抗淬滅劑，蓋上18mm×18mm的蓋玻片，直接鏡檢或置于-20℃保存。2.通過20倍物鏡計數(shù)CTC異性核數(shù)量。3.根據(jù)10倍物鏡定位異性核位置，滴油，用油鏡觀察實驗結(jié)果，并拍照記錄結(jié)果。4.然后再根據(jù)10倍物鏡定位下一個異性核位置，滴油，用油鏡觀察實驗結(jié)果并視野拍照記錄結(jié)果。5.重復(fù)操作至拍完所有的異性核，數(shù)量與20倍物鏡計數(shù)結(jié)果一致。顯微鏡使用通道如下：表8熒光基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長八、檢測結(jié)果判斷及分析1.陽性卵巢癌細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)在濾膜上，富集有卵巢癌細(xì)胞，前卵巢細(xì)胞陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)為：具有相應(yīng)靶標(biāo)miRNA特異性標(biāo)識物，在本試劑盒中表現(xiàn)為在相應(yīng)的熒光通道下顯示熒光信號點。2)細(xì)胞核DAPI染色陽性。3)卵巢癌細(xì)胞核形狀不規(guī)則，直徑大于10μm，明顯大于濾膜孔徑，濾膜孔徑為7μm。白細(xì)胞大小與濾膜孔大小相近。2.使用上述檢測方法，對每個樣本進(jìn)行檢測和觀察，其中，針對細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標(biāo)檢測miRNA的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個卵巢癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體結(jié)果為：表9樣本檢測結(jié)果(熒光信號點數(shù))實施例4試劑盒的穩(wěn)定性1、試劑盒穩(wěn)定性檢測本發(fā)明提供一種miRNA檢測的試劑盒，所述的試劑盒針對不同的目標(biāo)檢測miRNA，選取不同數(shù)量的捕獲探針，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實現(xiàn)不同數(shù)量miRNA的并行檢測。本實施例將使用實施例2的探針組Group1組成的試劑盒，對三組不同細(xì)胞株來源的15種樣本(每種細(xì)胞株5個樣本)中的hsa-miR-21-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-200c-3p表達(dá)情況進(jìn)行檢測，從而評估本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性。本實施例使用卵巢癌的3種不同的細(xì)胞株來源的卵巢癌細(xì)胞作為檢測對象，從而驗證其有效性和穩(wěn)定性(可重復(fù)性)，具體細(xì)胞株和樣本如表10所示，本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)細(xì)胞株名稱，即可在現(xiàn)有產(chǎn)品中獲得相關(guān)的細(xì)胞株。實驗步驟參考實施例3。表10細(xì)胞株和檢測樣本樣本號卵巢癌細(xì)胞株實驗組樣本11～樣本15SK-OV-3Group3樣本16～樣本20HO-8910Group4樣本21～樣本25A2780Group53、檢測結(jié)果使用上述試劑盒，對每個樣本進(jìn)行檢測和觀察，其中，針對細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標(biāo)檢測miRNA標(biāo)志物的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個卵巢癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體結(jié)果為：表11樣本檢測結(jié)果(熒光信號點數(shù))從上述檢測結(jié)果可見，一方面，不同細(xì)胞株來源的樣本，其檢測結(jié)果不同，因此，本發(fā)明是能夠?qū)崿F(xiàn)不同miRNA表達(dá)水平檢測的，是有效的；另一方面，相同細(xì)胞株來源的5個樣本，其hsa-miR-21-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-200c-3p等4中miRNA的熒光點數(shù)檢測結(jié)果相近(±3)，具體見Group3(樣本11～15)、Group4(樣本16～20)或Group5(樣本21～25)，因此，本試劑盒重復(fù)性好；由此可見，本發(fā)明試劑盒是有效的，穩(wěn)定性可靠的，其它針對不同miRNA種類的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實施例5靶標(biāo)miRNA數(shù)量選擇1、試劑盒制備的設(shè)計(捕獲探針數(shù)量的選擇)本發(fā)明提供一種靶標(biāo)miRNA檢測的試劑盒，所述的試劑盒針對不同的目標(biāo)檢測miRNA，選取不同數(shù)量的捕獲探針，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實現(xiàn)不同數(shù)量miRNA的并行檢測。本實施例分別針對1種、3種、5種、7種miRNA，選用捕獲探針，信號放大探針選擇一級信號方法探針、二級放大探針以及三級信號放大探針，組成檢測試劑盒，對同一細(xì)胞株 SK-OV-3來源的樣本進(jìn)行檢測，對比其檢測效果，.具體組成如表12，所述探針選自實施例1～2，實驗步驟參考實施例3。表12選擇不同數(shù)量靶標(biāo)miRNA的捕獲探針(表格數(shù)字為SEQIDNO.)2、使用上述試劑盒，對每個樣本進(jìn)行檢測和觀察，其中，針對細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標(biāo)檢測miRNA標(biāo)志物的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個卵巢癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體結(jié)果為：表13樣本檢測結(jié)果(熒光信號點數(shù))通過上述4組實驗對比可知，本試劑盒可以針對不同數(shù)量的靶標(biāo)miRNA進(jìn)行檢測，使用1條、3條和5條、7條的針對不同miRNA捕獲探針均可完成檢測，特異性和穩(wěn)定性都很好。其它針對標(biāo)志基因的使用不同數(shù)量捕獲探針的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實施例6標(biāo)記探針的選擇1、試劑盒制備的設(shè)計(信號放大探針組合的選擇)本發(fā)明提供一種卵巢癌相關(guān)miRNA檢測的試劑盒，所述的試劑盒針對不同的目標(biāo)檢測miRNA，選取不同信號探針組合，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實現(xiàn)miRNA的并行檢測。本實施例將使用實施例1的所提供的各級信號放大探針組成的試劑盒，對同一細(xì)胞株(SK-OV-3)來源的5個樣本中的hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-203a-3p和hsa-miR-214-3p表達(dá)情況進(jìn)行檢測，從而評估本發(fā)明所提供的P2，P3，P4，P5，P6，P7信號放大探針的適用性。具體的試劑盒組成如下：表14不同信號放大探針組合(表格數(shù)字為SEQIDNO.)2、使用上述試劑盒，對每個樣本進(jìn)行檢測(應(yīng)用實施例3所述檢測方法)和觀察，其中，針對細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標(biāo)檢測miRNA標(biāo)志物的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個卵巢癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體結(jié)果為：表15不同信號放大探針組合的檢測結(jié)果通過上述3組實驗對比可知，使用不同信號探針組合組成的試劑盒對miRNA進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果相一致，除了本實施例檢測的miRNA以及其放大探針組合外，本發(fā)明所提供的其他miRNA以及其他信號放大探針的組合，同樣能實現(xiàn)本實施例的檢測效果，具體試驗結(jié)果省略。由此可知，本發(fā)明提供的信號放大探針可以根據(jù)實際操作需要進(jìn)行任意搭配，并且 能實現(xiàn)本發(fā)明所述的miRNA檢測，其檢測結(jié)果一致，說明本發(fā)明所提供的信號放大探針對于卵巢癌相關(guān)miRNA的檢測具有良好的適用性。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3