專利名稱：編碼小麥淀粉合成相關(guān)酶的核酸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼參與植物淀粉合成之小麥酶的核酸分子。所述酶是可溶性的1-型淀粉合酶。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的核酸分子的載體，宿主細胞，植物細胞和植物。
另外，本發(fā)明還描述了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物因?qū)肓吮景l(fā)明的核酸分子而能合成特性有所改變的淀粉。
最近，由于能用作可再生原料的植物成分的重要性日漸增加，生物技術(shù)研究的一個目的致力于改變這些植物原料以適應(yīng)加工業(yè)的需求。另外，為了使可再生的原料能用于盡可能多的領(lǐng)域，必須產(chǎn)生多種多樣的材料。
除了油，脂肪和蛋白質(zhì)外，多糖構(gòu)成了重要的植物可再生原料。除了纖維素外，淀粉(高等植物中最重要的貯存物之一)在多糖中占據(jù)核心位置。從此意義上講，小麥是最重要的作物之一，因為它所提供的淀粉約占歐盟淀粉總產(chǎn)量的20％。
多糖淀粉是化學(xué)均一單位-葡萄糖分子的聚合物。然而，它是不同分子類型高度復(fù)雜的混合物，其不同體現(xiàn)在下列幾個方面，即聚合化程度，葡萄糖鏈分支的出現(xiàn)及其鏈長，另外，它還可以被衍生化，例如磷酸化。因此，淀粉不能構(gòu)成均一的原料。尤其是，直鏈淀粉(實質(zhì)上是由1,4-糖苷鍵連接的葡萄糖分子的未分支的聚合物)與支鏈淀粉有所不同，后者構(gòu)成具有不同分支的葡萄糖鏈的復(fù)雜混合物。因1,6-糖苷鍵的額外出現(xiàn)而產(chǎn)生分支。在小麥中，直鏈淀粉約占所合成淀粉總量的11至37％。
為了以盡可能多的方式將適當?shù)牡矸塾糜诜秶M可能寬的工業(yè)需求，需要提供能合成對多種目的特別適用的經(jīng)修飾淀粉的植物。提供這種植物的一個可能的方法是應(yīng)用植物育種法。然而，由于小麥的特征為多倍體(四-和六倍體)，已證實植物育種很難對淀粉合成施加影響。最近，通過使天然突變體雜交才產(chǎn)生了“蠟質(zhì)”(不含直鏈淀粉的)小麥(Nakamura等，Mol.Gen.Genet.248(1995)，253-259)。
另一種植物育種法是通過重組方法特異性修飾產(chǎn)淀粉植物。然而，該方法的前提條件是鑒定并表征參與淀粉合成和/或淀粉修飾的酶并分離編碼這些酶的核酸分子。
導(dǎo)致淀粉合成的生物化學(xué)途徑實際上是已知的。植物細胞中的淀粉合成在質(zhì)體中進行。在具有光合作用活性的組織中，這些質(zhì)體是葉綠體，在不具有光合作用活性的淀粉貯存組織中，這些質(zhì)體是造粉體。
參與淀粉合成的重要的酶是淀粉合酶和分支酶。已有人描述了多種淀粉合酶同工型，它們都能通過將ADP-葡萄糖上的葡糖基殘基轉(zhuǎn)移至α-1,4-葡聚糖上而催化聚合反應(yīng)。分支酶催化將α-2,6-分支導(dǎo)入線性α-1,4-葡聚糖。
淀粉合酶可分為兩類即與淀粉粒結(jié)合的淀粉合酶(“結(jié)合淀粉粒的淀粉合酶”；GBSS)和可溶性淀粉合酶(“可溶性淀粉合酶”；SSS)。這種區(qū)別方式總是不確定的，因為一些淀粉合酶能同時以與淀粉粒結(jié)合的形式和固體形式存在(Denyer等，植物學(xué)雜志，4(1993),191-198；Mu等，植物學(xué)雜志，6(1994),151-159)。另外還有人依次描述了多種植物的上述兩類淀粉合酶的多種同工型，這些同工型彼此之間的不同之處在于它們對啟動分子的依賴性(所謂的引物依賴型(Ⅱ型)和非引物依賴型(Ⅰ型)淀粉合酶)。
迄今為止，僅測定了同工型GBSSⅠ在淀粉合成過程中的確切功能，其中該酶合成不含直鏈淀粉的(所謂的蠟質(zhì))淀粉的活性大大降低或全面降低(Shure等，細胞35(1983),225-233；Visser等，Mol.Gen-Genet.225(1991),289-296；WO92/11376),由這一結(jié)果可推測得到下列假說，即該酶在直鏈淀粉的合成過程中起著決定性的作用。在綠藻雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的細胞中也觀察到這一現(xiàn)象(Delrue等，細菌學(xué)雜志，174(1992),3612-3620)。另外，在衣藻屬中可以闡明GBSSⅠ不僅參與直鏈淀粉的合成，對支鏈淀粉的合成也起著一定的作用。不具有GBSSⅠ活性的突變體缺乏正常合成的含有較長鏈葡聚糖的特定支鏈淀粉組分。
迄今為止，仍不清楚與淀粉粒結(jié)合的淀粉合酶(尤其是GBSS Ⅱ)和可溶性淀粉合酶的其它同工型的功能。推測可溶性淀粉合酶與分支酶一起參與支鏈淀粉的合成(例見Ponstein等，植物生理學(xué)，29(1990),234-241)，它們在調(diào)節(jié)淀粉合成速率方面起著重要作用。
對小麥而言，已在蛋白質(zhì)水平上鑒定了至少兩個與淀粉粒結(jié)合的淀粉合酶同工型(60kDA和100-105kDA)和另一個可能代表可溶性淀粉合酶的同工型(Denyer等，Planta 196(1995),256-265；Rahman等，澳大利亞植物生理學(xué)雜志，22(1995),793-803)。早先已借助于層析法檢測到幾種SSS同工型的存在(Rijven，植物生理學(xué)，81(1986),448-453)。編碼小麥GBSSⅠ的cDNA已經(jīng)有人描述(Ainsworth等，植物分子生物學(xué)，22(1993),67-82)。
迄今為止，已從WO97/45545中得知編碼小麥淀粉合酶同工型的核酸序列或該核酸的亞序列。但編碼除GBSS Ⅰ外的淀粉合酶的cDNA序列僅在豌豆(Dry等，植物學(xué)雜志，2(1992),193-202)，水稻(Baba等，植物生理學(xué)，103(1993),565-573)和馬鈴薯(Edwards等，植物學(xué)雜志，8(1995),283-294)中得以描述。不僅在小麥中，也在一系列其它的植物種中鑒定了可溶性的淀粉合酶。例如，已從豌豆(Denyer和Smith,Planta 186(1992),609-617)和馬鈴薯(Edwards等，植物學(xué)雜志，8(1995),283-294)中分離到均一的可溶性淀粉合酶。在這些情況下，被鑒定為SSS Ⅲ的可溶性淀粉合酶同工型和與淀粉粒結(jié)合的淀粉合酶GBSS Ⅱ相同(Denyer等，植物學(xué)雜志，4(1993),191-198;Edwards等，植物學(xué)雜志，8(1995),283-294)相同。借助于層析法，還在諸如大麥的其它一些種類的植物中鑒定出多種SSS同工型的存在(Tyynela和Schulman,Physiologica Plantarum 89(1993)835-841；Kreis,Planta 148(1980),412-416)。然而，至今無人描述過編碼這些蛋白質(zhì)的DNA序列。
為了提供另一些能改變?nèi)魏钨A存淀粉的植物，優(yōu)選為谷類植物，尤其是小麥，使得它們能合成經(jīng)修飾淀粉的方法，在每種情況下都必須鑒定出編碼淀粉合酶其它同工型的DNA序列。
因此，本發(fā)明的目的是提供核酸分子，尤其是得自小麥的核酸分子，所述核酸分子編碼參與淀粉生物合成的酶，這樣就可以產(chǎn)生經(jīng)基因修飾的植物，從而產(chǎn)生化學(xué)和/或物理特性有所改變的植物淀粉。
通過提供在專利權(quán)利要求書中所描述的使用形式即可達到此目的。
因此，本發(fā)明涉及核酸分子，其編碼的蛋白質(zhì)具有可溶性小麥淀粉合酶的活性，優(yōu)選所述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)實質(zhì)上含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明特別地涉及含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其部分及其相應(yīng)的核糖核苷酸序列的核酸分子，優(yōu)選核酸分子含有SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)，尤其優(yōu)選核酸分子含有SEQ ID NO1的第9至570位核苷酸。
本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的核酸分子之一可雜交的核酸分子。
本發(fā)明還涉及編碼可溶性小麥淀粉合酶的核酸分子，其序列因遺傳密碼的簡并性而與上述分子的核苷酸序列有所不同。
本發(fā)明還涉及具有與上述序列之一的全部或部分互補之序列的核酸分子。
本發(fā)明上下文中所用術(shù)語“雜交”指的是在常規(guī)雜交條件下，優(yōu)選在嚴緊條件下進行雜交，所述條件描述于例如Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第2版(1989)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約。尤其優(yōu)選在下列條件下進行“雜交”雜交緩沖液2×SSC；10×Denhardt溶液(Ficoll 400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鯡精DNA;50μg/m tRNA；或0.25M磷酸鈉緩沖液pH7.2；1mM EDTA；7％SDS雜交溫度 T=65至70℃洗滌緩沖液0.2×SSC；0.1％SDS洗滌溫度 T=40至75℃原則上，與本發(fā)明的核酸分子可雜交的核酸分子能編碼得自任何表達淀粉合酶之小麥植物的淀粉合酶。
與本發(fā)明的分子可雜交的核酸分子能分離自例如小麥或小麥植物組織的基因組文庫或cDNA文庫，或者也可通過重組方法或化學(xué)合成方法產(chǎn)生。
使用本發(fā)明的分子或其部分或其反向互補序列，通過例如按標準方法(例見Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第2版(1989)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)進行雜交可鑒定和分離這種核酸分子?？梢允褂玫碾s交探針是例如具有與SEQ ID NO1所示相同或基本上相同的核苷酸序列或其部分的核酸分子。用作雜交探針的片斷也可以是借助于常規(guī)合成技術(shù)制備而成的合成片斷，該片斷的序列與本發(fā)明核酸分子的序列基本上一致。
與本發(fā)明的核酸分子可雜交的分子也包括編碼本發(fā)明之小麥淀粉合酶的上述核酸分子的片斷，衍生物和等位基因變體。應(yīng)理解，“片斷”指的是長度足以編碼所述蛋白質(zhì)之一的核酸分子部分。本文所用術(shù)語“衍生物”指的是這些分子的序列與上述核酸分子的序列有一個或多個位置不同，并與這些序列有高水平的同源性?！巴葱浴敝傅氖切蛄型恍灾辽贋?0％，尤其是同一性至少為60％，優(yōu)選同一性大于80％，尤其優(yōu)選大于90％。相對于上述核酸分子而言的差異是通過缺失，取代，插入或重組產(chǎn)生的。
另外，“同源性”也指本發(fā)明的核酸分子或其編碼的蛋白質(zhì)之間存在功能和/或結(jié)構(gòu)等同性。與上述分子同源并構(gòu)成這些分子的衍生物的核酸分子原則上是這些分子的變異，其構(gòu)成表現(xiàn)出相同生物功能的修飾。它們可以是天然變異，例如得自其它生物體的序列，或者也可以是突變，其中突變可以是天然的，也可以通過定點誘變導(dǎo)入。另外，變異可以是合成產(chǎn)生的序列。等位基因變體既可以是天然變體也可以是合成產(chǎn)生的變體或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。
由本發(fā)明的核酸分子的多種變體編碼的蛋白質(zhì)具有某些共同的特征。所述特征包括例如酶活性，分子量，免疫反應(yīng)性，構(gòu)象等，或者物理特性，如在凝膠電泳中的遷移特性，層析特性，沉降系數(shù)，溶解性，光譜特征，帶電特征，穩(wěn)定性；最適pH，最適溫度等。
淀粉合酶的重要特征是ⅰ)它們位于植物細胞質(zhì)體的基質(zhì)中；ⅱ)它們能合成線性α-1,4-連接的葡聚糖。按Deyer和Smith(Plante186(1992),606-617)所述可測定該活性。由本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)是可溶性的小麥Ⅰ型淀粉合酶。這些蛋白質(zhì)具有某些與先前已知的其它植物的可溶性淀粉合酶同源的區(qū)域。
本發(fā)明的核酸分子可以是DNA分子，尤其是cDNA或基因組分子。另外，本發(fā)明的核酸分子可以是RNA分子，它可由例如本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)錄得到。本發(fā)明的核酸分子可以得自例如天然來源，或者可通過重組技術(shù)或合成產(chǎn)生。
本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的核酸分子特異性雜交的寡核苷酸。所述寡核苷酸的長度優(yōu)選至少為10個，尤其是至少為15個，特別優(yōu)選至少為50個核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸能與本發(fā)明的核酸分子特異性雜交，即與編碼其它蛋白質(zhì)，尤其是其它淀粉合酶的核酸序列不雜交或僅有很低程度的雜交。本發(fā)明的寡核苷酸可用作例如PCR反應(yīng)的引物或用作雜交探針以分離相關(guān)基因。同樣，它們可以是反義構(gòu)建體的組分或編碼適當核酶的DNA分子的組分。
本發(fā)明還涉及載體，尤其是質(zhì)粒，粘粒，噬粒，病毒，噬菌體和基因工程常規(guī)使用的其它載體，所述載體含有本發(fā)明的上述核酸分子。所述載體適于轉(zhuǎn)化原核或真核細胞，優(yōu)選轉(zhuǎn)化植物細胞。
如果載體與側(cè)翼調(diào)節(jié)區(qū)適當連接，即能特別適用于將本發(fā)明的核酸分子整合至植物細胞的基因組中。例如，農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移中使用的二元載體。優(yōu)選在有義或反義方向上整合本發(fā)明的核酸分子以確保在轉(zhuǎn)化的原核或真核細胞中合成可翻譯的，或(適當時合成)不可翻譯的RNA。
術(shù)語“載體”一般指的是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當輔助物，它可以將單鏈或雙鏈核酸分子直接轉(zhuǎn)移至宿主細胞，例如DNA或RNA病毒，病毒片斷，當缺乏或存在調(diào)節(jié)元件時適于將核酸轉(zhuǎn)移至細胞中的質(zhì)粒構(gòu)建體，或支持材料，如玻璃纖維或顆粒槍法中所用的金屬顆粒，也可包括通過化學(xué)或物理方法直接導(dǎo)入細胞的核酸分子。
在優(yōu)選的實施方案中，載體中的核酸分子與調(diào)節(jié)元件相連，這樣可確保在原核或真核細胞中轉(zhuǎn)錄和合成可翻譯的RNA，或必要時確保合成不可翻譯的RNA。
在原核細胞，例如大腸桿菌中表達本發(fā)明的核酸分子對于更詳細地鑒定由這些分子編碼的酶的活性至關(guān)重要。尤其是，當植物細胞中缺乏其它參與淀粉合成的酶時，由此可鑒定上述酶的合成產(chǎn)物。從而清楚地了解上述蛋白質(zhì)在植物細胞淀粉合成過程中所發(fā)揮的作用。
另外，可通過常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)(例見Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版(1989)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)，在本發(fā)明的核酸分子中導(dǎo)入多種形式的突變，從而合成生物特性有所改變的蛋白質(zhì)。一方面，可以產(chǎn)生缺失突變體，其中通過連續(xù)缺失編碼DNA序列的5’或3’末端而產(chǎn)生核酸分子，從而合成相應(yīng)的截短蛋白質(zhì)。核苷酸序列5’末端的缺失能夠鑒定出例如何種氨基酸序列負責將酶運送至質(zhì)體(轉(zhuǎn)運肽)。這樣就可以直接產(chǎn)生因除去了上述序列而不再位于質(zhì)體，但位于胞質(zhì)溶膠中的酶，或者產(chǎn)生因添加了其它信號序列而位于其它區(qū)室中的酶。
另一方面，可在改變其氨基酸序列能影響例如酶活性或酶調(diào)節(jié)的位置處導(dǎo)入點突變。通過這種方法，可以產(chǎn)生例如Km值有所改變的突變體，或產(chǎn)生不再受細胞中正常存在的別構(gòu)調(diào)節(jié)或共價修飾之類的調(diào)節(jié)機制影響的突變體。
另外，通過例如使用ADP-葡萄糖-6-磷酸替代ADP-葡萄糖可以產(chǎn)生底物或產(chǎn)物特異性有所改變的本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體。另外，可以產(chǎn)生活性-溫度分布圖有所改變的本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體。
為了對原核細胞進行重組修飾，可將本發(fā)明的核酸分子或其部分導(dǎo)入允許發(fā)生誘變的質(zhì)粒中，或者通過重組DNA序列來改變序列?？蛇M行堿基交換，或借助于標準方法(例見Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第2版(1989)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)添加天然或合成的序列。為了使DNA片斷彼此相連，可在片斷中添加銜接子或接頭。另外，還可進行一些操作以提供適當?shù)南拗菩粤呀馕稽c或消除多余的DNA或限制性裂解位點。在適于插入，缺失或取代之處，可進行體外誘變，引物修復(fù)，限制性切割或連接。通常使用的分析方法是序列分析，限制性分析或生物化學(xué)和分子生物學(xué)的其它方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及被本發(fā)明的上述核酸分子或本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，尤其是原核或真核細胞，并涉及由這些轉(zhuǎn)化細胞衍生得到的，含有本發(fā)明的核酸分子或載體的細胞。優(yōu)選這些細胞是原核或真核細胞，尤其是植物細胞。
本發(fā)明還涉及具有淀粉合酶活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)由本發(fā)明的核酸分子編碼并可通過重組技術(shù)制備，本發(fā)明還涉及所述蛋白質(zhì)的制備方法，所述方法包括在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能合成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的適當條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞，隨后從宿主細胞和/或培養(yǎng)基中分離出該蛋白質(zhì)。
只要提供了本發(fā)明的核酸分子，即可借助于重組方法直接干預(yù)植物的淀粉代謝并使其發(fā)生變化以合成物理化學(xué)特性相對于已知淀粉而言有所變化的經(jīng)修飾淀粉，所述物化特性如下直鏈淀粉/支鏈淀粉的比例，分支的程度，平均鏈長，磷酸含量，膠凝特性，形成凝膠或薄膜的特性，淀粉粒大小和/或淀粉粒形狀。
因此，可以在植物細胞中表達本發(fā)明的核酸分子以增加所述淀粉合酶的活性，或者將本發(fā)明的核酸分子導(dǎo)入本身不表達該酶的細胞中。另外，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法修飾本發(fā)明的核酸分子以得到本發(fā)明的淀粉合酶，該酶經(jīng)修飾后不再受細胞內(nèi)在調(diào)節(jié)機制的控制或具有經(jīng)改變的溫度-活性分布圖或者底物或產(chǎn)物特異性。
當在植物中表達本發(fā)明的核酸分子時，原則上，所合成的蛋白質(zhì)可以位于植物細胞中的任何所需區(qū)室。為了將該蛋白質(zhì)定位于特定的區(qū)室，必須缺失確保定位于質(zhì)體的序列，必要時，必須將其余的編碼區(qū)與確保定位于所需區(qū)室的DNA序列連接。所述定位序列是已知的(例見Braun等，EMBO J.11(1992),3219-3227；Wolter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988),846-850；Sonnewald等，植物學(xué)雜志，1(1991),95-106)。
因此，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生被本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法，其中本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的載體整合至植物細胞，被本發(fā)明的載體或核酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細胞，和由這些轉(zhuǎn)化細胞得到的轉(zhuǎn)基因植物細胞的基因組中。本發(fā)明的細胞含有一個或多個本發(fā)明的核酸分子或載體，它們優(yōu)選與確保在植物細胞中進行轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA元件，尤其是適當?shù)膯幼酉噙B接。這些細胞與天然植物細胞的不同之處特別地體現(xiàn)于下列事實即它們含有這些細胞本身不具有的本發(fā)明的核酸分子，或者所述核酸分子整合于細胞基因組的某個非正常(即所述核酸分子一般不會在此出現(xiàn)的)位置，即位于不同的基因組環(huán)境中。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞與天然植物細胞的不同之處還體現(xiàn)在必要時，除了該細胞中天然出現(xiàn)的核酸分子拷貝外，它們還含有至少一個拷貝穩(wěn)定整合至其基因組中的本發(fā)明的核酸分子。如果導(dǎo)入細胞中的一個或多個核酸分子對已天然存在于細胞中的核酸分子而言是添加的拷貝，那么也可特別地通過下列事實很容易地區(qū)分本發(fā)明的植物細胞和天然的植物細胞，即這一添加的拷貝或這些添加的拷貝位于基因組中它或它們一般不會出現(xiàn)的位置。借助于例如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的Southern印跡分析法，以簡單的方式即可檢查出它們之間的區(qū)別。
如果已導(dǎo)入植物基因組中的核酸分子對植物細胞而言是異源序列，轉(zhuǎn)基因植物細胞產(chǎn)生的本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)錄物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如Northern印跡分析，以簡單的方式進行檢測。
如果導(dǎo)入的本發(fā)明的核酸分子對植物細胞而言為同源序列，可在本發(fā)明核酸分子的額外表達的基礎(chǔ)上區(qū)分本發(fā)明的細胞和天然細胞。優(yōu)選轉(zhuǎn)基因的植物細胞含有更多的本發(fā)明核酸分子轉(zhuǎn)錄物。通過例如Northern印跡分析可以對其進行檢測。在此意義上的“更多”指的是比相應(yīng)的未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞優(yōu)選至少多10％，優(yōu)選至少多20％，尤其優(yōu)選至少多50％轉(zhuǎn)錄物。另外，優(yōu)選細胞表現(xiàn)出相應(yīng)增加或減少的本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性(至少10％，20％或50％)。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)可將轉(zhuǎn)基因的植物細胞再生為完整的植物。
本發(fā)明的另一個主題是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括將一個或多個本發(fā)明的核酸分子或載體整合至植物細胞的基因組中，再由所述植物細胞再生完整的植物。通過再生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞得到的植物也是本發(fā)明的主題。本發(fā)明還涉及含有上述轉(zhuǎn)基因植物細胞的植物。原則上，轉(zhuǎn)基因植物可以是任何一種植物，即不僅是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。優(yōu)選它們是有用的植物，優(yōu)選為合成淀粉或貯存淀粉的植物，尤其優(yōu)選為黑麥，大麥，燕麥，小麥，高粱和小米，西米，玉米，水稻，豌豆，大豌豆(marrowfat peas)，木薯，馬鈴薯，番茄，油菜子，大豆，大麻，亞麻，向日葵，豇豆或竹芋(arrowroot)，尤其優(yōu)選小麥，玉米，水稻和馬鈴薯。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明植物的繁殖材料，例如果實，種子，塊莖，根狀莖，幼苗，插條，愈傷組織，原生質(zhì)體，細胞培養(yǎng)物等。
本發(fā)明還涉及制備經(jīng)修飾淀粉的方法，所述方法包括從上述本發(fā)明的植物和/或該植物的貯存淀粉的部位提取淀粉的步驟。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知從植物或該植物的貯存淀粉的部位，尤其是從小麥中提取淀粉的方法，參見例如Eckhoff等(谷類植物化學(xué)，73(1996)54-57)“淀粉化學(xué)和技術(shù)”(編輯Whistler,BeMiller和Paschall(1994),第2版，Academic Press Inc.London Ltd;ISBN0-12-746270-8；例見第Ⅻ章，p412-468玉米和高粱淀粉生產(chǎn)；Watson；第ⅩⅢ章，p469-479；木薯淀粉，竹芋和西米淀粉生產(chǎn)；Corbishley和Miller；第ⅩⅣ章，p479-490馬鈴薯淀粉生產(chǎn)和用途；Mitch；第ⅩⅤ章，p491-506小麥淀粉生產(chǎn)，修飾和用途；Knight和Oson；和第ⅩⅥ章，p507-528水稻淀粉生產(chǎn)和用途；Rohmer和Klem)。通常，用于從植物原料中提取淀粉的方法所用的裝置為分離器，傾析器，旋液分離器，噴霧干燥器和流化床干燥器。
由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞和植物表達本發(fā)明的核酸分子，因此，能合成物理化學(xué)特性相對于野生型植物合成的淀粉而言有所改變的淀粉，所述物化特性如下直鏈淀粉/支鏈淀粉的比例，分支的程度，平均鏈長，磷酸含量，膠凝特性，淀粉粒大小和/或淀粉粒形狀。尤其是，相對于已知淀粉而言，由這種淀粉制備的凝膠的粘度和/或形成薄膜或凝膠的特性有所改變。
本發(fā)明的另一個主題是可得自本發(fā)明的植物細胞和植物及其繁殖材料的淀粉，和可通過上述本發(fā)明方法得到的淀粉。
另外，使用本發(fā)明的核酸分子還可以產(chǎn)生植物細胞和植物，其中本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性降低。使用上述核酸分子還可以合成化學(xué)和/或物理特性相對于野生型植物細胞產(chǎn)生的淀粉而言有所改變的淀粉。
因此，本發(fā)明的另一個主題是含有本發(fā)明的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞，所述細胞中的淀粉合酶活性比未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞低。
通過例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，使用本發(fā)明的核酸分子經(jīng)表達適當?shù)姆戳xRNA，有義RNA以獲得共抑制作用或通過表達適當構(gòu)建的可特異性裂解編碼淀粉合酶之轉(zhuǎn)錄物的核酶，即可得到淀粉合酶活性降低的植物細胞，參見Jorgensen(Trends Biotechnol,8(1990),340-344),Niebel等(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995),91-103),Flavell等(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995),43-46),Palaqui和Vaucheret(植物分子生物學(xué)，29(1995),149-159),Vaucheret等(Mol.Gen.Genet.248(1995),311-317),de Borne等(Mol.Gen.Genet.243(1994),613-621)。
為了降低本發(fā)明的淀粉合酶的活性，優(yōu)選通過例如表達反義RNA來降低植物細胞中編碼所述淀粉合酶的轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目。
一方面，可以使用包含本發(fā)明之蛋白質(zhì)的全部編碼序列(其中包括任何可能存在的側(cè)翼序列)的DNA分子，或者可使用僅包含部分編碼序列的DNA分子，但這些部分序列必須足夠長以對細胞施加反義作用。通常，使用長度最低為15bp，優(yōu)選長度為100-500bp，尤其是長度大于500bp的序列足以進行反義抑制。原則上，所用的DNA分子小于5000bp，優(yōu)選序列小于2500bp。
還可以使用與本發(fā)明的DNA分子的序列具有高水平的同源性，但又不完全相同的DNA序列。同源性最低應(yīng)大于約65％，優(yōu)選使用同源性為95至100％的序列。
本發(fā)明的另一個主題是產(chǎn)生經(jīng)修飾淀粉的方法，所述方法包括從本發(fā)明的細胞或植物和/或該植物貯存淀粉的部位提取淀粉的步驟。
本發(fā)明的另一個主題是可得自本發(fā)明的細胞或植物及其繁殖材料或其部分的淀粉，以及可通過本發(fā)明的方法得到的淀粉。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可修飾本發(fā)明的淀粉，未經(jīng)修飾或經(jīng)修飾的淀粉形式適于食品或非食品部門的多種用途。
原則上，本發(fā)明的淀粉的可能的用途可分成兩類。一類包括通過酶解或化學(xué)方法得到的淀粉水解液，主要是葡萄糖和葡聚糖單位。它們可用作起始物質(zhì)以進一步進行化學(xué)修飾和加工，例如發(fā)酵。簡化水解方法和對其進行節(jié)約設(shè)計對于降低成本具有顯著意義。目前是使用淀粉葡糖苷酶進行酶解。通過減少酶的用量來節(jié)約成本較為簡單易行。通過改變淀粉的結(jié)構(gòu)，例如增加淀粉粒的表面積，降低限制所用酶接近的分支或立體結(jié)構(gòu)水平而使淀粉更容易被消化可實現(xiàn)上述目的。
本發(fā)明的淀粉因其聚合物結(jié)構(gòu)可用作所謂的天然淀粉的其它用途可再分為兩個應(yīng)用領(lǐng)域1．食品工業(yè)淀粉是多種食品中的傳統(tǒng)添加劑，其功能基本上是結(jié)合含水的添加劑或?qū)е抡扯仍黾踊蚴剐纬赡z的能力增加。其重要的特性是粘彈性，吸著特性，溶脹溫度，膠凝溫度，粘度，增稠能力，淀粉溶解性，透明度和凝膠結(jié)構(gòu)，熱穩(wěn)定性，剪切穩(wěn)定性，酸穩(wěn)定性，經(jīng)受退減的趨勢，成膜能力，凍融穩(wěn)定性，在鹽溶液中的粘稠穩(wěn)定性，消化能力和與例如無機或有機離子形成復(fù)合物的能力。
2．非食品工業(yè)在這一重要領(lǐng)域中，淀粉可用作多種制備方法的助劑或用作工業(yè)產(chǎn)物的添加劑。當將淀粉用作助劑時，尤其應(yīng)提及紙和紙板業(yè)。淀粉主要用于阻滯的目的(留著固體)，用于結(jié)合填充物顆粒和碎屑，用作硬化劑和用于脫水。另外，還利用了淀粉在挺度，硬度，牢固性，觸感，光澤度，平滑度，粘附力和外觀方面的有利特性。
2.1．紙和紙板業(yè)在造紙業(yè)中，必須區(qū)分4個應(yīng)用領(lǐng)域，即表面處理，涂布，紙料和噴淋。表面處理對淀粉的需求實質(zhì)上是高白度，適合的粘度，高粘稠穩(wěn)定性，良好的成膜能力和低的塵埃形成能力。當用于涂布時，固體含量，適當?shù)恼扯龋呓Y(jié)合能力和高色素親和力起著重要作用。當用作紙料添加劑時，重要的是快速，均勻，無損失的分布，高的機械強度和在紙幅中完全留著。如果淀粉被用于噴淋，重要的是適合的固體含量，高粘度和高結(jié)合能力。
2.2．粘合劑工業(yè)淀粉的重要應(yīng)用領(lǐng)域是粘合劑工業(yè)，其潛在的用途被次分為下列4類用作純粹的淀粉糊劑，用于已用特定化合物處理過的淀粉糊劑，將淀粉用作合成樹脂和聚合物分散物的添加劑，和將淀粉用作合成粘合劑的增量劑?；诘矸鄣恼澈蟿┯?0％用于生產(chǎn)瓦楞紙板，生產(chǎn)紙袋，生產(chǎn)紙和鋁的復(fù)合材料，生產(chǎn)盒紙板和信封、郵票上的涂膠粘合劑等。
2.3．紡織業(yè)和織物護理品工業(yè)淀粉用作助劑和添加劑的重要應(yīng)用領(lǐng)域是生產(chǎn)織物和織物護理品。在紡織業(yè)中必須區(qū)分下列4個應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒌矸塾米魃蠞{劑，即平滑和加固除草刺性能以使織物免受紡織過程中所施加張力的影響，和增加織物在紡織過程中的耐磨度的助劑；將淀粉用作織物整理劑(尤其是在使品質(zhì)降低的預(yù)處理，如漂白，染色等之后)；將淀粉用作制備染料糊劑所用的增稠劑以防止?jié)B色；將淀粉用作縫線整經(jīng)劑中的添加劑。
2.4．建筑材料工業(yè)第四個應(yīng)用領(lǐng)域是將淀粉用作建筑材料中的添加劑。例如生產(chǎn)糊墻紙板，其中與石膏漿混合的淀粉與水發(fā)生膠凝作用，擴散至石膏心板的表面，將紙板與心板結(jié)合在一起。其它應(yīng)用領(lǐng)域是抹灰摻加劑和礦物纖維。在即用即混的混凝土中，使用淀粉產(chǎn)物延遲粘結(jié)。
2.5．土壤穩(wěn)定作用淀粉的另一個市場是生產(chǎn)土壤穩(wěn)定劑，當土壤被人為地擾亂時，使用該穩(wěn)定劑可臨時保護土壤顆粒免受水的侵襲。根據(jù)目前的知識看，淀粉和聚合物乳劑的混合產(chǎn)物與以前使用的產(chǎn)品在降低腐蝕和防止結(jié)硬皮的作用上是等價的，但價格較便宜。
2.6．用于作物保護產(chǎn)品和肥料淀粉的一個應(yīng)用領(lǐng)域是用于作物保護產(chǎn)品中改變產(chǎn)品的特定特性，因此，淀粉可用于改善作物保護產(chǎn)品和肥料的濕度，控制活性成分的釋放，將液態(tài)、易揮發(fā)的和/或惡臭的活性成分轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒕畹摹⒎€(wěn)定的、可成形的物質(zhì)，混合不相容的化合物和通過降低分解來延長作用時間。
2.7．醫(yī)藥品和化妝品工業(yè)另一個應(yīng)用領(lǐng)域是醫(yī)藥品和化妝品工業(yè)。在藥品工業(yè)中，淀粉可用作片劑的結(jié)合劑或用于稀釋膠囊中的結(jié)合劑。另外，淀粉可用作片劑崩解劑，因為吞咽后它們可吸收液體并在短時間內(nèi)溶脹到一定程度，使得活性成分被釋放出來。為了保證質(zhì)量，藥用潤滑粉末和治創(chuàng)傷的粉末是基于淀粉制備的。在化妝品工業(yè)中，淀粉可用作例如粉末添加劑(芳香物質(zhì)和水楊酸)的載體。淀粉的相對大的應(yīng)用領(lǐng)域是牙膏。
2.8．在木炭和炭磚中加入淀粉淀粉的一個應(yīng)用領(lǐng)域是用作木炭和炭磚中的添加劑。由于加入了淀粉，大量木炭可以粘結(jié)或成磚，從而防止炭磚過早地崩解。對于燒烤用木炭而言，淀粉的加入量為4至6％，對經(jīng)過熱化處理的木炭而言，淀粉的加入量為0.1至0.5％。另外，淀粉還有一個重要用途是用作結(jié)合劑，因為當在木炭和炭磚中加入淀粉時可顯著降低有害物質(zhì)的發(fā)散。
2.9．礦石和煤漿加工另外，淀粉還可在礦石和煤漿加工業(yè)中用作絮凝劑。
2.10．鑄造助劑另一個應(yīng)用領(lǐng)域是用作鑄造助劑中的添加劑。多個鑄造工序需要用經(jīng)結(jié)合劑處理過的沙子制備型芯。目前廣泛使用的結(jié)合劑是用經(jīng)修飾的淀粉(在大多數(shù)的情況下是可溶脹的淀粉)處理過的膨潤土。
添加淀粉的目的是增加流動性和改善結(jié)合力。另外，可溶脹的淀粉還能滿足生產(chǎn)工藝的其它需求，例如可在冷水中分散，可重新水合，易于與沙子混合并具有高的與水結(jié)合的能力。
2.11．用于橡膠工業(yè)在橡膠工業(yè)中，淀粉可用于改善技術(shù)性能和外觀性能，原因是能改善表面光澤度，改善手感和外觀，為此，可在冷硫化之前將淀粉涂布于橡膠材料發(fā)粘的表面，另外，淀粉還能改善橡膠的可印刷能力。
2.12．生產(chǎn)皮革替代物另外，還可出售經(jīng)修飾的淀粉以生產(chǎn)皮革替代物。
2.13．淀粉用于合成聚合物在聚合物工業(yè)中，可以聯(lián)想到下列應(yīng)用領(lǐng)域在加工步驟中摻入淀粉降解產(chǎn)物(淀粉僅用作填充劑，合成聚合物和淀粉之間沒有直接的連鍵)，或者，在生產(chǎn)聚合物時摻入淀粉降解產(chǎn)物(淀粉和聚合物形成穩(wěn)定的連鍵)。
淀粉用作純粹的填充劑與其它物質(zhì)(例如滑石)相比是沒有競爭力的，但是，當?shù)矸鄣奶匦阅苡绊懀蚨@著改變終產(chǎn)物的特征譜時，情況就大不相同了。例如，將淀粉產(chǎn)物用于加工熱塑塑料，如聚乙烯。此時，使用常規(guī)加工技術(shù)，以1∶1的比例混合淀粉和合成聚合物而得到母煉膠，從中可產(chǎn)生多種產(chǎn)物和粒狀聚乙烯。通過將淀粉摻入聚乙烯薄膜中，可獲得增加的物質(zhì)通透性(對空心體而言)，改善的水蒸汽通透性，改善的防靜電性能，改善的防粘結(jié)性能和改善的墨水書寫能力。
還可在聚氨基甲酸酯泡沫中使用淀粉。通過調(diào)整淀粉衍生物和使加工工藝最優(yōu)化，可以直接控制合成聚合物和淀粉的羥基之間的反應(yīng)。由于使用了淀粉，導(dǎo)致聚氨基甲酸酯薄膜獲得了下列特性譜熱膨脹系數(shù)降低，皺縮性能降低，壓力-張力性能改善，水蒸汽的通透性增加但不會改變對水的攝取，易燃性降低，最終的拉伸強度降低，可燃部分不會形成滴狀物，不含鹵素或者延緩老化。仍然存在的缺點是壓縮強度降低和沖擊強度降低。
目前，產(chǎn)品開發(fā)不再局限于薄膜，也可生產(chǎn)淀粉含量超過50％的固體聚合物產(chǎn)品，例如罐，平板和盤子。另外，淀粉/聚合物的混合物也被認為是有利的，因為它們的生物可降解性更高。
淀粉移植物聚合物已變得非常重要，因為它們與水結(jié)合的能力非常高。它們是根據(jù)自由基鏈機制的原理移植的具有淀粉骨架和合成單體側(cè)鏈的產(chǎn)品。目前使用的淀粉移植物聚合物的獨特之處在于對水的結(jié)合和留著能力較高(1000g水/克淀粉)以及高粘度。最近幾年，這些超級吸附劑的應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴展，例如用于衛(wèi)生領(lǐng)域，如尿布和衛(wèi)生巾，和用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，例如用于種子外被。
一方面，決定新的，經(jīng)基因修飾的淀粉的應(yīng)用是基于其結(jié)構(gòu)，水含量，蛋白質(zhì)含量，脂質(zhì)含量，纖維含量，灰分/磷酸含量，直鏈淀粉/支鏈淀粉的比例，分子量分布，分支程度，顆粒大小和顆粒形狀和結(jié)晶性，另一方面，也基于影響下列特征的特性流動和吸著性能，膠凝溫度，粘度，在鹽溶液中的粘稠穩(wěn)定性，增稠能力，溶解性，凝膠結(jié)構(gòu)和凝膠透明度，熱穩(wěn)定性，剪切穩(wěn)定性，酸穩(wěn)定性，經(jīng)受減退的趨勢，凝膠形成，凍融穩(wěn)定性，復(fù)合物形成，碘結(jié)合，膜形成，粘附力，酶穩(wěn)定性，消化能力和反應(yīng)性。
通過重組方法生產(chǎn)經(jīng)修飾的淀粉一方面可以改變得自植物之淀粉的特性，從而似乎不再需要通過化學(xué)或物理的方法進行其它修飾。另一方面，可對通過重組方法改變的淀粉進行進一步的化學(xué)修飾，以進一步改善上述應(yīng)用領(lǐng)域中的一些性能。原則上，這些化學(xué)修飾是已知的。尤其是，它們是通過熱處理，用有機酸或無機酸處理，氧化和酯化進行修飾，導(dǎo)致例如形成磷酸淀粉，硝酸淀粉，硫酸淀粉，黃原酸淀粉，醋酸淀粉和檸檬酸淀粉。另外，也可在強酸存在下使用單-或多羥基醇以生產(chǎn)淀粉醚，導(dǎo)致形成淀粉烷基醚，O-烯丙基醚，羥基烷基醚，O-羧甲基醚，含N淀粉醚，含P淀粉醚，含S淀粉醚，交聯(lián)淀粉或淀粉移植物聚合物。
本發(fā)明之淀粉的優(yōu)選用途一方面是生產(chǎn)包裝材料和一次性使用的物品，另一方面是用作食品或食品前體。
為了在植物細胞中在有義或反義方向上表達本發(fā)明的核酸分子，可將它們與確保在植物細胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA元件連接。所述調(diào)節(jié)元件特別地包括啟動子，增強子和終止子。通常，在植物細胞中具有活性的任何啟動子都適于表達。
可選擇啟動子，以使表達為組成型或使表達僅在特定組織，植物發(fā)育的特定時間點或由外部因子決定的時間點發(fā)生。對植物而言，啟動子可以是同源或異源的。適當啟動子的例子為組成型表達的花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子和玉米遍在蛋白啟動子，在塊莖中特異性表達的patatin啟動子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989),23-29)，或確保僅在具有光合活性的組織中表達的啟動子，如ST-LS1啟動子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987),7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989),2445-2451)，或者在胚乳中特異性表達的啟動子，小麥HMG啟動子，USP啟動子，云扁豆蛋白啟動子或玉米醇溶蛋白基因啟動子。
也可存在終止序列，它們可用于正確終止轉(zhuǎn)錄并為轉(zhuǎn)錄物添加poly-A尾，據(jù)認為這樣可起到穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物的作用。文獻中已描述過該元件(參見EMBO J.8(1989),23-29)，必要時可以交換。
本發(fā)明提供了編碼具有可溶性小麥淀粉合酶功能之蛋白質(zhì)的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可以產(chǎn)生功能體現(xiàn)于淀粉生物合成的酶，產(chǎn)生通過重組技術(shù)改變過的植物，其中該酶的活性已經(jīng)改變，因此所合成的淀粉的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性也有所改變。
原則上，本發(fā)明的核酸分子也可用于產(chǎn)生另一種植物，其中本發(fā)明之淀粉合酶的活性增加或降低，而同時，參與淀粉合成的其它酶的活性也有所改變。改變植物中的淀粉合酶活性導(dǎo)致合成結(jié)構(gòu)有所改變的淀粉。另外，可將編碼淀粉合酶的核酸分子或適當?shù)姆戳x構(gòu)建體導(dǎo)入植物細胞，所述植物細胞中內(nèi)源性GBSSⅠ，SSS或GBSSⅡ蛋白已因反義作用或突變而被抑制，或者分支酶的合成已被抑制(例見WO92/14827或Shannon和Garwood,1984,Whistler,BeMiller和Paschall，淀粉化學(xué)和技術(shù)，Academic Press,London，第2版25-86)。
如果想抑制經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中參與淀粉生物合成的幾個酶的合成，轉(zhuǎn)化可包括在反義方向上同時含有幾個所述酶的編碼區(qū)的DNA分子，所述DNA分子處于適當啟動子的控制之下?；蛘吒鱾€序列也可以受其自身啟動子的控制，或者由聯(lián)合啟動子將序列轉(zhuǎn)錄成融合體，或者使序列處于聯(lián)合啟動子的控制之下。一般優(yōu)選最后一種方式，因為此時所述蛋白質(zhì)的合成被抑制在大致相同的水平上。至于該構(gòu)建體中所用各個編碼區(qū)的長度，上文中提及的產(chǎn)生反義構(gòu)建體所用的序列長度在此也適用。原則上，對該DNA分子中由一個啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的反義片斷的數(shù)目沒有上限，但是，所形成的轉(zhuǎn)錄物的長度優(yōu)選不超過10kb，優(yōu)選其長度不超過5kb。
在反義方向上，與其它編碼區(qū)一起位于該DNA分子中的適當啟動子之后的編碼區(qū)可以得自編碼下列蛋白質(zhì)的DNA序列與淀粉粒結(jié)合的淀粉合酶(GBSSⅠ和Ⅱ)和可溶性的淀粉合酶(SSSⅠ和Ⅱ)，分支酶(異淀粉酶，支鏈淀粉酶，R-酶，分支酶，脫支酶)，淀粉磷酸化酶和歧化酶。上面列舉的僅是一些例子。也可聯(lián)合使用其它DNA序列。
在被上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細胞中，所述構(gòu)建體可以合成多種同時被抑制的酶。
另外，可將構(gòu)建體導(dǎo)入一個或多個淀粉生物合成基因缺損的植物突變體(Shannon和Garwood,1984,Whistler,BeMiller和Paschall，淀粉化學(xué)和技術(shù)，Academic Press,London，第2版25-86)。這些缺損可涉及下列蛋白質(zhì)與淀粉粒結(jié)合的淀粉合酶(GBSSⅠ和Ⅱ)和可溶性的淀粉合酶(SSSⅠ和Ⅱ)，分支酶(BEⅠ和Ⅱ)，脫支酶(R-酶)，歧化酶和淀粉磷酸化酶。上面列舉的僅是一些例子。
在被上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細胞中，該方法還可以合成多種同時被抑制的酶。
為了將外源基因?qū)敫叩戎参镏?，可以使用多種含有大腸桿菌復(fù)制信號和標記基因的克隆載體，所述標記基因可用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細菌細胞。這種載體的例子有pBR322,pUC系列，M13mp系列，pACYC184等?？蓪⑺栊蛄袑?dǎo)入載體的適當限制性裂解位點。使用所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞。在適當培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞，隨后收集細胞并裂解之?；厥召|(zhì)粒，一般用于鑒定所得質(zhì)粒DNA的分析方法是限制性分析，凝膠電泳和其它生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法。每次操作之后，裂解質(zhì)粒DNA，將所得DNA片斷與其它DNA序列連接。將各個質(zhì)粒DNA序列克隆至相同或不同的質(zhì)粒中。
可使用多種技術(shù)將DNA導(dǎo)入植物宿主細胞。這些技術(shù)包括使用根瘤農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌為轉(zhuǎn)化劑，用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細胞，原生質(zhì)體融合，注射，電穿孔DNA，利用biolistic法導(dǎo)入DNA和其它方法。
將DNA注射和電穿孔至植物細胞中對所用質(zhì)粒沒有特別的需求?？墒褂弥T如pUC衍生物的簡單質(zhì)粒。然而，如果由按此方法轉(zhuǎn)化的細胞再生完整的植物，那么就需要存在選擇標記基因。
根據(jù)將所需基因?qū)胫参锛毎姆椒?，還需要其它DNA序列。例如，如果使用，Ti或Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞，至少必須將Ti和Ri質(zhì)粒T-DNA的右邊界序列，但常常需要將右和左邊界序列與需導(dǎo)入的基因連接作為側(cè)翼區(qū)域。
如果使用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化，必須將欲導(dǎo)入的DNA克隆至特定的質(zhì)粒中，或者導(dǎo)入中間載體或者導(dǎo)入二元載體。由于中間載體的序列與T-DNA中的序列同源，因此中間載體可通過同源重組整合至農(nóng)桿菌Ti或Ri質(zhì)粒中。所述質(zhì)粒也含有T-DNA轉(zhuǎn)移所需的vir區(qū)域。中間載體不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制。利用輔助質(zhì)粒(接合)可將中間載體轉(zhuǎn)移至根瘤農(nóng)桿菌中。二元載體能在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復(fù)制。它們含有選擇標記基因和接頭或多接頭，并位于右和左T-DNA邊界區(qū)之間?？芍苯訉⑵滢D(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中(Holster等，Mol.Gen.Genet.163(1978),181-187)。用作宿主細胞的農(nóng)桿菌應(yīng)該含有攜有vir區(qū)域的質(zhì)粒。vir區(qū)域是將T-DNA轉(zhuǎn)移至植物細胞所需的。也可存在其它T-DNA?？墒褂萌绱宿D(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞。
已深入研究了使用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，其詳細描述于EP120516；Hoekema，二元植物載體系統(tǒng)Offsetdrukkerij Kanters B.V.,Alblasserdam(1985)，第Ⅴ章；Fraley等，Crit.Rev.Plant.Sci.,4,1-46和An等，EMBO J.4(1985),277-287。
為了將DNA轉(zhuǎn)移至植物細胞中，可便利地將植物外植體與根瘤農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。然后，在特別地含有某些糖，氨基酸，抗生素或抗微生物劑(用于選擇轉(zhuǎn)化細胞)的適當培養(yǎng)基中，由被感染的植物材料(例如葉片區(qū)，莖區(qū)，根，原生質(zhì)體或在懸浮培養(yǎng)物中生長的植物細胞)再生完整的植物。然后檢查所得植物中是否存在已導(dǎo)入的DNA。使用biolistic法或通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入外源DNA的其它方法是已知的(例見Willmitzer,L.,1993轉(zhuǎn)基因植物，生物技術(shù)，大量綜合性論文(H.J.Rehm,G.Reed,A.Puhler,P.Stadler編)，Vol.2,627-659,VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge)。
盡管借助于根瘤農(nóng)桿菌，經(jīng)由Ti-質(zhì)粒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化雙子葉植物的方法已經(jīng)完善地建立，但近期的工作表明利用基于農(nóng)桿菌的載體實際上甚至能夠轉(zhuǎn)化單子葉植物(Chan等.，植物分子生物學(xué)，22(1993),491-506；Hiei等，植物學(xué)雜志，6(1994),271-282)。
另一種轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是利用biolistic法進行轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，或經(jīng)物理或化學(xué)誘導(dǎo)將DNA攝入原生質(zhì)體，例如通過電穿孔部分透化的細胞，利用玻璃纖維轉(zhuǎn)移DNA，將DNA大量注射至花序中，將DNA微量注射至小孢子或原胚，通過萌發(fā)的花粉攝取DNA和通過溶脹將DNA攝入胚中(參見Potrykus，植物生理學(xué)(1990),269-273)。
過去，已在多種谷類植物中建立了上述的三種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對組織進行電穿孔，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和通過顆粒轟擊將DNA轉(zhuǎn)移至可再生的組織和細胞(參見Jahne等.，Euphytica 85(1995),35-44)。
轉(zhuǎn)化小麥的不同方法描述于文獻中(參見Maheshwari等.，Critical Reviews in Plant Science 14(2)(1995),149-178)Hess等(植物科學(xué)，72(1990),233)利用大量注射法使花粉和農(nóng)桿菌直接靠近。通過Southern印跡分析和NPTⅡ試驗檢測含有nptⅡ基因作為選擇標記的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化子顯示出正常的表型，并且是可育的。在連續(xù)2代中檢測卡那霉素抗性。
第一個用與微粒結(jié)合的DNA轟擊之后再生的轉(zhuǎn)基因可育小麥植物是由Vasil等(Bio/Technology 10(1992),667-674)描述的。轟擊的靶組織是胚發(fā)生的愈傷組織培養(yǎng)物(C型愈傷組織)。所用選擇標記是編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶因而可介導(dǎo)對除草劑膦絲菌素之抗性的bar基因。Weeks等(植物生理學(xué)，102(1993),1077-1084)和Becker等(植物學(xué)雜志，5(2)(1994),299-307)描述了另一個系統(tǒng)。其中，DNA轉(zhuǎn)化的靶組織是不成熟胚的盾片，在體外初級階段對其進行刺激可誘導(dǎo)體細胞胚。Becker等(文獻同上)所研制系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化效率是“Florida”品種的每83個胚產(chǎn)生1株轉(zhuǎn)基因植物，顯著高于Weeks等建立的系統(tǒng)，后者的轉(zhuǎn)化效率是“Bohwhite”品種的每1000個胚產(chǎn)生1至2株轉(zhuǎn)基因植物。
Becker等(文獻同上)所研制的系統(tǒng)形成了實施例所述轉(zhuǎn)化實驗的基礎(chǔ)。
一旦導(dǎo)入的DNA整合至植物細胞的基因組，它原則上能保持穩(wěn)定，并且在最初的轉(zhuǎn)化細胞的后代中也能維持。它一般含有上述選擇標記之一，以賦予轉(zhuǎn)化的植物細胞以除草劑(如膦絲菌素)抗性或抗生素(卡那霉素，G418，博來霉素或潮霉素)抗性，或者可經(jīng)由某些糖或氨基酸的存在或缺乏進行選擇。因此，選定的每個標記都可以選擇有DNA導(dǎo)入的轉(zhuǎn)化細胞。
在植物中，轉(zhuǎn)化細胞按常規(guī)方式生長(例見McCormick等，植物細胞報道5(1986),81-84)。所得植物可正常生長并與具有相同的轉(zhuǎn)化種質(zhì)或其它種質(zhì)的植物雜交。所得雜種個體具有相應(yīng)的表型特性，種子可得自植物細胞。應(yīng)培養(yǎng)兩代或更多代以確保表型特征能穩(wěn)定維持和遺傳。另外，應(yīng)收獲種子以確保保留所需表型或其它特性。
下列實施例是想闡明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行任何意義上的限制。1．克隆方法載體pBluescript Ⅱ SK(Stratagene)被用于克隆至大腸桿菌。2．細菌菌株Bluescript載體和反義構(gòu)建體使用大腸桿菌菌株DH5α(BethesdaResearch Laboratories,Gaithersburg,USA)。體內(nèi)切除使用的是大腸桿菌菌株XLl-Blue。3．轉(zhuǎn)化不成熟的小麥胚培養(yǎng)基MS100ml/l macrosalt(D.Becker和H.Lorz，植物組織培養(yǎng)手冊(1996),B 121-20)1ml/l microsalt2ml/l Fe/NaEDTA30g/l蔗糖#30MS+2,4-D(2mg/l)#31MS+2,4-D(2mg/l)+膦絲菌素(除草劑BASTA的PPT活性成分(2mg/l))#32MS+2,4-D(0.1mg/l)+PPT(2mg/l)#39MS+2,4-D(2mg/l)+各為0.5N的甘露糖醇/山梨糖醇使用KOH將上述各培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH5.6，并使用0.3％Gelrite固化。
Becker和Lorz(D.Becker和H.Lorz，植物組織培養(yǎng)手冊(1996)，B121-20)開發(fā)并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化不成熟的小麥胚的方法。
在下述實驗中，遵循Becker和Lorz(文獻同上)所開發(fā)的方法。
為了進行轉(zhuǎn)化，收集開花后發(fā)育12至14天的具有穎果的復(fù)穗狀花序并進行表面滅菌。將分離的盾片鋪于誘導(dǎo)培養(yǎng)基#30上，使胚軸朝向培養(yǎng)基。
預(yù)培養(yǎng)2至4天(26℃，黑暗中)之后，將外植體轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基#39中進行滲透預(yù)培養(yǎng)(2至4小時，26℃，黑暗中)。
為了進行biolistic轉(zhuǎn)化，每次轟擊使用約29微克其上預(yù)先沉淀了幾微克靶DNA的金粒。由于進行的實驗是共轉(zhuǎn)化，每批沉淀中加入的靶DNA由比例為1∶1的靶基因和抗性標記基因(bar基因)組成。4．對DNA片斷進行DIG標記經(jīng)由特異性PCR摻入經(jīng)DIG-標記的dUTP(Boehringer Mannheim，德國)以標記用作篩選探針的DNA片斷。實施例中所用的介質(zhì)溶液20×SSC175.3g NaCl88.2g檸檬酸鈉加雙蒸水至1000ml10N NaOH至pH7.0根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定，將質(zhì)粒pTaSS1 8/1保藏于DSMZ(Braunschweig，聯(lián)邦德國)，保藏號為DSM 12794。實施例1鑒定，分離和表征編碼可溶性小麥淀粉合酶(SSⅡ)(Triticum aestivum L.,cv Florida)的cDNA
為了鑒定編碼可溶性小麥淀粉合酶(SSⅠ)同工型的完整的cDNA，遵循了異源篩選策略。為此，用適當?shù)墓押塑账岷Y選小麥cDNA文庫?？砂聪率?，使用5’RACE法(快速擴增cDNA末端)分離篩選所用的SSⅠ特異性寡核苷酸。
根據(jù)廠商說明(λZAPⅡ-cDNA合成試劑盒，Stratagene GmbH,Heidelberg，德國)，由位于λZAPⅡ載體中的約20天齡穎果(胚乳)的poly(A)+RNA合成小麥cDNA文庫。測定cDNA文庫的滴度之后，得出初始滴度為1.26 ×106pfu/ml。
用得自小麥的SSⅠ探針篩選cDNA文庫，使用5’-RACE分離DNA片斷，用Boehringer(Mannheim，德國)提供的5’RACE試劑盒(下文稱之為試劑盒)擴增5’末端。根據(jù)廠商說明進行所有步驟。除非另有說明，僅使用試劑盒中的試劑和酶。
首先，將約20天齡穎果的poly(A)+RNA轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA并用于加尾反應(yīng)。在第一個反應(yīng)中，根據(jù)改良的方法，按下述用引物寡(dT)#8(試劑盒)和B2F5擴增用寡(dA)錨#9(試劑盒)在5’區(qū)域提供的cDNA在50μl一批的反應(yīng)中，使用5μl加尾cDNA,5μl 10×反應(yīng)緩沖液(Life Technologies),0.25μM B2F5引物，0.75μM寡(dT)#8,0.2mM dNTP和5U Taq聚合酶(重組的，Life Technologies)。PCR方案是94℃3分鐘/94℃45秒/56℃1分鐘/72℃1分鐘30秒，29個循環(huán)/72℃ 5分鐘。
隨后，用引物寡(dT)#8(試劑盒)，B2F5和位于5’的引物B2F6進行另一個PCR反應(yīng)。在50μl一批的反應(yīng)中，使用1μl PCR產(chǎn)物，5μl10×反應(yīng)緩沖液(Life Technologies),0.25μM B2F5引物，0.25μMB2F6引物，0.75μM寡(dT)#8,0.2mM dNTP和5U Taq聚合酶(重組的，Life Technologies)。PCR方案是94℃3分鐘/94℃45秒/60℃ 1分鐘/72℃1分鐘30秒,29個循環(huán)/72℃5分鐘。B2F5 5’CCTCCCAATTCAAGGATTAGTG 3’ (Seq ID No.3)B2F6 5’CCTCGCATGCAGCATAGCAA 3’ (Seq ID No.4)
在瓊脂糖凝膠中分離通過上述方法得到的PCR產(chǎn)物，分離大于800bp的DNA片斷。使用由Stratagene(Heidelberg)提供的pCR-Script SK(+)克隆試劑盒克隆PCR片斷。對克隆的亞片斷進行序列分析鑒定出約150bp迄今未知的SSⅠ克隆序列。
從該新序列的5’區(qū)域選擇寡核苷酸B2R00和B2F6.2以擴增DNA片斷(SSⅠ探針)，隨后，用地高辛配基-11-dUTP標記該片斷并用作探針以篩選小麥cDNA文庫。根據(jù)“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)使用者指南(Boehringer Mannheim)”中的說明，通過用引物B2R00和B2F6.2進行PCR反應(yīng)以標記SSⅠ探針。B2R005’TGTGGCTGCAAGTGAGGAGG 3’ (Seq ID No.5)B2F6.2 5’CCAGTCACAAACACGTAGCTACG 3′ (Seq ID No.6)為了篩選小麥cDNA文庫，平鋪了700000個噬菌體。將噬菌體鋪于平板上，根據(jù)標準方法對平板進行印跡。于65℃,在5×SSC,3％Blocking(Boehringer Mannheim),0.2％十二烷基硫酸鈉(SDS),0.1％十二烷基肌氨酸鈉和50μg/ml鯡精DNA中對濾膜進行預(yù)雜交和雜交，在雜交溶液中加入1.3ng/ml經(jīng)DIG-標記的SSⅠ探針，將雜交溶液保溫過夜。于65℃，按“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)使用者指南(BoehringerMannheim)”中所述的方法洗滌濾膜。通過另外2次篩選循環(huán)挑選出單個陽性克隆。經(jīng)由體內(nèi)切除得到的單個克隆為pBluescript SK噬粒(方法遵照廠商說明；Stratagene,Heidelberg)。
經(jīng)由微量制備法分析克隆之后和限制性消化質(zhì)粒DNA之后，進一步分析克隆TaSS Ⅰ 8/1。實施例2對質(zhì)粒pTaSS Ⅰ 8/1的cDNA插入物進行的序列分析由克隆pTaSS Ⅰ 8/1分離質(zhì)粒DNA，利用雙脫氧核苷酸法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977),5463-5467)測定cDNA插入物的序列?？寺aSS Ⅰ 8/1中插入物的長度為2805 bp,構(gòu)成了完整的cDNA。核苷酸序列示于SEQ ID NO1。相應(yīng)的氨基酸序列示于SEQ ID NO2。與已知序列的比較揭示出SEQ ID N01所示的序列是新的并含有完整的編碼區(qū)。實施例3產(chǎn)生植物轉(zhuǎn)化載體pTa-γ-SSⅠ-8/1為了表達實施例1中分離的cDNA,以pUC19為基礎(chǔ)質(zhì)粒構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體pTa-γ-SSⅠ-8/1。為了構(gòu)建載體，在有義方向上將質(zhì)粒TaSSI8/1的完整cDNA插入物與遍在蛋白啟動子的3’末端連接。該啟動子由玉米遍在蛋白1基因(Christensen A.H等，植物分子生物學(xué)，18(1992),675-689)的第一個未翻譯的外顯子和第一個內(nèi)含子組成。多接頭和NOS終止子部分得自質(zhì)粒pACT1.cas(CAMBIA,TG0063;Cambia,GPO Box 3200,Canberra ACT 2601，澳大利亞)。McElroy等(分子育種1(1995),27-37)描述了具有該終止子的載體構(gòu)建體和基于pACT1.cas的構(gòu)建體，所得載體被稱為pUbi.cas。
通過用限制性酶XbaⅠ和SspⅠ限制性消化得自克隆TaSS Ⅰ 8/1的片斷來克隆表達載體。利用Klenow反應(yīng)補平片斷末端，隨后，將片斷連接至表達載體pUbi.cas的SmaⅠ克隆位點。所得表達載體被稱為pTA-γ-SSⅠ8.1。在第二個構(gòu)建體中，通過用外切核酸酶處理首次除去了克隆TaSSⅠ-8.1的5’-非翻譯前導(dǎo)序列。然后將其克隆至表達載體pUbi.cas。該構(gòu)建體被稱為Ta-γ-SSⅠ8/1-2。
隨后，用載體pTa-γ-SSⅠ-8/1和pTa-γ-SSⅠ-8/1-2轉(zhuǎn)化小麥。
序列表<110> Hoechst Schering AgrEvo GmbH<120> Nucleic acid molecules encoding wheat enzymes<150> DE 198 20607.0<151> 1998-05-08<160> 6<210> 1<211> 2771<212> DNA<213> Triticum aestivum<220><221> CDS<222> (280) … (2547)<400> 1CGCCAC TCCACTCGCC TTGCCCCACT 26CCCACTCTTC TCTCCCCGCG CACACCGAGT CGGCACCGGC TCATCACCCA TCACCTCGGC 86CTCGGCCACC GGCAAACCCC CCGATCCGCT TTTGCAGGCA GCGCACTAAA ACCCCGGGGA 146GCGCGCCCCG CGGCAGCAGC AGCACCGCAG TGGGAGAGAG AGGCTTCGCC CCGGCCCGCA 206CCGAGCGGGG CGATCCACCG TCCGTGCGTC CGCACMCCT CCGCCTCCTC CCCTGTCCCG 366CGCGCCCACA CCC ATG GCG GCG ACG GGC GTC GGC GCC GGG TGC CTC GCC 315Met Ala Ala Thr Gly Val Gly Ala Gly Cys Leu Ala1 5 10CCC AGC GTC CGC CTG CGC GCC GAT CCG GCG ACG GCG GCC CGG GCG TCC363Pro Ser Val Arg Leu Arg Ala Asp Pro Ala Thr Ala Ala Arg Ala Ser15 20 25GCC TGC GTC GTC CGC GCG CGG CrC CGG CGC TTG GCG CGG GGC CGC TAC 411Ala Cys Val Val Arg Ala Arg Leu Arg Arg Leu Ala Arg Gly Arg Tyr30 35 40GTC GCC GAG CTC AGC AGG GGC CCC GCG GCG CGC CCC GCG CAG CAG459Val Ala Glu Leu 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Gly Gln Gly Leu Asn Glu Leu Leu385 390 395AGC TCC CGA AAA AGT GTA TTG AAT GGA ATT GTA AAT GGA ATT GAC ATT 1515Ser Ser Arg Lys Ser Val Leu Asn Gly Ile Val Asn Gly Ile Asn Ile400 405 410AAT GAT TGG AAC CCC ACC ACA GAC AAG TGT CTC CCT CAT CAT TAT TCT 1563Asn Asp Trp Asn Pro Thr Thr Asp Lys Cys Leu Pro His His Tyr Ser415 420 425GTC GAT GAC CTC TCT GGA AAG GCC AAA TGT AAA GCT GAA TTG CAG AAG 1611Val Asp Asp Leu Ser Gly Lys Ala Lys Cys Lys Ala Glu Leu Gln Lys430 435 440GAG TTG GGT TTA CCT GTA AGG GAG GAT GTT CCT CTG ATT GGC TTT ATT 1659Glu Leu Gly Leu Pro Val Arg Glu Asp Val Pro Leu Ile Gly Phe Ile445 450 455 460GGA AGA CTG GAT TAC CAG AAA GGC ATT GAT CTC ATT AAA ATG GCC ATT 1707Gly Arg Leu Asp Tyr Gln Lys Gly Ile Asp Leu Ile Lys Met Ala Ile465 470 475CCA GAG CTC ATG AGG GAG GAC GTG CAA TTT GTC ATG CTT GGA TCT GGG 1755Pro Glu Leu Met Arg Glu Asp Val Gln Phe Val Met Leu Gly Ser Gly480 485 490GAT CCA ATT TTT GAA GGC TGG ATG AGA TCT ACC GAG TCG AGT TAC AAG 1803Asp Pro Ile Phe Glu Gly Trp Met Arg Ser Thr Glu Ser Ser Tyr Lys495 500 505GAT AAA TTC CGT GGA TGG GTT GGA TTT AGT GTT CCA GTT TCC CAC AGA 1851Asp Lys Phe Arg Gly Trp Val Gly Phe Ser Val Pro Val Ser His Arg510 515 520ATA ACT GCA GGT TGC GAT ATA TTG TTA ATG CCA TCG AGA TTT GAA CCT 1899Ile Thr Ala Gly Cys Asp Ile Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro525 530 535 540TGC GGT CTT AAT CAG CTA TAT GCT ATG CAA TAT GGT ACA GTT CCT GTA 1947Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met Gln Tyr Gly Thr Val Pro Val545 550 555GTT CAT GGA ACT GGG GGC CTC CGA GAC ACA GTC GAG ACC TTC AAC CCT 1995Val His Gly Thr Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Glu Thr Phe Asn Pro560 565 570TTT GGT GCA AAA GGA GAG GAG GGT ACA GGG TGG GCG TTC TCA CCG CrA2043Phe Gly Ala Lys Gly Glu Glu Gly Thr Gly TrP Ala Phe Ser Pro Leu575 580 585ACC GTG GAC AAG ATG TTG TGG GCA TTG CGA ACC GCG ATG TCG ACA TTC2091Thr Val Asp Lys Met Leu Trp Ala Leu Arg Thr Ala Met Ser Thr Phe590 595 600AGG GAG CAC AAG CCG TCC TGG GAG GGG CTC ATG AAG CGA GGC ATG ACG2139Arg Glu His Lys Pro Ser Trp Glu Gly Leu Met Lys Arg Gly Met Thr605 610 615 620AAA GAC CAT ACG TGG GAC CAT GCC CCG AGC AGT ACG AGC AGA TCT TCG2187Lys Asp His Thr Trp Asp His Ala Pro Ser Ser Thr Ser Arg Ser Ser625 630 635AGT GGG CCT TCG TGG ACC AAC CCT ACG TCA TGT AGA CGG GGA CTG GGG2235Ser Gly Pro Ser Trp Thr Asn Pro Thr Ser Cys Arg Arg Gly Leu Gly640 645 650AGG TCC AAG TGC GAG TCT CCT TCA GCT CTG AAG ACA TCC TCT TCA TCC2283Arg Ser Lys Cys Glu Ser Pro Ser Ala Leu Lys Thr Ser Ser Ser Ser655 660 665TTC CGC GGC CCG GAA GGA TAC CCC TGT ACA TTG CGT TGT CCT GCT ACA2331Phe Arg Gly Pro Glu Gly Tyr Pro Cys Thr Leu Arg Cys Pro Ala Thr670 675 680GTA GAG TCG CAA TGC GCC TGC TTG CTT TGG TTC GCC GGT TCG AGA ACA 2379Val Glu Ser Gln Cys Ala Cys Leu Leu Trp Phe Ala Gly Ser Arg Thr685 690 695 700TAT GAC GGC TGT GCT GCT GCG GCG GTG ACA GCT TCG GGT GGA CGA CAG 2427Tyr Asp Gly Cys Ala Ala Ala Ala Val Thr Ala Set Gly Gly Arg Gln705 710 715TTA CAF TTT TGG GGA ATA AGG AAG GGA TGT GCT GCA GGA TGG TTA ACA 2475Leu Gln Phe Trp Gly Ile Arg Lys Gly Cys Ala Ala Gly Trp Leu Thr720 725 730GCA AAG CAC CAC TCA GAT GGC AGC CTC TCT GTC CGT GTT ACA GCT GAA 2525Ala Lys His His Ser Asp Gly Ser Leu Ser Val Arg Val Thr Ala Glu735 740 745ATC AGA AAC CAA CTG GTG ACT CTT TAGCCTTAGT GATTGTGAAG TTTGTTGCCT 2577Ile Arg Asn Gln Leu Val Thr Leu750 755TCTGTGTATG TTGTCTTGTC CTTAGCTGAC AAATATTTGA CCTGTTGGAG AAATTAATCT 2637TTGCTGCTGT TATAATTTAA TCAAAAGAGG GGGTTTCCTC CGATTTCATT AAAAAAAAAA 2697AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2757AAAAAAAAAA AAAA 2771<210> 2<211> 756<212> PRT<213 Triticum aestivum<400> 2Met Ala Ala Thr Gly Val Gly Ala Gly Cys Leu Ala Pro Ser Val Arg1 5 10 15Leu Arg Ala Asp Pro Ala Thr Ala Ala Arg Ala Ser Ala Cys Val Val20 25 30Arg Ala Arg Leu Arg Arg Leu Ala Arg Gly Arg Tyr Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Arg Glu Gly Pro Ala Ala Arg pro Ala Gln Gln Gln Gln Leu Ala50 55 60Pro Pro Leu Val Pro Gly Phe Leu Ala Pro Pro Pro Pro Ala pro Ala65 70 75 80Gln Ser Pro Ala Pro Thr Gln Pro Pro Leu Pro Asp Ala Gly Val Gly85 90 95Glu Leu Ala Pro Asp Leu leu LEu Glu Gly Ile Ala Glu Asp Ser Ile100 105 110Asp Ser Ile Ile Val Ala Ala Ser Glu Gln Asp Ser Glu Ile Met Asp115 120 125Ala Asn Glu Gln Pro Gln Ala Lys Val Thr Arg Ser Ile Val Phe Val130 135 140Thr Gly Glu Ala Ala Pro Tyr Ala Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Val145 150 155 160Cys Gly Ser Leu Pro Ile Ala Leu Ala Ala Arg Gly His Arg Val Met165 170 175Val Val Met Pro Arg Tyr Leu Asn Gly Ser Ser Asp Lys Asn Tyr Ala180 185 190Lys Ala Leu Tyr Thr Ala Lys His Ile Lys Ile Pro Cys Phe Gly Gly195 200 205Ser His Glu Val Thr Phe Phe His Glu Tyr Arg Asp Asn Val Asp Trp210 215 220Val Phe Val Asp His Pro Ser Tyr His Arg Pro Gly Ser Leu Tyr Gly225 230 235 240Asp Asn Phe Gly Ala Phe Gly Asp Asn Gln Phe Arg Tyr Thr Leu Leu245 250 255Cys TyT Ala Ala Cys Glu Ala Pro Leu Ile Leu Glu Leu Gly Gly Tyr260 265 270Ile Tyr Gly Gln Asn Cys Met Phe Val Val Asn Asp Trp His Ala Ser275 280 285Leu Val Pro Val Leu Leu Ala Ala Lys Tyr Arg Pro Tyr Gly Val Tyr290 295 300Arg Asp Ser Arg Ser Thr Leu Val Ile His Asn Leu Ala His Gln Gly305 310 315 320Val Glu Pro Ala Ser Thr Tyr Pro Asp Leu Gly Leu Pro Pro Glu Trp325 330 335Tyr Gly Ala Leu Glu Trp Val Phe Pro Glu Trp Ala Arg Arg His Ala340 345 350Leu Asp Lys Gly Glu Ala Val Asn Phe Leu Lys Gly Ala Val Val Thr355 360 365Ala Asp Arg Ile Val Thr Val Ser Gln Gly Tyr Ser Trp Glu Val Thr370 375 380Thr Ala Glu gly Gly Gln Gly Leu Asn Glu Leu leu Ser Ser Arg Lys385 390 395 400Ser Val Leu Asn Gly Ile Val Asn Gly Ile Asp Ile Asn Asp Trp Asn405 410 415Pro Thr Thr Asp Lys Cys Leu Pro His His Tyr Ser Val Asp Asp Leu420 425 430Ser Gly Lys Ala Lys Cys Lys Ala Glu Leu Gln Lys Glu Leu Gly Leu435 440 445Pro Val Arg Glu Asp Val Pro Leu Ile Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp450 455 460Tyr Gln Lys Gly rle Asp Leu Ile Lys Met Ala Ile Pro Glu Leu Met465 470 475 480Arg Glu Asp Val Gln Phe Val Met Leu Gly Ser Gly Asp Pro Ile Phe485 490 495Glu GIy Trp Met Arg Ser Thr Glu Ser Ser Tyr Lys Asp Lys Phe Arg500 505 510Gly Trp Val Gly Phe Ser Val Pro Val Ser His Arg Ile Thr Ala Gly515 520 525Cys Asp Ile Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ash530 535 540Gln Leu Tyr Ala Met Gln Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Gly Thr545 550 555 560Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Glu Thr Phe Asn Pro Pne Gly Ala Lys565 570 575Gly Glu Glu Gly Thr Gly Trp Ala Phe Ser Pro Leu Thr Val Asp Lys580 585 590Met Leu Trp Ala Leu Arg Thr Ala Met Ser Thr Phe Arg Glu His Lys595 600 605Pro Ser Trp Glu Gly Leu Met Lys Arg Gly Met Thr Lys Asp His Thr610 615 620Trp Asp His Ala Pro Ser Ser Thr Ser Arg Ser Ser Ser Gly Pro Ser625 630 635 640Trp Thr Asn Pro Thr Ser Cys Arg Arg Gly Leu Gly Arg Ser Lys Cys645 650 655Glu Ser Pro Ser Ala Leu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Phe Arg Gly Pro660 665 670Glu Gly Tyr Pro Cys Thr Leu Arg Cys Pro Ala Thr Val Glu Ser Gln675 680 685Cys Ala Cys Leu Leu Trp Phe Ala Giy Ser Arg Thr Tyr Asp Gly Cys690 695 700Ala Ala Ala Ala Val Thr Ala Ser Gly Gly Arg Gln Leu Gln Phe Trp705 710 715 720Gly Ile Arg Lys Gly Cys A la Ala Gly Trp Leu Thr Ala Lys His His725 730 735Ser Asp Gly Ser Leu Ser Val Arg Val Thr Ala Glu Ile Arg Asn Gln740 745 750Leu Val Thr Leu755<210> 3<211> 22<212>人工序列<220><223>引物<400> 3CCTCCCAATT CAAGGATTAG TG 22<210> 4<211> 20<212>人工序列<220><223>引物<400> 4CCTCGCATGC AGCATAGCAA20<210> 5<211> 20<212>人工序列<220><223>引物<400> 5TGTGGGCTGCA AGTGAGGAGG20<210> 6<211> 23<212>人工序列<220><223>引物<400> 6CCAGTCACAA ACACGTAGCT ACG 2權(quán)利要求
1．編碼具有小麥淀粉合酶之功能的蛋白質(zhì)的核酸分子，其選自(a)編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子，(b)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其部分，或與其相對應(yīng)的核糖核苷酸序列的核酸分子，(c)與(a)或(b)所述的核酸分子之一可雜交或與其互補的核酸分子，和(d)其核苷酸序列因遺傳密碼的簡并性而與(a)，(b)或(c)所述核酸分子的序列有所不同的核酸分子。
2．權(quán)利要求1所述的核酸分子，其為DNA分子。
3．權(quán)利要求2所述的DNA分子，其為cDNA分子。
4．權(quán)利要求1至3中的一項或多項所述的核酸分子，其含有調(diào)節(jié)元件。
5．權(quán)利要求1所述的核酸分子，其為RNA分子。
6．核酸分子，所述分子能與權(quán)利要求1至5中任一項所述的核酸分子特異性雜交。
7．權(quán)利要求6所述的核酸分子，其為長度至少為15個核苷酸的寡核苷酸。
8．載體，其含有權(quán)利要求1至5中任一項所述的DNA分子。
9．權(quán)利要求8所述的載體，其中所述核酸分子在有義方向上與調(diào)節(jié)元件相連，該調(diào)節(jié)元件能確保在原核或真核細胞中轉(zhuǎn)錄和合成可翻譯的RNA。
10．權(quán)利要求8所述的載體，其中所述核酸分子在有義方向上與調(diào)節(jié)元件相連，該調(diào)節(jié)元件能確保在原核或真核細胞中合成不可翻譯的RNA。
11．權(quán)利要求8所述的載體，其中所述核酸分子在反義方向上與調(diào)節(jié)元件相連，該調(diào)節(jié)元件能確保在原核或真核細胞中合成不可翻譯的RNA。
12．宿主細胞，所述宿主細胞是被權(quán)利要求1至5中的一項或多項所述的核酸分子或者權(quán)利要求8至11中的一項或多項所述的載體轉(zhuǎn)化的細胞或衍生自該細胞的細胞。
13．由權(quán)利要求1至4中的一項或多項所述的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。
14．制備權(quán)利要求13所述的蛋白質(zhì)的方法，其中在能合成所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12所述的宿主細胞，隨后從經(jīng)培養(yǎng)的細胞和/或培養(yǎng)基中分離出所述蛋白質(zhì)。
15．產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的植物細胞的方法，其中將a)權(quán)利要求1至5中的一項或多項所述的核酸分子，或b)權(quán)利要求8至11中的一項或多項所述的載體整合至植物細胞的基因組中。
16．轉(zhuǎn)基因的植物細胞，所述細胞是被權(quán)利要求1至5中的一項或多項所述的核酸分子或者權(quán)利要求8至11中的一項或多項所述的載體轉(zhuǎn)化的細胞或衍生自該細胞的細胞。
17．產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的植物細胞的方法，其中將a1)權(quán)利要求1至5中的一項或多項所述的核酸分子，或a2)權(quán)利要求8至11中的一項或多項所述的載體整合至植物細胞的基因組中，和b)由所述植物細胞再生完整的植物。
18．含有權(quán)利要求16所述的植物細胞的植物。
19．權(quán)利要求19所述的植物，其為單子葉植物或雙子葉植物。
20．權(quán)利要求19所述的植物，其為有用的植物。
21．權(quán)利要求20所述的植物，其為貯存淀粉的植物。
22．權(quán)利要求21所述的植物，其為玉米，水稻，馬鈴薯或小麥植物。
23．權(quán)利要求18至22中的一項或多項所述植物的繁殖材料。
24．淀粉，其可得自權(quán)利要求16所述的植物細胞，權(quán)利要求18至22中的一項或多項所述的植物或者權(quán)利要求23所述的繁殖材料。
25．權(quán)利要求24所述的淀粉用于生產(chǎn)食品或食品前體，優(yōu)選為生產(chǎn)烘烤食品或漿糊的用途。
26．權(quán)利要求24所述的淀粉用于生產(chǎn)包裝材料或一次性用品的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼酶的核酸分子,所述酶參與植物淀粉的合成。這些酶中涉及得自小麥的可溶性淀粉合酶。本發(fā)明還涉及含有上述核酸分子的載體和宿主細胞,尤其是經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞以及由其再生的植物,它們表現(xiàn)出本發(fā)明淀粉合酶的活性增加或降低。
文檔編號C12N15/54GK1299415SQ99805918
公開日2001年6月13日 申請日期1999年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月8日
發(fā)明者H·羅茲, S·盧蒂科, M·布洛克 申請人:阿溫提斯作物科學(xué)有限公司