專利名稱：編碼小麥中參與淀粉合成的酶的核酸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼小麥中參與植物淀粉合成的酶的核酸分子，這些酶是淀粉合酶的同種型。
本發(fā)明另外涉及含有這些核酸分子的載體和細(xì)菌，以及被所述核酸分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和植物。另外，本發(fā)明還描述了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，由于整合了編碼小麥淀粉合酶的DNA分子，所述轉(zhuǎn)基因植物合成的淀粉在其特性上有所修飾。
鑒于最近被歸于作為原料的再生來源的植物性物質(zhì)的漸增的重要性，生物技術(shù)研究的一個(gè)目的是嘗試使植物性原料適應(yīng)加工工業(yè)的需要。為了能在盡可能多的領(lǐng)域內(nèi)使用經(jīng)修飾的再生性原料，得到多種物質(zhì)也很重要。除了油類、脂肪和蛋白質(zhì)以外，多糖構(gòu)成得自植物的必不可少的再生性原料。除了纖維素以外，淀粉在多糖中保持重要的地位，在高等植物中淀粉是最重要的儲(chǔ)藏物質(zhì)之一。在高等植物中，小麥?zhǔn)怯腥さ脑耘嘀参?，因?yàn)樗a(chǎn)生的淀粉占?xì)W盟淀粉生產(chǎn)總量的20％。
多糖淀粉是由化學(xué)上同質(zhì)的基本組分即葡萄糖分子組成的聚合物，然而，它由多種類型的分子構(gòu)成了高度復(fù)合的混合物，所述分子在它們的聚合程度和葡萄糖鏈的分支程度方面各不相同，因此，淀粉不是同質(zhì)的原料。人們特別地區(qū)分了直鏈淀粉和支鏈淀粉，所述直鏈淀粉是由α-1,4-糖苷分支的葡萄糖分子組成的基本上未分支的聚合物，而支鏈淀粉是具有多種分支的葡萄糖鏈的復(fù)合混合物。額外的α-1,6-糖苷互連導(dǎo)致了分支。對(duì)于小麥而言，根據(jù)品種的不同，合成的淀粉由約11-37％的直鏈淀粉組成。為了使淀粉能得到盡可能廣泛的應(yīng)用，似乎需要提供能合成經(jīng)修飾之淀粉的植物，所述淀粉特別適用于多種用途。育種可以提供這種植物，然而由于栽培小麥的多倍體特性(四-和六-倍體)使得這種方法很難用于小麥。僅在最近，科學(xué)家通過將天然產(chǎn)生的突變體雜交成功地培育出“waxy”(不含直鏈淀粉)小麥(Nakamura等，Mol.Gen.Genet.248(1995),253-259)。利用重組DNA技術(shù)對(duì)產(chǎn)淀粉植物的淀粉代謝進(jìn)行特異性的遺傳修飾也可以提供這種植物，然而，其前提是要鑒定和表征參與淀粉合成和/或淀粉修飾的酶以及分離編碼這些酶的各個(gè)DNA分子。
導(dǎo)致淀粉產(chǎn)生的生化途徑基本上是已知的，植物細(xì)胞中的淀粉合成發(fā)生于質(zhì)體中。在具有光合活性的組織中為葉綠體，在無光合活性的貯存淀粉的組織中為造粉體。
參與淀粉合成的最重要的酶是淀粉合酶以及分支酶。已描述了淀粉合酶的多種同種型，這些酶都可以通過將ADP-葡萄糖的葡糖基殘基轉(zhuǎn)移至α-1,4-葡聚糖而催化聚合反應(yīng)。分支酶催化將α-1,6分支引入線性α-1,4-葡聚糖中。
淀粉合酶可分成兩組與顆粒結(jié)合的淀粉合酶(GBSS)和可溶性的淀粉合酶(SSS)，這種區(qū)分經(jīng)常不明顯，因?yàn)橐恍┑矸酆厦缚膳c顆粒結(jié)合，并且也是可溶性的(Denyer等，植物學(xué)雜志，4(1993),191-198；Mu等，植物學(xué)雜志，6(1994),151-159)。在這些分類中，描述了多種植物的多種同種型，這些同種型的不同之處在于它們對(duì)引物分子的依賴程度(所謂的“引物依賴型”(Ⅱ型)和“引物非依賴型”(Ⅰ型)淀粉合酶)。
迄今為止，僅成功地測(cè)定出同種型GBSSⅠ在淀粉合成過程中的確切功能。在此酶活性急劇下降或完全降低的植物中合成了無直鏈淀粉的淀粉(所謂的“waxy”淀粉)(Shure等，細(xì)胞，35(1983),225-233；Visser等，Mol.Gen.Genet.225(1991),289-296；WO 92/11376)；因此，在合成直鏈淀粉時(shí)此酶起著決定性的作用，在綠藻菜因哈德衣藻的細(xì)胞中也觀察到這一現(xiàn)象(Delrue等，細(xì)菌學(xué)雜志，174(1992)，3612-3620)。另外，已經(jīng)闡明在衣藻中GBSSⅠ不僅參與直鏈淀粉的合成，也對(duì)支鏈淀粉的合成具有影響。在未顯示出任何GBSSⅠ活性的突變體中，表現(xiàn)為長(zhǎng)鏈葡聚糖的正常合成的支鏈淀粉的某些組分消失了。
迄今為止，仍不清楚與顆粒結(jié)合的淀粉合酶尤其是GBSSⅠ以及可溶性淀粉合酶的其它同種型的功能。估計(jì)可溶性淀粉合酶與分支酶一起參與支鏈淀粉的合成(例見Ponstein等，植物生理學(xué)，92(1990),234-241)，它們對(duì)調(diào)節(jié)淀粉合成速率起著重要的作用。對(duì)于小麥而言，已在蛋白質(zhì)水平上鑒定了與顆粒結(jié)合的淀粉合酶的至少兩種同種型(60kDa和100-105 kDa)和可能代表可溶性淀粉合酶的其它同種型(Denyer等，Planta 196(1995),256-265；Rahman等，澳大利亞植物生理學(xué)雜志，22(1995),793-803)。通過層析法已證明了幾種SSS-同種型的存在(Rijven，植物生理學(xué)，81(1986),448-453)。已描述了編碼小麥GBSSⅠ的cDNA(Ainsworth等，植物分子生物學(xué)，22(1993),67-82)。
編碼小麥淀粉合酶其它同種型的核酸序列仍是未知的。
迄今為止，僅描述了編碼豌豆(Dry等，植物學(xué)雜志，2(1992),193-202)，水稻(Baba等，植物生理學(xué)，103(1993),565-573)和馬鈴薯(Edwards等，植物學(xué)雜志，8(1995),283-294)的除GBSSⅠ以外的其它淀粉合酶的cDNA序列。
已在除小麥以外的幾種其它植物種類中鑒定出可溶性的淀粉合酶，例如，已從豌豆(Denyer和Smith,Planta 186(1992),609-617)和馬鈴薯(Edwards等，植物學(xué)雜志，8(1995),283-294)中以均質(zhì)的形式分離出了可溶性的淀粉合酶。在這些情況下發(fā)現(xiàn)被鑒定為SSSⅡ的可溶性淀粉合酶同種型與同顆粒結(jié)合的淀粉合酶GBSSⅡ相同(Denyer等，植物學(xué)雜志，4(1993),191-198；Edwards等，植物學(xué)雜志，8(1995),283-294)。對(duì)于其它植物種類，如大麥而言，通過層析法描述了幾種SSS同種型的存在(Tyynela和Schulman,Physiologia Plantarum 89(1993)835-841；Kreis,Planta 148(1980),412-416)，然而，至今仍未描述編碼這些蛋白質(zhì)的DNA序列。為使有可能修飾任何所需的儲(chǔ)藏淀粉的植物，尤其是小麥，以使其合成經(jīng)修飾的淀粉，不得不鑒定編碼淀粉合酶其它同種型的各個(gè)DNA序列。
因此，本發(fā)明的目的是提供編碼參與淀粉合成的酶、尤其是得自小麥的酶的核酸分子，利用所述核酸分子可產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的植物，該植物顯示出增加或降低的酶活性，籍此促進(jìn)對(duì)這些植物中合成的淀粉的化學(xué)和/或物理特性的修飾。通過權(quán)利要求書中所述的方案已達(dá)到此目的。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及編碼小麥中具有可溶性淀粉合酶之生物活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，優(yōu)選這種分子編碼的蛋白質(zhì)含有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。本發(fā)明具體地涉及含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的全部或部分的核酸分子，優(yōu)選含有SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)、或某些情況下也可以是含有其相應(yīng)的核糖核苷酸序列的分子。
本發(fā)明還涉及編碼小麥的可溶性淀粉合酶并能與上述分子之一雜交的核酸分子。
編碼小麥的可溶性淀粉合酶的核酸分子和因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而序列與上述分子的核苷酸序列有所不同的核酸分子也是本發(fā)明的主題。
本發(fā)明也涉及具有與上述序列的全部或部分互補(bǔ)之序列的核酸分子。
由上述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)是源于小麥的可溶性淀粉合酶，這些蛋白質(zhì)與目前已知的其它植物種類的可溶性淀粉合酶顯示出某些同源區(qū)域。
本發(fā)明的另一方面涉及編碼具有小麥中可溶性淀粉合酶之生物活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，優(yōu)選這種分子編碼的蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。本發(fā)明具體地涉及含有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或其部分的核酸分子，優(yōu)選含有SEQ ID NO:5所示的編碼區(qū)、或某些情況下也可以是含有其相應(yīng)的核糖核苷酸序列的分子。
本發(fā)明還涉及編碼小麥的可溶性淀粉合酶并能與上述分子之一雜交的核酸分子。
編碼小麥的可溶性淀粉合酶的核酸分子和因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而序列與上述分子的核苷酸序列有所不同的核酸分子也是本發(fā)明的主題。
本發(fā)明也涉及具有與上述序列的全部或部分互補(bǔ)之序列的核酸分子。
由上述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)是具有小麥淀粉合酶生物活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)與其它已知序列比較同源性時(shí)，發(fā)現(xiàn)其與豌豆編碼的同顆粒結(jié)合之淀粉合酶的序列具有最高程度的同源性，因此，推測(cè)所述核酸分子編碼小麥的同顆粒結(jié)合的淀粉合酶。
本發(fā)明的核酸分子可以是DNA或RNA分子，例如相應(yīng)的DNA分子是基因組的或cDNA分子?？蓮奶烊粊碓捶蛛x或通過已知方法合成本發(fā)明的核酸分子。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“雜交”指的是在常規(guī)雜交條件下，優(yōu)選在如Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版(1989)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約中所述的嚴(yán)格條件下進(jìn)行的雜交。
例如可從由小麥組織產(chǎn)生的小麥基因組中或cDNA文庫(kù)中分離出能與本發(fā)明的分子雜交的核酸分子。
因此，通過使用本發(fā)明的分子或這些分子的一部分，或某些情況下可使用這些分子的反向互補(bǔ)鏈，通過例如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法的雜交(例見Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版(1989)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)可鑒定和分離這樣的核酸分子。
至于雜交所用的探針，可使用諸如確切地或基本上含有SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:5所示核苷酸序列或其部分的核酸分子。用作雜交探針的片段也可以是使用常規(guī)的合成法產(chǎn)生的合成片段，此片段的序列與本發(fā)明的核酸分子的序列基本上相同。鑒定和分離出可與本發(fā)明的核酸分子雜交的基因之后，必須測(cè)定序列并分析由此序列編碼的蛋白質(zhì)的特性。
可與本發(fā)明的核酸分子雜交的分子也包括編碼本發(fā)明所述之小麥蛋白質(zhì)的上述核酸分子的片段、衍生物和等位基因變體。因此，片段限定為核酸分子的一部分，它們應(yīng)足夠長(zhǎng)以使其能編碼所述蛋白質(zhì)之一。這也包括缺乏編碼信號(hào)肽的核苷酸序列的本發(fā)明核酸分子的一部分，所述信號(hào)肽負(fù)責(zé)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到質(zhì)體中。這種片段是諸如編碼SEQ IDNO:2所示氨基酸殘基34-671的核苷酸序列，或編碼SEQ ID NO:6所示氨基酸殘基58-799或61-799的核苷酸序列。另外，本發(fā)明特別優(yōu)選的片段是含有SEQ ID NO:1之核苷酸186-2239的片段以及在其5’末端含有一額外的G殘基的片段，和含有SEQ ID NO:2之核苷酸1084-2825的片段。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“衍生物”指的是這些分子的序列與上述核酸分子的序列在一個(gè)或多個(gè)位置上有所不同，它們表現(xiàn)出與上述核酸分子有高度的同源性，這里的同源性指的是序列至少40％相同，特別是至少60％相同，優(yōu)選80％以上相同，更優(yōu)選90％以上相同。與上述核酸分子相比時(shí)出現(xiàn)的偏差可能是由缺失、取代、插入或重組引起的。
另外，同源性指的是各個(gè)核酸分子之間或由它們編碼的蛋白質(zhì)之間存在著功能和/或結(jié)構(gòu)上的等同。與上述分子同源并代表這些分子的衍生物的核酸分子通常是這些分子的變異，所述變異構(gòu)成可產(chǎn)生相同的生物學(xué)功能的修飾。這些變異可以是自然發(fā)生的變異，例如源于其它生物體的序列或突變，因此這些突變可以是自然發(fā)生的或可以是通過特異性誘變而導(dǎo)入的。另外，變異可以是合成產(chǎn)生的序列，等位基因變體可以是自然產(chǎn)生的變體以及合成產(chǎn)生的變體或由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。由本發(fā)明核酸分子的多種變體編碼的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出某些共有的特性。酶活性、分子量、免疫反應(yīng)性、構(gòu)象等屬于這些特性，如在凝膠電泳中的遷移率、層析特性、沉降系數(shù)、溶解性、光譜特性、穩(wěn)定性、pH最適值、溫度最適值等的物理特性也屬于這些特性。淀粉合酶的顯著特征是ⅰ)它們定位于植物細(xì)胞質(zhì)體的基質(zhì)內(nèi)；ⅱ)它們具有使用ADP-葡萄糖為底物合成線性α-1,4-連接的聚葡聚糖的能力。按Denyer和Smith(Planta 186(1992),606-617)所示方法或如實(shí)施例中所述的方法可測(cè)定此活性。
可特異性地與本發(fā)明核酸分子的鏈雜交的核酸分子也是本發(fā)明的主題，優(yōu)選這些核酸分子是長(zhǎng)度至少為10，尤其是長(zhǎng)度至少為15，更優(yōu)選長(zhǎng)度至少為50個(gè)核苷酸的寡核苷酸。這些核酸分子可特異性地與本發(fā)明核酸分子的鏈雜交，即它們不與或僅在低水平上與編碼其它蛋白質(zhì)，尤其是其它淀粉合酶的核酸序列雜交?？蓪⒈景l(fā)明的寡核苷酸用作諸如PCR反應(yīng)的引物，它們也可以是反義構(gòu)建體或編碼適當(dāng)核酶的DNA分子的組分。
另外，本發(fā)明涉及載體，尤其是質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體和基因工程中通用的其它載體，所述載體含有上述的本發(fā)明的核酸分子。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體中所含的核酸分子與確?？煞g的RNA能在原核或真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和合成的調(diào)控元件連接。
在如大腸桿菌的原核細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸分子是有趣的，原因在于這可以更精確地鑒定這些分子編碼的酶的酶促活性，具體地說，可以在缺乏參與植物細(xì)胞淀粉合成的其它酶的情況下表征由各個(gè)酶合成的產(chǎn)物，從而可以推論出各個(gè)蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞內(nèi)淀粉合成過程中發(fā)揮的功能。
另外，利用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)(例見Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)可將多種突變導(dǎo)入本發(fā)明的核酸分子，從而誘導(dǎo)具有可能被修飾的生物學(xué)特性的蛋白質(zhì)的合成。利用此技術(shù)，一方面可以產(chǎn)生缺失突變體，其中通過在編碼序列的DNA的5’或3’末端連續(xù)地缺失可產(chǎn)生核酸分子，這些核酸分子可導(dǎo)致相應(yīng)的縮短的蛋白質(zhì)的合成，這種在核苷酸序列5’末端的缺失使得例如有可能鑒定出負(fù)責(zé)質(zhì)體中酶轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸序列(轉(zhuǎn)運(yùn)肽)。由于除去了有關(guān)序列，使得酶的特異性生產(chǎn)不再位于質(zhì)體中而是位于胞質(zhì)溶膠內(nèi)，或者由于其它信號(hào)序列的加入使得酶的特異性生產(chǎn)位于其它區(qū)室中。
另一方面，在氨基酸序列的修飾會(huì)影響諸如酶活性或酶調(diào)節(jié)的位置處也可導(dǎo)入點(diǎn)突變。通過此方法，可產(chǎn)生諸如具有經(jīng)修飾的Km值的突變體，或產(chǎn)生不再受細(xì)胞中經(jīng)常出現(xiàn)的通過別構(gòu)調(diào)節(jié)或共價(jià)修飾而發(fā)生的調(diào)節(jié)機(jī)制所支配的突變體。
另外，可產(chǎn)生表現(xiàn)出經(jīng)修飾的底物或產(chǎn)物特異性的突變體，如使用ADP-葡萄糖-6-磷酸代替ADP-葡萄糖為底物的突變體，而且，可產(chǎn)生具有經(jīng)修飾的活性-溫度分布圖的突變體。
為了在原核細(xì)胞中進(jìn)行遺傳操作，可將本發(fā)明的核酸分子或這些分子的部分整合到允許誘變或通過DNA序列重組進(jìn)行序列修飾的質(zhì)粒中。利用標(biāo)準(zhǔn)方法(參見Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版(1989)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國(guó))，可進(jìn)行堿基替換或加入天然或合成的序列。為了連接DNA片段，可將銜接子或接頭與片段連接。另外，可利用能提供適當(dāng)限制性位點(diǎn)或能除去多余的DNA或限制性位點(diǎn)的操作。在利用插入、缺失或取代的任何地方，都可使用體外誘變、“引物修復(fù)”、限制性酶切或連接。為了分析，通常使用序列分析、限制性酶切分析和其它的生物化學(xué)-分子生物學(xué)方法。
在另-個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及經(jīng)上述本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化和/或遺傳修飾的宿主細(xì)胞，特別是原核或真核細(xì)胞，還涉及來源于以上述方式被轉(zhuǎn)化和/或遺傳修飾并含有本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的載體的細(xì)胞。優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。這種細(xì)胞的特征在于被導(dǎo)入的本發(fā)明的核酸分子對(duì)于被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞而言可以是異源的，即該核酸分子不會(huì)天然存在于這些細(xì)胞中；或者該核酸分子可以位于基因組中其它位置，而不是其相應(yīng)的天然存在的序列。另外，由本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)，以及所述蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法都是本發(fā)明的主題，所述方法包括在允許蛋白質(zhì)合成的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，然后從經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離所述蛋白質(zhì)。
另外，本發(fā)明也涉及被一種或多種本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。這種細(xì)胞含有一種或多種本發(fā)明的核酸分子，優(yōu)選將該/這些核酸分子與可確保在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)控DNA元件、尤其是啟動(dòng)子連接。這種細(xì)胞與天然存在的植物細(xì)胞的不同之處在于它們至少含有一種不會(huì)天然存在于這種細(xì)胞中的本發(fā)明的核酸分子，或者在于這種分子整合到細(xì)胞基因組中的某個(gè)位置，而不是其天然存在的位置，即基因組環(huán)境不同。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可將轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞再生為整個(gè)植株，因此，通過再生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞而得到的植物也是本發(fā)明的主題。本發(fā)明的另一個(gè)主題是含有上述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的植物。轉(zhuǎn)基因植物理論上可以是任何所需種類的植物，即可以是單子葉植物以及雙子葉植物。這些植物、特別是合成淀粉或儲(chǔ)藏淀粉的植物，如谷類(黑麥、大麥、燕麥、小麥等)、水稻、玉米、豌豆、木薯或馬鈴薯是較優(yōu)選的有用植物。
通過利用本發(fā)明的核酸分子，目前可以通過重組DNA技術(shù)以通過育種不可能實(shí)現(xiàn)的方式特異性地干擾植物的淀粉代謝，籍此，可以合成的經(jīng)修飾淀粉與野生型植物中合成的淀粉相比在其物理-化學(xué)特性上已經(jīng)被修飾的方式修飾淀粉代謝，所述特性具體地為直鏈淀粉/支鏈淀粉的比率，分支的程度，平均鏈長(zhǎng)，磷酸含量，成糊特性，淀粉顆粒的大小和/或形狀。通過增加本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的活性，例如，通過過量表達(dá)各個(gè)核酸分子，或利用不再受細(xì)胞特異性調(diào)控機(jī)制支配和/或其活性為不同的溫度依賴性的突變體有可能增加經(jīng)遺傳修飾的植物的產(chǎn)量。干擾小麥淀粉合成的可能性的經(jīng)濟(jì)意義不言而喻，因?yàn)榇酥参锂a(chǎn)生相當(dāng)量的淀粉。
因此，可以在植物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸分子以增加各個(gè)淀粉合酶的活性，或者可將它們導(dǎo)入通常不表達(dá)所述酶的細(xì)胞中。另外，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法修飾本發(fā)明的核酸分子以產(chǎn)生本發(fā)明的淀粉合酶，該淀粉合酶不再受細(xì)胞特異性調(diào)控機(jī)制的支配，或可顯示出經(jīng)修飾的溫度依賴性或底物相對(duì)產(chǎn)物特異性。
在植物中表達(dá)本發(fā)明的核酸分子時(shí)，合成的蛋白質(zhì)理論上可位于植物細(xì)胞內(nèi)任何所需的區(qū)室中。為了使蛋白質(zhì)位于特定的區(qū)室內(nèi)，必須缺失確保在質(zhì)體中定位的序列，余下的編碼區(qū)可任選地與確保在各個(gè)區(qū)室中定位的DNA序列連接，這樣的序列是已知的(例見Braun等，EMBOJ,11(1992),3219-3227；Wolter等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，85(1988),846-850；Sonnewald等，植物學(xué)雜志，1(1991),95-106)。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明植物的增殖材料，如果實(shí)、種子、塊莖、根莖、秧苗、插枝、愈傷組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等。
源于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物以及增殖材料的淀粉也是本發(fā)明的主題。
由于至少一種本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)、或(某些情況下為)額外的表達(dá)，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物合成的淀粉與野生型植物合成的淀粉相比，在其物理-化學(xué)特性方面有所修飾，特別是在其直鏈淀粉/支鏈淀粉的比率、分支的程度、平均鏈長(zhǎng)、磷酸含量、成糊特性、淀粉顆粒的大小和/或形狀等方面有所修飾。與野生型淀粉相比，這樣的淀粉特別是在其粘度和/或此淀粉膠的凝膠結(jié)構(gòu)特性方面有所修飾。
與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物相比，其中至少一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性有所降低的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是本發(fā)明的另一個(gè)主題。
利用本發(fā)明的核酸分子可以產(chǎn)生其中至少一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性有所降低的植物細(xì)胞和植物，這也可導(dǎo)致與野生型植物細(xì)胞產(chǎn)生的淀粉相比具有經(jīng)修飾的化學(xué)和/或物理特性的淀粉的合成。
使用本發(fā)明的核酸分子，通過表達(dá)至少一種有義RNA的至少一種相應(yīng)的反義RNA以達(dá)到共抑制的效應(yīng)，或表達(dá)至少一種相應(yīng)構(gòu)建的可特異性切割編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)之一的轉(zhuǎn)錄物的核酶，即可產(chǎn)生其內(nèi)至少一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性降低的植物細(xì)胞。為了表達(dá)反義RNA，一方面可使用含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)之完整序列、包括可能存在的側(cè)翼序列的DNA分子，以及僅含有編碼序列的一部分的DNA分子，所述部分序列應(yīng)足夠長(zhǎng)以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的反義效果?；旧希蛄虚L(zhǎng)度最低為15bp，優(yōu)選長(zhǎng)度為100-500bp，為了有效地進(jìn)行反義抑制，尤其可使用長(zhǎng)度超過500bp的序列。通常使用的DNA分子小于5000bp，優(yōu)選序列長(zhǎng)度小于2500bD。
也可使用與本發(fā)明DNA分子的序列具有高度同源性但不完全相同的DNA序列，最低的同源性應(yīng)大于65％，優(yōu)選利用同源性為95-100％的序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知利用共抑制效應(yīng)降低植物細(xì)胞中本發(fā)明酶之活性的方法，有關(guān)描述參見例如Jorgensen(生物技術(shù)動(dòng)態(tài)(TrendsBiotechnol),8(1990),340-344),Niebel等(現(xiàn)代微生物學(xué)和免疫學(xué)專題(Curr.Top.Microbiol.Immunol.),197(1995),91-103),Flavell等(現(xiàn)代微生物學(xué)和免疫學(xué)專題，197(1995),43-46),Palaqui和Vaucheret(植物分子生物學(xué)，29(1995),149-159),Vaucheret等(Mol.Gen.Genet.,248(1995),311-317),de Borne等(Mol.Gen.Genet.,243(1994),613-621)等其它文獻(xiàn)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知為了降低細(xì)胞中某些酶的活性可表達(dá)相應(yīng)的核酶，有關(guān)描述可參見例如EP-B1 0 321 201，有關(guān)植物細(xì)胞中核酶的表達(dá)描述于Feyter等(Mol.Gen.Genet.250(1996),329-338)。
另外，含有上述本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的植物也是本發(fā)明的主題。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可使本發(fā)明的植物細(xì)胞再生為整個(gè)植株。優(yōu)選這些植物是上文提及的那些，特別是有用的植物，尤其是合成淀粉或(某些情況下可以是)儲(chǔ)藏淀粉的植物，本發(fā)明中特別優(yōu)選的是小麥。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明植物的增殖材料，特別是果實(shí)、種子、塊莖、根莖、秧苗、插枝、愈傷組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等。
另外，得自上述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物以及增殖材料的淀粉也是本發(fā)明的主題。
由于至少一種本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性的降低，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物合成的淀粉與野生型植物合成的淀粉相比，其物理-化學(xué)特性有所修飾，特別是其直鏈淀粉/支鏈淀粉的比率、分支的程度、平均鏈長(zhǎng)、磷酸含量、成糊特性、淀粉顆粒的大小和/或形狀等方面有所修飾。與來源于野生型植物的淀粉相比，這種淀粉比如可能在其粘度和/或其膠的凝膠結(jié)構(gòu)特性方面有所修飾。
可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)修飾本發(fā)明的淀粉；未經(jīng)修飾的淀粉以及修飾形式的淀粉適用于糧食或非糧食行業(yè)。
淀粉可能的用途基本上可次分為兩個(gè)主要的領(lǐng)域，一個(gè)領(lǐng)域包括通過酶解或化學(xué)方法得到淀粉的水解產(chǎn)物，主要是葡萄糖和葡聚糖組分，可將所述水解產(chǎn)物用作其它化學(xué)修飾和方法(如發(fā)酵)的起始物質(zhì)。在本申請(qǐng)中，重要的是水解過程可簡(jiǎn)單地、便宜地進(jìn)行。最近，基本上使用淀粉葡糖苷酶酶解進(jìn)行水解反應(yīng)?？梢韵胂笸ㄟ^因淀粉結(jié)構(gòu)的變化如谷物表面的增加所致的水解酶使用量的減少、因限制所用酶進(jìn)入能力的分支或空間結(jié)構(gòu)較少所致的可消化能力的改善可以降低花費(fèi)。因淀粉的聚合物結(jié)構(gòu)為所謂的天然淀粉而使用淀粉的其它領(lǐng)域可被次分為另外兩個(gè)領(lǐng)域1．用于糧食淀粉是多種糧食的典型添加物，其中淀粉的主要目的是結(jié)合含水的添加物和/或?qū)е抡扯仍黾踊蚰z結(jié)構(gòu)增加。重要的特性是流動(dòng)和吸附作用，膨脹和成糊溫度，粘度和稠化特性，淀粉的溶解性，透明度和糊劑結(jié)構(gòu)，對(duì)熱、剪切力和酸的抗性，反向傾向，薄膜形成能力，對(duì)冷凍/融化的抗性，可消化能力以及與如無機(jī)或有機(jī)離子形成復(fù)合物的能力。
應(yīng)用天然淀粉的優(yōu)選領(lǐng)域是面包房-食品和面團(tuán)領(lǐng)域。
2．用于非糧食類淀粉的其它主要應(yīng)用領(lǐng)域是用作多種生產(chǎn)過程中的佐劑或技術(shù)產(chǎn)物中的添加物。淀粉用作佐劑的主要應(yīng)用領(lǐng)域首推造紙和紙板工業(yè)，在此領(lǐng)域中，淀粉作為固化物主要用于保留(阻擋固體)，給填料和精細(xì)顆粒上漿并可用于脫水。另外，可利用淀粉在粘稠性、硬度、可靠性(sound)、握力、光澤度、光滑性、拉扯強(qiáng)度以及外觀方面的有利特性。
2.1造紙和紙板工業(yè)在造紙過程中，可將四個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域，即表面處理、涂層、聚集和噴涂分開。
在表面處理方面對(duì)淀粉的需求實(shí)質(zhì)上為高水平的亮度、相應(yīng)的粘度、高粘度穩(wěn)定性、形成良好的薄膜以及形成較少灰塵。當(dāng)用于涂層時(shí)，固體含量、相應(yīng)的粘度、高結(jié)合能力以及高的顏料親和性起著重要的作用。作為聚集時(shí)的添加物，重要的是快速、均一、無損耗的分散、高機(jī)械穩(wěn)定性和完全保留在紙漿中。當(dāng)使用淀粉噴涂時(shí)，固體的相應(yīng)含量、高粘度以及高結(jié)合能力也很重要。
2.2粘合劑工業(yè)應(yīng)用的主要領(lǐng)域是例如粘合劑工業(yè)，該應(yīng)用領(lǐng)域可次分為四個(gè)領(lǐng)域用作純粹的淀粉膠，用于用特殊化合物制備的淀粉膠，將淀粉用作合成樹脂和聚合物分散相的添加物，以及將淀粉用作合成添加物的膨脹劑。所有基于淀粉的添加物中有90％被用于生產(chǎn)波面紙板，硬紙袋和包，紙和鋁的組合材料，紙箱，以及信封、郵票的濕潤(rùn)膠等。
2.3紡織品和紡織品維護(hù)工業(yè)作為佐劑和添加物的另一種可能的用途是生產(chǎn)紡織品和紡織品維護(hù)產(chǎn)品。在紡織工業(yè)中，可區(qū)分下列四個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域淀粉用作上漿劑，即作為光滑和強(qiáng)化除草籽特性的佐劑以獲得抗紡織中活躍之張力的保護(hù)作用以及在紡織過程中增加磨損抗性；作為主要在使質(zhì)量退化的預(yù)處理，如漂白、染色等之后改良紡織品的試劑；作為染料糊劑生產(chǎn)中的增稠劑以防止染料擴(kuò)散；和作為縫合紗的扭曲劑的添加物。
2.4建筑工業(yè)淀粉應(yīng)用的第四個(gè)領(lǐng)域是用作建筑材料的添加物，一個(gè)例子是生產(chǎn)灰膠紙柏板，其中用水使混合于稀灰漿中的淀粉糊化，淀粉在灰膠紙柏板的表面進(jìn)行擴(kuò)散，從而使紙板與板結(jié)合。應(yīng)用的其它領(lǐng)域是將淀粉與灰漿和礦物纖維混合。在混合好的凝結(jié)物中，可使用淀粉以使上漿的進(jìn)程減速。
2.5研磨的穩(wěn)定化另外，淀粉利于生產(chǎn)用于研磨穩(wěn)定化的設(shè)備，該設(shè)備可用于臨時(shí)保護(hù)研磨顆?？谷斯ね赁D(zhuǎn)動(dòng)中的水。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的知識(shí)，可認(rèn)為由淀粉和聚合物乳劑組成的混合產(chǎn)物與目前使用的產(chǎn)品具有相同的可減少腐蝕和結(jié)殼的效果，但前者相對(duì)較便宜。
2.6淀粉用于植物保護(hù)劑和肥料另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是將淀粉用于植物保護(hù)劑以修飾這些制品的特殊特性，例如，淀粉可用于改善植物保護(hù)劑和肥料的濕度，活性組分的劑量釋放，將液體的、易揮發(fā)的和/或有氣味的活性組分轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒕У?、穩(wěn)定的、可變形的物質(zhì)，混合不相容的組合物，以及因武碎減少而導(dǎo)致的作用時(shí)期延長(zhǎng)。
2.7藥物、藥品和化妝品工業(yè)淀粉也可用于藥物、藥品和化妝品工業(yè)領(lǐng)域。在制藥工業(yè)中，淀粉可用作片劑的結(jié)合劑或用于膠囊內(nèi)的結(jié)合劑的稀釋中。另外，淀粉也適用于片劑的崩解劑，因?yàn)橥ㄟ^吞咽，淀粉吸收了液體，短時(shí)間后，淀粉膨脹以使活性組分被釋放出來。為了質(zhì)量的原因，藥品的流動(dòng)性和噴灑的粉末是另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域。在化妝品領(lǐng)域，淀粉可用作例如粉末添加物的載體，所述添加物為香味劑和水楊酸。淀粉相對(duì)較廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域是牙膏。
2.8淀粉用作煤炭和煤球的添加物淀粉也可用作煤炭和煤球的添加物。通過加入淀粉，煤炭可以定量凝聚和/或以高質(zhì)量成球，從而防止煤球在球化之前崩解。燒烤用的煤炭含有4-6％加入的淀粉，加熱用的煤炭含有0.1-0.5％加入的淀粉。另外，淀粉適于用作結(jié)合劑，因?yàn)閷⒌矸奂尤朊禾亢兔呵蛑锌梢栽诤艽蟪潭壬蠝p少有毒物質(zhì)的散發(fā)。
2.9礦石和煤漿的加工另外，在礦石和煤漿的加工過程中，淀粉也可用作絮凝劑。
2.10淀粉用作鑄造中的添加物另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是用作鑄造中加工材料的添加物。對(duì)于多種鑄造過程而言，需要由粗礦石與結(jié)合劑混合以產(chǎn)生核心。目前，最常用的結(jié)合劑是與經(jīng)修飾的淀粉、多半為膨脹淀粉混合的膨潤(rùn)土。
加入淀粉的目的是增加流動(dòng)抗性以及改善結(jié)合強(qiáng)度，另外，膨脹淀粉可滿足更多的生產(chǎn)過程中的先決條件，如在冷水中的分散能力、重新水合的能力、與粗礦石良好的混合能力和高的結(jié)合水的能力。
2.11淀粉用于橡膠工業(yè)在橡膠工業(yè)中，淀粉可用于改良技術(shù)和光學(xué)質(zhì)量，原因是可改良表面光澤度、握力和外觀。為此，在冷硬化之前將淀粉分散于橡膠物質(zhì)粘性的涂有橡膠的表面。淀粉也可用于改良橡膠的可印刷能力。
2.12生產(chǎn)皮革代用品經(jīng)修飾之淀粉的另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是生產(chǎn)皮革代用品。
2.13合成聚合物中的淀粉在塑料市場(chǎng)出現(xiàn)了下列應(yīng)用領(lǐng)域在加工過程中摻入源于淀粉的產(chǎn)物(淀粉僅是填料，合成的聚合物和淀粉之間沒有直接的連鍵)或，另一種選擇是生產(chǎn)聚合物時(shí)摻入源于淀粉的產(chǎn)物(淀粉和聚合物形成穩(wěn)定的鍵)。
純粹只用作填料的淀粉不能與其它物質(zhì)比如滑石競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)特殊的淀粉特性變得有效，從而終產(chǎn)物的特性分布明顯改變時(shí)情況會(huì)有所不同。一個(gè)例子是在加工熱塑材料如聚乙烯時(shí)使用淀粉產(chǎn)物，籍此，利用共表達(dá)，按1∶1的比率混合淀粉和合成的聚合物以形成母料，由此可通過使用顆?；垡蚁┑钠胀夹g(shù)產(chǎn)生多種產(chǎn)物。淀粉摻入聚乙烯薄膜中可增加中空體中物質(zhì)的滲透性，改良水蒸氣的滲透性，改良抗靜電特性，改良抗阻塞特性以及改良含水染料在其上的印刷能力。淀粉還可以用于聚氨酯泡沫，由于淀粉衍生物的變動(dòng)以及由于加工技術(shù)的最優(yōu)化，可以特異性地控制合成聚合物和淀粉羥基之間的反應(yīng)，結(jié)果因使用了淀粉使得聚氨酯薄膜具有下列特性分布熱擴(kuò)張系數(shù)降低，收縮特性降低，壓力/張力特性得以改良，水蒸氣滲透性增加而接受水的能力未變，燃燒能力和裂化密度降低，不會(huì)脫落易燃的部分，不含鹵化物，并能減緩老化。目前仍存在的不利之處是壓力和沖擊強(qiáng)度有所降低。
薄膜的產(chǎn)品開發(fā)不是唯一的選擇，利用超過50％的淀粉含量也可產(chǎn)生固體塑料產(chǎn)品，如盆、盤和碗。另外，淀粉/聚合物混合物提供了更易于生物降解的優(yōu)點(diǎn)。
另外，由于淀粉與水結(jié)合的極端能力，淀粉移植的聚合物最為重要。這些產(chǎn)品具有淀粉骨架和根據(jù)基鏈機(jī)理移植到淀粉上的合成單體的側(cè)格。目前可用的淀粉移植聚合物的特色在于其具有高粘度的達(dá)1000克水/克淀粉的改良的結(jié)合和保留能力。這些超級(jí)吸附劑主要用于衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域如尿布和床單這類的產(chǎn)品，以及農(nóng)業(yè)部門如種子顆粒。
如何選擇使用經(jīng)重組DNA技術(shù)修飾的新淀粉一方面取決于結(jié)構(gòu)，水含量，蛋白質(zhì)含量，脂質(zhì)含量，纖維含量，灰分/磷酸含量，直鏈淀粉/支鏈淀粉比率，相對(duì)分子量的分布，分支的程度，顆粒大小和形狀以及結(jié)晶作用；另一方面取決于導(dǎo)致下列特征的特性流動(dòng)和吸附特性，糊化溫度，粘度，增稠特性，溶解性，糊劑結(jié)構(gòu)，透明度，對(duì)熱，剪切力和酸的抗性，反向傾向，形成凝膠的能力，對(duì)冷凍/融化的抗性，形成復(fù)合物的能力，碘結(jié)合性，薄膜形成，粘附強(qiáng)度，酶穩(wěn)定性，可消化能力和反應(yīng)性。
經(jīng)遺傳操作轉(zhuǎn)基因植物對(duì)已修飾淀粉的生產(chǎn)可以某種途徑修飾源于所述植物的淀粉的特性從而沒有必要通過化學(xué)或物理方法對(duì)其進(jìn)一步修飾。另一方面，通過重組DNA技術(shù)修飾的淀粉可能會(huì)經(jīng)受進(jìn)一步的化學(xué)修飾，由此導(dǎo)致進(jìn)一步改善上述某些應(yīng)用領(lǐng)域的質(zhì)量。這些化學(xué)修飾理論上是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它們尤其是通過-熱處理-酸處理-氧化處理和-酯化處理進(jìn)行的修飾，所述修飾會(huì)導(dǎo)致磷酸酯、硝酸酯、硫酸酯、黃原酸酯、醋酸酯和檸檬酸酯淀粉的形成。其它有機(jī)酸也可以用于酯化-形成淀粉醚淀粉烷基醚，O-烯丙醚，羥烷基醚，O-羧甲基醚，含N的淀粉醚，含P的淀粉醚，和含S的淀粉醚-形成分支淀粉-形成淀粉移植的聚合物。
優(yōu)選將本發(fā)明的淀粉用于生產(chǎn)包裝和一次性使用的材料。
為了在植物細(xì)胞中以有義或反義方向表達(dá)本發(fā)明的核酸分子，可將所述核酸分子與確保在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)控DNA元件連接。特別地，這種調(diào)控DNA元件是啟動(dòng)子，基本上在植物細(xì)胞中有活性的任何啟動(dòng)子都可用于表達(dá)。
可選擇啟動(dòng)子以便組成型表達(dá)或在某個(gè)組織中表達(dá)，在植物發(fā)育的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)或由內(nèi)部環(huán)境決定的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)。對(duì)于植物而言，啟動(dòng)子可以是同源的或異源的。用于組成型表達(dá)的適當(dāng)啟動(dòng)子是例如花椰菜花葉病毒35S RNA啟動(dòng)子和玉米遍在蛋白啟動(dòng)子。為了在馬鈴薯中進(jìn)行塊莖特異性表達(dá)，可使用patatin基因啟動(dòng)子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.,8(1989),23-29)?？纱_保僅在光合活性組織中表達(dá)的啟動(dòng)子的一個(gè)例子是ST-LS1啟動(dòng)子(Stockhaus等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，84(1987),7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.,8(1989),2445-2451)。小麥HMG啟動(dòng)子、USP啟動(dòng)子、云扁豆蛋白啟動(dòng)子或玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子適用于胚乳特異性表達(dá)。另外，也可存在終止序列，該序列可用于正確地終止轉(zhuǎn)錄并給轉(zhuǎn)錄物加上一polyA尾，據(jù)信這可以穩(wěn)定該轉(zhuǎn)錄物。這樣的元件描述于文獻(xiàn)中(參見Gielen等，EMBO J.,8(1989),23-29)，并可根據(jù)需要進(jìn)行更換。
本發(fā)明提供了編碼兩種不同類型的小麥淀粉合酶的核酸分子，從而能夠鑒定這些同種型在淀粉生物合成中的功能，而且能夠生產(chǎn)經(jīng)遺傳修飾的植物，所述植物中至少一種所述酶的活性有所修飾。這樣使得可在按此方式操作得到的植物中合成具有經(jīng)修飾的結(jié)構(gòu)因而具有經(jīng)修飾的物理-化學(xué)特性的淀粉。
也可使用本發(fā)明的核酸分子來生產(chǎn)植物，該植物中至少有一種本發(fā)明的淀粉合酶的活性有所增加或降低，或者是在此同時(shí)，該植物參與淀粉生物合成的其它酶的活性也有修飾。因此，所有種類的組合和替代都是可以想到的。通過修飾植物中一種或多種淀粉合酶同種型的活性，即可合成其結(jié)構(gòu)經(jīng)過修飾的淀粉。通過增加經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的淀粉儲(chǔ)存組織(如玉米或小麥的胚乳或馬鈴薯的塊莖)的細(xì)胞中一種或多種淀粉合酶同種型的活性，即可增加產(chǎn)量。例如，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子或相應(yīng)的反義構(gòu)建體可整合到植物細(xì)胞中；因反義效應(yīng)或突變，該細(xì)胞中內(nèi)源GBSSⅠ-、SSS-或GBSSⅡ-蛋白的合成已被抑制，或該細(xì)胞中分支酶的合成已被抑制(例見Nakamura等(文獻(xiàn)同上))。
如果想抑制轉(zhuǎn)化植物中幾種淀粉合酶的合成，可使用DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述DNA分子同時(shí)含有幾個(gè)反義方向的受適當(dāng)啟動(dòng)子控制的區(qū)域，所述區(qū)域編碼相應(yīng)的淀粉合酶。此處每個(gè)序列可由其自身的啟動(dòng)子控制，或者這些序列也可以共同啟動(dòng)子的融合形式轉(zhuǎn)錄。一般優(yōu)選后者，因?yàn)樵谶@種情況下，各個(gè)蛋白質(zhì)的合成應(yīng)可以抑制到大致相同的程度。
另外，可以構(gòu)建DNA分子，其中除了含有編碼淀粉合酶的DNA序列以外，還含有編碼參與淀粉合成的其它蛋白質(zhì)或其修飾形式的DNA序列?？稍俅螌⑿蛄邪错樞蜻B接，并通過共同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。至于這種構(gòu)建體中所用的各個(gè)編碼區(qū)的長(zhǎng)度，與涉及反義構(gòu)建體產(chǎn)生的上述討論是一樣的。由這種DNA分子中的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的反義片段的數(shù)目沒有上限，然而所得轉(zhuǎn)錄物應(yīng)該不大于10kb，優(yōu)選為5kb。
與其它編碼區(qū)一起位于這樣的DNA分子中適當(dāng)啟動(dòng)子之后的反義方向上的編碼區(qū)可得自編碼下列蛋白質(zhì)的DNA序列與顆粒結(jié)合的淀粉合酶(GBSSⅠ和Ⅱ)，其它可溶性淀粉合酶，分支酶，去分支酶，歧化酶和淀粉磷酸化酶，這種列舉只是為了舉例，也可以在這樣的聯(lián)合構(gòu)架內(nèi)使用其它DNA序列。
利用這種構(gòu)建體可以在被這些分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞內(nèi)同時(shí)抑制幾種酶的合成。
另外，構(gòu)建體也可整合到標(biāo)準(zhǔn)的突變體中，所述突變體中一個(gè)或多個(gè)淀粉生物合成的基因有缺陷。這些缺陷與下列蛋白質(zhì)有關(guān)與顆粒結(jié)合的淀粉合酶(GBSSⅠ和Ⅱ)和可溶性淀粉合酶(SSSⅠ和Ⅱ)，分支酶(BEⅠ和Ⅱ)，去分支酶(R-酶)，歧化酶和淀粉磷酸化酶，這種列舉只是為了舉例。
利用這種策略，還可以在被這些核酸分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞內(nèi)同時(shí)抑制幾種酶的合成。為了使外源基因整合到高等植物中，可使用大量克隆載體，所述載體含有大腸桿菌的復(fù)制信號(hào)和用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞的標(biāo)記基因。這種載體的例子是pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。所需序列可整合到載體中的適當(dāng)限制性位點(diǎn)處。將所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，隨后收集細(xì)胞并裂解之，回收質(zhì)粒。至于鑒定所得質(zhì)粒DNA的分析方法，通常使用限制性分析、凝膠電泳和其它生物化學(xué)-分子生物學(xué)方法。每次操作后，可切割質(zhì)粒DNA，將所得DNA片段與其它DNA序列連接?？蓪⒚糠N質(zhì)粒DNA克隆到相同的或其它質(zhì)粒中?？墒褂枚喾N技術(shù)將DNA整合到植物宿主細(xì)胞中，這些技術(shù)包括使用根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌作為轉(zhuǎn)化介質(zhì)用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、原生質(zhì)體融合、DNA注射和電穿孔，利用biolistic法整合DNA以及其它技術(shù)。
對(duì)于注射、biolistic法和將DNA電穿孔至植物細(xì)胞的技術(shù)而言，對(duì)所用的質(zhì)粒沒有特別的要求，可使用如pUC衍生物這樣的簡(jiǎn)單質(zhì)粒。然而，在由按此方式轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生整個(gè)植株的情況下，應(yīng)存在選擇性的標(biāo)記基因。
取決于將所需基因整合至植物細(xì)胞的方法，可能必需其它的DNA序列。如果使用Ti或Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，通常應(yīng)至少將Ti和Ri質(zhì)粒T-DNA的右邊緣序列、然而更通常應(yīng)將其右和左邊緣序列與外源基因連接以作為側(cè)翼區(qū)域整合。
如果使用土壤桿菌轉(zhuǎn)化，應(yīng)將待整合的DNA克隆至特殊的質(zhì)粒中，即或者克隆至中間載體中，或者克隆至二元載體中。由于與T-DNA序列同源的序列，中間體載體可因同源重組整合到土壤桿菌的Ti或Ri質(zhì)粒中。所述質(zhì)粒也含有T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的vir-區(qū)域，中間載體在土壤桿菌中不能復(fù)制。利用輔助質(zhì)粒可使中間載體轉(zhuǎn)移至根癌土壤桿菌中(接合)。二元載體在大腸桿菌以及土壤桿菌中都可復(fù)制，它們含有選擇性標(biāo)記基因以及由右和左T-DNA邊緣區(qū)域所包圍的接頭或多接頭?？芍苯訉⑺鼈冝D(zhuǎn)化至土壤桿菌中(Holsters等，Mol.Gen.Genet.,163(1978),181-187)。用作宿主細(xì)胞的土壤桿菌應(yīng)含攜有vir-區(qū)域的質(zhì)粒。通常vir-區(qū)域是將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中所必需的。也可能存在其它的T-DNA。使用以此方式轉(zhuǎn)化的土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
使用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞已得到深入研究，詳細(xì)的描述見EP120516；Hoekema，二元植物載體系統(tǒng)Offsetdrukkerij Kanters B.V.,Alblasserdam(1985)，第Ⅴ章；Fraley等，植物科學(xué)的評(píng)論性綜述,4,1-46和An等，EMBO J.,4(1985),277-287。
為了將DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞，植物外植體適于與根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌共培養(yǎng)。然后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中由被感染的植物材料(如葉片、莖的節(jié)段、根、以及原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的植物細(xì)胞)再生整個(gè)植株，所述培養(yǎng)基中含有抗生素或殺生物劑(biozide)以選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。然后檢測(cè)以此方式得到的植物中是否存在整合的DNA。通過使用biolistic法或通過轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體整合外源DNA的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例見Willmitzer,L.,1993，轉(zhuǎn)基因植物生物技術(shù)，多卷論文集(H.J.Rehm,G.Reed,A.Puhler,P.Stadler編)，第2卷，627-659，VCH Weiheim-New York-Basel-Cambridge)。
轉(zhuǎn)化單子葉植物的其它系統(tǒng)是利用biolistic法轉(zhuǎn)化、電學(xué)或化學(xué)誘導(dǎo)DNA整合至原生質(zhì)體中、部分滲透細(xì)胞的電穿孔、將DNA大量注射到花序中、將DNA微量注射到微孢子和原胚中、通過使花粉萌發(fā)整合DNA、通過膨脹將DNA整合到胚中(參見Potrykus，植物生理學(xué)(1990),269-273)。
盡管通過利用根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化雙子葉植物是成熟的方法,但最新研究表明也可使用基于土壤桿菌的載體轉(zhuǎn)化單子葉植物(Chan等，植物分子生物學(xué)，22(1993),491-506；Hiei等，植物學(xué)雜志，6(1994),271-282；Bytebier等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，84(1987),5345-5349；Raineri等，Bio/Technology 8(1990),33-38；Gould等，植物生理學(xué)，95(1991),426-434；Mooney等，植物、細(xì)胞組織和器官培養(yǎng)，25(1991),209-218；Li等，植物分子生物學(xué)，20(1992),1037-1048)。
以前已為多種類型的谷物建立了上述轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的三個(gè)植物組織的電穿孔、原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和通過對(duì)再生組織和細(xì)胞進(jìn)行顆粒轟擊來轉(zhuǎn)移DNA(例見Jahne等，Euphytica 85(1995),35-44)。
在相應(yīng)的文獻(xiàn)中以多種方式描述了小麥的轉(zhuǎn)化(參見Maheshwari等，植物科學(xué)的評(píng)論性綜述，14(2)(1995),149-178)。Hess等人(植物科學(xué)，72(1990),233)使用大量注射以使花粉和土壤桿菌相互靠近。通過Southern印跡分析和NPTⅡ試驗(yàn)證明了含有nptⅡ基因作為選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化體構(gòu)成了正常的表型，并且是可育的，在兩個(gè)連續(xù)的世代中都證明了卡那霉素抗性。
Vasil等人(Bio/Technology,10(1992),667-674)描述了第一個(gè)轉(zhuǎn)基因的、可育的小麥植株，該植株被與微粒結(jié)合的DNA轟擊后可再生。轟擊的靶組織是胚性愈傷組織培養(yǎng)物(C型愈傷組織)。使用bar基因作為選擇性標(biāo)記基因，該基因編碼膦絲菌素(phosphinotricine)磷酸轉(zhuǎn)移酶因而可賦予對(duì)除草劑膦絲菌素的抗性。
Weeks等人(植物生理學(xué)，102(1993),1077-1084)以及Becker等人(植物學(xué)雜志，5(2)(1994),299-307)描述了其它系統(tǒng)。此處將未成熟胚的盾片用作DNA轉(zhuǎn)化的靶組織。在一個(gè)導(dǎo)入性的體外相中，處理盾片使其可誘導(dǎo)體細(xì)胞胚。與Weeks等人建立的系統(tǒng)相比，在Becker等人(文獻(xiàn)同上)開發(fā)的系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化效率相當(dāng)高，為每83個(gè)‘Florida’類的胚可得到1株轉(zhuǎn)基因植物，而前者為每1000個(gè)‘Bobwhite’類的胚僅可得到1-2株轉(zhuǎn)基因植物。
由Becker等人(文獻(xiàn)同上)開發(fā)的系統(tǒng)構(gòu)成了實(shí)施例所述轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
一旦被導(dǎo)入的DNA已整合到植物細(xì)胞的基因組中，通常該DNA會(huì)在基因組中持續(xù)穩(wěn)定，在原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞的子代中也能維持穩(wěn)定。該DNA通常還含有選擇性標(biāo)記，該標(biāo)記可賦予經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞對(duì)殺生物劑如膦絲菌素的抗性，或?qū)股乇热缈敲顾?、G418、博來霉素或潮霉素等的抗性，因此，獨(dú)立選擇的標(biāo)記應(yīng)可允許從缺乏整合的DNA的細(xì)胞中選擇出以被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
可使用植物學(xué)中常用的方法培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(見McCormick等人，植物細(xì)胞通訊5(1986),81-84)?？梢酝ǔ５姆绞脚囵B(yǎng)所得植物，并與具有相同的轉(zhuǎn)化遺傳特性或另一種遺傳特性的植物雜交育種，所得雜合個(gè)體具有相應(yīng)的表型特征。該植物細(xì)胞可產(chǎn)生種子。
應(yīng)培養(yǎng)兩代或更多代以確保表型特征是否能保持穩(wěn)定，以及是否會(huì)傳遞。另外，應(yīng)收獲種子以確保相應(yīng)的表型或其它特性可以維持。
在實(shí)施例中使用了下列方法1．克隆為了在大腸桿菌中克隆，使用了載體pBluesciptⅡ SK(Stra-tagene)。
2．細(xì)菌菌株針對(duì)Bluescipt載體和反義構(gòu)建體使用了大腸桿菌菌株DH5α(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburgh,USA)。為進(jìn)行體內(nèi)切割使用了大腸桿菌菌株XL1-Blue。
3．轉(zhuǎn)化未成熟的小麥胚所用培養(yǎng)基MS:100ml/l大分子鹽1ml/l小分子鹽2ml/l Fe/NaEDTA30g/l蔗糖(D.Becker和H.Lorz，植物組織培養(yǎng)手冊(cè)(1996),B12:1-20)#30:MS+2.4-D(2mg/l)#31:MS+2.4-D(2mg/l)+膦絲菌素(PPT，除草劑BASTA的活性組分(2mg/l))#32:MS+2.4-D(0,1mg/l)+PPT(2mg/l)#39:MS+2.4-D(2mg/l)+各0.5M甘露糖/山梨糖醇用KOH將所述培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至5.6，并用0.3％的Gelrite加固。
Becker和Lorz(D.Becker和H.Lorz，植物組織培養(yǎng)手冊(cè)(1996),B12:1-20)開發(fā)并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化小麥未成熟胚的方法。
在下文所述的實(shí)驗(yàn)中，觀察到由Becker和Lorz(文獻(xiàn)同上)制訂的方案。為了轉(zhuǎn)化，可在開花之后收獲12-14天發(fā)育階段中的帶穎果的復(fù)穗狀花序，并對(duì)該花序進(jìn)行表面滅菌。將分離的盾片鋪平，使其胚軸線面向誘導(dǎo)培養(yǎng)基#30。
預(yù)培養(yǎng)(26℃，黑暗)2-4天后，將外植體轉(zhuǎn)移到#39培養(yǎng)基上，以進(jìn)行滲透預(yù)培養(yǎng)(2-4小時(shí)，26℃，黑暗)。
對(duì)于biolistic轉(zhuǎn)化而言，每次轟擊使用29μg金顆粒，所述顆粒上已沉淀了5μg或73ng靶DNA。由于所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)是共轉(zhuǎn)化，按1∶1的比率在沉淀混合物中加入靶DNA，所述靶DNA由靶基因和抗性標(biāo)記基因(bar基因)組成。
4．用DIG標(biāo)記DNA片段通過特異性PCR摻入DIG標(biāo)記的dUTP(Boehringer Mannheim，德國(guó))可標(biāo)記用作篩選探針的DNA片段。
實(shí)施例1鑒定、分離和表征編碼小麥(Tricitum aestivum L.,cvFlorida)可溶性淀粉合酶的cDNA由約21日齡的小麥穎果的poly(A)+-RNA合成cDNA，根據(jù)廠商的方案(ZAP-cDNA合成試劑盒和ZAP-cDNA GigapackⅡ GoldCloning試劑盒，Stratagene GmbH,Heidelberg)進(jìn)行下文提及的所有實(shí)驗(yàn)。
測(cè)定cDNA文庫(kù)的滴度之后，發(fā)現(xiàn)原始滴度為1.25×106pfu/ml。利用經(jīng)DIG標(biāo)記的DNA片段進(jìn)行篩選。將編碼水稻可溶性淀粉合酶之亞片段的經(jīng)DIG-標(biāo)記的PCR片段(Baba等，文獻(xiàn)同上)用作探針，PCR所用引物的序列為R1:ACA GGA TCC TGT GCT ATG CGG CGT GTG AAG (Seq.ID No.3)R2:TTG GGA TCC GCA ATG CCC ACA GCA TTT TTT TC (Seq.ID No.4)為了進(jìn)行篩選，在每個(gè)平板(直徑15cm)上平鋪約5×104pfu，挑選陽(yáng)性克隆。通過體內(nèi)切割得到單個(gè)分離的克隆，即pBluescript SK(-)噬菌粒。
利用少量制備法分析克隆之后和對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性分析之后，進(jìn)一步地加工TaSSS克隆。
分離克隆TaSSS的質(zhì)粒DNA，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，74(1977),5463-5467)測(cè)定cDNA插入片段的序列。
首先測(cè)定含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸186-2239的部分序列，在該序列5’末端含有一多余的G殘基?？寺aSSS的插入片段長(zhǎng)度為2239 bp，并構(gòu)成了幾乎全長(zhǎng)的cDNA，該核苷酸序列示于SEQ IDNO:1，相應(yīng)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。推定的信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于SEQ ID NO:1所示氨基酸殘基33和34之間。
序列分析和與已公開的序列的比較表明SEQ ID NO:1所示序列是新序列并含有幾乎全長(zhǎng)的編碼區(qū)，該編碼區(qū)表現(xiàn)出與其它生物體的可溶性淀粉合酶具有同源性。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員利用TaSSS的部分cDNA序列能分離出5’區(qū)缺失掉的區(qū)域，從而得到完整的cDNA克隆。為此可使用克隆TaSSS的5’區(qū)作為探針以篩選完整的cDNA，通過利用雜交的標(biāo)準(zhǔn)方法可分離完整的克隆，另一方面，通過使用5’-Race-法(如Boehringer Mannheim或其它廠商)可得到所缺失掉的5’末端。
實(shí)施例3植物轉(zhuǎn)化載體pTaSSS-as的制備為了表達(dá)小麥分離的cDNA的反義RNA，以pUC19為基本質(zhì)粒設(shè)計(jì)植物轉(zhuǎn)化載體，其中在反義方向上將質(zhì)粒pTaSSS的cDNA插入片段與DNA片段連接，因此表達(dá)受到遍在蛋白啟動(dòng)子的控制。此啟動(dòng)子由玉米遍在蛋白1基因第一個(gè)未翻譯的外顯子和第一個(gè)內(nèi)含子組成(Christen-sen A.H.等，植物分子生物學(xué)，18(1992),675-689)。
多接頭和NOS-終止子部分得自質(zhì)粒pAct1.cas(CAMBIA,TG0063；Cambia,GPO Box 3200,Canberra ACT 2601，澳大利亞)，McElroy等人描述了具有此終止子的載體構(gòu)建體和基于pAct1.cas的構(gòu)建體(分子育種1(1995),27-37)。使用如上所述的pTaSSS轉(zhuǎn)化小麥。
實(shí)施例4鑒定、分離和表征編碼小麥(Tricitum aestivum L.,cvFlorida)淀粉合酶的另一個(gè)cDNA在目前已知的編碼植物可溶性的和與顆粒結(jié)合的淀粉合酶序列的比較中，可明顯看出不同蛋白質(zhì)有3個(gè)高度保守的區(qū)域。
為了分離小麥可溶性淀粉合酶，選擇這3個(gè)區(qū)域以產(chǎn)生多克隆的肽抗體，因此，制備具有下列氨基酸序列的3個(gè)合成多肽肽1NH2-PWSKTGGLGDVC-COOH (SEQ ID NO:7)肽2NH2-PSRFEPCGLNQLY-COOH(SEQ ID NO:8)肽3NH2-GTGGLRDTVENC-COOH (SEQ ID NO:9)將這些肽與KLH載體(匙孔血藍(lán)蛋白)偶聯(lián)，隨后用于在兔(Eurogentec,Seraing，比利時(shí))中制備多克隆抗體。
所得抗體被稱為
抗肽1的抗SS1多克隆抗體，抗肽2的抗SS2多克隆抗體，抗肽3的抗SS3多克隆抗體。
隨后使用抗體以在小麥穎果的cDNA文庫(kù)中篩選出編碼小麥淀粉合酶的序列。為此，可使用按實(shí)施例1所述產(chǎn)生的cDNA表達(dá)文庫(kù)。為了分析噬菌體的噬斑，將所述文庫(kù)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，該濾膜已預(yù)先在10mM IPTG溶液中保溫30-60分鐘，并在Whatman濾紙上干燥好。37℃下轉(zhuǎn)移3小時(shí)，然后于室溫下將濾膜與封閉溶液保溫30分鐘，再用TBST-緩沖液洗滌兩次達(dá)5-10分鐘。將濾膜與適當(dāng)稀釋度的多克隆抗體一起在室溫下振蕩1小時(shí)或在4℃下振蕩16小時(shí)。根據(jù)廠商的說明書，利用Immun-Blot Assay試劑盒和山羊抗兔IgG(Biorad)鑒定出表達(dá)了已被一種抗體所識(shí)別的蛋白質(zhì)的噬斑。使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)一步純化cDNA文庫(kù)中表達(dá)了已被一種抗體所識(shí)別的蛋白質(zhì)的噬菌體克隆。利用體內(nèi)切割法(Strategene)由陽(yáng)性噬菌體克隆產(chǎn)生大腸桿菌克隆，該大腸桿菌克隆含有雙鏈pBluescriptⅡ SK質(zhì)粒，相應(yīng)的cDNA插入片段位于多接頭的EcoRⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)之間。檢查插入片段的大小和限制性切割的模式之后，對(duì)適當(dāng)?shù)目寺aSSS進(jìn)行序列分析。
實(shí)施例5 pTaSS1質(zhì)粒的cDNA插入片段的序列分析由pTaSS1克隆分離質(zhì)粒DNA，通過使用雙脫氧核苷酸法(Sanger等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，74(1977),5463-5467)的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定cDNA插入片段的序列。
首先測(cè)定含有SEQ ID NO:5所示的核苷酸1084-2825的部分序列。pTaSS1克隆插入片段的長(zhǎng)度為2825bp，并構(gòu)成了完整的cDNA，該核苷酸序列示于SEQ ID NO:5，相應(yīng)的氨基酸序列示于SEQID NO:6。
序列分析和與已公開的序列的比較表明SEQ ID NO:5所示序列是新序列并含有編碼區(qū)，該編碼區(qū)表現(xiàn)出與其它生物體的淀粉合酶具有同源性。推測(cè)此cDNA編碼的蛋白質(zhì)具有與顆粒結(jié)合性淀粉合酶的生物活性。
另外，由于與信號(hào)肽切割位點(diǎn)的已知一致序列具有同源性，已發(fā)現(xiàn)推定的信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)肽在SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的第57和58或第60和61位之間發(fā)生切割。
實(shí)施例6植物轉(zhuǎn)化載體pTaSS1-as的制備為了表達(dá)小麥分離的cDNA的部分反義RNA，以pUC19為基本質(zhì)粒構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體，植物轉(zhuǎn)化載體在反義方向上部分含有質(zhì)粒pTaSS1的cDNA插入片段。表達(dá)受遍在蛋白啟動(dòng)子的控制，此啟動(dòng)子由玉米遍在蛋白1基因第一個(gè)未翻譯的外顯子和第一個(gè)內(nèi)含子組成(Christen-sen A.H.等，植物分子生物學(xué)，18(1992),675-689)。
多接頭和NOS終止子部分得自質(zhì)粒pAct.cas(CAMBIA,TG0063；Cambia,GPO Box 3200,Canberra ACT 2601，澳大利亞)，McElroy等人描述了具有此終止子的載體構(gòu)建體和基于pAct1.cas的構(gòu)建體(分子育種，1(1995),27-37)。
使用如上所述的pTaSS1-as載體轉(zhuǎn)化小麥。
實(shí)施例7大腸桿菌突變體與編碼小麥可溶性淀粉合酶的cDNA克隆互補(bǔ)通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分析由cDNA克隆TaSSS(實(shí)施例2)編碼的可溶性淀粉合酶的酶活性，所述互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)使用了大腸桿菌突變體Hfr G6MD2(M.Schwartz菌株；CGSC#5080；大腸桿菌遺傳保藏中心，NewHavan，美國(guó))作為宿主以表達(dá)基因。該大腸桿菌突變體表現(xiàn)出編碼細(xì)菌ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(glg C)、糖原合酶(glg A)和分支酶(glg B)的glg操縱子的缺失。該突變導(dǎo)致不能經(jīng)ADP-葡萄糖途徑合成糖原。另外，mal A操縱子的缺失阻止了由淀粉麥芽糖酶合成線性α-1,4-葡聚糖(mal Q)。
通過質(zhì)粒pTaSSSΔ188和pACAG共轉(zhuǎn)化突變體G6MD2來檢測(cè)可溶性淀粉合酶的功能性。質(zhì)粒pTaSSSΔ188含有所說的2239bp cDNA序列的核苷酸188-2239，此段序列編碼可溶性淀粉合酶。將此cDNA作為EcoRⅠ/XhoⅠ片段插入pBluescript載體(Stratagene)的多接頭區(qū)域，這使得由載體編碼的β-半乳糖苷酶α肽的N末端與可溶性淀粉合酶的一部分讀框一致地融合。
對(duì)G6MD2中糖原合酶(glg A)突變的成功互補(bǔ)取決于ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的表達(dá)，該酶負(fù)責(zé)提供可作為α-1,4-葡聚糖合成之底物的ADP-葡萄糖，因此，共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pACAG(Abel G.J.W.,(1995),Untersuchungen zur Funktion Von Starke-Synthasen in derKartoffel(Solanum tuberosum L.),Dissertation,Freie UniversitatBerlin)，該質(zhì)粒含有分離自大腸桿菌菌株LCB618的glg C基因座的編碼區(qū)(Baecker等，生物化學(xué)雜志，258(1983)5084-5088)，該編碼區(qū)受lacZ啟動(dòng)子的控制。所編碼的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性受激活劑果糖-1,6-二磷酸和抑制劑AMP的影響較小，從而可以充足地提供ADP-葡萄糖。
將被構(gòu)建體pTaSSSΔ188和pACAG共轉(zhuǎn)化的細(xì)胞平鋪在補(bǔ)加了1％葡萄糖、1mM IPTG和50μM二氨基庚二酸鹽的LB-瓊脂平板上。通過碘氣流染色所得菌落，經(jīng)轉(zhuǎn)化的G6MD2細(xì)胞顯示出亮藍(lán)褐色，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落顯示出黃色，藍(lán)褐色表明表達(dá)的融合蛋白具有ADP葡萄糖α-1,4-葡聚糖4-α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。
通過碘染色經(jīng)構(gòu)建體pACAG和pEc5.3共轉(zhuǎn)化的G6MD2細(xì)胞檢查該系統(tǒng)。質(zhì)粒pEc5.3含有通過PCR技術(shù)分離自大腸桿菌菌株DH5α的糖原合酶(glg A)基因(Abel G.J.W.,(1 995),Untersuchungen zurFunktion Von Starke-Synthasen in der Kartoffel(Solanum tuberosumL.),Dissertation,Freie Universitat Berlin)。經(jīng)碘染色后，已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞顯示出暗藍(lán)色，這表明合成了α-1,4-葡聚糖。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名Hoechst Schering AgrEvo GmbH(B)街道Miraustrasse 54(C)城市柏林(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵編(ZIP):13509(ⅱ)發(fā)明題目編碼小麥中參與淀粉合成的酶的核酸分子(ⅲ)序列數(shù)9(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC可兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度2239個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物Triticum aestivum L.
(B)品系cv.Florida(E)單元型約21日齡的穎果(ⅶ)直接來源
(A)文庫(kù)pBluescript sk(-)中的cDNA文庫(kù)(B)克隆TaSSS(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3…2017(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CG ACG CAG CCG CCC CTG CCG GAC GCC GGC GTG GGG GAA CTC GCG CCC47Thr Gln Pro Pro Leu Pro Asp Ala Gly Val Gly Glu Leu Ala Pro1 5 10 15GAC CTC CTG CTC GAA GGG ATT GCT GAG GAT TCC ATC GAC AGC ATA ATT 95Asp Leu Leu Leu Glu Gly Ile Ala Glu Asp Ser Ile Asp Ser Ile Ile20 25 30GTG GCT GCA AGT GAG CAG GAT TCT GAG ATC ATG GAT GCG AAT GAG CAA 143Val Ala Ala Ser Glu Gln Asp Ser Glu Ile Met Asp Ala Asn Glu Gln35 40 45CCT CAA GCT AAA GTT ACA CGT AGC ATC GTG TTT GTG ACT GGT GAA GCT 191Pro Gln Ala Lys Val Thr Arg Ser Ile Val Phe Val Thr Gly Glu Ala50 55 60GCT CCT TAT GCA AAG TCA GGG GGG TTG GGA GAT GTT TGT GGT TCG TTA 239Ala Pro Tyr Ala Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Val Cys Gly Ser Leu65 70 75CCA ATT GCT CTT GCT GCT CGT GGT CAC CGA GTG ATG GTT GTA ATG CCA 287Pro Ile Ala Leu Ala Ala Arg Gly His Arg Val Met Val Val Met Pro80 85 90 95AGA TAC TTA AAT GGG TCC TCT GAT AAA AAC TAT GCA AAG GCA TTA TAC 335Arg Tyr 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(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅲ)假設(shè)是(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:TTGGGATCCG CAATGCCCAC AGCATTTTTT TC 32(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度2825個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物Triticum aestiyum L.
(B)品系cv.Florida(E)單元型約21日齡的穎果(ⅶ)直接來源(A)文庫(kù)pBluescript sk(-)中的cDNA文庫(kù)(B)克隆pTASS1(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置162…2559(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CTTCGGCCTG ACCCCGTTCG TTTACCCCCA CACAGAGCAC ACTCCAGTCC AGTCCAGCCC 60ACTGCCACCG CGCTACTCTC CACTCCCACT GCCACCACCT CCGCCTGCGC CGCGCTCTGG 120GCGGACCAAC CCGCGAACCG TACCATCTCC CGCCCCGATC C ATG TCG TCG GCG 173Met Ser Ser Ala675GTC GCG TCC GCC GCA TCC TTC CTC GCG CTC GCG TCA GCC TCC CCC GGG221Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser Ala Ser Pro Gly680 685 690AGA TCA CGC AGG cGG GCG AGG GTG AGC GCG CAG CCA CCC CAC GCC GGG269Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro Pro His Ala Gly695 700 705GCC GGC AGG TTG CAC TGG CCG CCG TGG CCG CCG CAG CGC ACG GCT CGC317Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln Arg Thr Ala Arg710 715 720GAC GGA GCT GTG GCG GCG CTC GCC GCC GGG AAG AAG GAC GCG GGG ATC365Asp Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys Asp Ala Gly Ile725 730 735GAC GAC GCC GCC GCG TCC GTG AGG CAG CCC CGC GCA CTC CGC GGT GGC413Asp Asp Ala 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Ala Met Pro Trp Ile Val Ser Gln Asp Val Gln1300130513101315CTG GTG ATG CTG GGC ACC GGG CGC CAC GAC CTG GAG AGC ATG CTG CAG 2141Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu Ser Met Leu Gln132013251330CAC TTC GAG CGG GAG CAC CAC GAC AAG GTG CGC GGG TGG GTG GGG TTC 2189His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly Trp Val Gly Phe133513401345TCC GTG CGC CTG GCG CAC CGG ATC ACG GCG GGG GCG GAC GCG CTC CTC 2237Set Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala Asp Ala Leu Leu135013551360ATG CCC TCC CGG TTC GAG CCG TGC GGG CTG AAC CAG CTC TAC GCC ATG 2285Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met136513701375GCC TAC GGC ACC GTC CCC GTC GTG CAC GCC GTC GGC GGC CTC AGG GAC 2333Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp1380138513901395ACC GTG CCG CCG TTC GAC CCC TTC AAC CAC TCC GGG CTC GGG TGG ACG 2381Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly Leu Gly Trp Thr140014051410TTC GAC CGC GCC GAG GCG CAC AAG CTG ATC GAG GCG CTC GGG CAC TGC 2429Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala Leu Gly His Cys141514201425CTC CGC ACC TAC CGA GAC TTC AAG GAG AGC TGG AGG GCC CTC CAG GAG 2477Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg Ala Leu Gln Glu143014351440CGC GGC ATG TCG CAG GAC TTC AGC TGG GAG CAC GCC GCC AAG CTC TAC 2525Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala Ala Lys Leu Tyr144514501455GAG GAC GTC CTC GTC AAG GCC AAG TAC CAG TGG T GAACGCTAGC 2569Glu Asp Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp146014651470TGCTAGCCGC TCCAGCCCCG CATGCGTGCA TGACAGGATG GAACTGCATT GCGCACGCAG 2629GAAAGTGCCA TGGAGCGCCG GCATCCGCGA AGTACAGTGA CATGAGGTGT GTGTGGTTGA 2689GACGCTGATT CCAATCCGGC CCGTAGCAGA GTAGAGCGGA GGTATATGGG AATCTTAACT 2749TGGTATTGTA ATTTGTTATG TTGTGTGCAT TATTACAATG TTGTTACTTA TTCTTGTTAA 2809AAAAAAAAAA AAAAAA 2825(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度799個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Met Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser1 5 10 15Ala Ser Pro Gly Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro20 25 30Pro His Ala Gly Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln35 40 45Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys50 55 60Asp Ala Gly Ile Asp Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Gln Pro Arg Ala65 70 75 80Leu Arg Gly Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val85 90 95Lys Thr Leu Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro100 105 110Ala Ala Arg Gln Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Met Pro115 120 125Val Asn Gly Glu Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp130 135 140Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro Ser Thr Gln Asn145 150 155 160Arg Ala Pro Val Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Pro165 170 175Thr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser180 185 190Ile Ser Asp Lys Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ala Glu Lys Thr Pro195 200 205Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Glu Ser Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ser210 215 220Asp Thr Val Ser Asp Val Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Val225 230 235 240Val Glu Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro245 250 255Ala Val Gln Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu260 265 270Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala Val Ala Asp Asp Ala275 280 285Gly Ser Phe Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly290 295 300Glu Asn Val Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp305 310 315 320Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala325 330 335Leu Ala Lys Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly340 345 350Asp Tyr Glu Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala355 360 365Ala Gly Gln Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly370 375 380Val Asp Phe Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Glu385 390 395 400Asp Ile Tyr Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu405 410 415Phe Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly420 425 430Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His435 440 445Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly450 455 460Leu Met Gln Tyr Thr Arg Ser Ile Met Val Ile His Asn Ile Ala His465 470 475 480Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu485 490 495His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His500 505 510Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val Val515 520 525Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp530 535 540Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile545 550 555 560Val Asn Gly Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Ala His565 570 575Leu Lys Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser580 585 590Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln595 600 605Val Arg Ala Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly610 615 620Gln Lys Gly Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser625 630 635 640Gln Asp Val Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu645 650 655Ser Met Leu Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly660 665 670Trp Val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala675 680 685Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln690 695 700Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly705 710 715 720Gly Leu Arg Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly725 730 735Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala740 745 750Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg755 760 765Ala Leu Gln Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala770 775 780Ala Lys Leu Tyr Glu Asp Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp785 790 795(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7Pro Trp Ser Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Cys1 5 10(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Gly Thr Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Glu Asn Cys1 5 10
權(quán)利要求
1．編碼小麥淀粉合酶的核酸分子，該分子選自(a)編碼含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列之蛋白質(zhì)的核酸分子；(b)含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或相應(yīng)的核糖核苷酸序列的核酸分子；(c)能與(a)或(b)所述核酸分子雜交并編碼可溶性淀粉合酶的核酸分子；(d)因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而核苷酸序列與(a)、(b)或(c)所述核酸分子的序列有所不同的核酸分子；(e)編碼含有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列之蛋白質(zhì)的核酸分子；(f)含有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列或相應(yīng)的核糖核苷酸序列的核酸分子；(g)能與(e)或(f)所述核酸分子雜交的核酸分子；和(h)因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而核苷酸序列與(e)-(g)所述分子之序列有所不同的核酸分子。
2．權(quán)利要求1的核酸分子，它是DNA分子。
3．權(quán)利要求2的DNA分子，它是cDNA分子。
4．權(quán)利要求1的核酸分子，它是RNA分子。
5．與權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)的核酸分子的一條鏈能特異性雜交的核酸分子。
6．權(quán)利要求5的核酸分子，它是長(zhǎng)度至少為15個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
7．含有權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)的核酸分子的載體。
8．權(quán)利要求7的載體，其中核酸分子在有義方向與能確保在原核或真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和合成可翻譯的RNA的調(diào)控元件連接。
9．被權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)的核酸分子或被權(quán)利要求7或8的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或源于這種細(xì)胞的細(xì)胞。
10．由權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。
11．生產(chǎn)權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)的方法，其中在允許合成該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，然后從經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離該蛋白質(zhì)。
12．被權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)的核酸分子或被權(quán)利要求7或8的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，或源于這種細(xì)胞的細(xì)胞，其中編碼小麥可溶性淀粉合酶的核酸分子受調(diào)控元件的控制，該元件允許在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出可翻譯的mRNA。
13．含有權(quán)利要求12的植物細(xì)胞的植物。
14．權(quán)利要求13的植物，它是有用的植物。
15．權(quán)利要求14的植物，它是儲(chǔ)存淀粉的植物。
16．權(quán)利要求15的植物，它是小麥。
17．權(quán)利要求13至16中任何一項(xiàng)的植物的增殖材料，其含有權(quán)利要求12的植物細(xì)胞。
18．可得自權(quán)利要求13至16中任何一項(xiàng)的植物或權(quán)利要求17的增殖材料的淀粉。
19．轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞，其特征在于該植物細(xì)胞中權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)的活性有所降低。
20．權(quán)利要求19的植物細(xì)胞，其中該細(xì)胞中所說的活性的降低是通過表達(dá)權(quán)利要求1 DNA分子之轉(zhuǎn)錄物的反義RNA而達(dá)到的。
21．含有權(quán)利要求19或20的植物細(xì)胞的植物。
22．權(quán)利要求21的植物，它是有用的植物。
23．權(quán)利要求22的植物，它是儲(chǔ)存淀粉的植物。
24．權(quán)利要求23的植物，它是小麥。
25．權(quán)利要求21至24中任何一項(xiàng)的植物的增殖材料，其含有權(quán)利要求19或20的細(xì)胞。
26．可得自權(quán)利要求21至24中任何一項(xiàng)的植物或權(quán)利要求25的增殖材料的淀粉。
27．權(quán)利要求18或26的淀粉用于生產(chǎn)糧食的用途。
28．權(quán)利要求27的用途，其中所述糧食是面包房食品或面團(tuán)。
29．權(quán)利要求18或26的淀粉用于生產(chǎn)包裝材料或一次性物品的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼參與植物淀粉合成之酶的核酸分子,這些酶是小麥的淀粉合酶。本發(fā)明還涉及含有所述核酸分子的載體和宿主細(xì)胞,尤其是經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和由這些細(xì)胞再生的植物,它們表現(xiàn)出增加或減少的所述淀粉合酶的活性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1219970SQ97195004
公開日1999年6月16日 申請(qǐng)日期1997年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月29日
發(fā)明者M·布洛克, H·洛茨, S·魯?shù)峡? L·瓦爾特, C·弗洛比格, J·考斯曼 申請(qǐng)人:赫徹斯特-舍林農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司