專利名稱：人丙種球蛋白親和配位體及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術和生物醫(yī)藥領域，更具體地，本發(fā)明涉及一類新的丙種球蛋白親和配位體，其制備方法，以及這類新親和配位體在純化生產丙種球蛋白(尤其是人丙種球蛋白)的應用。本發(fā)明還涉及新的純化丙種球蛋白的方法。
免疫球蛋白(Immunoglobulins)是重要的免疫球蛋白，缺乏時人體的防御機能低下。免疫球蛋白至少有五種IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。每個IgG分子都有四條對稱的多肽鏈組成兩條重鏈、兩條輕鏈，鏈間由二硫鍵相連。正常人的免疫球蛋白又稱丙種球蛋白，也可稱為多價免疫球蛋白，是從大量的混合血漿或胎盤血中分離制得的免疫球蛋白濃縮劑。要求IgG的含量在90％以上，至少90％的蛋白應具有單體和二聚體的分子量，裂解物和多聚體(＞二聚體)相加不能超過10％。
免疫球蛋白的作用機理是被動免疫，主要用來預防一些病毒性感染，如用于甲肝、丙型肝炎、麻疹等疾病的預防以及丙種球蛋白缺乏癥。
表1免疫蛋白制劑的適應癥
目前，醫(yī)用免疫球蛋白主要從健康人血漿中分離。所用的生產技術主要采用低溫乙醇沉淀法。這種工藝已經有50年的歷史了。這類傳統(tǒng)方法操作步驟多，產品種類有限，血漿中的很多其他有效物質被浪費掉了。比如，生產滅毒合格的白蛋白和抗體，需要10步操作。這種工藝生產的白蛋白和抗體，產品純度不夠高，雖然生產過程中使用了病毒滅活步驟，但潛在病毒的遺傳物質(DNA和RNA)和組成蛋白并沒有去除干凈，在某些條件下仍然有危險。
雖然近年來發(fā)展出了以離子交換和凝膠過濾為中心的層析法生產工藝，但是生產滅毒合格的白蛋白和抗體仍需要10步左右的操作。使用這種工藝，產品的純度有所提高，但生產成本并沒有降低，產品種類也沒有增加，血漿中許多其它含量較少的寶貴蛋白質仍被浪費掉了。
低溫乙醇法的操作相對簡單，產量高，適宜工業(yè)化規(guī)模生產。低溫乙醇法還有保持蛋白質天然性質的優(yōu)點乙醇沉淀血漿蛋白在接近血漿溶液冰點溫度下進行，能使蛋白質變性降至最低限度，保持其天然狀態(tài)。此外，低溫乙醇法分離過程中有抑菌作用。近年來的研究證明，適當?shù)牡蜏匾掖脊に?6+9法、Kistler和Nitschmann法)有殺滅和清除艾滋病毒的作用，增強了制品的安全性。乙醇作為主要原材料，價格低廉，易于獲得。但低溫乙醇法的應用，應具備低溫冷室及連續(xù)冷凍離心機等設備條件，需要相當?shù)馁Y金。另外，工作人員需在相對低溫條件下操作。產品的純度有限，最終產品種難免含有微量的雜質和變性產品，易于引起負反應。
近年來，層析法被越來越廣泛地應用于生物制劑的純化制備。Curling等人1978年發(fā)表了應用離子交換層析(Ion-Exchange chromatography)分離免疫球蛋白的方法。Suomela等人描述了小規(guī)模離子交換層析分離免疫球蛋白。將凝膠過濾(Gelfiltration,又稱分子篩層析)與離子交換及超濾技術相結合，用于大量血漿蛋白的分離是可行的。然而，雖然柱層析法制備的產品純度高，能很好的保持蛋白質的天然性質而且產品收獲率也較高，但是生產成本偏高，生產效率低。
制備免疫球蛋白的其它的方法還有鹽析法(硫酸銨鹽析)、利凡諾(Rivanol)沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、熱乙醇/PEG法等。但是，由于各種因素和缺點，這些方法都無法得到廣泛采用。
因此，本領域迫切需要開發(fā)高效率、低成本的大規(guī)模生產人免疫球蛋白的方法和材料。
本發(fā)明的一個目的是提供一類新的化合物，這類化合物可作為免疫球蛋白的親和配位體，因而用于免疫球蛋白的親和純化。
本發(fā)明的另一目的是提供這類化合物的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供固定有該化合物的親和介質。
本發(fā)明的另一目的是提供一種低成本、高效率的大規(guī)模生產人免疫球蛋白的親和技術工藝。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種式(Ⅰ)化合物， 式中，R選自無、H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素；R1選自苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基團；R2選自苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基團；X1、X2、X3、X4、X5各自獨立地選自碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；而且X1、X2、X3、X4、X5為線性結構，或者X2、X3、X4與選自N、O、C的原子一起構成5元、6元或7元環(huán)，附加條件是當X1、X2、X3、X4、X5為線性結構時，R不是無或H。
較佳地，該化合物具有式(Ⅰa)結構 式中，R′選自H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素；X2和X4為碳原子，且X1和X5為NH。
在本發(fā)明的另一方面，提供了式(Ⅰ)化合物的用途，它被用作丙種球蛋白的親和配位體而用于丙種球蛋白的親和純化。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離純化丙種球蛋白的方法，在該方法中包括用親和分離丙種球蛋白的步驟，而且在該親和分離步驟中，使用權利要求1所述的化合物作為丙種球蛋白親和配位體。
較佳地，在該親和分離步驟中，在親和分離步驟中，親和介質吸附丙種球蛋白的條件為pH5.0-9.0，離子強度為0.0-0.1 M的緩沖液；洗脫條件為pH2.0-4或9-12，離子強度為0.1-0.8M的緩沖液。
更佳地，在親和分離步驟之后，該方法還包括進一步的精制步驟，該精制步驟選自下組用陰離子交換柱吸附除去丙種球蛋白中殘留的雜質，較佳地在pH5.8-6.2條件下用DEAE-Sepharose離子交換柱進行；用陽離子交換柱吸附除去丙種球蛋白中殘留的雜質，較佳地在pH5.4-5.8條件下用SP-Sepharose離子交換柱進行。
用凝膠過濾層析除去丙種球蛋白中殘留的雜質；用超濾除去丙種球蛋白中殘留的雜質；或它們的組合。
本發(fā)明還提供了一種新的可用于分離純化丙種球蛋白的親和介質，該介質包括固相載體和固定在固相載體上的本發(fā)明的親和配位體。
本發(fā)明人經過多年研究，發(fā)現(xiàn)了以下一類新的式(Ⅰ)化合物， 式中，R選自無、H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素；R1選自苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基團；R2選自苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基團；X1、X2、X3、X4、X5各自獨立地選自碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；而且X1、X2、X3、X4、X5為線性結構，或者X2、X3、X4與選自N、O、C的原子一起構成5元、6元或7元環(huán)，附加條件是當X1、X2、X3、X4、X5為線性結構時，R不是無或H。
本發(fā)明的化合物可作為分離人或底物丙種球蛋白的親和配位體，因而具有極大的應用價值，例如用于親和層析。
親和層析，又稱為生物選擇性吸附層析，已經成為純化生物大分子活性物質不可缺少的分離技術。隨著對生物制品中活性成分的純度和需求量的增加，雜質含量的降低，傳統(tǒng)分離技術如凝膠過濾和離子交換層析技術再也不能滿足工業(yè)生產和學術研究的要求。
與其它方法相比，親和層析方法具有以下幾個明顯的特點。親和層析介質允許對生物分子選擇地吸附和解離，可以取得很高的純化倍數(shù)，常常為1000多倍。此外，蛋白在純化過程中不僅得到濃縮，當結合到親和配位體上時，蛋白的性質也更加穩(wěn)定；其結果又提高了目標產品的活性回收率。因此，親和分離技術非常適用于處理體積大，濃度低的生物活性物質。
在大規(guī)模生產的純化工藝中，采用親和層析技術可以大大減少純化過程的步驟，從而減少了合格產品的生產時間和成本。當下游生產成本占總生產成本的80％時顯得更加重要。在純化過程的任何環(huán)節(jié)都可以使用親和層析技術，但采用的越早，獲得的經濟效益越大。J.Bonnerjea(Biotechnology,4,954-958,1986)對生物制品生產工藝調查的結果顯示，在所有被考察的工藝中，一步純化效果最佳的單元操作中，有45％是利用親和步驟獲得的。
親和分離介質的關鍵是親和配位體(也可稱為“親和配基”)。親和配位體必須能夠選擇性地和可逆地吸附生物大分子。傳統(tǒng)的親和配位體為親和介質的成功使用奠定的基礎。然而，在工業(yè)生產中，天然的親和配位體，如抗體、輔酶、氨基酸、多肽、蛋白、凝集素，具有不可克服的缺點最突出的因素是成本昂貴，生物和化學性質不穩(wěn)定，生產中難于維持結合活性，也不能經受在線清潔和消毒，因此，還可能被其它物質，如病毒和內毒素污染。針對根據(jù)丙種球蛋白的結構和性質，本發(fā)明人專門設計和合成了一系列化合物；這些化合物固定于層析介質上后，不僅能夠提供高效的純化倍數(shù)、重復性的結果，而且配基極少脫落。更適合工業(yè)化、大規(guī)模生產醫(yī)用和試劑用丙種球蛋白。
本發(fā)明化合物的結構特征是化學基團R1和R2通過任何5個原子X1、X2、X3、X4、X5所構成的骨架連接起來，從而形成的本發(fā)明的化合物。X1、X2、X3、X4、X5可分別為氧、氮、碳、硫。連接的化學鍵可以是單鍵，雙鍵或三鍵。骨架可以是包含全部或部分的X1、X2、X3、X4、X5的線性或環(huán)形結構；R1可以是苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基團；R2可以是苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基團。更佳地，R1可以是對苯甲脒、對苯乙酮和苯二甲酰肼；R2可以是鄰苯硼酸、對苯磺酸和間苯胺。
較佳地，X2、X3、X4與選自N、O、C的原子一起構成6元環(huán)。更佳地，該化合物具有式(Ⅰa)結構
式中，R′選自H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素；X2和X4為碳原子，且X1和X5為NH。
如本文所用，烷基通常含有約1-8個碳原子，較佳地1-6個碳原子，更佳地1-4個碳原子，它可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀的飽和脂族烴基。合適的烷基例子包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基等。合適的環(huán)狀脂族基團例子通常含有3-8個碳原子，而且包括環(huán)戊基和環(huán)己基。
在通式(Ⅰ)和(Ⅰa)中，R或R′是連接基團或分子，用于將本發(fā)明的親和配位體固定在固相載體上，從而形成親和層析基質。本領域已知的各種連接基團或連接分子都可用作本發(fā)明的R或R′基團。合適的例子包括(但并不限于)H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素。較佳地，R或R′基團選自鹵原子、氨基、羥基或羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、纖維素。
在通式(Ⅰ)和(Ⅰa)中，R1或R2是能與丙種球蛋白發(fā)生相互作用，從而產生親和力的基團。較佳地，R1選自苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基團；而R2選自苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基團。此外，R1和R2還可以被一個或多個C1-C4烷基或鹵原子等取代。
R1和R2之間宜通過任何5個原子X1、X2、X3、X4、X5所構成的骨架而連接，其中X1、X2、X3、X4、X5可分別為氧、氮、碳、硫。
在制備本發(fā)明化合物時，可用常規(guī)的有機合成方法，依次將R1和R2連接于X1、X2、X3、X4、X5所構成的骨架。可選用的方法包括(但并不限于)親核取代反應、縮合反應等。
在本發(fā)明范圍內的一些具體化合物如下具有式(Ⅱ)所示結構的化合物
具有式(Ⅲ)所示結構的化合物 具有式(Ⅳ)所示結構的化合物 具有式(Ⅴ)所示結構的化合物
具有式(Ⅵ)所示結構的化合物 具有式(Ⅶ)所示結構的化合物 和具有式(Ⅷ)所示結構的化合物 較佳地，該化合物是具有式(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅷ)所示結構的化合物。
本發(fā)明的新的式(Ⅰ)化合物，因為與免疫球蛋白具有極高的親和力，因此非常適合作為丙種球蛋白的親和配位體，用于丙種球蛋白的親和純化。此外，本發(fā)明的親和配位體很穩(wěn)定，可以耐受醫(yī)藥生產中必需的現(xiàn)場在線清洗和消毒，可以方便地滿足GMP(Good Manufacturing Practice)標準。
本發(fā)明還提供了一種新的分離純化丙種球蛋白的方法，其中用式(Ⅰ)化合物作為親和配位體進行親和純化。各種常規(guī)的親和純化技術都可用于本發(fā)明，不同點僅在于用本發(fā)明的式(Ⅰ)化合物作為親和配位體。
本發(fā)明還提供了一種新的可用于分離純化丙種球蛋白的親和介質，該介質包括固相載體和固定在固相載體上的本發(fā)明的親和配位體。在制備本發(fā)明親和介質時，可以將用常規(guī)方法本發(fā)明的式(Ⅰ)化合物固定在常規(guī)的合適載體上，從而形成親和介質。
可用本發(fā)明純化方法提純的原料包括(但并不限于)采集的人血漿、胎盤血、基因工程菌或細胞和動物生物反應器表達的人免疫球蛋白的發(fā)酵液或細胞培養(yǎng)液。
這種親和技術工藝， 由于利用丙種球蛋白和親和配位體之間的高親和力，因此經一步親和純化處理就可獲得高純度的產品，可以在大規(guī)模生產和實驗室中經濟高效地制備高純度的人免疫球蛋白，成本和生產效率可以與低溫乙醇法相當，產品的純度和質量與層析法相同。此外，這個生產工藝能夠提高人免疫球蛋白的生產效率，降低生產成本，提高產品質量。
在附圖中，

圖1是從SDS-PAGE檢測人血漿一步純化抗體的效果的電泳圖。其中圖1A是8％的非還原SDS-PAGE檢測親和層析純化后抗體純度的電泳圖，圖1B是12％的還原SDS-PAGE檢測親和層析純化后抗體純度的電泳圖。
下面結合實施例進一步詳細地闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于闡述目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例1式(Ⅱ)化合物的制備 該化合物是用如下方法合成的將3-氨基-苯硼酸(21.00mmol,1.05eq)溶于碳酸氫鈉溶液(0.5M,10ml)。在攪拌下滴加入三氯三氮嗪(20.0mmol,1eq)的丙酮冰水(1∶1)懸浮液。用碳酸氫鈉溶液(0.5M)保持反應體系的pH在6到7之間。反應進行大約兩小時后，用TLC(硅膠，溶劑甲醇/乙酸，95/5)和Ehrlich′s試劑檢測不到芳香胺時，用旋轉蒸發(fā)器除去丙酮。再用乙酸酸化水相，沉淀析出得到白色粉末，過濾，干燥得到產物Ⅱ-Ⅰ(C9H7N4O2BCl2),4.7g(產率84％)。
用元素分析法測得化學組成(％)C,37.87；H,2.52；N,19.53；C9H7N4O2BCl2的理論值(％)C,37.94；H,2.48；N,19.67。
將對氨基苯甲脒鹽酸鹽(20mmol,leq)溶解于碳酸氫鈉溶液(0.5M,10ml)形成的溶液與產物Ⅱ-Ⅰ(3.24g,20mmol,1eq)溶解于NaHCO3(0.5M,15ml)形成的溶液，在pH6到7混合，并用NaHCO3(0.5M)維持pH在6-7,60℃保溫過夜。當用TLC(硅膠，溶劑甲醇/乙酸，5/95)和Ehrlich′s試劑檢測不到芳香胺時停止反應，旋轉蒸發(fā)濃縮后，用醋酸調節(jié)pH到9.5，析出灰色沉淀，得到式(Ⅱ)化合物(C16H15N7O2BCl)，產量為5.7g(75％)。
用元素分析法測得化學組成為(％)C,49.94；H,4.02；N,25.49；C16H15N7O2BCl理論值為(％)C,50.09；H,3.94；N:25.57％；)實施例2式(Ⅱ)化合物的親和層析介質的制備和親和純化丙種球蛋白將實施例1制得的式(Ⅱ)化合物(2g)，溶解于50ml Na2CO3(0.5M,pH11.0)，加入到氨基Sepharose6B(100ml)中，90℃搖振過夜。然后取出Sepharose，經0.5M醋酸(50ml)，0.1M NaOH(50ml)和蒸餾水(200ml)分別洗滌后，得到親和層析介質，命名為puk9，加入用20％乙醇儲存待用。
將親和層析介質puk9(20ml)，裝入層析柱(5.0×10.0cm)中。用200mlTris·HCl(20mM,pH7.2)平衡后，把7ml人血漿(Tris·HCl,20mM,pH7.2)加到柱上。用70ml Tris·HCl(20mM,pH7.2)洗去未吸附的物質后，再用2ml醋酸溶液(0.1M)洗脫，收集洗脫組份。用12％的SDS-PAGE檢測抗體的純度。丙種球蛋白的一步純化的回收率＞93％，純度大于79％。
實施例3式(Ⅲ)化合物的制備 該化合物是用如F方法合成的將對氨基苯磺酸(21.00mmol,1.05eq)溶于碳酸氫鈉溶液(0.5M,10ml)，在攪拌下滴加入三氯三氮嗪(20.0mmol,1eq)的丙酮冰水(1∶1)懸浮液。用碳酸氫鈉溶液(0.5M)保持反應體系的pH在6到7之間。反應進行大約兩小時后，用TLC(硅膠，溶劑乙酸)和Ehrlich′s試劑檢測不到芳香胺時，用旋轉蒸發(fā)器除去丙酮。再用乙酸酸化水相，沉淀析出得到白色粉末，過濾，干燥得到產物Ⅲ-Ⅰ(C9H6N4O3Cl2S)，產量為4.5g(產率70％)。
用元素分析法測得化學組成為(％)C,33.52；H,1.93；N,17.42；C9H6N4O3Cl2S的理論值(％)C,33.66；H,1.88；N,17.45。
將對氨基苯乙酮(20mmol,1eq)溶解于丙酮/碳酸氫鈉溶液(0.5M,10ml)(1/1∶v/v)的溶液，與產物Ⅲ-Ⅰ(20mmol,1eq)溶解于NaHCO3(0.5M,15ml)的溶液在pH6到7混合，并用NaHCO3(0.5M)維持pH在6-7，60℃保溫過夜。當用TLC(硅膠，溶劑甲醇/氨水，95/5)和Ehrlich′s試劑檢測不到芳香胺時停止反應，旋轉蒸發(fā)濃縮后，用醋酸調節(jié)pH到2.5，析出無定型沉淀，得到式(Ⅲ)化合物(C17H14N5O4ClS)，產量為5.0g(60％)。
用元素分析法測得化學組成為(％)C,48.56；H,3.47；N,16.59；C17H14N5O4ClS的理論值(％)C,48.63；H,3.36；N:16.68。
實施例4式(Ⅲ)化合物的親和層析介質的制備和親和純化丙種球蛋白將實施例3制得的式(Ⅲ)化合物(2.4g)，溶解于50ml Na2CO3(0.5M,pH11.0),加入到氨基Sepharose6B(100ml)中，90℃搖振過夜。然后取出Sepharose，經0.5M醋酸(50ml)，0.1M NaOH(50ml)和蒸餾水(200ml)分別洗滌后，得到親和層析介質，命名為Af7-11，加入用20％乙醇儲存待用。
將親和層析介質Af-7-11(20ml)，裝入層析柱(5.0×10.0cm)中。用200mlTris·HCl(20mM,pH7.2)平衡后，把7ml人血漿(Tris·HCl,20mM,pH7.2)加到柱上。用70ml Tris·HCl(20mM,pH7.2)洗去未吸附的物質后，再用2ml醋酸溶液(0.1M)洗脫，收集洗脫組份。用12％的SDS-PAGE檢測抗體的純度。丙種球蛋白的一步純化的回收率＞30％，純度大于78％。
實施例5式(Ⅷ)化合物的制備 該化合物是用如下方法合成的將4-氨基苯乙酮(21.00mmol,1.05eq)溶于碳酸氫鈉溶液(0.5M,10ml)，在攪拌下滴加入三氯三氮嗪(20.0mmol,1eq)的丙酮冰水(1∶1)懸浮液。用碳酸氫鈉溶液(0.5M)保持反應體系的pH在6到7之間。反應進行大約兩小時后，用TLC(硅膠，溶劑乙酸)和Ehrlich′s試劑檢測不到芳香胺時，用旋轉蒸發(fā)器除去丙酮。再用乙酸酸化水相，沉淀析出得到白色粉末，過濾，干燥得到產物Ⅷ-Ⅰ(C11H8N4OCl2)，產量為4.4g(產率78％)。
用元素分析法測得化學組成為(％)C,33.08；H,2.04；N,14.02；C11H8N4OCl2的理論值(％)C,33.12；H,2.02；N,14.05。
將酪氨酸(20mmol,1eq)溶解于丙酮/NaHCO3(0.5M)(1/1,v/v)的溶液，與產物Ⅷ-Ⅰ(10mmol,1eq)溶解于50ml丙酮/NaHCO3(0.5M)(1/l,v/v)的溶液在pH6到7混合，并用NaHCO3(0.5M)維持pH在6-7,60℃保溫過夜。當用TLC(硅膠，溶劑甲醇/氨水，95/5)和Ehrlich′s試劑檢測不到芳香胺時停止反應，旋轉蒸發(fā)濃縮后，用醋酸調節(jié)pH到2.5，析出無定型沉淀，得到式(Ⅷ)化合物(C17H15N8O2Cl)，產量為3.8g(89％)。
用元素分析法測得化學組成為(％)C,60.17；H,4.55；N,17.53；C17H15N8O2Cl的理論值(％)C,60.22；H,4.55；N:17.56
實施例6式(Ⅷ)化合物的親和層析介質的制備和親和純化丙種球蛋白將實施例5制得的式(Ⅷ)化合物(3.1g)，溶解于50ml Na2CO3(0.5M,pH11.0)，加入到氨基Sepharose6B(100ml)中，90℃搖振過夜。然后取出Sepharose，經0.5M醋酸(50ml)，0.1M NaOH(50ml)和蒸餾水(200ml)分別洗滌后，得到親和層析介質，命名為Afl1-3，加入用20％乙醇儲存待用。
將親和層析介質Af11-3(20ml)裝入層析柱(5.0×10.0cm)中。用200mlTris·HCl(20mM,pH 8.0)平衡后，把7ml人血漿(Tris·HCl,pH8.0,20mM)加到柱上。用70ml Tris·HCl(20mM,pH8.0)洗去未吸附的物質后，再用20ml Na2CO3(0.1M)洗脫，收集洗脫組份。用8％的非還原和12％的還原SDS-PAGE檢測抗體的純度，結果如圖1所示，其中圖1A是8％的非還原SDS-PAGE檢測抗體純度的電泳圖，圖1B是12％的還原SDS-PAGE檢測抗體純度的電泳圖。丙種球蛋白的一步純化的回收率＞83％，純度大于95％。
實施例7對親和純化后的丙種球蛋白進行精制將實施例2中的丙種球蛋白的洗脫液，調節(jié)pH到pH 6.0，離子強度0.02，洗滌后直接上到DEAE-Sepharose離子交換柱(2×5cm)，收集洗脫液。檢測表明丙種球蛋白回收率＞90％，純度大于97％。
調節(jié)流穿液pH到5.5，離子強度0.01，后再上到SP-Sepharose柱(2×5cm)，收集流穿液，丙種球蛋白的總回收率＞85％，純度大于99％。
應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1．一種式(Ⅰ)化合物， 式中，R選自無、H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素；R1選自苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基團；R2選自苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基團；X1、X2、X3、X4、X5各自獨立地選自碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；而且X1、X2、X3、X4、X5為線性結構，或者X2、X3、X4與選自N、O、C的原子一起構成5元、6元或7元環(huán)，附加條件是當X1、X2、X3、X4、X5為線性結構時，R不是無或H。
2．如權利要求1所述的化合物，其特征在于，該化合物具有式(Ⅰa)結構 式中，R′選自H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素；X2和X4為碳原子，且X1和X5為NH。
3．按權利要求1所述的化合物，其特征在于，該化合物選自下組具有式(Ⅱ)所示結構的化合物 具有式(Ⅲ)所示結構的化合物 具有式(Ⅳ)所示結構的化合物 具有式(Ⅴ)所示結構的化合物 具有式(Ⅵ)所示結構的化合物 具有式(Ⅶ)所示結構的化合物 和具有式(Ⅷ)所示結構的化合物
4．按權利要求1所述的化合物，其特征在于，該化合物是具有式(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅷ)所示結構的化合物
5．一種如權利要求1所述化合物的用途，其特征在于，它被用于丙種球蛋白的親和純化。
6．如權利要求5所述的用途，其特征在于，該化合物是具有式(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅷ)所示結構的化合物
7．一種分離純化丙種球蛋白的方法，在該方法中包括用親和分離丙種球蛋白的步驟，其特征在于，在該親和分離步驟中，使用權利要求1所述的化合物作為丙種球蛋白親和配位體。
8．按權利要求7所述的方法，其特征在于，在親和分離步驟中，親和介質吸附丙種球蛋白的條件為pH5.0-9.0，離子強度為0.0-0.1M的緩沖液；洗脫條件為pH2.0-4或9-12，離子強度為0.1-0.8M的緩沖液。
9．按權利要求7所述的方法，其特征在于，在親和分離步驟之后，該方法還包括進一步的精制步驟，該精制步驟選自下組用陰離子交換柱吸附除去丙種球蛋白中殘留的雜質；用陽離子交換柱吸附除去丙種球蛋白中殘留的雜質；用凝膠過濾層析除去丙種球蛋白中殘留的雜質；用超濾除去丙種球蛋白中殘留的雜質；或它們的組合。
10．如權利要求7-9中任一權利要求所述的方法，其特征在于，該丙種球蛋白是人的丙種球蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類新的可作為丙種球蛋白親和配位體的化合物,該化合物的制備方法,以及這類新親和配位體在純化生產丙種球蛋白(尤其是人丙種球蛋白)的應用。本發(fā)明還提供了新的用于純化丙種球蛋白的親和介質和方法。本發(fā)明可高效率、低成本的大規(guī)模生產人免疫球蛋白,尤其是高純度的丙種球蛋白(抗體)的醫(yī)用級產品。
文檔編號C07D251/18GK1302802SQ9911993
公開日2001年7月11日 申請日期1999年10月29日 優(yōu)先權日1999年10月29日
發(fā)明者李榮秀, 王繼武, 肖齊世, 顧靖, 李永紅, 李燕玲 申請人:上海中路生物工程有限公司