專利名稱：用于重組多克隆蛋白或多克隆細(xì)胞系的結(jié)構(gòu)表征的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及這樣的方法，該方法用于重組多克隆蛋白或產(chǎn)生該蛋白的多克隆細(xì)胞系的結(jié)構(gòu)表征，以驗證最終產(chǎn)物的批與批之間的一致性和在單一生產(chǎn)批次(run)期間的組成穩(wěn)定性。特別地，本發(fā)明涉及用于表征重組多克隆抗體的方法。
背景技術(shù)：
很久以來已認(rèn)識到抗體的預(yù)防性或治療性施用(所謂的被動免疫)可增強身體免疫系統(tǒng)消除傳染性因子的能力。歷史上已從人血漿獲得這些治療性抗體(最初抗體組合物被稱為免疫球蛋白或γ球蛋白)。為獲得這些抗體，從免疫的人供體收集血液，提取和純化免疫球蛋白級分。只有免疫球蛋白的特定級分對于特定的抗原是特異性的。由于幾個限制，例如有限的供體數(shù)量、昂貴的生產(chǎn)、來自供體的傳染性污染的風(fēng)險、不可避免的批與批之間的變化以及復(fù)雜的施用方案的原因，免疫球蛋白的治療性使用非常復(fù)雜。
近年來，重組單克隆抗體已為免疫球蛋白產(chǎn)品提供了另一種選擇。然而，其只抗單一的靶，從而可能不能有效地抗復(fù)雜或動態(tài)的靶，例如傳染性因子。存在一些混合單克隆抗體以克服該問題的示例(例如，Nowa kowski，A等人2002.Proc Natl Acad Sci USA99，11346-11350和US5,126,130)。
近年來已發(fā)展了用于適合用于預(yù)防性和治療性施用的高度特異性的多克隆抗體的重組生產(chǎn)的技術(shù)(WO2004/061104)。可從生產(chǎn)性生物反應(yīng)器中以單一的制劑純化重組多克隆抗體(rpAb)而不用分離操作、生產(chǎn)、純化或表征組成重組多克隆蛋白的單個成員。然而，這些生產(chǎn)策略需要驗證身份和證明在一段時間內(nèi)抗體分子的復(fù)雜混合物的一致性生產(chǎn)。
此外，必須在一定程度上表征使用重組技術(shù)工業(yè)化產(chǎn)生的多克隆抗體，以從國家和超國家監(jiān)管部門(national and supranationalregulatory authorities)獲得作為研究性或治療性藥物的許可。因為重組多克隆抗體方法是個全新的概念，因此以前從未闡述過關(guān)于包含多個不同的但高度同源的蛋白的樣品中單一蛋白的相對比例方面的問題。因此，一般基于非臨床和臨床功效數(shù)據(jù)和通常歷史安全數(shù)據(jù)以及原始的化學(xué)、生產(chǎn)和控制(CMC)參數(shù)例如純度、結(jié)合的滴度以及外來因子(adventitious agent)的缺乏來批準(zhǔn)從血液產(chǎn)生的免疫球蛋白。當(dāng)然，這些過份簡化的方法對于重組產(chǎn)生的蛋白是不可接受的。因此，對于新的單克隆抗體的混合物，監(jiān)管機構(gòu)要求，應(yīng)當(dāng)使用生物學(xué)測定法和全面的蛋白質(zhì)化學(xué)表征技術(shù)，使混合物接受混合物中的各組成抗體的單獨表征。然而，這不是個技術(shù)上可行的方法或不適合于基于超過10、20或甚至更多的不同抗體的真實的多克隆組合物。
發(fā)明的公開內(nèi)容本發(fā)明提供了用于證明不同的同源蛋白例如來自多克隆細(xì)胞系的重組多克隆蛋白特別是重組多克隆抗體的混合物的一致性生產(chǎn)的結(jié)構(gòu)表征平臺。
發(fā)明描述用于預(yù)防性和治療性用途的重組多克隆蛋白的工業(yè)生產(chǎn)的前提是表達過程中克隆多樣性的維持。因此，能夠監(jiān)控和測量產(chǎn)生多克隆抗體的多克隆細(xì)胞系的克隆多樣性，和在任何想要的時間點上的多克隆蛋白中以及任何相關(guān)的樣品中的單一蛋白的相對比例，從而允許在單個批次中分析表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及分析最終產(chǎn)品的批與批之間的變化是非常重要的。
同源蛋白組合物例如重組多克隆抗體或重組多克隆T細(xì)胞受體(TcR)由具有非常相似的物理化學(xué)性質(zhì)的各種蛋白組成。當(dāng)純化重組產(chǎn)生的多克隆蛋白時，這是個有利方面，因為可將其當(dāng)作單一蛋白一樣進行純化，而不會在過程中喪失多樣性。然而，當(dāng)表征多克隆蛋白的單個成員的相對分布時，該相似性帶來了挑戰(zhàn)，因為物理化學(xué)性質(zhì)上的相似性使其難以將一個成員和其他成員區(qū)分開。
最普遍地，當(dāng)生產(chǎn)重組多克隆蛋白時，已知原始的組成，因為在產(chǎn)生用于生產(chǎn)該重組多克隆蛋白的細(xì)胞系之前，已對編碼多克隆蛋白的序列進行了分離、篩選和測序。關(guān)于這樣的細(xì)胞系的生產(chǎn)，請參見WO2004/061104，此處引用作為參考。該方法的極少的例外可以是這樣的情形，在該情形中，直接使用未篩選或未選擇的文庫例如來自恢復(fù)期患者(convalescent patient)的文庫產(chǎn)生重組多克隆抗體。
為確保在培養(yǎng)和純化后，產(chǎn)出物(重組多克隆蛋白)的多樣性和輸入物(編碼序列的文庫)的多樣性相似，必需獲得關(guān)于多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系中多克隆蛋白和/或其編碼序列的單個成員的數(shù)目的相對比例。本發(fā)明提供了能夠提供關(guān)于多克隆細(xì)胞系和多克隆蛋白的多樣性信息的、基于遺傳分析和蛋白質(zhì)表征技術(shù)的結(jié)構(gòu)表征平臺。
定義術(shù)語“抗獨特型抗體”是特異性結(jié)合多克隆蛋白的單個成員的可變部分的全長抗體或其片段(例如，F(xiàn)v、scFv、Fab、Fab’或F(ab)2)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗獨特型抗體特異性地結(jié)合多克隆抗體或多克隆TcR的單個成員的可變部分。抗獨特型抗體的特異性優(yōu)選地抗多克隆抗體或多克隆T細(xì)胞受體的單個成員的抗原特異性部分，即所謂的V區(qū)。然而，其也顯示對單個成員的確定的亞群體例如出現(xiàn)在混合物中的特異性VH基因家族的特異性。
術(shù)語“抗獨特型肽”是指能夠特異性地結(jié)合從而能夠鑒定同源蛋白的混合物中的單個蛋白成員的特異性肽配體。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗獨特型肽特異性地結(jié)合多克隆抗體或多克隆TcR的單個成員。本發(fā)明的抗獨特型肽優(yōu)選地抗單一抗體或單一T細(xì)胞受體的序列的抗原特異性部分。然而，抗獨特型肽也可顯示對單個成員的確定的亞群體的特異性。
術(shù)語“大批量(bulk)”N末端測序”是指包含許多不同的同源蛋白分子例如多克隆蛋白的樣品的N末端蛋白測序。該大批量測序同時提供了樣品中出現(xiàn)的所有不同蛋白的序列信息。在其中氨基酸在樣品中的單個成員之間發(fā)生變化的位置上，可對這些位置進行定量，在可變位置上的單個氨基酸的不同量將提供關(guān)于包含特定變異的蛋白亞群體的信息。如果要進行N末端測序的蛋白包含超過一個亞基，那么優(yōu)選地在測序之前將這些亞基分離以減少復(fù)雜性，例如，如果樣品是多克隆抗體，那么可在測序之前將重鏈和輕鏈分離。
術(shù)語“克隆多樣性”或“多克隆性(polyclonality)”是指多克隆蛋白、編碼其的核酸序列或生產(chǎn)其的多克隆細(xì)胞系的可變性或多樣性?？勺冃缘奶卣髟谟诙嗫寺〉鞍谆蚓幋a序列的文庫的單個成員之間的氨基酸序列或核酸序列上的差異。對于多克隆細(xì)胞來說，可通過細(xì)胞系內(nèi)呈現(xiàn)的核酸序列的可變性例如，如整合入單個細(xì)胞的基因組中的單位點整合的可變性來確定克隆的多樣性。然而，其也可以以出現(xiàn)在細(xì)胞系內(nèi)的細(xì)胞表面上的氨基酸序列的可變性來進行確定。
術(shù)語“表位”是指T細(xì)胞受體或抗體結(jié)合的抗原性分子的部分?？乖蚩乖苑肿右话阃瑫r提供幾種或甚至許多種表位。
術(shù)語“免疫球蛋白”一般用作在血液或血清中發(fā)現(xiàn)的抗體的混合物的總稱。因此，從血清產(chǎn)生的多克隆抗體通常稱為免疫球蛋白或γ球蛋白。然而，也可將免疫球蛋白用于稱呼來自其他來源的抗體例如重組免疫球蛋白的混合物。
此處所用的術(shù)語“單一克隆”，是指表達特定蛋白例如單克隆抗體的細(xì)胞的等基因群體。這些單一克隆可通過例如用想要的核酸轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，然后篩選陽性轉(zhuǎn)染子來獲得，可擴增單一克隆或可混合和擴增許多單一克隆?？赏ㄟ^混合表達多克隆抗體的不同單個成員的單一克隆來產(chǎn)生多克隆細(xì)胞系。
術(shù)語“單個成員”或“不同的成員”是指包含不同的但同源的蛋白分子的蛋白組合物例如多克隆蛋白的蛋白分子，其中所述單個蛋白分子和組合物的方他分子同源，并且包含多肽序列的一個或多個片段，所述片段也稱為可變區(qū)，該片段的特征在于多克隆蛋白的單個成員之間的氨基酸序列上的差異。例如在由Ab1至Ab50組成的多克隆抗體中，具有Ab1的序列的所有蛋白被當(dāng)作多克隆抗體的單個成員，例如Ab1可以在CDR3區(qū)上和Ab2蛋白不同。例如單個成員的亞群體可以由屬于Ab1、Ab12和AB33的抗體組成。
術(shù)語“多克隆抗體”描述了能夠結(jié)合相同或不同的抗原上的幾種不同的特異性抗原決定簇或和其反應(yīng)的不同抗體分子的組合物。多克隆抗體的可變性位于組成多克隆抗體的單種抗體的所謂可變區(qū)，特別是位于互補決定區(qū)(CDR)1、CDR2和CDR3區(qū)。
術(shù)語“多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系”、“多克隆細(xì)胞系”、“多克隆原始細(xì)胞庫(master cell bank)(pMCB)”和“多克隆工作細(xì)胞庫(pWBC)”可互換使用，其是指用各種目的核酸序列的文庫轉(zhuǎn)染的表達蛋白的細(xì)胞的群體。優(yōu)選地，一起組成重組多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的單種細(xì)胞只攜帶不同目的核酸序列的一個拷貝，所述核酸序列的一個拷貝編碼目的重組多克隆蛋白的一個成員，各拷貝整合入各細(xì)胞的基因組的相同位置。組成這樣的生產(chǎn)性細(xì)胞系的細(xì)胞可以是例如細(xì)菌、真菌、真核細(xì)胞例如酵母、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，特別是永生化的哺乳動物細(xì)胞系例如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞(例如，Sp2/0細(xì)胞、NS0)、NIH3T3、YB2/0和永生化人細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞、HEK293細(xì)胞或PER.C6。
如此處所用的，術(shù)語“多克隆蛋白”是指包含不同的但同源的蛋白分子(優(yōu)選地選自免疫球蛋白超家族)的蛋白組合物。甚至更優(yōu)選地是作為抗體或T細(xì)胞受體(TcR)的同源蛋白分子。因此，各蛋白分子和組合物中的其他分子同源，但也包含一個或多個可變肽序列的片段，所述片段的特征在于多克隆蛋白的單個成員(也稱為不同的變體成員)之間的氨基酸序列上的差異。這些多克隆蛋白的已知示例包括抗體、T細(xì)胞受體和B細(xì)胞受體。多克隆蛋白可由蛋白分子的確定的亞群組成，所述亞群由共同特征來確定，例如在抗想要的靶抗原的多克隆抗體的情況下，由共有的對想要的靶的結(jié)合活性來確定。重組多克隆蛋白一般由這些確定的分子的亞群組成，其中各成員的序列是已知的。只有在極少的情況下，重組多克隆蛋白可，在該重組蛋白也包含明顯比例的非靶特異性蛋白質(zhì)的意義上，與來源于血清的免疫球蛋白相似。
術(shù)語“多克隆T細(xì)胞受體(TcR)”描述了能夠結(jié)合或和來自相同的或不同的抗原的幾種不同的特異性抗原決定簇反應(yīng)的不同TcR分子的組合物。多克隆TcR的可變性位于組成多克隆TcR的單種TCR分子的所謂可變區(qū)，特別是位于CDR1、CDR2、CDR3和CDR4區(qū)。本發(fā)明的TcR分子是經(jīng)基因工程改造的α-β鏈或γ-δ鏈的可溶性二聚體。在例如(Willcox，B.E等人1999.Protein Sci 8，2418-2423)中描述了這些經(jīng)基因工程改造的TcR。
術(shù)語“蛋白”是指氨基酸的任何鏈，無論長度或翻譯后的修飾。蛋白可以單體或包含兩個或更多個裝配的多肽鏈、蛋白的片段、多肽、寡肽或肽的多聚體的形式存在。
術(shù)語“哨崗蛋白(sentinel protein)”描述了多克隆蛋白的單個成員，該成員在多克隆蛋白的生產(chǎn)期間或在不同的批次中的存在可被監(jiān)控。系列相關(guān)樣品中的崗哨蛋白的存在反映批次之間或在單次生產(chǎn)中的一段時間內(nèi)多克隆蛋白的表達上的穩(wěn)定性。此外，其反映在下游加工例如重組產(chǎn)生的多克隆蛋白的純化期間，多樣性的維持。
術(shù)語“獨特的標(biāo)志性肽”描述了許多來源于多克隆蛋白的單個成員的可變區(qū)的肽。優(yōu)選地通過蛋白酶處理或蛋白片段化的其他方法產(chǎn)生肽，可明確地歸類為多克隆蛋白的單個個體成員的肽稱為獨特的標(biāo)志性肽。
附圖描述

圖1在9周的培養(yǎng)后，來自等分3948和3949的抗RhD重組多克隆抗體(抗RhD rpAb)組合物的陽離子交換層析譜。下面的圖表對應(yīng)于等分3949，上面的對應(yīng)于等分3948。上圖的Y軸被移位以將其和下圖分離。峰A-J包含在靜電荷上存在差異的抗體和顯示電荷不均一性的單種抗體。
圖2顯示在11周的培養(yǎng)后，對產(chǎn)生自生產(chǎn)抗RhD rpAb的多克隆細(xì)胞系等分3948+和3949+(FCW065)的RT-PCR產(chǎn)物的HinfIRFLP分析的凝膠圖。鑒定對應(yīng)于特定克隆的條帶。
圖3來自表達具有8個不同的抗獼猴D抗體的抗RhD rpAb的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的抗獼猴D抗體輕鏈的T-RFLP模式。8個不同的抗獼猴D的克隆對應(yīng)于箭頭指示的峰。
圖4在給定的時間點上，來自表達具有25個不同的抗獼猴D抗體的抗RhD rpAb的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的抗獼猴D抗體的重鏈的T-RFLP模式。25個不同的抗獼猴D的克隆對應(yīng)于箭頭指示的峰。
圖5通過8個不同的抗獼猴D的重鏈編碼序列的T-RFLP所評估的cDNA分布，所述序列來自培養(yǎng)了5周的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物。
圖6顯示使用陽離子交換層析分析的具有8個不同抗體的抗RhDrpAb的相對濃度(％)。根據(jù)滯留時間和從在相同條件下使用陽離子交換層析單獨進行分析的單個抗體獲得的峰模型，使整合的層析峰對應(yīng)于單個抗體。
圖7具有25個單個成員的抗RhD rpAb的陽離子交換層析譜，所述抗RhD rpAb來自4周培養(yǎng)后獲得的樣品。峰AC1至25包含在靜電荷上具有差異的抗體和表現(xiàn)電荷不均一性的單種抗體。
圖8來自具有10個單個成員的重組多克隆抗RhD抗體的陽離子交換層析的洗脫特征譜。字母表示在第二維中接受RP-HPLC的峰。
圖9顯示來自圖8的級分B5的RP-HPLC的洗脫特征譜。
圖10顯示通過顏色編碼的蛋白質(zhì)作圖(color-codedprotein-map)(以灰度表示)顯示的具有10個單個成員的重組多克隆抗RhD抗體的2D LC組分分析。
圖11顯示來自具有8個單個成員的重組多克隆抗RhD抗體的純化的LC的Asp-N降解物的強陽離子交換層析的洗脫特征譜。粗體水平線指示接受MALDI-TOF分析以鑒定標(biāo)志性肽的級分。
圖12顯示獲得的關(guān)于具有25個單個成員的抗RhD rpAb的OD280IEX層析譜和獲自使用抗獨特型肽PEP162、PEP202和PEP305的3個獨立的ELISA分析的ELISA數(shù)據(jù)的結(jié)合。對通過離子交換層析獲得的各級分進行ELISA分析。將ELISA數(shù)據(jù)規(guī)范化為總OD的百分比以使分別使用PEP162、PEP202和PEP305的3個ELISA測定可相互比較。
圖13顯示在發(fā)酵期間在不同的培養(yǎng)時間點上，3種崗哨抗體抗RhD162、202和305的分布。G8對應(yīng)于在生物反應(yīng)器接種后的第8天。
圖14用PEP20四聚體染色的3個細(xì)胞系的FACS數(shù)據(jù)。(A)顯示PEP202陰性細(xì)胞系RhD162。(B)顯示細(xì)胞系RhD202，和(C)顯示細(xì)胞系RhD162和Rhd202的50％混合物(對應(yīng)于本實驗中的混合物a)。A、B和C中的第一個圖框顯示FSC-SSC的點圖，其中R1是基于大小(FSC)和粒度(SSC)的活的和健康細(xì)胞的門控(gating)。中間圖框中的直方圖描繪了細(xì)胞的熒光強度。R6門控包圍經(jīng)四聚體染色的細(xì)胞。最后的圖框顯示計算中使用的R6中的細(xì)胞的百分比。
圖15顯示在包含25個單個成員的抗RhD rpAb樣品的下游加工期間，在不同的階段采集的樣品的陽離子交換層析特征譜，所述抗體呈現(xiàn)于通過捕獲洗脫(A)、Sephadex G-25(B)、DEAE-Sepharose(C)和MEP Hypercel(D)收集的材料。
圖163個代表性的顯示3種不同電荷模式的單克隆抗RhD抗體的IEX特征譜。(A)均一的，(B)“3峰”模式，(C)復(fù)合模式。
圖17RhD189和突變的Glu變體RhD189E的IEX分析。
圖18變體RhD189E和其天然的對應(yīng)物RhD189的結(jié)合活性。通過FACS測量抗體和RhD陽性紅細(xì)胞的結(jié)合，平均熒光強度(MFI)顯示為抗體濃度的函數(shù)。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一方面提供了用于結(jié)構(gòu)表征以獲得關(guān)于單個成員在樣品中的相對比例的信息的方法，該樣品包含(i)具有不同的可變區(qū)的不同的同源蛋白或(ii)產(chǎn)生這些蛋白的細(xì)胞系。可使用該表征平臺在包含不同的同源蛋白的組合物的生產(chǎn)或純化加工期間或長期貯存期間評估不同方面。優(yōu)選地，本發(fā)明的表征平臺用于下列目的中的一個，所述目的是1)確定單個成員或其中一些相互之間關(guān)聯(lián)的單個成員在單一樣品中的相對比例，ii)評估一種或多種單個成員在不同樣品中的相對比例以確定批與批的一致性，和iii)評估一種或多種單個成員的實際比例。任選地，可將其和最初用于產(chǎn)生多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的載體的文庫相比較。所述表征平臺特別適合用于監(jiān)控多克隆細(xì)胞系的克隆多樣性和/或由所述細(xì)胞系產(chǎn)生的多克隆抗體中的單種蛋白的比例。可同時監(jiān)控單個生產(chǎn)批次期間的組合穩(wěn)定性和批與批之間的一致性。可選擇地，可將平臺方法用于不同的同源蛋白混合物的純化的組合物，包括多克隆蛋白或單克隆抗體的混合物，例如，以確定在這樣的組合物中單個成員的長期穩(wěn)定性。
本發(fā)明的一個實施方案是這樣的方法，其表征包含具有不同可變區(qū)的不同的同源蛋白或產(chǎn)生這些蛋白的細(xì)胞的樣品，從而獲得關(guān)于所述蛋白或其編碼序列的單個成員的比例或存在的信息，所述方法包括通過一種或多種蛋白質(zhì)表征技術(shù)和/或通過一種或多種編碼蛋白的序列的遺傳分析來分析所述樣品的等分。
在本發(fā)明的其他實施方案中，結(jié)構(gòu)表征平臺包含許多選自蛋白質(zhì)表征技術(shù)和遺傳分析法的分析技術(shù)。因此，結(jié)構(gòu)表征平臺可包含任何數(shù)量的下面部分描述的單個實施方案。只根據(jù)其中一種實施方案中描述的分析技術(shù)就可足以獲得關(guān)于樣品的信息。然而，優(yōu)選地從這些分析技術(shù)中的2、3、4、5、6、7、8、9或10個技術(shù)中獲得信息，從而可組合下面列出的單個實施方案以產(chǎn)生表征平臺。幾種分析技術(shù)的組合使得能夠產(chǎn)生和多克隆混合物的相對或絕對組成相關(guān)的更詳細(xì)的數(shù)據(jù)組。獲自這些技術(shù)的信息可以是定量的和定性的，這樣當(dāng)匯集在一起時就提供了被分析的樣品的總體表征。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，一種分析技術(shù)是蛋白的表征技術(shù)，而另一種分析技術(shù)是遺傳分析技術(shù)。
遺傳分析是指這樣的技術(shù)，例如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析法、末端RFLP(T-RFLP)法、微陣列分析法、定量PCR例如實時PCR和核酸測序。
蛋白質(zhì)表征技術(shù)是指通常在蛋白質(zhì)組學(xué)中使用的用于表征未知蛋白的技術(shù)，例如i)根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)分離蛋白的層析分析技術(shù)，ii)同源蛋白的蛋白水解降解物的分析，iii)“大批量”N末端測序，和iv)使用對于同源蛋白是特異性的檢測分子的分析法。
本發(fā)明已發(fā)展了用于和上述分析技術(shù)結(jié)合以表征同源蛋白的復(fù)雜混合物的本發(fā)明的另一個概念。該概念基于選擇許多存在于同源蛋白的混合物(例如，多克隆抗體或多克隆TcR)中或在產(chǎn)生該同源蛋白的細(xì)胞混合物(例如，多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系)的表面上的崗哨蛋白。定量和定性地表征崗哨蛋白以確定該蛋白的亞群體在生產(chǎn)期間在多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中或細(xì)胞表面上以一致的方式存在。例如可使用這樣的檢測分子分析崗哨蛋白，該分子對于同源蛋白的單個成員是特異性的，例如抗獨特型分子。崗哨蛋白的概念可進一步用于評估不同細(xì)胞培養(yǎng)批次之間的一致性。可將崗哨蛋白的概念擴展至通過蛋白酶處理的多克隆蛋白產(chǎn)生的獨特性肽，如果所述多克隆蛋白是多克隆抗體或TcR，這些崗哨肽優(yōu)選地包含CDR的部分?；趤碜跃幋a多克隆蛋白的文庫的單個成員的獨特核酸序列，在基因水平上進行的分析也可使用崗哨原理。特別地可選擇對應(yīng)于抗體或TcR的CDR區(qū)的核酸序列作為崗哨核酸序列，最優(yōu)選的是CDR3區(qū)域。崗哨蛋白、肽或核酸序列可因分析技術(shù)而產(chǎn)生變化，其依賴于可用選擇的分析方法辨別的多克隆蛋白的成員或編碼其的核酸序列。
多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的克隆多樣性的遺傳分析在本發(fā)明的一些實施方案中，通過評估編碼多克隆蛋白的特定成員的細(xì)胞和/或編碼多克隆蛋白的單個成員的mRNA水平的數(shù)量來監(jiān)控用于生產(chǎn)多克隆蛋白的表達系統(tǒng)中的多克隆性?？墒褂美鏡FLP或T-RFLP分析、寡核苷酸微陣列分析、定量PCR例如實時PCR和獲自生產(chǎn)性細(xì)胞系的基因序列的可變區(qū)的核酸測序在mRNA或基因組水平上對該多克隆性進行監(jiān)控?？蛇x擇地，可使用相同的技術(shù)定性地證明多克隆細(xì)胞系的多樣性?？稍跇悠?該樣品在培養(yǎng)期間在不同的時間點上獲自單一的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物)中監(jiān)控編碼多克隆蛋白的核酸序列，從而在整個生產(chǎn)批次中監(jiān)控該編碼序列個體的相對比例以確定其組成穩(wěn)定性?？蛇x擇地，可在樣品(該樣品在特定的時間點上獲自不同的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物)上監(jiān)控編碼多克隆蛋白的核酸序列，從而在不同的批次中監(jiān)控編碼序列個體的相對比例以確定批與批之間的差異。優(yōu)選地，用于遺傳分析的樣品是通過例如沉淀對培養(yǎng)的細(xì)胞富集過的細(xì)胞培養(yǎng)物級分。一般通過在想要的時間點收集細(xì)胞培養(yǎng)物的級分，然后通過例如離心除去培養(yǎng)基來獲得樣品。用于批與批之間的一致性的比較的樣品優(yōu)選地獲自處于適于體外生產(chǎn)的年齡的細(xì)胞。
RFLP/T-RFLP可在基因組水平或mRNA水平上進行RFLP和T-RFLP分析。當(dāng)產(chǎn)生多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系以使各細(xì)胞只包含一個拷貝的目的序列時，基因組水平上的分析可提供關(guān)于產(chǎn)生所述多克隆抗體的單個成員的細(xì)胞在生產(chǎn)性細(xì)胞系中的相對比例的信息。另一方面，mRNA水平上的分析可提供關(guān)于多克隆蛋白的單個成員的潛在表達水平的信息。一般通過在限制性酶切分析前將mRAN反轉(zhuǎn)錄成cDNA來進行mRNA水平上的分析。然而，也可能直接對mRNA進行分析。
在末端RFLP分析中，標(biāo)記用于PCR或RT-PCR的正向和/或反向引物，從而產(chǎn)生末端標(biāo)記的PCR片段。在用合適的限制性內(nèi)切酶降解后，產(chǎn)生不同大小的片段，可通過電泳、優(yōu)選地毛細(xì)管電泳分離其，可通過標(biāo)記擴增子(Liu等1997，Applied and EnvironmentalMicrobiology63，4516-4522)檢測所述片段。適合的標(biāo)記物可提供可通過熒光、放射性、比色法、X射線衍射或吸收、磁性或酶促活性檢測的信號，其包括，例如，熒光團、發(fā)色團、放射性同位素(特別是32P、33P、35S和125I)、電子致密劑(electron-dense reagents)、酶和具有特異性結(jié)合伴侶的配體。優(yōu)選地，使用熒光團作為標(biāo)志物。
在具有大量多樣性的多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系中，可能不能獲得各單個編碼序列的獨特限制性片段。如果發(fā)生該情況，可選擇崗哨核酸序列來監(jiān)控多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的克隆多樣性。可選擇地，可對根據(jù)大小不能分離的片段進行測序以確定所有單個編碼序列的分布。
寡核苷酸微陣列分析寡核苷酸微陣列，例如DNA芯片，可用于測量多克隆細(xì)胞系中的基因組DNA水平或mRNA水平，通過測量產(chǎn)生自該細(xì)胞系的標(biāo)記的DNA和附著至固體表面的探針的雜交來進行測量(Guo，Z等人1994.Nucleic Acid Res.22，5456-5465)。
探針可以是代表預(yù)期存在于多克隆細(xì)胞系中的序列(來源于多克隆細(xì)胞系自身或來自用于轉(zhuǎn)染包含多克隆細(xì)胞系的宿主細(xì)胞的DNA文庫)的雙鏈cDNA序列或有義寡核苷酸(長度為20-90nt)。將探針附著至固體表面，例如玻璃、塑料或凝膠基質(zhì)的表面，如果使用雙鏈探針，在進行測定前使其變性。當(dāng)分析表達同源蛋白例如多克隆抗體或多克隆TcR的多克隆細(xì)胞系時，優(yōu)選地使用精心設(shè)計的寡核苷酸探針以阻止探針和從多克隆細(xì)胞系產(chǎn)生的標(biāo)記的cDNA之間不想要的交互雜交。為了設(shè)計對于多克隆產(chǎn)物的各單個成員是特異性的探針，基于用于產(chǎn)生多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的編碼可變區(qū)的序列的比對設(shè)計這些探針。對于抗體，編碼序列主要在CDR區(qū)上存在差異，在CDR3區(qū)域上具有最高的可變性。優(yōu)選地將具有最高可變性的區(qū)域用于有義寡核苷酸探針的設(shè)計。探針優(yōu)選地在序列上和多克隆細(xì)胞中包含的單個成員互補，并盡可能地和其他成員高度相異。可使用一種或多種對于各可變區(qū)是特異性的探針。為了標(biāo)準(zhǔn)化，可使用和恒定區(qū)中的序列雜交的探針。將探針直接點在用于雜交的表面上或在表面上原位合成(Pease等人1994.PNAS 915022-5026，Singh-Gasson等人1999.NatureBiotech.17947-978)。
通過收獲多克隆細(xì)胞群體和制備來自所述細(xì)胞的基因組DNA、總RNA或mRNA來產(chǎn)生待分析的標(biāo)記的DNA。當(dāng)使用基因組DNA時，在相關(guān)的編碼序列的PCR擴增中使用合適地標(biāo)記的引物或標(biāo)記的核苷酸來獲得標(biāo)記。當(dāng)使用總RNA或mRNA時，可能單獨地通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或和使用標(biāo)記的引物或核苷酸的PCR組合來獲得cDNA。合適的標(biāo)記物可提供可通過熒光、放射性、比色法、X射線衍射或吸收、磁性或酶促活性檢測的信號，其包括熒光團、發(fā)色團、放射性同位素(特別是32P、33P、35S和125I)、電子致密劑、酶和具有特異性結(jié)合伴侶的配體。優(yōu)選地，使用熒光團作為標(biāo)記物。當(dāng)被分析的編碼序列是抗體的重鏈和輕鏈時，通過位于可變區(qū)3’的恒定區(qū)的反義引物啟動的反轉(zhuǎn)錄制備第一鏈cDNA。如不進行其他的PCR，優(yōu)選地用標(biāo)記的核苷酸進行合成。如果反轉(zhuǎn)錄之后進行PCR，使用確保所有的可變區(qū)家族都被擴增的一系列有義引物?？蛇x擇地，可使用和在所有mRNA中都相同的區(qū)域(例如，5’非翻譯區(qū)或編碼信號肽的序列)雜交的有義引物?？蓪τ辛x和/或反義引物進行熒光標(biāo)記或可在該方法中使用標(biāo)記的核苷酸。
當(dāng)已制備探針和標(biāo)記的DNA后，通過在經(jīng)最優(yōu)化以產(chǎn)生低噪聲和高特異性信號的條件下將變性的標(biāo)記DNA和固定的寡核苷酸雜交來進行微陣列測定法。清洗后，測量各雜交探針，計算特異性信息的量。
定量PCR先前已將PCR方法改造以使之檢測和定量樣品中的核酸序列，參見例如Higuchi，R，等人1993.Kinetic Biotechnology11，1026-1030；Holiand，P.M.等人1991.PNAS88，7276-7280；Livak，K.J.等人1995 PCR Methods Appl.4，357-362。如在標(biāo)準(zhǔn)的PCR中一樣，這些方法使用正向和反向引物和一種或多種額外的核酸序列，該核酸序列和要擴增的核酸雜交。該額外的核酸序列，稱為“探針”，和要擴增的核酸的部分雜交，該部分在和兩個引物雜交的部分之間，以這樣的方式標(biāo)記該額外的核酸序列，通過該方式各連續(xù)的PCR循環(huán)在探針或其標(biāo)記物上產(chǎn)生變化。探針或其標(biāo)記物中的該變化使標(biāo)記物活化或增強至和各PCR循環(huán)期間擴增的核酸的增加的拷貝數(shù)相關(guān)聯(lián)的程度。這樣的方法一般稱為“實時”PCR，其提供了通過將熱循環(huán)和標(biāo)記物檢測結(jié)合逐周期檢測增加的PCR產(chǎn)物的逐周期檢測法。在實時PCR的特定版本中，通過聚合酶例如Taq聚合酶的外切核酸酶的活性產(chǎn)生探針或其標(biāo)記物中的變化，因而該技術(shù)通常稱為Taq或TaqMan實時PCR(例如，Holland，P.M.等1991.PNAS88，7276-7280)。
合適的標(biāo)記物可提供可通過熒光、放射性、比色法、X射線衍射或吸收、磁性或酶促活性檢測的信號，其包括，例如，熒光團、發(fā)色團、放射性同位素(特別是32P、33P、35S和125I)、電子致密劑、酶和具有特異性結(jié)合伴侶的配體。最普遍地，用于探針的標(biāo)記物是提供熒光輸出信號的熒光標(biāo)記物。這可以通過提供在一個末端(通常在5’末端)用熒光報道染料標(biāo)記，而在另一端(3′末端)用淬滅劑染料標(biāo)記(例如，Livak，K.J.等1995 PCR methods Appl.4，357-362)的雙標(biāo)記探針來獲得。當(dāng)探針是完整的時候，淬滅染料和報道染料的靠近抑制了報道染料的熒光。在Wilhelm，J.和Pingoud，A.，2003.Chemblochem.4，1120-1128中對合適的染料進行了綜述。在各PCR循環(huán)中，DAN聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性切斷探針，于是將報道染料和淬滅染料分離。該分離導(dǎo)致增強的報道染料的熒光。
在PCR期間，如果目的靶存在于樣品中，探針將特異性地在正向和反向PCR引物位點之間退火。只有當(dāng)探針和靶分子雜交時，DNA聚合酶的外切核酸酶活性才斷裂報道物和淬滅染料之間的探針。這些探針通常稱為TaqMan探針。只有靶序列和探針互補并在PCR期間擴增時，才可檢測熒光的增加。因為這些必要條件，非特異性擴增不能被檢測。只有包含和探針互補的序列的擴增產(chǎn)物才能通過熒光信號的存在被識別，從而消除了涉及假陽性的分析的某些因素。另外，可使用一種或多種其他酶幫助限制攜帶污染的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的擴增。
該類型的定量PCR允許移液誤差和體積變化的規(guī)范化，以確定各單個反應(yīng)的規(guī)范化的報告子信號，可通過各反應(yīng)內(nèi)的被動參照除以報告物熒光來進行規(guī)范化?？墒褂密浖治鰺晒鈴姸壬系闹鹧h(huán)的增加和將這些數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)比較，以確定用于絕對定量的起始拷貝數(shù)目或?qū)⑵渑c其他未知樣品比較以比較相對量。
特別地，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中的TaqMan實時PCR適合用于表征多克隆細(xì)胞系。因此，當(dāng)用于表達多克隆抗體的細(xì)胞系時，該技術(shù)用于定量編碼單個抗體的序列的相對比例，因為可為多克隆細(xì)胞系中出現(xiàn)的各成員的重鏈和/或輕鏈設(shè)計獨特的TaqMan探針。優(yōu)選地，選擇CDR區(qū)域CDR1、CDR2或CDR3中的一個用于設(shè)計TaqMan探針。最優(yōu)選地，選擇CDR3用于設(shè)計TaqMan探針?？稍赗asmussen，T.等人2000.Exp.Hematol.28，1039-1045(此處引用作為參考)中找到這些可變重鏈CDR3 TaqMan探針的示例。
核酸測序核酸測序是熟知的技術(shù)，其可和本發(fā)明一起使用以提供關(guān)于多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞的多樣性的定性信息?？蓪νㄟ^單細(xì)胞克隆從多克隆細(xì)胞系產(chǎn)生的單細(xì)胞或在獲自多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的各種細(xì)胞的未經(jīng)處理的樣品進行測序。
單個細(xì)胞水平上的測序可提供關(guān)于生產(chǎn)性細(xì)胞系內(nèi)產(chǎn)生多克隆蛋白的單個成員的細(xì)胞的相對比例的信息。在該方法中，在想要的時間點上獲得來自多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的樣品，待表征的編碼多克隆蛋白的細(xì)胞是通過例如使用有限稀釋法(limited dilution)或通過細(xì)胞分選儀例如FACS Aria進行單細(xì)胞克隆的。應(yīng)當(dāng)從多克隆細(xì)胞系獲得的單細(xì)胞的數(shù)目依賴于預(yù)期存在于細(xì)胞系內(nèi)的序列的多樣性。優(yōu)選地，應(yīng)當(dāng)對3倍數(shù)量的在細(xì)胞系產(chǎn)生期間形成輸入的單種編碼序列進行單細(xì)胞分選，以產(chǎn)生95％的可能性在受試樣品中重新發(fā)現(xiàn)所有其。因此，如果使用25種不同的編碼序列的文庫產(chǎn)生細(xì)胞系，應(yīng)當(dāng)從樣品中獲取至少75個單個細(xì)胞克隆進行測序，假定25種不同的序列以相等的量存在。這樣應(yīng)當(dāng)確保大多數(shù)在多克隆細(xì)胞系中呈現(xiàn)的單個編碼序列呈現(xiàn)在單個細(xì)胞克隆中，如果其在生產(chǎn)過程中未被丟失。將單個細(xì)胞在獨立的小孔中培養(yǎng)至匯合，將來自各孔的等分在核酸測序反應(yīng)中用作模板?？稍趍RNA水平或基因組水平上進行測序，在測序前分別使用RT-PCR或PCR擴增步驟。mRNA或基因組水平上獲得的序列信息可確定編碼各單個抗體組分的細(xì)胞的百分比。此外，在mRNA水平上獲得的序列信息可用于估量多克隆組合物中各單種抗體的表達水平。除了測序外，可能在mRNA水平上進行TaqMan實時PCR以獲得關(guān)于單個細(xì)胞克隆的潛在的表達水平的信息。同樣可在單個細(xì)胞水平上進行前面描述的RFLP或T-RFLP分析。
對獲自多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的不同細(xì)胞的未處理的樣品的測序也可提供關(guān)于從細(xì)胞系產(chǎn)生的多克隆蛋白的單個成員的潛在表達水平的信息，該信息基于多克隆蛋白的單個成員的編碼序列的相對mRNA水平。在該方法中，在想要的時間點上獲得來自多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的樣品。直接對樣品中的裂解的細(xì)胞進行RT-PCR。以這樣的方式設(shè)計用于RT-PCR反應(yīng)的引物，即，使其在有義和反義引物與在所有mRNA中都一致的區(qū)域雜交的情況下，預(yù)期以相同的功效擴增所有編碼序列(例如，可使用5’非翻譯區(qū)或編碼信號肽的序列中的有義引物和恒定區(qū)序列中的反義引物)。將擴增的PCR片段克隆入測序載體和轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，優(yōu)選地大腸桿菌(E.coli)。對這樣的質(zhì)粒DNA進行測序，該DNA來自呈現(xiàn)來自多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的單個編碼序列的單個克隆，獲得的單個編碼序列的比例反映多克隆細(xì)胞系中各單個編碼序列的mRNA水平和單個蛋白成員的潛在表達水平。
在本發(fā)明的其他實施方案中，上述遺傳分析用作獨立的分析。優(yōu)選地，對來自相同樣品的等分進行一種或多種分析，從而盡可能多地獲得關(guān)于細(xì)胞系的克隆多樣性的信息。可選擇地可以多維的方法組合遺傳分析法，例如可在RFLP或T-RFLP分析之后對RFLP或T-RFLP片段進行微陣列分析，或可在RFLP分析之后對RFLP片段進行測序。特別地，對呈現(xiàn)超過一個單個組分并由于其相同的限制性片段大小而不能分離的RFLP片段進行測序是個有利方面。
用于估量多克隆性的蛋白質(zhì)表征技術(shù)在本發(fā)明的實施方案中，通過一種或多種蛋白質(zhì)表征技術(shù)監(jiān)控同源蛋白或生產(chǎn)同源蛋白的表達系統(tǒng)的混合物的多克隆性。蛋白質(zhì)表征技術(shù)是指能夠單獨的或和其他技術(shù)一起提供這樣的信息的任何技術(shù)，該信息是關(guān)于溶液中的或存在于多克隆細(xì)胞系中的細(xì)胞的表面上的單克隆蛋白的混合物的或重組多克隆蛋白的單個成員的存在或相對比例的信息。依賴于重組多克隆蛋白的復(fù)雜性，可使用一種或多種下列技術(shù)i)層析分離技術(shù)，ii)用于鑒定代表多克隆蛋白的單個成員的獨特標(biāo)志性肽的多克隆蛋白的蛋白水解降解物的分析法，iii)“大批量”N末端測序法，和iv)使用特異性檢測分子的分析法，例如用于表征多克隆蛋白的崗哨蛋白成員的技術(shù)。
包含不同的同源蛋白的樣品可以是純化的單克隆蛋白的混合物或多克隆蛋白。多克隆蛋白可從例如獲自多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液產(chǎn)生，該上清液以例如只是通過例如離心與細(xì)胞分離的“粗”上清液或通過例如A蛋白親和純化、免疫沉淀或凝膠過濾純化的上清液的形式存在。然而，這些預(yù)純化步驟不是重組多克隆抗體表征方法的一部分，因為其沒有提供組合物中不同的同源蛋白的任何分離。優(yōu)選地，接受本發(fā)明的表征方法的樣品已接受了至少一個純化步驟。最優(yōu)選地是包含90％、95％或99％的純同源蛋白的樣品。
可在這樣的樣品中監(jiān)測組成多克隆蛋白的不同的同源蛋白，該樣品在培養(yǎng)期間在不同的時間點上獲自單個多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物，從而在整個生產(chǎn)批次中監(jiān)測單個多克隆蛋白成員的相對比例以估量其組成穩(wěn)定性。可選擇地，可在這樣的樣品中監(jiān)測組成多克隆蛋白的不同的同源蛋白，該樣品獲自特定時間點上的不同多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物，從而監(jiān)測不同的批次中的單個編碼序列的相對比例以估量批與批之間的一致性。
層析分離技術(shù)多克隆蛋白的單個成員的層析分離可基于這樣的物理化學(xué)性質(zhì)上的差異，例如i)靜電荷(以離子交換層析法(IEX)為例說明)、ii)疏水性(以反相層析法(RP-HPLC)和基于鹽濃度的疏水性相互作用層析法(HIC)為例說明)、iii)等電點(pI值)(以色譜聚焦法為例說明)或iv)親和力(以使用抗獨特型肽/抗體的親和層析法或用于分離κ和λ抗體輕鏈的L蛋白層析法為例說明)。第5種眾所周知的層析技術(shù)，基于下列物理化學(xué)性質(zhì)大小。然而這不是特別適合于表征同源蛋白例如多克隆抗體或多克隆TcR的技術(shù)，因為所有成員大小基本相同?？赏耆珡谋碚髌脚_省略掉通過大小的分離法。已將這些上述層析技術(shù)中的一些用于從人血清中分離免疫球蛋白種類例如IgA、IgG和IgM(Gallo，P.等人1987.J.Chromatogr.416，53-62)或亞類例如IgG1、IgG2、IgG3(Scharf，0等人2001.J.Virol.75，6558-6565)。然而，以前未進行過關(guān)于來源于血清的免疫球蛋白或重組多克隆抗體中的單個抗體的多樣性的分離。
a)離子交換層析法在本發(fā)明的實施方案中，使用離子交換層析法分離重組多克隆蛋白的單個成員或多克隆蛋白的單個成員的亞群。通過離子交換層析法進行的分離基于待分離的組合物中的單個蛋白的靜電荷。依賴于重組多克隆蛋白的pI值、選擇的柱緩沖液的pH值和鹽濃度，可使用陰離子或陽離子交換層析法將重組多克隆蛋白的單個成員至少分離至某種程度。例如，只要pH適當(dāng)?shù)氐陀谥亟M多克隆蛋白組合物的單個成員的最低pI值，那么重組多克隆蛋白的所有單個成員一般都會結(jié)合帶負(fù)電荷的陽離子交換層析介質(zhì)。然后一般使用鹽(例如，氯化鈉)的不斷增加的梯度或使用不斷增加的pH值，依賴于單種蛋白的靜電荷，可將被結(jié)合的重組多克隆蛋白的單個成員從柱上洗脫。在洗脫過程中可獲得幾種級分。單個級分優(yōu)選地包含多克隆蛋白的單個成員，但也可包含多克隆蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多種不同的成員。陽離子和陰離子交換的一般原理在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，可商購獲得用于離子層析的柱子。
b)色譜聚焦法在本發(fā)明的其他實施方案中，使用色譜聚焦法分離重組多克隆蛋白的單個成員或多克隆蛋白的單個成員的亞群。通過色譜聚焦法進行的分離基于單種蛋白的pI值上的差異，使用具有高于重組多克隆蛋白的pI值的pH值的柱緩沖液進行該分離。其中單個成員具有相對低的pI值的重組多克隆蛋白將結(jié)合帶正電荷的弱陰離子交換介質(zhì)。然后，通過在柱中產(chǎn)生逐漸增加的pH梯度，依賴于單個成員的pI值，可將結(jié)合的重組多克隆蛋白的單個成員從柱子上洗脫，使用經(jīng)設(shè)計涵蓋單個成員的pI值的pH范圍的多緩沖液(polybuffer)產(chǎn)生該增加的pH梯度。在洗脫期間可獲得幾種級分。單個級分優(yōu)選地包含多克隆蛋白的單個成員，但也可包含多克隆蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多種不同的成員。使用陰離子交換劑的色譜聚焦法的一般原理在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，可商購獲得陰離子柱。具有陽離子交換劑的色譜聚焦法在本領(lǐng)域也是已知的(Kang，X.和Frey，D.D.，2003.j.Chromatogr.911，117-128，此處引用作為參考)。
c)疏水相互作用層析法在本發(fā)明的其他實施方案中，使用疏水相互作用層析分離重組多克隆蛋白的單個成員或多克隆蛋白的單個成員的亞群。通過疏水相互作用層析進行的分離基于待分離的組合物中的單個蛋白的疏水性上的差異。將重組產(chǎn)生的多克隆蛋白結(jié)合至存在于這樣的緩沖液中的用疏水性配體修飾的層析介質(zhì)，該緩沖液有利于疏水相互作用。一般在包含低百分比的有機溶劑(RP-HPLC)的緩沖液中或包含相當(dāng)高濃度的選擇的鹽(HIC)的緩沖液中獲得該結(jié)合。隨后一般使用逐漸增加的有機溶劑(RP-HPLC)的梯度或逐漸降低的選擇的鹽(HIC)的梯度，依賴于單個成員的疏水性，將結(jié)合的重組多克隆蛋白的單個成員從柱子上洗脫。在洗脫期間可獲得幾種級分。單個級分優(yōu)選地包含多克隆蛋白的單個成員，但也可包含多克隆蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多種不同的成員。疏水相互作用層析法的一般原理在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，可商購獲得用于RP-HPLC和HIC的柱子。
d)親和層析法在本發(fā)明的其他實施方案中，使用親和層析法分離重組多克隆蛋白的單個成員或多克隆蛋白的單個成員的亞群。通過親和層析法進行的分離基于對特異性檢測分子、配體或蛋白的親和力的不同。將檢測分子、配體或蛋白或其組合(這些在下面都稱為配體)固定在層析介質(zhì)上，在有利于單個成員和固定的配體之間相互作用的條件下將重組多克隆蛋白加于親和柱。將顯示對固定的配體沒有親和力的蛋白收集在柱流通液(column flow through)中，隨后在不利于結(jié)合的條件(例如，低pH、高鹽濃度或高配體濃度)下將顯示對固定的配體具有親和力的蛋白從柱子上洗脫。在洗脫期間可獲得幾種級分。單個級分優(yōu)選地包含多克隆蛋白的單個成員，但也可包含多克隆蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多種不同的成員?？捎糜诒碚髦亟M多克隆蛋白的配體是例如靶-抗原、抗獨特型分子或用于分離具有κ和λ輕鏈的抗體的L蛋白。
當(dāng)重組多克隆蛋白具有對超過一個表位的親和力時，使用靶-抗原的親和層析法是特別適合的。靶可以是例如包含許多表位的癌細(xì)胞或病毒或靶的組合。這些表位可通過合成的方法合成并固定在層析介質(zhì)上?？稍O(shè)計每柱使用一個表位或每柱使用幾種不同的表位的測定法，從而使得能夠在關(guān)于針對特定表位的單個成員的分布的方面表征重組多克隆蛋白混合物?？蛇x擇地，可將完整的抗原或靶分子固定在層析介質(zhì)上。
可進行使用特異性結(jié)合多克隆蛋白的單個成員或這些單個成員的亞群體的抗獨特型分子(例如，抗獨特型肽或抗獨特型抗體)的親和層析，從而獲得關(guān)于重組多克隆蛋白的選擇的成員(也稱為崗哨蛋白)或單個成員的亞群體的相對比例的信息。理想地，各單種抗獨特型分子只特異性地結(jié)合一種單個成員，但不結(jié)合重組多克隆蛋白的其他成員，盡管在本發(fā)明中也可使用結(jié)合確定的成員的亞組的抗獨特型分子。優(yōu)選地，產(chǎn)生針對所有單個成員的抗獨特型分子，這樣可表征完整的多克隆組合物。當(dāng)重組多克隆蛋白是多克隆抗體或TcR時，抗獨特型分子針對抗體或T細(xì)胞受體的序列的抗原特異性部分?？蓡蝹€地將抗獨特性分子固定至層析介質(zhì)，這樣一個柱子包含一種抗獨特型分子，由此獲得關(guān)于特定蛋白成員或蛋白的亞群體的信息。然后可將流通物施加于具有固定的第二抗獨特型分子的第二柱，依此類推?？蛇x擇地，將幾種不同的抗獨特型分子固定在用于相同的柱子的相同的層析基質(zhì)上。然后在允許單個蛋白被洗脫在不同的級分中的條件下，例如，通過向柱子加入逐漸增加的量的游離獨特型分子或使用pH或鹽梯度來進行洗脫。通過該方法，可能使用一維分析獲得關(guān)于多克隆蛋白質(zhì)幾個成員的比例的信息。
當(dāng)重組多克隆蛋白是多克隆抗體時，其可由包含κ輕鏈或λ輕鏈的單個成員組成。在這樣的多抗隆抗體中，可通過利用L蛋白針對λ輕鏈抗體的親和力的缺乏來將具有λ輕鏈的抗體和具有κ輕鏈的抗體分離。因此，使用L蛋白親和層析法可將包含λ輕鏈的抗體成員的亞組和包含κ輕鏈的抗體成員的亞組分離。然后可另外使用其它的用于單個抗體定量的層析技術(shù)(例如上述的技術(shù))進一步表征κ和λ抗體亞組。
多維層析依賴于待分析的樣品中的不同同源蛋白例如重組多克隆蛋白的復(fù)雜性，想要地可將上述a)至d)中的兩種或更多種層析技術(shù)以二維、三維或多維的形式組合。優(yōu)選地在所有維中使用液相層析術(shù)取代二維凝膠電泳。然而，這不排除在一維或多維中使用凝膠電泳或沉淀技術(shù)進行重組多克隆蛋白的表征。
在例如Lubman，D.M.等人2002.J.Chromatogr.B Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.782，183-196；WO01/58925和WO01/58926中描述了液相二維層析法。已使用該方法比較健康細(xì)胞和癌細(xì)胞的蛋白表達，從而在蛋白水平上產(chǎn)生不同的展示。此外，已在WO03/102539中描述了用于在例如細(xì)胞提取物中分離蛋白，從而同樣產(chǎn)生不同展示的三維層析法，在該層析法中第三維是通過大小進行分離。
在本發(fā)明的其他實施方案中，多維層析法用于樣品中的不同的同源蛋白的表征。特別地使用多維層析法表征具有不同的可變區(qū)域的同源蛋白例如抗體和T細(xì)胞受體的樣品。優(yōu)選地，對在前面的維中洗脫期間獲得的級分進行另外的維。然而，也可將流通物用于其他維的分析。當(dāng)前面的維是親和層析時，該方法可以變得特別適用。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將多維層析用于分離來自多克隆抗體(來源于血清的免疫球蛋白或重組體)或單克隆抗體的混合物的單種抗體分子以獲得關(guān)于其多樣性的信息。優(yōu)選地多維層析法是液相層析法。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，將多維層析用于分離來自多克隆T細(xì)胞受體或單克隆T細(xì)胞受體的混合物的單種T細(xì)胞受體分子以獲得關(guān)于其多樣性的信息。優(yōu)選地多維層析法是液相層析法。
一般地，試圖在多維層析法中，在不同的維使用基于不同物理化學(xué)性質(zhì)的層析技術(shù)，例如在第一維中通過電荷進行分離，在第二維中通過疏水性進行分離和在第三維中通過親和力進行分離。然而，當(dāng)用于隨后的維中時，一些層析技術(shù)可提供額外的分離，即使其利用蛋白的相似物理化學(xué)性質(zhì)。例如在色譜聚焦法之后進行離子交換層析法或進行順次使用不同配體的親和層析法時可獲得額外的分離。
表1列出了高達5維的方法，其中可將層析技術(shù)用作本發(fā)明的表征平臺的部分。然而，不應(yīng)當(dāng)將這當(dāng)作維(dimension)的必需數(shù)目。如果在一、二、三或四維之后已獲得表征重組多克隆蛋白的充分的分離，那么可省略剩余的維。因此，如果使用離子交換層析法(IEX)獲得充分的分離，那么就不必進行色譜聚焦法、RP-HPLC等。如果另一方面證明5維不夠，可加上另外的維。此外，表1不應(yīng)當(dāng)被當(dāng)作層析技術(shù)的所有可能組合的完全目錄，或被當(dāng)作技術(shù)本身的完全目錄。
表1
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，多維液相層析(LC)是選自表1中所示的前兩維的二維LC技術(shù)。
在本發(fā)明的其他優(yōu)選的實施方案中，多維LC是選自表1中所示的前三維的三維LC技術(shù)。
作為多維LC技術(shù)的另外的選擇，和合適的電泳技術(shù)例如凝膠電泳或毛細(xì)管電泳組合的免疫沉淀法以及隨后的抗原的定量可用于表征重組多克隆蛋白。該技術(shù)特別適合用于表征靶向復(fù)雜抗原的重組多克隆抗體?？墒褂脴?biāo)記的抗原混合物和A蛋白小珠免疫沉淀靶向例如復(fù)雜的病毒抗原的重組多克隆抗體。然后可使用等電聚焦法或2D PAGE分離抗原，然后對單個抗原進行定量，以反映重組多克隆抗體中的靶向特定抗原的抗體的量。
重組蛋白中的N末端電荷不均一性的消除在上述的蛋白質(zhì)表征技術(shù)中，同源蛋白的混合物中的單種蛋白的不均一性可使表征更加復(fù)雜，因為單種蛋白可在例如IEX特征譜中導(dǎo)致幾個峰。不均一性在抗體和其他重組蛋白中是個普遍現(xiàn)象，是由于酶促或非酶促翻譯后修飾造成的。這些修飾可產(chǎn)生大小或電荷的不均一性。普通的翻譯后修飾包括N糖基化、甲硫氨酸氧化、蛋白水解斷裂和脫酰胺作用。不均一性也可產(chǎn)生于基因水平上的修飾，例如轉(zhuǎn)染期間導(dǎo)入的突變(Harris，J.R等人1993.Biotechnology11，1293-7)和在轉(zhuǎn)錄期間重鏈和輕鏈的可變基因之間的交換事件(Wan，M.等人1999.Biotechnol Bioeng.62，485-8)。這些修飾是外遺傳的，因此不能單獨地從構(gòu)建體的基因結(jié)構(gòu)來預(yù)測。
在表征之間可處理可導(dǎo)致不均一性的這些翻譯后修飾的一些修飾?？赏ㄟ^使用特異性羧肽酶抑制劑或用羧肽酶處理抗體以簡化總體模式來解決由于酶促去除C末端賴氨酸產(chǎn)生的電荷差異(Perkins，M.等2000.Pharm Res.17，1110-7)。由糖基化模式的差異產(chǎn)生的大小差異也可通過使用例如PNG酶F、Endo H、O-糖苷酶或神經(jīng)氨酸酶的酶促去糖基化來解決。
已顯示蛋白的化學(xué)降解，例如脫酰胺作用在生產(chǎn)和貯存期間是非常嚴(yán)重的問題，其導(dǎo)致電荷的不均一性。在溫和條件下發(fā)生Asn至Asp的脫酰胺作用和異Asp(異天冬氨酰肽鍵(isoaspartyl petidebonds))的形成(Aswad，D.W.等2000.J Pharm Biomed Anal.21，1129-36)。這些重排最容易在Asn-Gly、Asn-Ser和Asp-Gly序列發(fā)生，在所述序列中局部的多肽鏈柔性很高。
電荷不均一性的另一個原因可能是由于N末端谷氨酰胺殘基的環(huán)化(脫酰胺作用)造成的焦谷氨酸(PyroGlu)導(dǎo)致的N末端封閉造成的。已描述了IgG和其他蛋白的這些翻譯后修飾?？贵w的N末端的部分環(huán)化，特別是如果HC和LC都參與時，將導(dǎo)致電荷的不均一性，從而產(chǎn)生復(fù)雜的IEX模式。圖16中顯示由于在一個或多個抗體的VH和VL鏈上的N末端PyroGlu的形成產(chǎn)生的潛在的IEX模式。如果要通過基于靜電荷的技術(shù)表征包含不同的同源蛋白(其具有不同可變區(qū))的樣品，例如重組多克隆抗體，很明顯示這樣的分析十分復(fù)雜，即使只有少量樣品組分具有圖16B和C顯示的IEX模式，因為這掩蓋了例如多克隆抗體組合物的IEX特征譜中的克隆多樣性。該問題不能通過使用特異性酶、焦谷氨酸氨肽酶來解決，首先因為為了獲得高產(chǎn)量的去封閉的抗體，必須對還原的和烷基化的抗體進行去封閉(Mozdzanowski，J.等人1998 Anal Biochem.260，183-7)，這和隨后的IEX分析不相容，其次因為不可能獲得所有抗體的100％斷裂。
因此本發(fā)明的其他方面涉及消除由N末端谷氨酰胺殘基的環(huán)化造成的電荷不均一性。如果和前述的基于物理化學(xué)性質(zhì)靜電荷的表征工具中的任一種結(jié)合，例如IEX層析和色譜聚焦結(jié)合，那么本發(fā)明的該方面特別有用。通過例如將N末端谷氨酰胺變成另一種氨基酸從而確保多肽鏈不包含所述N末端谷氨酰胺來消除N末端PyroGlu殘基的形成。如果蛋白是由不同亞基構(gòu)成的異聚蛋白，優(yōu)選地將所有N末端Gln殘基變成其他殘基。對于抗體，交換重鏈和/或輕鏈的N末端上的Gln殘基。通過編碼具有N末端谷氨酰胺的多肽的核酸序列的定點誘變進行該交換。優(yōu)選地，用谷氨酸殘基替代N末端谷氨酰胺，因為這是谷氨酰胺的不帶電荷的衍生物。在重組多克隆蛋白中，必須改變編碼成員的單個序列并重新插入表達載體以產(chǎn)生新的表達改變了的蛋白的細(xì)胞系。然后可將該細(xì)胞系加入生產(chǎn)多克隆蛋白的細(xì)胞的集合中。
同源蛋白質(zhì)的可變區(qū)的蛋白水解降解物的分析如上所述，可使用許多層析技術(shù)，基于完整的蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)表征包含具有不同可變區(qū)的不同的同源蛋白的蛋白樣品。從這些前述的分析中獲得的信息可另外地用從同源蛋白的蛋白水解降解物的分析獲得的信息進行補充。優(yōu)選地，對這樣的樣品的等分進行蛋白水解降解，該樣品和進行完整的蛋白的層析分析的樣品相同。
在本發(fā)明的其他方面，這樣的獨特標(biāo)志性肽的鑒定可用于以定量的方式就單個成員的存在表征蛋白組合物，所述獨特性標(biāo)志性肽產(chǎn)生自同源蛋白的組合物的單個成員的可變區(qū)。通過包含不同的同源蛋白的蛋白組合物(樣品)的蛋白水解降解產(chǎn)生這些獨特標(biāo)志性肽。
為了進行同源蛋白的混合物的可變區(qū)域的肽作圖，在蛋白水解降解后保持這樣的可變區(qū)的部分的完整性是非常重要的，該可變區(qū)的部分可在混合物中將單個成員和其他成員區(qū)分開。因此，應(yīng)當(dāng)這樣選擇一種或多種蛋白酶以使能夠獲得重組多克隆蛋白的各單個成員的至少一個獨特的序列，也稱為標(biāo)志性肽。當(dāng)同源蛋白的混合物是重組多克隆蛋白或重組多克隆TcR時，一般通過CDR區(qū)表征相互區(qū)分單個成員的序列。用于產(chǎn)生獨特標(biāo)志性肽的蛋白酶或化合物的選擇基于組成同源蛋白的樣品的蛋白序列的分析。一般地，蛋白酶或化合物應(yīng)當(dāng)高度特異性地在蛋白中確定的位置上進行切割。這些特異性切割的蛋白酶在本領(lǐng)域是熟知的，其可以是例如胰蛋白酶、endo Glu-C、賴氨酰內(nèi)肽酶、endo Arg-C、endo Asp-N或endo Asn-C。這些酶僅僅是示例，不應(yīng)當(dāng)被理解為對本實施方案的限制。
當(dāng)用一種或多種選擇的蛋白酶降解多克隆蛋白樣品時，產(chǎn)生這樣的肽的混合物，所述肽產(chǎn)生自來自所有單個成員的恒定區(qū)和可變區(qū)。和從恒定區(qū)產(chǎn)生的肽的主群體相比，獨特標(biāo)志性肽部分在其物理化學(xué)性質(zhì)上顯示差異。因此可使用上述層析技術(shù)中的一種分離獨特標(biāo)志性肽。優(yōu)選地，使用特別地設(shè)計用于肽分離的離子交換層析法或RP-HPLC法將獨特肽和恒定區(qū)肽的主要級分分離。同樣地，可將前述的多維層析技術(shù)用于分離獨特標(biāo)志性肽。在一維或多維中分離后，可使用質(zhì)譜(MS)鑒定不同的肽。可使用蛋白組學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的MS技術(shù)鑒定所述肽。優(yōu)選的MS技術(shù)是基質(zhì)輔助UV激光解吸/電離(MALDI)飛行時間(TOF)質(zhì)譜和電噴霧電離飛行時間(ESI-TOF)質(zhì)譜。
可選擇地，可對通過a)至d)中和上面的“多維液相層析法”部分中所述的一維或多維層析法分離的完整蛋白進行水解降解，然后進行分離的蛋白級分的蛋白水解斷裂。然后可通過MS(Kachman，M.T.等人2002.Ana 1.Chem.74，1779-1791)分析這些降解物。該方法在表征非常復(fù)雜的多克隆蛋白上可以是非常有利的，因為可選擇性地將其用于通過完整蛋白的一維或多維分析獲得的部分級分以進一步表征這些蛋白。
如果N末端標(biāo)志性肽包含獨特的可變區(qū)，可進一步進行蛋白水解降解以分離這些肽?？苫旧习凑誈evaert，K.等人，2003.Nat.Biotechnol.21，566-569(此處引用作為參考)中所述的方法分離N末端肽。簡而言之，通過例如乙?；忾]重組多克隆蛋白的游離氨基，然后用適合的蛋白酶降解蛋白混合物。降解在內(nèi)部肽上產(chǎn)生游離的N末端氨基，該氨基隨后可用可使內(nèi)部肽和N末端肽分離的化合物封閉。這些化合物可以是i)Gevaert描述的允許通過疏水性相互作用分離的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，II)生物素，在結(jié)合固定的鏈霉抗生物素后隨后被除去，或iii)預(yù)活化的基質(zhì)(例如，NHS活化的、CNBr活化的ECH Sepharose材料，或具有二氫唑酮基的紫外連接的雙丙烯酰胺支持物)，然后離心，由此將結(jié)合的內(nèi)部肽和存在于上清液中的乙酰化的N末端肽分離。隨后可通過和上述的MS分析結(jié)合的一維或多維液相層析法分析分離的乙酰化N末端肽?？蛇x擇地，用允許其特異性分離的化合物封閉完整蛋白的N末端，用第二化合物乙?；蚍忾]斷裂后產(chǎn)生的內(nèi)部肽。
此外，可使用特征性的氨基酸側(cè)鏈官能團在蛋白水解降解后鑒定獨特標(biāo)志性肽?？墒褂貌煌挠H和技術(shù)中的一種或其組合，所述親和技術(shù)捕獲具有和不具有相關(guān)氨基酸側(cè)鏈修飾并包含特異性氨基酸殘基的肽?？墒褂霉潭ㄓ羞@樣的特異性親和標(biāo)簽的柱材料或小珠純化包含例如，半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、組氨酸和酪氨酸的肽，所述親和標(biāo)簽捕獲包含這些氨基酸殘基的肽(Bernhard，O.K.等人2003.Proteomics 3，139-146；Chelius，D.和Shaler，T.A.，2003.Bioconjug.Chem.14，205-211；Gavaert，K.等人2002.Mol.CellProteomics 1，896-903；Gygl，S.P.等人，1999.Nat.Biotechnol17，994-999)。在生物素化半胱氨酸殘基后，可將包含半胱氨酸和酪氨酸殘基的獨特可變區(qū)肽捕獲在鏈霉抗生物素柱上，隨后在洗脫包含半胱氨酸的肽后，可將這些肽加于特異性結(jié)合酪氨酸殘基的柱子或小珠。可將基于對特異性氨基酸殘基的親和力的該肽的捕獲作為前面描述的層析技術(shù)例如RP-HPLC和離子交換層析法的附加維來進行。首先，在一維或多維中，將層析技術(shù)用于重組多克隆蛋白的蛋白水解降解物，然后在最后的維中對一種或多種級分進行該氨基酸特異性捕獲，然后通過MS進行分析?？蛇M一步將基于側(cè)鏈官能團的肽的分離法和N末端肽分離技術(shù)結(jié)合起來進行。
當(dāng)通過蛋白水解降解，然后通過肽分離處理的被分析研究的重組多克隆蛋白是多聚體蛋白時，優(yōu)選地在蛋白水解前進行亞基的分離以簡化蛋白水解降解物的“指紋圖譜”?？赏ㄟ^例如還原或烷基化游離半胱氨酸，然后通過凝膠過濾分離亞基(例如如果多克隆蛋白是抗體或TcR的話，分別將重鏈和輕鏈或?qū)ⅵ伶満挺骆湻珠_)來進行該分離?？蛇x擇地，可在天然的條件下進行蛋白水解降解。對于抗體，這可以是個特別合適的選擇，因為抗體的四級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致在恒定區(qū)內(nèi)對蛋白水解斷裂的高抗性。因此，完整的非還原的多克隆抗體的蛋白水解斷裂很可能產(chǎn)生主要來自可變區(qū)的肽。
也根據(jù)崗哨概念，通過選擇可在蛋白水解降解物內(nèi)表征的崗哨肽來使用上述的蛋白水解降解技術(shù)。
“大批量” N末端測序如所描述的，可分離N末端序列并用于表征多克隆蛋白的蛋白水解降解物的指紋圖譜?？蛇x擇地，可直接從完整的蛋白對N末端測序，從而省略蛋白水解步驟。包含具有不同可變區(qū)的不同的同源蛋白的蛋白樣品的“大批量”N末端序列分析可用于比較例如重組多克隆蛋白的純化的批量產(chǎn)品。當(dāng)多克隆蛋白是重組多克隆抗體或TcR時，優(yōu)選地分別對分離的重鏈和輕鏈或分離的α鏈和β鏈的混合物進行“大批量”N末端測序。在例如同源重鏈的混合物中，一些氨基酸位置可以是完全保守的，盡管其他位置可以發(fā)生變化，這可通過氨基酸序列的比對來確定。因此，在特定的幾輪測序期間可獲得幾種不同的氨基酸。例如，如通過同源序列的比對預(yù)先確定的，多克隆抗體中的位點4可代表5種不同的氨基酸。在“大批量”N末端序列分析期間，可對這些可變的氨基酸進行定量，代表例如重組多克隆抗體中位點4的單個氨基酸的不同量可用于比較不同樣品的相對組成。
使用特異性檢測分子進行的復(fù)雜的同源蛋白混合物的表征本發(fā)明的表征平臺還使用特異性檢測分子，其中各特異性檢測分子可鑒定同源蛋白的復(fù)雜混合物中的單個蛋白成員，因而支持監(jiān)控樣品中特定成員的存在。特異性檢測分子可以是例如特異性配體例如具有對于多克隆蛋白的單個成員的特異性的小有機分子、肽或蛋白。特別地，配體-肽或蛋白例如抗獨特型肽或抗獨特型抗體是本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。結(jié)合同源蛋白的復(fù)雜混合物的確定的亞組的檢測分子也可用于本發(fā)明。
可使用特異性檢測分子通過下列方面表征同源蛋白的復(fù)雜混合物i)允許確定包含同源蛋白的復(fù)雜混合物的樣品中的一種或多種單種蛋白的濃度或相對比例，ii)用作層析分析中的另外的維，iii)允許確定在同源蛋白的復(fù)雜混合物的發(fā)酵期間獲得的樣品中的單種蛋白濃度，和iv)允許確定表達同源蛋白的混合物的多克隆細(xì)胞系(例如工作細(xì)胞庫或生物反應(yīng)器細(xì)胞樣品)中的單種蛋白產(chǎn)生性細(xì)胞。可對多克隆細(xì)胞系或?qū)亩嗫寺〖?xì)胞系分配入單管然后經(jīng)歷一段培養(yǎng)時間后的單種細(xì)胞進行步驟iv)。
為了產(chǎn)生能夠鑒定同源蛋白的復(fù)雜混合物中的單個蛋白成員的特異性肽-配體，可通過親和層析，然后通過純化展示結(jié)合抗體、TcR或另一種想要的單個蛋白成員的外源肽的噬菌體來篩選大量的絲狀噬菌體表達載體文庫(Scott和Smith 1990.Science 249，386-90)，所述文庫在病毒體表面展示了外源寡聚體肽。EP1106625特別地描述了能夠結(jié)合用于免疫目的的抗RhD抗體的肽的產(chǎn)生。被展示的肽文庫大約為5至50個氨基酸長，優(yōu)選地7至20個氨基酸長，更優(yōu)選地8至15個氨基酸長和最優(yōu)選地9至12個氨基酸長。當(dāng)已鑒定相關(guān)肽后，可合成其。
抗獨特型抗體的產(chǎn)生通常在本領(lǐng)域是已知的。簡而言之，用想要的抗獨特型抗體所針對的抗體免疫小鼠。從免疫的小鼠產(chǎn)生單克隆抗體，使用例如雜交瘤技術(shù)或噬菌體展示篩選所述單克隆抗體以產(chǎn)生具有想要的特異性的抗獨特型抗體。應(yīng)當(dāng)就特異性和潛在的交叉反應(yīng)性表征抗獨特型肽或抗獨特型抗體。該分析將驗證抗獨特型肽或抗獨特型抗體是否識別特定成員或可選擇地，識別多克隆蛋白內(nèi)的緊密相關(guān)的成員的亞組(對于抗體，相關(guān)成員可以是例如特定的VH基因家族)。
可將抗獨特型肽/抗獨特型抗體用于免疫檢測測定法例如ELISA、FLISA或RIA以直接定量單個成員蛋白(例如，特定抗體或特定TcR)?？蛇x擇地，可將抗獨特型肽/抗獨特型抗體用于親和層析法，單獨使用地或作為第一維或在前述的其他層析分離法之后作為額外的維使用。免疫沉淀法是這樣的另外的方法，在該方法中檢測分子可用于分離和表征多克隆蛋白的單個成員。此外，可使用抗獨特型肽或抗獨特型抗體在多克隆細(xì)胞系中分離和/或確定生產(chǎn)單種蛋白的細(xì)胞。Borth，N.等人2000-2001.Biotechnol Bioeng.71，266-273和Brezinsky，S.C.等人2003.J.Immunol.Methods 277，141-155描述的技術(shù)都可用于從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離生產(chǎn)單種蛋白的細(xì)胞。
潛在地，可能產(chǎn)生針對多克隆蛋白中的每一個單個成員的特異性檢測分子以獲得完全的表征。然而，為了監(jiān)控表達的穩(wěn)定性或批與批之間的一致性，根據(jù)本發(fā)明，在重組多克隆蛋白中鑒定許多單個成員(所謂的崗哨蛋白)以進行定量和/或定性的表征，從而確保單個蛋白成員的該集合體在重組產(chǎn)生的多克隆蛋白的不同批次中是一致表達和純化的就足夠了。該方法可特別地適合用于簡化蛋白分子的復(fù)雜混合物的表征。作為重組多克隆蛋白的代表的崗哨蛋白的概念不僅用于特異性檢測分子，事實上任何前述的表征技術(shù)或這些技術(shù)的組合都可使用哨崗蛋白或肽的概念。此外，崗哨蛋白可視技術(shù)的變化而變化?；谄湮锢砘瘜W(xué)性質(zhì)上的差異可特別好地分離多克隆蛋白的一些特定成員，而具有高親和力的抗獨特型抗體特別適合用于分離具有相同的物理化學(xué)性質(zhì)的蛋白。
在本發(fā)明的實施方案中，使用一種或多種特異性檢測分子監(jiān)控樣品(其包含具有不同可變區(qū)的不同的同源蛋白)中的一種或多種崗哨蛋白的相對比例。在一系列相關(guān)的樣品中的一種或多種崗哨蛋白的比例上的一致性反映了批次之間和在單個生產(chǎn)批次內(nèi)的一段時間內(nèi)，多克隆蛋白的表達上的組成穩(wěn)定性。此外，可確定重組多克隆蛋白或單克隆蛋白的混合物在長期貯存期間的組成穩(wěn)定性。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，通過一種或多種下列技術(shù)表征重組多克隆蛋白的崗哨蛋白，i)抗獨特型肽/抗體親和層析，ii)使用抗獨特型肽/抗體的免疫沉淀，iii)針對其特有的物理化學(xué)特性進行的完整成員的多維層析分離，和iV)使用層析和MS的蛋白水解肽的作圖。
被表征的不同的同源蛋白的混合物的復(fù)雜性通過本發(fā)明的平臺表征的樣品包含不同的同源蛋白的確定的亞組(其具有不同的可變區(qū)蛋白)，例如多克隆蛋白或具有不同CDR區(qū)的抗體(例如，多克隆抗體或單克隆抗體的混合物)或具有不同CDR區(qū)的T細(xì)胞受體(例如，多克隆TcR或單克隆TcR的混合物)。優(yōu)選地具有不同可變區(qū)的不同的同源蛋白是重組蛋白。此外，優(yōu)選地，已通過共同的性質(zhì)(例如，在抗想要的靶抗原的抗體或TcR的情況下，對想要的靶的共有的結(jié)合活性)確定了多克隆蛋白或單克隆蛋白的混合物中的單個成員。一般地，通過本發(fā)明的表征平臺分析的多克隆蛋白組合物包含至少3、4、5、10、20、50、100、1000、104、105或106個不同的變體成員。通常地，沒有單個的變體成員可構(gòu)成超過多克隆蛋白組合物中的單個成員的總數(shù)的75％。優(yōu)選地，沒有單個成員超過最終的多克隆組合物中的單個成員的總數(shù)的50％、更優(yōu)選地25％和最優(yōu)選地10％。
在抗體的情況下，被靶向的抗原的復(fù)雜性將影響利用本發(fā)明的平臺表征的多克隆蛋白組合物中的不同變體成員的數(shù)目。對于小的或不是非常復(fù)雜的靶，例如小靶蛋白，可建立用于表征的包含3至100個不同的變體成員的多克隆蛋白組合物，優(yōu)選地變體的數(shù)目不超過90、或甚至80或70個。在許多情況下，不同變體的數(shù)目不超過60或50，優(yōu)選地，變體的數(shù)目在5和40之間的范圍之內(nèi)，例如5和30之間。然而，對于更復(fù)雜的靶，例如具有復(fù)雜的或可交換的表面蛋白、或包含幾種病毒亞型的病毒，建立用于表征的包含20至500個不同變體成員的多克隆蛋白組合物。對于非常復(fù)雜的靶，其中抗原包含許多不同的分子，根據(jù)本發(fā)明，可能需要表征包含50至10,000個不同的變體成員的多克隆蛋白組合物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，包含具有不同可變區(qū)的不同的同源蛋白的樣品是多克隆抗體。多克隆抗體可由一種或多種不同抗體同種型例如人同種型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2或小鼠同種型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA組成。
在本發(fā)明的一個實施方案中，包含具有不同可變區(qū)的不同的同源蛋白的樣品是多克隆TcR。
實施例在下列的實施例中，已使用各種這樣的抗RhD重組多克隆抗體(抗RhD rpAb)組合物來說明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)表征平臺，該抗RhD重組多克隆抗體由不同的單種抗RhD抗體成員或產(chǎn)生所述抗RhD rpAb的細(xì)胞系組成。單種抗RhD特異性抗體和產(chǎn)生其的細(xì)胞系對應(yīng)于2004年7月20日提交的本受證方的丹麥專利申請PA2004 01133中描述的相應(yīng)的抗體和細(xì)胞系。簡而言之，從用RhD陽性的紅細(xì)胞免疫接種的獼猴D陰性供體產(chǎn)生重鏈可變區(qū)和κ/λ輕鏈區(qū)的組合噬菌體展示文庫。就抗RhD特異性抗體產(chǎn)生性克隆淘選文庫。將來自抗原特異性噬菌體的可變重鏈和輕鏈基因?qū)D(zhuǎn)移至哺乳動物表達載體。使用Flp-FRT重組系統(tǒng)以位點專一性的方式將哺乳動物載體單個地轉(zhuǎn)染入CHO Flp-In細(xì)胞系(Invitrogen，CA)。通過表2中顯示的序列號(seq Id)鑒定完全的輕鏈(LC)和重鏈的可變區(qū)(VH)的核酸(nuc.)和蛋白(a.a)序列。這些號對應(yīng)于2005年7月18日提交的標(biāo)題為“ANTI-RHESUS DRECOMBINANT POLYCLONAL ANTIBODY AND METHODS OF MANUFACTURE”的本受證方的國際專利申請PCT/DK2005/000501中所示的SEQ ID NOs。必須區(qū)分表2的seq id’s和本申請的SEQ ID NOs，因為這兩者不完全相同。重鏈的恒定區(qū)對應(yīng)于人IgG1。
表2用于下列實施例的單種抗RhD抗體/細(xì)胞克隆的目錄
實施例1本發(fā)明舉例說明了多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系的產(chǎn)生，和在一維中使用層析技術(shù)的蛋白水平上和使用RFLP分析的基因水平上的批與批之間變化的表征。
用于抗獼猴D重組多克隆抗體生產(chǎn)的生產(chǎn)性細(xì)胞系的建立選擇各表達不同的重組抗獼猴D抗體的10個細(xì)胞系，將其混合以組成重組多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞，所述抗體來自該細(xì)胞基因組的特定位置(RhD157.119D11、RhD158.1198B06、RhD159.119B09、RhD161.119E09、RhD163.119A02、RhD190.119F05、RhD191.119E08、RhD192.119G06、RhD197.127A08和RhD204.128A03)。RhD197和RhD204是λ克隆，而剩下的是κ克隆。
在表達單種抗獼猴抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物完全適應(yīng)搖瓶中的無血清懸浮培養(yǎng)后，將其以等量細(xì)胞數(shù)目混合，從而產(chǎn)生多克隆CHO-Flp-In(019)細(xì)胞系。將混合的細(xì)胞培養(yǎng)物離心并以10×106細(xì)胞/管的等分進行冷凍。
解凍2管(3948 FCW065和3949 FCW065)并將其各自培養(yǎng)在裝有100ml Excell302無血清培養(yǎng)基和新霉素的1000ml搖瓶中，培養(yǎng)11周。
在純化抗RhD rpAb之前收獲和過濾上清液。
克隆多樣性在蛋白水平和在mRNA水平都測定克隆多樣性。在9周的培養(yǎng)后，采集用于分析抗體組成的上清液樣品，而在培養(yǎng)11周后，采集用于分析mRNA組成的細(xì)胞樣品。
抗體的組成從多克隆CHO-Flp-In(019)細(xì)胞系表達的抗RhD rpAb是IgG1同種型抗體。使用固定有A蛋白的柱子從2個等份(3948和3949)中純化抗RhD rpAb。單種抗體在pH 7.4下和固定的A蛋白相互作用，而污染性蛋白被從柱子中洗掉。然后在低pH值(pH 2.7)下從柱子上洗脫結(jié)合的抗體。合并通過280nm處的吸光率測量值確定的包含抗體的級分并針對5mM醋酸鈉pH5進行透析。
使用陽離子交換層析法分析從培養(yǎng)9周的等分3948和3949(FCW065)獲得的抗RhD rpAb組合物。以室溫下操作的60ml h-1的流速，將A蛋白純化的抗RhD rpAb用于25mM醋酸鈉、150mM氯化鈉(pH5.0)中的PolyCatA柱(4.6×100mm)。然后使用25mM醋酸鈉中的從150-350mM的氯化鈉、pH5.0的線性梯度，以60ml h-1的流速洗脫抗體組分。在280nm通過分光光度計檢測抗體組分。隨后整合層析譜(圖1)，使用單個峰A-J的面積定量抗體組分(表3)。將峰的總面積設(shè)置為100％。來自兩個等分的層析譜顯示了一致的峰分布，和各峰中相似的組分濃度。根據(jù)這些結(jié)果可得出在相同條件下生長的相同多克隆細(xì)胞系的等分將產(chǎn)生具有相似的單個抗體成員分布的抗RhD rpAb。
抗RhD rpAb的單個成員被指定至一個或多個特定的峰(概述于表3中)。該指定基于獲得的在理想條件下分析的單種抗體的層析譜。沒有獲得RhD158 Ab的單獨的層析譜，因此沒有將該克隆指定至任何一個峰。然而，可能考慮到峰D組成RhD158，由于不均一性的原因，該抗體也可能呈現(xiàn)在一些其他的峰中。特別地，來自克隆RhD197的抗體產(chǎn)物在IEX特征譜中顯示高度的不均一性。應(yīng)當(dāng)在15.3分鐘的滯留時間上觀察到RhD190 Ab。然而，其不能被檢測到，表明該克隆丟失或在重組多克隆生產(chǎn)性細(xì)胞系中以低于檢測極限的量產(chǎn)生?？寺hD190的丟失對應(yīng)于10％的多樣性的減少，該減少在關(guān)于最終抗RhDrpAb組合物的多樣性方面被認(rèn)為是可接受的。
表3
mRNA組成通過RT-PCR-RFLP分析評估在11周培養(yǎng)后的多克隆CHO-Flp-In(019)細(xì)胞系內(nèi)的克隆多樣性。簡而言之，將對應(yīng)于200個細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液接受凍融方法并將這些裂解物用作RT-PCR的模板，使用One-STEP RT-PCR試劑盒(Qiagen)，利用擴增輕鏈的引物進行該RT-PCR。引物序列為正向引物5’-TCTCTTCCGCATCGCTGTCT(SEQ ID NO 1)反向引物5’-AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC(SEQ ID NO 2)使用HinfI降解RT-PCR產(chǎn)物并通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，用溴化乙錠染色顯示限制性產(chǎn)物(圖2)。
表4中顯示了各單獨的克隆的預(yù)期大小的限制性片段，通過RT-PCR擴增的輕鏈的HinfI降解獲得所述片段。用粗體標(biāo)示可被指定至編碼多克隆抗獼猴D抗體的基因的單個成員的凝膠上的6個獨特的片段大小。并非所有獨特片段都可在凝膠上得到鑒定，這些片段以斜體標(biāo)示。然而，這不一定排除這些克隆實際上存在于培養(yǎng)物中，因為所述片段可能未和其他可鑒定的片段充分分離，或和更強的顯現(xiàn)的條帶相比，其濃度大低。這對于短片段來說尤其明顯，因為其結(jié)合更少量的溴化乙錠分子，從而更難被觀察到。
表4
相同多克隆細(xì)胞系的兩個等分(3948和3949)在凝膠上顯示了相似的表達模式，盡管條帶的強度不完全一致。這表明在相同條件下生長的相同多克隆細(xì)胞系的等分將產(chǎn)生具有相似克隆多樣性的抗RhDrpAb。
結(jié)論混合各自表達單克隆抗RhD抗體的10個細(xì)胞系以產(chǎn)生抗RhDrpAb生產(chǎn)性細(xì)胞系，該細(xì)胞系在9周的培養(yǎng)后仍保持起始多樣性的90％。在11周的培養(yǎng)后，可清楚地鑒定來自6個不同克隆的mRNA，幾種其他的克隆可能存在于大約500bp的條帶中。
多克隆CHO-Flp-In(019)細(xì)胞系的兩個等分顯示相似的關(guān)于克隆多樣性的結(jié)果的事實，表明在不同的批次之間可獲得可重復(fù)的結(jié)果。
實施例2本實施例顯示一段時間內(nèi)具有8個成員的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的表征。使用RFLP分析法在基因水平上和在一維中使用層析技術(shù)在蛋白水平上評估培養(yǎng)物的克隆多樣性。
評估多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中的克隆多樣性的RFLP分析法通過產(chǎn)生自多克隆細(xì)胞系的RT-PCR產(chǎn)物的末端RFLP(T-RFLP)分析法評估表達8個不同抗獼猴D抗體的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中的單種克隆的分布。在T-RFLP方法中，用熒光標(biāo)記正向和/或反向引物，從而從擴增子產(chǎn)生的限制性片段的部分將包含標(biāo)記物。然后可通過毛細(xì)管電泳分離標(biāo)記的片段，通過熒光檢測所述片段。依賴于所用的引物，可對輕鏈和重鏈的可變區(qū)編碼序列進行該分析。
簡而言之，在PBS中洗滌一次對應(yīng)于200個細(xì)胞的細(xì)胞懸浮物，將其接受凍融方法，從而產(chǎn)生在RT-PCR擴增中用作模板的裂解物，該RT-PCR擴增使用One-Step RT-PCR試劑盒(Qiagen)和合適的引物。
在標(biāo)準(zhǔn)的熱循環(huán)儀上和下列條件下進行RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄 55℃進行30分鐘變性95℃進行15分鐘起始循環(huán)(35個循環(huán))變性95℃進行30秒退火60℃進行30秒延伸72℃進行5分鐘結(jié)束循環(huán)延伸72℃進行15分鐘完成8℃永遠(yuǎn)為了分析輕鏈，使用下列引物進行RT-PCR擴增。
用6羧基熒光素(FAM)標(biāo)記反向引物，引物序列如下VL正向引物5’-TCTCTTCCGCATCGCTGTCT(SEQ ID NO 1)CL反向引物5’-FAM-AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC(SEQ ID NO2)在NEB1中用1U NheI、1U PstI和1U HinfI(都來自New EnglandBiolabs)降解20μl RT-PCR產(chǎn)物2小時。
在Statens Serum Institute，Copenhagen，DK，在ABI3700(Applied Biosystems)上通過熒光毛細(xì)管電泳檢測標(biāo)記的片段。
表5中顯示各抗RhD抗體產(chǎn)生性細(xì)胞克隆的預(yù)期的片段，F(xiàn)AM標(biāo)記的片段以粗體標(biāo)示。
表5
圖3中顯示T-RFLP模式，所有8個抗獼猴D抗體產(chǎn)生性克隆已被指定至特定的峰。在于RT-PCR期間不存在模板/引物競爭的假定下，相對峰面積將對應(yīng)于轉(zhuǎn)錄自多克隆細(xì)胞系中呈現(xiàn)的各抗體輕鏈基因的mRNA的相對量。
為了分析相同多克隆細(xì)胞系內(nèi)的重鏈可變區(qū)，使用VH特異性引物進行RT-PCR擴增。引物序列如下VH正向引物5’-FAM CGTAGCTCTTTTAAGAGGTG(SEQ ID NO 3)VH反向引物5’-HEX-ACCGATGGGCCCTTGGTGGA(SEQ ID NO 4)在NEB2中使用1U RsaI和1U NdeI(都來自New England Biolabs)降解20μl RT-PCR產(chǎn)物，進行2小時。
在ABI3700上通過熒光毛細(xì)管電泳檢測標(biāo)記的片段。由StatensSerum Institute，Copenhagen，DK進行分析。
表6中顯示預(yù)期的T-RFLP模式，其中FAM標(biāo)記的片段以粗體顯示，HEX(6-羧基-2′，4，4′，5，7，7′-六氯熒光素琥珀酰亞胺酯)標(biāo)記的片段以下劃線標(biāo)示。
表6
將多克隆細(xì)胞系培養(yǎng)超過5周，每周取樣一次，進行T-RFLP分析。對可變重鏈進行分析，但如果想要，也對輕鏈進行分析。
在限制性片段的毛細(xì)管電泳后，整合相對峰面積并將其用于評估多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的克隆多樣性。圖5顯示一段時間內(nèi)的相對量。
基于這些結(jié)果，似乎在一段時間內(nèi)，RhD196增加，而RhD203似乎減少。在培養(yǎng)時期內(nèi)其他克隆的數(shù)量相當(dāng)穩(wěn)定，在5周的培養(yǎng)后，可檢測到所有8種cDNA。
通過對輕鏈和重鏈以及對mRNA和DNA都進行T-RFLP，應(yīng)當(dāng)可能獲得多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)(例如在處于體外細(xì)胞年齡限制內(nèi)的細(xì)胞中或在培養(yǎng)期間的任何給定的時間點的細(xì)胞中)的克隆多樣性的精確指紋圖譜。
因此在抗體的生產(chǎn)期間，在一段時間內(nèi)可使用該技術(shù)監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)物中的克隆多樣性的穩(wěn)定性。也可將該技術(shù)用于監(jiān)控例如從相同多克隆工作細(xì)胞庫(pWCB)冷凍的不同安瓿的批與批之間的一致性，或在2次或更多次生產(chǎn)批次后收獲的細(xì)胞中的批與批之間的一致性。
評估多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中的克隆多樣性的陽離子交換層析分析法使用陽離子交換層析法分析從這樣的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的抗RhD rpAb，該多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物和用于上述T-RFLP分析的相同。以室溫下操作的60ml h-1的流速將A蛋白純化的重組產(chǎn)生的多克隆抗體加于25mM醋酸鈉、150mM氯化鈉、pH5.0中的PolyCatA柱(4.6×100mm)。然后使用25mM醋酸鈉中的150-350mM的氯化鈉、pH5.0的線性梯度，以60ml h-1的流速洗脫抗體組分。在280nm通過分光光度計檢測抗體組分，然后整合層析譜(圖1)，使用單個峰的面積對抗體組分進行定量。一段時間內(nèi)的相對量顯示于表6中。
結(jié)論通過RFLP分析在基因水平上和通過陽離子交換層析法在蛋白水平上獲得的結(jié)果是可比較的。圖5和圖6清楚地表明，在5周的培養(yǎng)期間，絕大部分多克隆細(xì)胞系的個體克隆和從該細(xì)胞系表達的多克隆抗體的單種抗體遵從相同的趨勢。因此，基因上和蛋白水平上的分析在評價基因水平上的細(xì)胞系的組成多樣性和產(chǎn)生自該細(xì)胞系的重組多克隆抗體的組成多樣性上是相當(dāng)?shù)韧摹?br> 實施例3本實施例舉例說明在一段時間內(nèi)具有25個成員的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的表征。使用T-RFLP分析在基因水平上和在一維中使用層析技術(shù)在蛋白水平上評價培養(yǎng)物的克隆多樣性。
在5周的培養(yǎng)時期內(nèi)從表達25個不同的抗獼猴D抗體的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的重鏈基因的可變部分的T-RFLP分析。
本實施例中檢查的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物由表達25個不同抗獼猴D抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物的混合物組成(如實施例1中描述的那樣產(chǎn)生)。將多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)5周，每周取樣一次，進行T-RFLP分析。
使用實施例2中描述的VH特異性引物進行RT-PCR，同樣地進行限制性片段化。
如果所有基因型存在，25個不同的編碼抗獼猴D的序列的T-RFLP將產(chǎn)生17個不同的FAM標(biāo)記的片段。一些片段呈現(xiàn)高達3個不同的基因型，而其他呈現(xiàn)單個基因型。圖7中顯示FAM標(biāo)記的片段的預(yù)期大小和一段時間內(nèi)不同的FAM標(biāo)記的片段的相對量。此外，T-RFLP特征譜的一個示例顯示于圖4中。
表7
可能分離限制性片段至這樣的程度，即，使得能夠獲得組成細(xì)胞系的25個克隆的12個單種克隆的信息?？蓾撛诘貙⑵溆嗟牟糠纸邮軠y序以獲得關(guān)于其余克隆的更多信息。
評估表達25個不同的抗獼猴D抗體的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中的克隆多樣性的陽離子交換層析分析法使用陽離子交換層析法分析產(chǎn)生自這樣的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的抗RhD rpAb，該多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物和用于上述T-RFLP的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物相同。以室溫下操作的60ml h-1的流速將A蛋白純化的重組產(chǎn)生的多克隆抗體加于25mM醋酸鈉、150mM氯化鈉、pH5.0中的PolyCatA柱(4.6×100mm)。然后使用25mM醋酸鈉中的150-350mM的氯化鈉、pH5.0的線性梯度，以60ml h-1的流速洗脫抗體組分。在280nm通過分光光度計檢測抗體組分，然后整合層析譜，使用單個峰的面積對不同的抗體組分進行定量。圖7顯示產(chǎn)生自第4周獲得的樣品的層析譜，從1至25對包含抗體的峰進行編號。層析譜包含和被分析的多克隆抗體中的單種抗體的數(shù)目一樣多的數(shù)目的峰純屬偶然。表8以總抗體組分的百分比(AC1至25)表示相對量和顯示各抗體組分中的單種抗體的呈現(xiàn)(峰)。基于在相同條件下使用陽離子交換層析法分析獲得的單克隆抗體的滯留時間和峰的模式，將單種抗體指定至整合的層析峰。
表8
陽離子交換層析法，基于單個成員之間在靜電荷上的差異，從多克隆抗體分離出單個抗體成員，此外還分離表現(xiàn)電荷不均一的單種抗體的形式。因此幾種抗體呈現(xiàn)在單峰中，例如AC1包含RhD293和RhD319(參見表8)，一些單種抗體還呈現(xiàn)在幾個層析峰中，例如RhD319存在于AC1和5(參見表8)中。
可將包含超過一種單種抗體的峰接受另外的蛋白質(zhì)化學(xué)表征技術(shù)，例如使用抗獨特型肽的定量分析、蛋白水解肽作圖、N末端測序或第二維層析。
結(jié)論本實施例舉例說明在一段培養(yǎng)時間內(nèi)，組合使用T-RFLP分析法和陽離子交換層析法分別分析主要轉(zhuǎn)錄物的分布和抗體組分的分布。T-RFLP分析獨特地鑒定在多克隆細(xì)胞系中表達的25個克隆的12個個體克隆，在本實施例中，舉例說明了在4周的培養(yǎng)期間可使用T-RFLP分析法檢測這12個克隆。潛在地，可通過呈現(xiàn)超過一個克隆的片段的序列分析鑒定更多的克隆。使用陽離子交換層析法分析抗體組分的分布，在本實施例中，觀察到在培養(yǎng)期間25個被分析的組分的分布相對穩(wěn)定。盡管由于表達的抗體的固有的電荷不均一性導(dǎo)致難以獨特地鑒定所有單種抗體，但在本實施例中顯示代表RhD160的抗體組分8在培養(yǎng)期間顯示和獲得的代表RhD160、293和196克隆的第13組的高T-RFLP值相符的最高抗體水平。此外，可通過T-RFLP和通過陽離子交換層析法唯一地鑒定的RhD207組分，顯示獲得的10-11％的T-RFLP水平和在抗體水平上獲得的略低一些的水平5.5-10％?？傊?，兩種技術(shù)一起證明了在培養(yǎng)期間在mRNA和抗體水平上的相對穩(wěn)定的產(chǎn)量；然而，也可以看到兩種技術(shù)之間潛在的差異，這可通過在培養(yǎng)的第5周，和在抗體水平上獲得的結(jié)果相反，一些克隆的轉(zhuǎn)錄顯示消失來說明。因此，本實施例證明兩種技術(shù)的互補應(yīng)用以確定在其中可獲得復(fù)雜多克隆蛋白的穩(wěn)定生產(chǎn)的培養(yǎng)間期。
實施例4本實施例舉例說明從多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有10個單個成員的多克隆抗RhD抗體的組成分析。使用這樣的二維液相層析評估多克隆抗體樣品的多樣性，該二維液相層析技術(shù)在第一維中使用陽離子交換和在第二維中使用反相(RP)-HPLC分別基于其靜電荷和疏水性分離抗體。
從多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生具有10個單個成員的多克隆抗RhD抗體樣品。使用A蛋白柱(HITrapTMProtein Acolumn，AmershamBiosciences GE Healthcare，England)從上清液純化抗RhD rpAb。
在Ettan LC系統(tǒng)(Amersham Biosystems，GE Healthcare，England)上，以室溫下操作的60ml h-1的流速將純化的多克隆抗體加于25mM醋酸鈉、150mM氯化鈉、pH5.0中的ProPac WCE10柱(4×250mm)。然后使用25mM醋酸鈉中的150-350mM的氯化鈉、pH5.0的線性梯度，以60ml h-1的流速洗脫抗體組分。在280nm通過分光光度計檢測抗體組分，收集對應(yīng)于特定峰的級分，在進行RP-HPLC分析前將其進一步濃縮。
使用RP-HPLC在第二維中進一步分離圖8中所示的級分。使用Zorbax Poroshell 300SB-CB柱(2.1×75mm(5μm))在Summit HPLC系統(tǒng)(Dionex，CA)上進行第二維，如Poroshell柱(AgilentTechnologies，CA)的說明書中推薦的，配置HPLC系統(tǒng)。將從陽離子交換層析收集的抗體組分以120ml h-1的流速加于10％CH3CN、0.1％TFA、0.3％PEG中的柱子(5μl)，以90％CH3CN、0.08％TFA、0.3％PEG的線性梯度進行洗脫。在70℃下操作柱子。所有的抗體組分樣品產(chǎn)生具有一個或兩個窄峰的層析譜?？贵w組分B5的RP-HPLC特征譜顯示于圖9中。
結(jié)論因為第一維中的陽離子交換層析法分離在靜電荷上存在差異的單種抗體和表現(xiàn)電荷不均一性的單種抗體，因此可在單個峰中呈現(xiàn)幾種抗體。
分離幾種抗體組分，導(dǎo)致如圖8中所示的相當(dāng)復(fù)雜的特征譜。如實施例2和3中所說明的，可能通過使用在相同條件下進行分析的單克隆抗體的比較性分析來鑒定各峰中的個體組分。然而，在本實施例中沒有進行該步驟，因為目的是提供用于樣品相互之間的比較的指紋圖譜而不是必須指定rpAb中的各單克隆抗體。因此，陽離子交換之后進行RP-HPLC的組合產(chǎn)生來自二維的數(shù)據(jù)，可制作如圖10中說明的詳細(xì)的顏色編碼的蛋白圖(ProteoVue軟件，Eprogen，USA)以評價批與批之間的一致性，而無需分析單克隆抗體以表征復(fù)雜rpAb的單個成員。
實施例5本實施例舉例說明從多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有8個單個成員的多克隆抗RhD抗體的表征。使用“大批量”N末端序列分析評估多克隆抗體的多樣性。
在下面的表9中顯示這樣的單個成員的N末端序列，所述單個成員存在于在本實施例中分析的多克隆抗RhD抗體樣品中。λ輕鏈序列以斜體顯示。
表9
通過還原性SDS-PAGE(NuPAGE 4-12％)分析A蛋白純化的抗RhDrpAb。將多肽電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后根據(jù)廠商說明書用考馬斯亮藍(lán)染色。
一條大約53kDa、對應(yīng)于重鏈(HC)的條帶和兩條大約25和30kDa、分別對應(yīng)于κ和λ+κ輕鏈的條帶清楚地顯現(xiàn)在考馬斯亮藍(lán)染色的PVDF膜上。切下這些條帶，將其接受N末端序列分析，使用ABI Procise蛋白測序儀(Applied Biosystems，CA)和標(biāo)準(zhǔn)的程序進行該分析。
測序結(jié)果概述于下面的表10。
表10
ND＝未確定的除了第1個殘基，HC的序列相同，而κLC在殘基2、5、6和7上是保守的，λLC在殘基1、5和6上是保守的(參見表9)。
獲自HC的測序的結(jié)果和表10中所示的預(yù)期的序列一致。來自大約25kDa的κLC條帶的序列數(shù)據(jù)表明具有N末端序列EIVLTQS(SEQID NO7)(對應(yīng)于RhD191、324、201和306)的抗體和具有N末端序列DIQMTQS(SEQ ID NO8)(對應(yīng)于RhD244和196)的抗體的存在。然而，使用現(xiàn)有技術(shù)不可能確定所有單個成員是否存在于多克隆抗體樣品中。測定大約30kDa的LC條帶的序列表明存在通過第3和第4循環(huán)中的Val的存在判定的RhD319抗體。沒有獲得RhD203抗體存在的證據(jù)(在第2和第4循環(huán)中分別沒有S和A)。然而，該重組單克隆抗體的離子交換層析和N末端序列分析強烈地表明RhD203的LC具有部分封閉的N末端。因此，不能最終通過N末端序列分析確定該抗體存在或不存在于被分析的混合物中。此外，30kDa的條帶似乎也包含一些κLC，因為在第1循環(huán)中存在E和D殘基，第4循環(huán)中存在M殘基。
總之，如果單種蛋白在其HC或LC的序列上存在差異并且N末端未被封閉，可使用大批量N末端序列分析法鑒定其的存在。該方法是定量的，只要單種多肽的N末端未被部分封閉。
實施例6本實施例舉例說明從多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有8個單個成員的多克隆抗RhD抗體的表征。通過使用用于肽分離的RP-HPLC或離子交換層法(IEX)分離來源于可變區(qū)的獨特標(biāo)志性肽來分析抗體的多樣性。
通過分離的重鏈和輕鏈的降解產(chǎn)生肽使用HITrap rProtein A柱通過親和層析從多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液純化具有8個單個成員的多克隆抗RhD抗體樣品。將凍干的材料溶解在6M鹽酸胍、0.5M EDTA、0.2M Tris HCl、pH8.4、還原的(DTT)和羧甲基化的(碘乙酸)。在EttanLC系統(tǒng)(Amersham Biosciences，GE Heal thcare，England)中在6M鹽酸胍、50mM磷酸鈉、pH8.4中的Superose12柱(10/300，來自Amersham Biosciences，GE Healthcare)上通過凝膠過濾分離重鏈和輕鏈。在磷酸鈉、pH8中以1∶500的酶對底物濃度周內(nèi)切蛋白酶Asp-N(Roche，1 054 589)降解分離的HC(大約3.5mg/ml)和LC(6.5mg/ml)。
通過RP-HPLC進行的獨特性肽的分離將從多克隆抗體樣品獲得的分離的HC和LC的單種Asp-N降解物的等分加于Agilent 1100 LC/MSD SL系統(tǒng)，該系統(tǒng)配備有連接至保護柱(Zorbax 300SB-CB，2.1×12.5mm，5μm)的Zorbax 300SB-C18(2.1×150mm)5μm柱，使用0.2ml/分鐘的流速在0.1％的TFA中平衡該柱。使用0.08％TFA、70％乙腈的線性梯度洗脫肽。在220nm通過分光光度計檢測肽和通過在線MS(大氣壓離子化(API)電噴霧技術(shù))分析肽。將75％丙酸/25％異丙醇的混合物經(jīng)后置柱(post-column)加入至流動相中以增強信號。使用 Chemstation軟件(AgilentTechnologies，CA)和BioLynx軟件(Micromass，WatersCorporation，MA)分析獲得的質(zhì)譜。
將來自于HC和LC的Asp-N降解物的MS分析結(jié)果分別概述于表11和12中。兩個表都顯示以平均質(zhì)量提供的理論和檢測的質(zhì)量。
表11重鏈的結(jié)果
a具有相同質(zhì)量的不同的肽。b具有幾乎相同的質(zhì)量的肽(4個相同和1個不同)。*表示N末端環(huán)化的Gln(PyroGlu)
表12輕鏈的結(jié)果
如在表11中所見，來自可變HC的13個肽和來自可變LC的16個肽可被鑒定為獨特標(biāo)志性肽，一些來自HC的可變區(qū)的肽，(例如，由a標(biāo)示的來自RhD196、RhD244和RhD306的D1)具有相同的質(zhì)量，因此這些質(zhì)量不能被明確地指定。然而，因為其他質(zhì)量在所有情況下可明確地指定至獨特性肽，因此獲得了所有8種抗體的陽性鑒定。對于LC，獨特性肽已被指定至八個抗體中的七個(表12)。缺少LC的信息的抗體是RhD324。因此，來自HC和LC的組合的MS數(shù)據(jù)證明，基于來自各抗體的獨特性肽的檢測，在抗RhD rpAb樣品中可鑒定所有8種抗體。
通過離子交換層析進行的獨特性肽的分離通過如下的強陽離子交換層析法分離HC和LC的Asp-N降解物如上所述，將從多克隆抗體中獲得的分離的HC和LC的個體Asp-N降解物的等分加于PolySulfoethyl A柱(2.1×100mm)，在Ettan LC系統(tǒng)(Amersham Biosciences，GE Healthcare，England)上，在室溫下以0.2m1/分鐘的流速加樣，所述柱已用10mM磷酸鉀、20％(v/v)乙腈、pH3.0平衡。隨后使用10mM磷酸鉀、20％或30％(v/v)乙腈、pH3.0中的0-500mM的氯化鉀洗脫肽。在215nm通過分光光度計檢測洗脫的肽，基于時間分級分離收集級分。將級分的等分(1μL)和1μl的70％乙腈/30％、0.1％TFA中的α-氰基-4羥基肉桂酸(20mg/mL)溶液混合并加于MS靶和用0.1％TFA洗滌。在Autoflex TOF(BrukerDaltronics，Bremen，Germany)上，通過MALDI-TOF來分析樣品，使用來自Bruker Daltronics(Bremen，Germany)的校正混合物進行外部質(zhì)量校正。使用GPMAW 6.1軟件(Lighthouse data，Odense，Denmark)分析(質(zhì)量搜尋和內(nèi)部校正)MALDI譜。
包含來自LC的Asp-N降解物的幾個峰的代表性層析譜顯示于圖11中。來自LC和HC的Asp-N降解物的級分的MALDI-TOF分析結(jié)果分別顯示于表13和14中。對于質(zhì)量＜3500 Da，以單同位素質(zhì)量(Monoisotopic mass)提供理論和實測質(zhì)量，對于質(zhì)量＞3500 Da以平均質(zhì)量提供理論和實測質(zhì)量。
表13來自輕鏈的結(jié)果
a相同的肽。b相同的肽。c相同的肽表14來自重鏈的結(jié)果
a相同的肽。b通過具有氧化的Met的相同的肽的鑒定驗證的。
如在表13和14中所看到的，可將來自可變LC的15個肽和來自可變HC的9個肽鑒定為獨特標(biāo)志性肽，一些來自HC的可變區(qū)和來自LC的肽具有相同的質(zhì)量，從而不能明確地指定其。因此，不可能通過使用強陽離子交換層析法為HC RhD201、203和324以及為LC RhD201和319指定獨特性肽。
結(jié)論從兩種不同的標(biāo)志性肽分析法獲得的結(jié)果足以證明，從HC和LC的MS分析獲得的組合數(shù)據(jù)使得能夠使用RP-HPLC從來自組成抗RhDrpAb的所有8個抗體的可變區(qū)鑒定出獨特性肽。通過使用強陽離子交換層析法，可鑒定抗RhD rpAb組合物中的8個單個成員中的6個。到目前為止還未完全詳盡地分析來自MS分析研究的結(jié)果，而只是分析到了表11至14中所顯示的程度。
實施例6A
本實施例舉例說明了從多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物(生物反應(yīng)器批次)產(chǎn)生的具有25個單個成員的重組多克隆抗RhD抗體的表征。通過使用RP-HPLC和用于肽鑒定的質(zhì)譜儀分離來源于LC或HC的可變區(qū)的獨特標(biāo)志性肽來分析抗體的多樣性。
通過降解分離的重鏈和輕鏈進行肽的產(chǎn)生從獲自生物反應(yīng)器的多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中純化具有25個單個成員的多克隆抗RhD的抗體樣品。通過使用MabSelect(Amersham Biosciences，GE healthcare)柱進行親和層析并在G25柱(Amersham Biosciences，GE healthcare)上脫鹽來進行純化。將凍干的材料溶解在6M鹽酸胍、0.2M Tris HCl、pH8.4、還原的(DTT)和羧甲基化(碘乙酸)中。通過在6M鹽酸胍、50mM磷酸鈉、pH8.4中的Superose12柱(10/300 GL，來自Amersham Biosciences，GE healthcare)上進行凝膠過濾來分離重鏈和輕鏈。在37℃下在1M尿素、50mM磷酸鈉、pH8中以1∶200的酶對底物濃度用內(nèi)切蛋白酶Asp-N(Roche，1054589)降解分離的HC和LC。
通過LC-MS進行的獨特性肽的分離將從多克隆抗體樣品獲得的分離的HC和LC的單種Asp-N降解物的等分加于Agilent 1100LC/MSD SL系統(tǒng)，該系統(tǒng)配備有連接至保護柱(Zorbax 300SB-CB，2.1×12.5mm，5μm)的Zorbax 300SB-C18(2.1×150mm)5μm柱，使用0.2ml/分鐘的流速在0.1％的TFA、14％的ACN中平衡該柱。使用0.08％TFA、70％乙腈的線性梯度洗脫肽。在220nm通過分光光度計檢測肽和通過在線MS(大氣壓離子化(API)電噴霧技術(shù))分析肽。將75％丙酸/25％異丙醇的混合物經(jīng)后置柱(post-column)加入至流動相中以增強信號。使用Chemstation軟件(Agilent Technologies，CA)和GPMAW 6.2軟件(Lighthouse data，Odense，Denmark)分析獲得的質(zhì)譜。
獲自HC和LC的Asp-N降解物的MS分析結(jié)果概述于表14A中，其中以平均質(zhì)量提供理論和檢測質(zhì)量。
表14A使用Asp-N斷裂和LC-MS分析法進行的來自抗RhD rpAb中的25個抗體的獨特疏水性肽的鑒定
aD和d分別表示通過Asp-N產(chǎn)生的來自HC和LC的肽，從預(yù)測的序列的N端至C端給肽編號。因此，d4表示通過在LC多肽的第3和第4個Asp-N位點斷裂產(chǎn)生的肽。b該肽包含缺失的斷裂位點。*表示N末端環(huán)化的Gln(pyroGlu)。
如在表14A中所看到的，來自LC的可變部分的22個肽和來自HC的可變部分的3個肽可鑒定為獨特標(biāo)志性肽。因此，來自HC和LC的MS數(shù)據(jù)明確地證明，基于來自各抗體的獨特性肽的檢測，可在抗RhDrpAb樣品中鑒定所有25個抗體。
實施例7本實施例舉例說明具有對重組多克隆抗RhD抗體的單個成員的特異性的抗獨特型肽的產(chǎn)生以及重組多克隆抗體中一種單個成員的濃度的確定。
抗RhD抗體特異性肽配體的產(chǎn)生將展示pIII的N末端上的以隨機的序列順序排列的7個氨基酸的噬菌體文庫(New England Biolab)用于親和選擇單種抗RhD抗體的肽結(jié)合物。肽文庫的線性和約束版本(Constrained version)都用于選擇。在4℃下，用10μg/ml的純化的單克隆抗RhD抗體(每孔使用100μl)包被微量滴定板(Maxisorb，NUNC)，進行12-16小時。將重組多克隆抗RhD抗體中包含的所有25個單種抗體用于篩選抗獨特型肽。然而，在重組多克隆抗體包含大量單個成員(例如多于50)的情況下，可使用崗哨抗體進行篩選。優(yōu)選地，選擇對應(yīng)于組成重組多克隆蛋白的抗體總數(shù)的至少4％的崗哨抗體，更優(yōu)選地選擇占據(jù)組成重組多克隆蛋白的抗體總數(shù)的至少8％、12％、16％、20％、30％或50％的崗哨抗體。隨后在PBS、0.05％Tween-20中洗滌包被的板，然后用2％脫脂牛奶/PBS封閉板。對于各淘選輪次，使用大約1011pfu/100μl的噬菌體?；旌霞s束版文庫和線性文庫，將其作為2％脫脂牛奶/PBS中的混合物一起淘選。在室溫下溫育1小時后，用甘氨酸/HCl、pH＝2.2洗脫結(jié)合的噬菌體，進行10分鐘，然后用Tris-HCl、pH＝9.0中和。在3至4輪的淘選后，分離單個克隆，提取DNA，在對應(yīng)于隨機肽區(qū)域的區(qū)域上測序。下面的表15顯示了來自單個克隆的推導(dǎo)的氨基酸序列的比對。
表15
根據(jù)相關(guān)序列組的推導(dǎo)的共有氨基酸序列，合成分別具有對抗-RhD162、202或305的特異性親和力的三種合成的肽。在C末端將各合成的肽偶聯(lián)至生物素。
通過ELISA檢驗各肽的特異性。簡而言之，在4℃下，用50μl/ml的鏈霉抗生物素包被(每孔使用100μl)ELISA板，進行12-16小時。然后，加入在PBS中稀釋至大約10μg/ml的肽，然后溫育1小時，通過洗滌除去過量的肽。隨后在2％的脫脂牛奶/PBS中封閉板，在PBS中洗滌3次。分別以始自10μg/ml的各種稀釋度加入各單種抗RhD抗體。使用抗人IgG綴合物(Caltag cat#H10307)檢測結(jié)合的抗體。洗滌板5次，通過加入25μl色原(TMB，Kem-En-Tech)進行檢測。15-25分鐘后加入25μl 1M H2SO4終止反應(yīng)。在450nm測量吸光率的值。檢測各肽抗單克隆抗RhD抗體組，顯示反應(yīng)性對于合適的單種成員蛋白是特異性的。因此，PEP162只結(jié)合抗RhD162抗體，PEP202只結(jié)合抗RhD202抗體和PRP305只結(jié)合抗RhD305抗體，信噪比高于10。
重組多克隆抗RhD抗體中的抗RhD305抗體的量的確定使用合適稀釋度的純化的抗RhD305單克隆抗體作為參照標(biāo)準(zhǔn)，可能確定抗RhD305抗體相對于重組多克隆抗RhD抗體的混合物的抗體總量的量。簡而言之，用鏈霉抗生物素包被ELISA板，用在PBS中被稀釋至大約10μg/ml的PEP305溫育板1小時。溫育后，通過洗滌除去多余的肽。然后在2％脫脂牛奶/PBS中封閉板并洗滌3次。以從1至16384倍范圍內(nèi)變化的稀釋度加入由25種單種抗RhD抗體組成的重組多克隆抗RhD抗體(樣品)。以四次重復(fù)分析樣品。在相同板上的分開的小孔中，加入始于10μg/ml的系列稀釋度(三個重復(fù))的單克隆抗RhD305抗體以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用抗人IgG綴合物(Caltag cat# H10307)檢測結(jié)合的抗體。洗滌板5次，加入25μl色原(TMB，Kem-En-Tech)進行檢測。15-25分鐘后加入25μl 1M H2SO4終止反應(yīng)。在450nm測量吸光率值。
所述標(biāo)準(zhǔn)曲線和下列范圍內(nèi)的濃度成線性比例
使用方程式y(tǒng)＝0.1161×-0.0256和R2＝0.9812，這些數(shù)據(jù)產(chǎn)生了標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用用于確定樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋因子的方程式計算抗RhD305抗體在重組多克隆抗RhD抗體樣品中的濃度。
在32倍稀釋度上，測量的樣品的平均OD450是1.24±0.14，對應(yīng)于多克隆抗RhD抗體中的3.8±0.5μg/ml的抗RhD305抗體濃度。重組多克隆抗RhD抗體樣品中的總抗體濃度是100μg/ml。因此，抗RhD305抗體占多克隆抗體樣品的3.8％。
實施例8本實施例舉例說明抗獨特型肽鑒定特定級分/峰中的崗哨抗體的用途，在通過重組多克隆抗RhD抗體的液相離子交換層析分析法進行的一維分離后，進行該鑒定。
通過陽離子交換層析分離由25個單種抗RhD抗體組成的重組多克隆抗RhD抗體，收集級分。使用三種抗獨特型肽(如實施例7中所描述的)通過ELISA檢查各級分以檢測各級分中特定的抗RhD抗體的存在。色譜圖和對各級分進行的ELISA數(shù)據(jù)一起顯示該方法可用于鑒定特定級分中的個體抗體(圖12)。因此，通過比較特定峰中的吸光率和ELISA數(shù)據(jù)，就可能進行同源蛋白的復(fù)雜混合物的組成的半定量評估。
實施例9當(dāng)生產(chǎn)用于醫(yī)藥用途的多克隆蛋白時，確保組成穩(wěn)定性是個至關(guān)重要的問題。在生產(chǎn)期間，可使用能夠鑒定同源蛋白的復(fù)雜混合物內(nèi)的單個蛋白成員的特異性肽-配體監(jiān)控多克隆蛋白的組成穩(wěn)定性，通過在發(fā)酵過程中在不同的代的時間點上提取培養(yǎng)基樣品和使用定量檢測法如實施例7中描述的ELSIA法進行監(jiān)控。
在本實施方案中，在產(chǎn)生由25個獨特抗RhD抗體組成的重組多克隆抗RhD抗體的pWCB的灌注發(fā)酵法中評估三種崗哨蛋白，即抗RhD162、202和305抗體的實際量。圖13舉例說明了在發(fā)酵過程中在不同的培養(yǎng)時間點上三種崗哨抗體(抗RhD162、202和305)的分布，G8對應(yīng)于生物反應(yīng)器的接種后第8天。
實施例10本實施例舉例說明了在細(xì)胞培養(yǎng)混合物中鑒定產(chǎn)生特定抗RhD抗體的細(xì)胞的方法。在本實施例中，使用抗獨特型肽和用于檢測的流式細(xì)胞儀分析由2種不同的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞系組成的混合物。
以確定的比例混合2種單個抗RhD抗體產(chǎn)生性細(xì)胞系，即RhD162和RhD202。克隆RhD202的百分比顯示于表16中。
用綴合有藻紅蛋白的鏈霉抗生物素(SA-PE)溫育生物素化的肽202(實施例7中制備的PEP202)以形成肽四聚體。在室溫下將該四聚體和細(xì)胞系混合物一起溫育20分鐘，將細(xì)胞通過FACS CAllbur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)。如圖14中的R1所描述的，對四聚體呈陽性的細(xì)胞設(shè)置門控。也測量單種的未混合的細(xì)胞(圖14A和B)。觀察到的抗RhD抗體產(chǎn)生性細(xì)胞系的特性是細(xì)胞系內(nèi)表達抗體和不表達抗體的細(xì)胞都存在。為評估混合物中PEP202陽性細(xì)胞的占有率，需要確定表達性細(xì)胞的總數(shù)。在本實施方案中，我們假定RhD162和RhD202的混合物中的表達性細(xì)胞的占有率和單獨的RhD202中的相同?？墒褂肞ep202和抗IgG抗體雙染細(xì)胞(未進行)確定該比例。然而，結(jié)果顯示假定的正確性。根據(jù)門控6(R6)中的細(xì)胞的百分比計算被PEP202四聚體結(jié)合的RhD202細(xì)胞在混合物中的百分比，如圖14中所示的。以mixa的測量作為示范，根據(jù)下列公式計算mixa)中的RhD202細(xì)胞系的百分比。
表16
實施例11本實施例舉例說明使用實時PCR確定單種克隆或這些克隆的崗哨選擇物在多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中的分布。
這些技術(shù)基于編碼單種抗體的核酸序列之間的序列差異。由于編碼單種抗體的序列的可變性的原因，可為存在于多克隆細(xì)胞系中的各成員的重鏈和/或輕鏈設(shè)計獨特的TaqMan探針。優(yōu)選地，選擇CDR區(qū)域CDR1、CDR2或CDR3中的一種設(shè)計TaqMan探針。最優(yōu)選地，選擇CDR3區(qū)域用于設(shè)計TaqMan探針。
寡核苷酸設(shè)計優(yōu)選地這樣設(shè)計引物，使得能夠獲得70-150個核苷酸的擴增子。一些可能的引物設(shè)計是在重鏈的FR3區(qū)或輕鏈可變區(qū)內(nèi)退火的共有正向引物，和在恒定區(qū)退火的反向引物。設(shè)計各目的克隆的TaqMan探針，該探針對于在樣品的單個成員之間存在差異的CDR區(qū)(優(yōu)選地CDR3區(qū))的部分是特異性的。
可設(shè)計如下所示的用于分析表達下列8種抗RhD抗體的多克隆細(xì)胞系的引物和探針組。
所有克隆的正向和反向引物正向引物CAC GGC TGA GTA TTA CTG TGC(SEQ ID NO 24)反向引物TTG GTG GAG CCA CTC GA(SEQ ID NO 25)用于所有個體克隆的TaqMan探針顯示于表17表17
編碼重鏈序列的可選擇的引物設(shè)計是如Rsamussen，T等人2000.Exp.Hematol.28，1039-1045中描述的在VH-DH連接區(qū)中退火的正向引物，在恒定區(qū)內(nèi)的反向引物，JH-C連接區(qū)中的TaqMan探針。
實時定量PCR從沉淀的細(xì)胞提取mRNA或基因組DNA。如果將mRNA用作模板，在實時PCR之前，將其反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA。建立對應(yīng)于待被分析的克隆的數(shù)目的許多實時PCR反應(yīng)。
在引物濃度和TaqMan探針濃度方面最優(yōu)化實時測定法。在用光學(xué)粘性蓋封閉的96孔板中以三次重復(fù)進行反應(yīng)。在商購獲得的PCRmastermix中進行PCR反應(yīng)和在ABI prism 7000(Applied Biosystems)中進行PCR反應(yīng)，隨后使用ABI prism 7000 SDS軟件進行分析。
多樣性的分析將不同克隆的CT值相互之間進行比較，計算多克隆細(xì)胞系中各克隆的分布。可使用所述方法在單個生產(chǎn)批次期間的一段時間內(nèi)評估批與批之間的變化和克隆的穩(wěn)定性。
實施例12本實施例舉例說明了這樣的方法，該方法通過對重鏈和/或輕鏈抗體基因(來自從多克隆細(xì)胞系產(chǎn)生的單細(xì)胞克隆)的可變區(qū)進行DNA測序評估，證明能夠產(chǎn)生重組多克隆抗體的多克隆細(xì)胞系(例如pWCB)的多克隆性。
單細(xì)胞克隆融化安瓿中的pWCB并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)天以重建良好的細(xì)胞生活力。然后，通過極限稀釋法獲得單細(xì)胞克隆，其中將細(xì)胞以1個細(xì)胞/小孔的密度涂板在完全培養(yǎng)基中的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在37℃下、5％CO2中溫育細(xì)胞10-20天，然后在顯微鏡下通過視覺就具有單個集落的小孔對板評分。
可選擇地，使用FACS細(xì)胞分選器獲得來自pWCB的單細(xì)胞克隆。門控有活力的pWCB細(xì)胞并以1個細(xì)胞/小孔將其分選入用100μl條件完全培養(yǎng)基預(yù)先裝填的96孔板中。如上所述溫育細(xì)胞和對單個集落評分。
核酸測序當(dāng)小孔中的單個細(xì)胞集落已培養(yǎng)至?xí)蠒r，將來自想要的數(shù)量(例如100)的小孔的各孔的等分(10-20μl)轉(zhuǎn)移至新的96孔板以用作DNA測序反應(yīng)中的模板。在mRNA水平或基因組水平上，分別使用1至100或1至1000個細(xì)胞進行測序。在第1種情況下，通過標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR技術(shù)例如，按照廠商說明書，使用商購獲得的Qiagen one-stepRT-PCR試劑盒產(chǎn)生這樣的PCR片段，該片段足以涵蓋區(qū)分存在于pWCB中的不同的抗體重鏈和輕鏈基因的可變區(qū)(一般至少是CDR3區(qū)域)。在PCR反應(yīng)前裂解細(xì)胞。所得的PCR片段是使用例如Qiagen Qiaquick GelExtraction試劑盒純化的并且用作標(biāo)準(zhǔn)DNA測序反應(yīng)中的模板，然后在自動DNA測序機器例如ABI PrismTM3100 Genetic Analyzer(AppliedBiosystems)上進行分析?？蛇x擇地，如上所述(除了省去逆轉(zhuǎn)錄步驟外)在基因組水平上進行DNA測序。
為了表征抗RhD重組多克隆抗體，使用下列引物用于VH擴增的PCR引物RhD#0015’TCTCTTCCGCATCGCTGTCT(SEQ ID NO 34)RhD#0075’AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC(SEQ ID NO 35)用于VL擴增的PCR引物RhD#0055’CGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTG(SEQ ID NO 36)RhD#0085’AAGACCGATGGGCCCTTGGTGGA(SEQ ID NO 37)測序引物是VH5’AACGGGTTTGCCGCCAGAACA(SEQ ID NO 38)VL5’CCGAGGGACCTGAGCGAGT(SEQ ID NO 39)使用抗獨特型肽的對單個細(xì)胞的ELISA作為對核酸測序的補充，可使用抗獨特型肽ELISA確定抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的混合物例如多克隆工作細(xì)胞庫的克隆組成。
將分選的單種細(xì)胞培養(yǎng)大約14天，從而產(chǎn)生來自單克隆的等基因細(xì)胞培養(yǎng)物。在如實施例7中描述的ELISA測定法中，可使用抗獨特型肽就特異性抗RhD抗體的存在分析來自這些培養(yǎng)物的上清液。這將提供關(guān)于產(chǎn)生特定的單個成員的克隆數(shù)目的信息。如果將單個成員的量和抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的總量進行比較(例如通過測量所有等基因細(xì)胞培養(yǎng)物上的IgG)，可獲得在多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生單種抗RhD抗體的細(xì)胞的比例的定量測量值。
實施例13本實施例顯示在重組多克隆抗體的下游加工(DSP)期間，使用陽離子交換層析分析法評估克隆多樣性。
下游加工使用下列DSP步驟純化來自進行中的生物反應(yīng)器批次的包含25個單個成員的抗RhD rpAb樣品1.使用MAbSelect柱捕獲抗體2.在pH3下進行病毒滅活3.使用sephadex G-25柱進行緩沖液交換4.使用DEAE-sepharose柱進行陰離子交換層析5.使用Planova 15N濾器進行病毒過濾，和6.使用MEP hypercel柱進行疏水性電荷誘導(dǎo)層析7.使用milipore biomax濾膜進行超濾/滲濾在單獨的DSP步驟后的克隆多樣性的分析在重組多克隆抗體組合物的DSP期間，使用陽離子交換層析分析克隆多樣性。以室溫下操作的60ml h-1的流速，將在抗RhD rpAb的DSP期間在步驟1、3、4和6后采集的樣品加于25mM醋酸鈉、150mM氯化鈉、pH5.0中的PolyCatA柱(4.6×100mm)上。然后使用25mM醋酸鈉中的150-350mM的氯化鈉、pH5.0的線性梯度，以60ml h-1的流速洗脫抗體組分。在280nm通過分光光度計檢測抗體組分，比較層析譜(圖15)以檢測在DSP期間克隆多樣性的潛在丟失。在本實施例中，使用陽離子交換層析法證明在重組多克隆抗體的DSP期間，克隆多樣性基本上未改變。
實施例14超過40種抗RhD的抗體的IEX分析已顯示許多單種抗體顯示如圖1 6B中所示的“3峰模式”。羧肽酶B處理以及糖類的分析已顯示該電荷不均一性不是由C末端賴氨酸的剪切或唾液酸的存在(數(shù)據(jù)未顯示)造成的。
本實施例證明了，電荷的不均一性是由于PyroGlu形成造成的，顯示了可如何使用定點誘變獲得均一的IEX模式。
抗體的表達和純化使這樣的穩(wěn)定的細(xì)胞系(如2004年7月20日提交的丹麥專利申請PA200401133中所描述的獲得的)適應(yīng)在補充有4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)和以1∶250稀釋的抗成團劑(anti-dumping agent)(Invitrogen)的無血清Excell 302培養(yǎng)基(JRHBiosc iences，Andover，UK)中的懸浮培養(yǎng)，擴增和使用常規(guī)的冷凍方法將其保存在-150℃下，所述穩(wěn)定的細(xì)胞系各表達不同的來自其基因組上的特定位點的重組抗獼猴D單克隆抗體。
在保存之前，從細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲上清液，在使用基本上如實施例1中所描述的親和層析(A蛋白)純化抗RhD單克隆抗體之前過濾上清液。
強陽離子交換層析將前面步驟中純化的單克隆抗體接受基本上如實施例1中所描述的強IEX層析。表18的IEX欄概述了存在于選擇的抗體的IEX特征譜中的峰的數(shù)目，這些IEX特征譜也顯示于圖16中。
N末端序列分析按照廠商說明書所描述的操作，使用Procise 494測序儀(Applied Biosystems，CA)通過Edman測序，在溶液中進行來自2個選擇的抗體(RhD198和RhD307)的IEX分析的分離峰的N末端序列分析。序列分析證明電荷不均一性是由于HC的N-末端Gln的部分環(huán)化造成的(參見表18)。因此，第1峰包含具有完全封閉的HC的N末端(HC的N末端具有0電荷)的抗體；第2峰對應(yīng)于這樣的抗體，在該抗體中HC的一個N末端被封閉(HC的N末端具有+1電荷)，第3峰最可能代表這樣的抗體，在該抗體中HC的N末端Gln未被修飾(HC的N末端具有2+電荷)。N末端谷氨酰胺環(huán)化為PyroGlu，使得其不易進行Edman測序列。
將同樣展示這種“3峰模式”或“1峰模式”的許多其他抗RhD抗體接受SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，所述抗體被電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，進行N末端序列分析。將這些印跡上的HC和LC條帶接受Edman測序。
根據(jù)其IEX模式(“1峰模式”)，一些在HC中具有N末端Gln的抗體(RhD162、RhD240)經(jīng)顯示被完全封閉，而具有“3峰模式”的抗體(RhD196、RhD305和RhD306)經(jīng)發(fā)現(xiàn)如所預(yù)期的被部分封閉(參見表18)。該解釋基于序列的產(chǎn)量和IEX特征譜中不同電荷變體(0、+1和2+)的相對百分比。
表18
a分別以常規(guī)和粗體字型標(biāo)示預(yù)期的和獲得的N末端序列。b獲自印跡的數(shù)據(jù)。c獲自來自IEX分析(在溶液中分析的)的分離的級分(峰1和2)的數(shù)據(jù)。dN末端谷氨酰胺環(huán)化成PyroGlu使其難以進行Edman測序。n.d.；未確定的。
定位誘變使用定位誘變，通過將N末端Gln轉(zhuǎn)變成Glu從選擇的抗體除去電荷不均一性。使用編碼這樣的全長抗體的表達質(zhì)粒RhD189，該抗體在重鏈中具有N末端Gln殘基和在LC鏈中具有N末端Glu殘基。該質(zhì)粒的VH區(qū)域的側(cè)翼為編碼信號肽的區(qū)域的3’末端的AscI位點和J區(qū)中的沉默XhoI位點。
使用下列引物進行誘變RhD189正向引物TGGGCGCGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG(SEQ IDNO 44)RhD189反向引物GGAGGCGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC(SEQ ID NO45)以下劃線標(biāo)示正向引物中的AscI位點和反向引物中的XhoI位點，而VH區(qū)域的N末端中的Glu密碼子(GAG)以斜體顯示。將RhD189質(zhì)粒用作使用上述引物的PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)廠商說明書，使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes，F(xiàn)inland)進行PCR反應(yīng)，進行25個循環(huán)。在1％的瓊脂糖凝膠上純化大約400bp的VH條帶，將其和BioTaq DNA聚合酶一起溫育，在瓊脂糖上重新純化，按照廠商說明書重新克隆入pCR2.1TOPO載體(Invitrogen，CA)。通過測序驗證包含VH插入物的克隆。用AscI和XhoI從質(zhì)粒RhD189中切除原始VH片段，用來自PCR2.1TOPO質(zhì)粒的突變片段插入替代。從來自克隆的陽性菌落制備無內(nèi)毒素的質(zhì)粒midiprep(Macherey-Nagel，Germany)，測序以驗證正確片段的存在。
將抗體接受SDS-PAGE分析、電轉(zhuǎn)印，然后進行HC條帶的N末端測序以驗證Gln被Glu取代(數(shù)據(jù)未顯示)。
顯示“3峰”IEX特征譜的抗體RhD189的HC的N末端Gln至Glu的轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生只有一個峰的顯著不同的特征譜(圖17)。因此通過將N末端Gln殘基轉(zhuǎn)變?yōu)镚lu殘基已消除了電荷不均一性。
結(jié)合測定為確定N末端突變是否影響抗體的功能性，就對RhD陽性紅細(xì)胞的結(jié)合對天然抗體RhD189和其突變的Glu對應(yīng)物RhD189E進行測定。在Blood Bank，Aalborh Hospital，DK，在征得同意后，通過在含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，Germany)的PBS(Gibco，Invitrogen，United Kingdom)中洗滌血液3次從獲自健康供體的全血制備紅細(xì)胞。重懸紅細(xì)胞，在4℃下將其作為10％的ID-Cellstab(DiaMed，Switzerland)中的溶液貯存。
以5×104細(xì)胞/μl使用PBS、1％的BSA中的RhD陽性紅細(xì)胞測量抗體的結(jié)合能力。在96孔板中(Becton Dickinson Labware，NJ，USA)，將樣品在PBS、1％BSA中稀釋三份。將50μl抗體溶液和50μl紅細(xì)胞混合，在37℃下溫育40分鐘。在PBS、1％的BSA中洗滌細(xì)胞2次(300g，2分鐘)。將80μl在PBS、1％BSA中以1∶20稀釋的藻紅蛋白綴合的山羊抗人IgG(Beckman Coulter，CA，USA)加入各樣品，在4℃下放置30分鐘。在PBS、1％BSA和FacsFlow(Becton Dickinson，Belgium)中洗滌樣品(300g，2分鐘)，將樣品重懸在200μl FACSFlow中。將樣品在FACSCalibur(Becton Dickinson，CA，USA)上進行檢驗，使用CellQuest Pro和Excel進行數(shù)據(jù)分析。
如圖18中所示，在Glu變體和其天然對應(yīng)物之間，在對RhD陽性紅細(xì)胞的結(jié)合能力上沒有觀察到顯著差異。
結(jié)論在許多抗RhD抗體的IEX特征譜中觀察到的不均一性是由于這些抗體中的N末端Gln殘基的部分環(huán)化造成的。用Glu殘基交換抗RhD抗體中的HC的N末端Gln殘基來消除固有的N末端電荷不均一性，而不影響對RhD陽性紅細(xì)胞的結(jié)合能力。
序列表<110>Symphogen A/S<120>用于重組多克隆蛋白或多克隆細(xì)胞系的結(jié)構(gòu)表征的方法<130>16270PCT00<160>45<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>1tctcttccgc atcgctgtct 20<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>2aggaaaggac agtgggagtg gcac24<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>3cgtagctctt ttaagaggtg 20<210>4
<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>4accgatgggc ccttggtgga 20<210>5<211>8<212>PRT<213>智人<400>5Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly1 5<210>6<211>8<212>PRT<213>智人<400>6Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly1 5<210>7<211>7<212>PRT<213>智人<400>7Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser1 5<210>8<211>7
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<400>19Ala Cys Thr Thr Leu Leu His Phe Leu Cys Gly Gly Gly1 5 10<210>20<211>13<212>PRT<213>人工序列<223>合成肽<400>20Ala Cys Thr Thr Leu Leu Ser Phe Leu Cys Gly Gly Glyl 5 10<210>21<211>13<212>PRT<213>人工序列<223>合成肽<400>21Ala Gly Thr Ser Leu Leu Ala Phe Leu Cys Gly Gly Gly1 5 10<210>22<211>13<212>PRT<213>人工序列<223>合成肽<400>22Ala Cys Ash Leu Leu Leu Gln Phe Leu Cys Gly Gly Gly1 5 10<210>23
<211>9<212>PRT<213>人工序列<223>合成肽<400>23Cys Thr Thr Leu Leu His Phe Leu Cys1 5<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>24cacggctgag tattactgtg c 21<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>25ttggtggagc cactcga17<210>26<211>33<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>26agaaatttgt tcggtgacta cgatcttaag tcc 33<210>27<211>28<212>DNA
<213>人工序列<223>引物序列<400>27agagaattga gcacgcaacg tggataca 28<210>28<211>34<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>28agagagagta ctctatatag cagcagctgg taca 34<210>29<211>29<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>29gatggtctcc tatagcagca gctggtacc 29<210>30<211>29<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>30gagagactct gttcggggag tcagtagat 29<210>31<211>29<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>3l
gggtactctg tatagcagca gctggtaca 29<210>32<211>33<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>32agagacctac aagggtatag aagcagctgg tac 33<210>33<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>33ccgacgattt ttggagtggg cc 22<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>34tctcttccgc atcgctgtct20<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>35aggaaaggac agtgggagtg gcac 24<210>36
<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>36cgttcttttt cgcaacgggt ttg 23<210>37<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>37aagaccgatg ggcccttggt gga 23<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>38aacgggtttg ccgccagaac a21<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>39ccgagggacc tgagcgagt 19<210>40<211>5<212>PRT<213>智人
<400>40Gln Val Gln Leu Val1 5<210>41<211>5<212>PRT<213>智人<400>41Gln Leu Gln Leu Gln1 5<210>42<211>5<212>PRT<213>智人<400>42Asp Ile Gln Leu Thr1 5<210>43<211>5<212>PRT<213>智人<400>43Asp Ile Gln Met Thr1 5<210>44<211>33<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列
<400>44tgggcgcgcc gaggtgcagc tggtggagtc tgg 33<210>45<211>30<212>DNA<213>人工序列<223>引物序列<400>45ggaggcgctc gagacggtga ccgtggtccc 30
權(quán)利要求
1.一種用于表征樣品的方法，所述樣品包含具有不同可變區(qū)的不同的同源蛋白或產(chǎn)生這些蛋白的細(xì)胞，用該方法可獲得關(guān)于所述蛋白質(zhì)或其編碼序列的單個成員的相對比例或存在的信息，所述方法包括通過一種或多種蛋白質(zhì)表征技術(shù)和/或通過編碼蛋白的序列的一種或多種遺傳分析法分析所述樣品的等分。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述遺傳分析法選自RFLP、T-RFLP、微陣列分析法、定量PCR和核酸測序法。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述樣品是細(xì)胞培養(yǎng)物級分，其包含所述培養(yǎng)物的細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)表征技術(shù)選自i)根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)分離蛋白的層析分析法，ii)同源蛋白的蛋白水解降解物的分析法，iii)“大批量”N末端測序和iv)使用同源蛋白的特異性檢測分子的分析法。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述層析分析法基于除了大小以外的其它物理化學(xué)性質(zhì)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中單個層析分析法基于選自下列的物理化學(xué)性質(zhì)i)凈電荷，ii)疏水性，iii)等電點，和iv)親和力。
7.權(quán)利要求4到6中任一項的方法，其中以多維層析的方式進行所述層析分析法。
8.權(quán)利要求4的方法，其中進行同源蛋白的蛋白水解降解物的分析以分離N末端標(biāo)志性肽或具有特征性氨基酸側(cè)鏈官能團的肽。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述特異性檢測分子是抗獨特型肽或抗獨特型抗體。
10.權(quán)利要求9的方法，其中在確定多克隆細(xì)胞系中的單種蛋白生產(chǎn)性細(xì)胞中使用所述抗獨特型肽或抗獨特型抗體。
11.權(quán)利要求1或4至9中任一項的方法，其中所述樣品產(chǎn)生自細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液。
12.前面權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述表征基于存在于所述樣品中的一種或多種崗哨蛋白或崗哨核酸序列的分析。
13.前面權(quán)利要求中任一項的方法，其中用至少兩種分析技術(shù)來分析所述樣品。
14.權(quán)利要求13的方法，其中一種分析技術(shù)是權(quán)利要求4至9中任一項的蛋白質(zhì)表征技術(shù)，而另一種分析技術(shù)是權(quán)利要求2的遺傳分析法。
15.前面權(quán)利要求中任一項的方法，其中在培養(yǎng)期間在不同的時間點上從單個多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物獲得所述樣品，并比較所述單種同源蛋白和/或編碼序列的相對比例。
16.權(quán)利要求1至14中任一項的方法，其中在特定的時間點從不同多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得所述樣品，并比較所述單種同源蛋白和/或編碼序列的相對比例。
17.前面權(quán)利要求中任一項的方法，其中具有不同的可變區(qū)的不同的同源蛋白是重組蛋白。
18.權(quán)利要求17的方法，其中重組蛋白組成重組多克隆蛋白。
19.前面權(quán)利要求中任一項的方法，其中具有不同的可變區(qū)的不同的同源蛋白是具有不同CDR區(qū)的抗體。
20.權(quán)利要求1-18中任一項的方法，其中具有不同的可變區(qū)的不同的同源蛋白是具有不同CDR區(qū)的T細(xì)胞受體。
21.抗獨特型肽或抗獨特型抗體用于分離和/或確定多克隆細(xì)胞系中的單種蛋白產(chǎn)生性細(xì)胞的用途。
22.多維層析術(shù)在就單種抗體分子的多樣性方面將其從多克隆抗體或單克隆抗體的混合物中分離的用途。
23.多維層析技術(shù)在就單種T細(xì)胞受體分子的多樣性方面將其從多克隆T細(xì)胞受體或單克隆T細(xì)胞受體的混合物中分離的用途。
24.用于消除由于重組蛋白中的N末端谷氨酰胺殘基的環(huán)化產(chǎn)生的N末端電荷不均一性的方法，其包括將所述N末端谷氨酰胺殘基改變?yōu)榱硪环N氨基酸。
25.權(quán)利要求24的方法，其中通過編碼所述蛋白的核酸序列的定點誘變進行所述改變。
26.權(quán)利要求24或25的方法，其中在多克隆蛋白的一種或多種單個成員上進行所述改變。
27.權(quán)利要求24至26中任一項的方法，其中所述蛋白是抗體或T細(xì)胞受體。
28.權(quán)利要求1或其從屬權(quán)利要求的方法，其使用基于凈電荷的層析分析法，其中使表現(xiàn)由于N末端谷氨酰胺殘基造成的電荷不均一性的蛋白接受權(quán)利要求24至27的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了可用于評估多克隆細(xì)胞系在生產(chǎn)期間的穩(wěn)定性和最終的多克隆產(chǎn)品的批與批之間的一致性的結(jié)構(gòu)表征平臺。所述結(jié)構(gòu)表征平臺基于單獨地或組合地提供表征多克隆細(xì)胞系和最終產(chǎn)品的所需信息的遺傳分析和蛋白質(zhì)表征技術(shù)。使用平臺技術(shù)分析的不同的同源蛋白的集合是例如重組多克隆抗體或單克隆抗體的混合物。
文檔編號C12N15/09GK101019030SQ200580023371
公開日2007年8月15日 申請日期2005年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
發(fā)明者L·K·拉斯姆森, T·弗蘭德森, S·K·拉斯姆森, P·S·安德森 申請人:西福根有限公司