專利名稱：結(jié)合系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使合成表面適配用于在其上固定靶分子。
背景技術(shù)：
存在簡(jiǎn)單處理以便使生物分子如肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、寡糖與靶基材結(jié)合用于藥物發(fā)現(xiàn)研究和診斷中多種應(yīng)用的需要。現(xiàn)有技術(shù)中存在許多方法，如在Hermanson等人，Bioconjugate Techniques:Academic Press, 1996中描述的那些，但是充分使用的方法是有限的。一種方法是使用與金屬離子(如鎳和鈷)結(jié)合的多組氨酸標(biāo)簽。固定的金屬離子親和層析法(IMAC)是一種高度可靠的純化方法，它已經(jīng)應(yīng)用于其他用途，如蛋白質(zhì)再折疊、生物傳感器和基于平板的免疫測(cè)定法(Ueda，E. K. Μ.，Gout, P. W.和Morganti，L.J. Chromatography A, 988 (2003) 1-23)。在IMAC中，將金屬離子經(jīng)過與一些固相支持物共價(jià)連接的金屬螯合基團(tuán)固定，所述固相支持物具有蛋白質(zhì)可以經(jīng)多His標(biāo)簽與之結(jié)合的一 些游離配位位點(diǎn)。隨后，可以通過用咪唑和其他螯合劑競(jìng)爭(zhēng)而釋放結(jié)合的蛋白質(zhì)。雖然蛋白質(zhì)釋放是IMAC的必需要求，靶蛋白提早釋放不是所希望的。需要將多組氨酸標(biāo)簽并入蛋白質(zhì)中以消除金屬-蛋白質(zhì)隨機(jī)結(jié)合、結(jié)合強(qiáng)度不可預(yù)測(cè)和重現(xiàn)性的問題。即便如此，金屬與多組氨酸標(biāo)簽相互作用是一種內(nèi)在低親和力相互作用，并且僅具有一個(gè)多組氨酸標(biāo)簽的大部分蛋白質(zhì)將在應(yīng)用條件(如固相測(cè)定法中的那些條件)下從金屬絡(luò)合物基材解離。對(duì)于這類條件下的穩(wěn)定結(jié)合，需要兩個(gè)多組氨酸標(biāo)簽(Nieba, L. , Nieba-Axmann, S. E. , Persson, A. , Hamalainen, M. , Edebratt, F. , Hansson, A. , Lidholm, J. , Magnusson. , Karlsson, A. F.和 Pluckthun, A. Anal.Biochem.，252(1997)217-228)。使靶分子與合成表面或基材結(jié)合的另一種方法使用金屬離子以便在靶分子和基材之間形成配位絡(luò)合物，從而使靶分子與基材連接，不需要事先修飾靶，如添加上述多組氨酸標(biāo)簽。具體見 PCT7AU2005/00966 (公布為 WO 2006/002472)。持續(xù)需要具有新穎或改進(jìn)的靶分子結(jié)合能力或功能的合成基材。還需要對(duì)靶分子具有改進(jìn)的結(jié)合親和力的合成基材。還需要合成基材，它們使得對(duì)靶分子的任何構(gòu)象性損傷最小化。還需要合成基材，它們適應(yīng)于提供靶分子的改進(jìn)取向。還需要合成基材，它們適應(yīng)于結(jié)合靶分子并且在其活化狀態(tài)下具有相對(duì)長(zhǎng)的貨架期，即，可以貯存更長(zhǎng)時(shí)間而在稍后用來(lái)與靶分子結(jié)合時(shí)不明顯喪失靶分子結(jié)合能力的基材。本說(shuō)明書中對(duì)任何現(xiàn)有技術(shù)的提及不是并且不應(yīng)當(dāng)視為承認(rèn)或以任何形式暗示這種現(xiàn)有技術(shù)形成在澳大利亞或任何其他管轄權(quán)的公知常識(shí)的部分或者可以合理地預(yù)期這項(xiàng)現(xiàn)有技術(shù)由本領(lǐng)域技術(shù)人員確認(rèn)、理解和視為相關(guān)的。發(fā)明概述本發(fā)明試圖解決至少一個(gè)上文提到的問題或局限或試圖解決至少一個(gè)上文提到的需求，并且在一個(gè)實(shí)施方案中提供一種使合成基材適配用于在其上固定靶分子的方法。這種方法包括以下步驟-提供一種合成基材；-提供金屬離子用于與這種基材結(jié)合，其中這些金屬離子不與靶分子絡(luò)合；-使這些金屬離子與這種基材在靶分子不存在的情況下接觸，從而形成其中該基材與這些金屬離子的配位位點(diǎn)結(jié)合的一種配位絡(luò)合物；-在這種基材存在的情況下從這些金屬離子中形成低聚金屬絡(luò)合物，從而基本上全部的與這種基材配位絡(luò)合的這些金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式；因而適配這種基材用于在其上固定一種靶分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種使合成基材適配用于在其上固定靶分子的方法。這種方法包括以下步驟-提供金屬離子用于與一種基材結(jié)合，其中這些金屬離子不與一種靶分子絡(luò)合；-在基材不存在的情況下從金屬離子中形成低聚金屬絡(luò)合物，從而基本上全部的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式；-使這些低聚金屬絡(luò)合物與這種基材在靶分子不存在的情況下接觸，從而形成其中該基材與這些低聚金屬絡(luò)合物的金屬離子的配位位點(diǎn)結(jié)合的一種配位絡(luò)合物；因而適配這種基材用于在其上固定靶分子。在某些實(shí)施方案中，提供一種在合成基材上固定靶分子的方法，所述方法包括-提供一種合成基材和一種待固定在其上的祀分子；-提供能夠與該基材和該靶分子結(jié)合的金屬離子，其中以低聚金屬絡(luò)合物的形式提供基本上全部的這些金屬離子；-使這些低聚金屬絡(luò)合物與該靶分子和該基材接觸，從而形成一種配位絡(luò)合物，在這種配位絡(luò)合物中，該基材和該靶分子與這些低聚金屬絡(luò)合物的金屬離子的配位位點(diǎn)結(jié)合并且安排這些低聚金屬絡(luò)合物以便使該靶分子與該基材連接；從而使靶分子固定在基材上。在其他實(shí)施方案中，提供一種使合成基材適配用于在其上固定靶分子的方法，所述方法包括-提供一種合成基材用于在其上固定一種祀分子；-提供能夠與該基材和該靶分子結(jié)合的金屬離子，其中以低聚金屬絡(luò)合物的形式提供基本上全部的這些金屬離子；-使這些低聚金屬絡(luò)合物與這種基材接觸，從而形成其中這種基材與這些低聚金屬絡(luò)合物的金屬離子的配位位點(diǎn)結(jié)合的一種配位絡(luò)合物；因而適配所述基材用于在其上固定一種靶分子?？梢院Y選/選擇基本上處于低聚金屬絡(luò)合物形式的兩種或更多種金屬離子以提供靶這種分子和基材之間穩(wěn)定的結(jié)合相互作用或連接。這意指靶分子借助與基本上全部處于低聚金屬絡(luò)合物形式的兩種或更多種金屬離子的配位作用固定在基材上。下文更詳細(xì)解釋據(jù)信發(fā)揮作用的機(jī)制。術(shù)語(yǔ)‘基本上全部處于低聚金屬絡(luò)合物形式’意指，優(yōu)勢(shì)比例的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物(例如二聚體、三聚體、四聚體等)形式，與單體金屬絡(luò)合物相對(duì)。例如，優(yōu)選地多于75%、優(yōu)選地多于80%、優(yōu)選地多于85%、優(yōu)選地多于90%、優(yōu)選地多于95%、優(yōu)選地多于98或99%的與基材配位絡(luò)合的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式。可以根據(jù)本文所述的毛細(xì)管電泳方法和技術(shù)人員已知的其他方法測(cè)定組合物中單體或低聚物的量％?？梢酝ㄟ^將包含單體絡(luò)合物和低聚絡(luò)合物的金屬絡(luò)合物的樣品分級(jí)并且回收低聚絡(luò)合物，獲得其中基本上全部金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式的金屬離子組合物。可以理解在一些實(shí)施方案中，在可能存在隨低聚金屬絡(luò)合物一起回收的一 些殘留單體金屬絡(luò)合物時(shí)，分級(jí)可能是不完善的。在其他實(shí)施方案中，可以在支持超過單體金屬絡(luò)合物產(chǎn)生低聚金屬絡(luò)合物的條件下產(chǎn)生這種組合物，在這種情況下，這種組合物包含金屬離子，其中以低聚金屬絡(luò)合物形式提供基本上全部金屬離子。在某些實(shí)施方案中，這種組合物含有處于單體金屬絡(luò)合物和低聚金屬絡(luò)合物形式的金屬離子，在特定條件下施加至基材時(shí)，這些金屬離子可以允許這些絡(luò)合物競(jìng)爭(zhēng)基材上的可用螯合位點(diǎn)，從而單體金屬絡(luò)合物實(shí)際上退出對(duì)基材上有限螯合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種在合成基材上固定靶分子的方法，所述方法包括-—種提供合成基材和一種待固定在其上的祀分子；-提供能夠與該基材和該靶分子結(jié)合的金屬離子，這些金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物和單體金屬絡(luò)合物形式；-使這些金屬絡(luò)合物與靶分子和基材在其中低聚金屬絡(luò)合物優(yōu)選地與靶分子和基材結(jié)合的條件下接觸，從而形成一種配位絡(luò)合物，在這種配位絡(luò)合物中該基材和靶分子與低聚金屬絡(luò)合物的金屬離子的配位位點(diǎn)結(jié)合并且設(shè)置這些低聚金屬絡(luò)合物以便使該靶分子與該基材連接；從而使靶分子固定在基材上。在其他實(shí)施方案中，這種方法使用低聚金屬絡(luò)合物的組合物或用這種組合物包被的基材，該組合物特征在于它基本上不包含單體金屬絡(luò)合物。低聚金屬絡(luò)合物可以包含多于一種類型的金屬離子，或這些絡(luò)合物可以由單一類型的元素金屬離子組成。低聚金屬絡(luò)合物可以包含相同數(shù)目的金屬離子。作為替代方案，用于在基材上綴合或固定靶分子的低聚金屬絡(luò)合物的組合物可以包括具有不同數(shù)目金屬離子的絡(luò)合物。例如，組合物可以具有包含2、3、4、5、6個(gè)和更多個(gè)金屬離子的絡(luò)合物。這些低聚金屬絡(luò)合物可以具有相同的構(gòu)象、幾何形狀或結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，用于在基材上固定靶的金屬離子組合物可以含有具有不同構(gòu)象、幾何形狀或結(jié)構(gòu)的低聚金屬絡(luò)合物。例如，一些可以是線性的，其他可以是分枝的，其他可以使簇集的等。本發(fā)明也在于合成和選擇相對(duì)于靶分子具有不同結(jié)合特征的低聚金屬絡(luò)合物(金屬二聚體、三聚體四聚體等)并且以這種方式提供特定金屬低聚物，從而可以進(jìn)一步操作相對(duì)于靶分子的結(jié)合結(jié)果。結(jié)果是通過低聚金屬絡(luò)合物的改進(jìn)結(jié)合作用，這種低聚金屬絡(luò)合物可以相對(duì)于靶分子實(shí)現(xiàn)較高的結(jié)合親和力和可能變動(dòng)的選擇性水平。類似地，通過選擇處于不同比率的不同低聚金屬絡(luò)合物的特定混合物，相對(duì)于靶分子和基材，其他結(jié)合特征和選擇性可以是可能的。這里，術(shù)語(yǔ)“基材”總體而言用來(lái)指希望結(jié)合特定靶分子的一些種類?！昂铣苫摹笨傮w上是一種非生物基材，即它不是細(xì)胞或細(xì)胞片段?！盎摹笨梢允亲鳛橐环N固定目的靶分子的合適平臺(tái)的常規(guī)固相材料?？傮w而言，所用的基材將是具有先前存在的固相應(yīng)用中常用模式的合成基材。例如，這種基材可以包括二氧化硅/玻璃、金和其他金屬或多個(gè)塑料/聚合物材料實(shí)例，包括聚(乙烯醇)表面或甲基丙烯酸酯表面?；目梢圆扇∪魏涡问?。在生物學(xué)應(yīng)用中，基材通常將處于微米或納米大小的珠、膜、多孔板、載玻片、毛細(xì)管柱、筒形式或其他模式?；牡谋砻婵赡芤呀?jīng)含有羧酸、酰胺、胺、羥基、醛或其他給電子基團(tuán)，或經(jīng)修飾以在其表面上提供低水平的給電子基團(tuán)。如將要描述那樣，基材的表面特征可以沒有最佳的金屬螯合配體，但是通過選擇特定的低聚金屬絡(luò)合物或其特定組合，可以實(shí)現(xiàn)本文所述方法的功效或優(yōu)化。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“基材”意在包括這類事物如可檢測(cè)標(biāo)記物和其他分子種類。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”以常規(guī)含義用來(lái)意指任何種類，它是可以檢測(cè)的并且與另一種分子連接時(shí)用來(lái)鑒定這種分子。標(biāo)記物的確切形式不是特別關(guān)鍵的，前提是本發(fā)明的基礎(chǔ)原理適用。以舉例方式，標(biāo)記物可以是放射性標(biāo)記物、酶、特異性結(jié)合對(duì)組分(例如，抗生物素蛋白、鏈霉親和素)、比色標(biāo)記或染料(例如，UV、VIS或紅外染料)、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、抗體、蛋白A、蛋白G等。本發(fā)明可以在診斷測(cè)定法領(lǐng)域具有特殊用途，并且原則上，可以使用 在這種環(huán)境下常規(guī)用來(lái)提供增加的信號(hào)檢測(cè)的任何標(biāo)記物。在這種背景下，本術(shù)語(yǔ)意在指活性(可檢測(cè))標(biāo)記物種類本身或與配位配體結(jié)合的活性標(biāo)記物，其中所述的配位配體使活性標(biāo)記物能夠與根據(jù)本發(fā)明所用的金屬絡(luò)合物結(jié)合。取決于活性標(biāo)記物種類的性質(zhì)，可能需要篩選并且選擇特定的低聚金屬絡(luò)合物或其特定組合，以便實(shí)現(xiàn)活性標(biāo)記物種類和金屬絡(luò)合物的金屬的必要結(jié)合。這種標(biāo)記物可以結(jié)合一種或多種低聚金屬絡(luò)合物并且低聚金屬絡(luò)合物可以結(jié)合一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這種標(biāo)記物可以在特征上是聚合性的，包含多種活性標(biāo)記物種類，并且它具有結(jié)合(螯合)多于一個(gè)分子的低聚金屬絡(luò)合物的能力。這里，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”還包括(預(yù)標(biāo)記)分子，如無(wú)機(jī)、有機(jī)或生物分子(例如，合成肽或寡核苷酸)，它們沒有作為活性標(biāo)記物發(fā)揮作用的能力，但是可以進(jìn)一步經(jīng)反應(yīng)或官能化以導(dǎo)致檢測(cè)到預(yù)標(biāo)記的靶分子。在此情況下，這種進(jìn)一步反應(yīng)/官能化在不破壞結(jié)合(配位)相互作用的情況下發(fā)生，其中所述的結(jié)合(配位)相互作用最初負(fù)責(zé)使預(yù)標(biāo)記分子和靶分子與低聚金屬絡(luò)合物的金屬離子結(jié)合不會(huì)破壞?？梢岳斫猓饘俳j(luò)合物的功能在此是充當(dāng)靶分子和預(yù)標(biāo)記分子之間的交聯(lián)劑。如上文解釋，預(yù)標(biāo)記分子可能需要與合適的配位配體結(jié)合，以便通過金屬絡(luò)合物實(shí)現(xiàn)結(jié)合。在下文并且除非上下文另外需要，否則，出于提及的便利，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”和其變體(如“標(biāo)記”)將用來(lái)包括所描述的實(shí)施方案，其中所述標(biāo)記物是預(yù)標(biāo)記物并且本發(fā)明的作用是是促進(jìn)靶分子與這種預(yù)標(biāo)記物交聯(lián)。除非另外指出，在本發(fā)明的環(huán)境下，術(shù)語(yǔ)“靶分子”指希望標(biāo)記的任何分子。除非另外指出，在本發(fā)明的環(huán)境下，術(shù)語(yǔ)“靶分子”指希望固定在基材上的分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這種靶分子是一種生物分子。對(duì)于作為靶分子的抗體而言，本發(fā)明具有特別的適用性。這就是說(shuō)，術(shù)語(yǔ)靶分子可以包括希望固定在基材表面上的任何分子。例如，靶分子可以是一種蛋白質(zhì)，如抗體、鏈霉親和素、蛋白A或蛋白G。本文中，術(shù)語(yǔ)“低聚金屬絡(luò)合物”指包含連接在一起的兩種或更多種單體種類的金屬絡(luò)合物種類。單體金屬絡(luò)合物是當(dāng)溶液中的金屬離子與溶液中還存在的電子供體配體形成配位共價(jià)鍵也稱作配位的共價(jià)鍵(dative covalent bond)時(shí)所形成的金屬種類。這類配體將在本文中稱作配位配體、金屬配體或簡(jiǎn)單地稱作配體。例如，在水溶液中，鉻(III)可以作為八面體絡(luò)合物存在，這種八面體絡(luò)合物具有6個(gè)圍繞中央鉻離子安排的配位水分子。對(duì)于任何給定金屬所形成的單體金屬絡(luò)合物的性質(zhì)將取決于溶液中的配體以及配體與金屬離子形成適度穩(wěn)定的締合的能力。取決于它們的結(jié)構(gòu)和與金屬離子相互作用從而形成絡(luò)合物的能力，配體可以是單齒的、雙齒的或多齒的。水合物和/或陰離子是配體(也稱作反離子)，它們總是溶液中金屬絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)的一部分。低聚金屬絡(luò)合物包含至少兩個(gè)借助配體的一個(gè)或多個(gè)橋接相互作用結(jié)合在一起的這些單體金屬絡(luò)合物?？梢酝ㄟ^更多配體橋接更多金屬種類以形成包含許多單體金屬種類的團(tuán)簇來(lái)形成更大的低聚絡(luò)合物。單體金屬絡(luò)合物可以結(jié)合在一起，以便形成具有任何構(gòu)象、幾何形狀或結(jié)構(gòu)的低聚金屬絡(luò)合物。例如，低聚金屬絡(luò)合物可以具有線性、分枝或團(tuán)簇幾何形狀或構(gòu)象。例如，圖I描述了3種基于鉻的低聚絡(luò)合物。在這個(gè)具體例子中，不同的PH條件可以導(dǎo)致獨(dú)立單體鉻絡(luò)合物即[Cr (H2O)6]3+經(jīng)其配體結(jié)合，從導(dǎo)致二聚體、三聚體 和四聚體和更大低聚金屬絡(luò)合物的形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于鉻的低聚金屬絡(luò)合物是水解性低聚金屬絡(luò)合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鉻低聚金屬絡(luò)合物通過兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立金屬離子之間的其他橋接配體形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以組合使用橋接金屬絡(luò)合物的不同方法。類似地，其他金屬絡(luò)合物形成低聚種類，并且不同的低聚物群(根據(jù)它們特定的形成方法)是有可能的。同樣，據(jù)它們特定的形成方法，添加其他配體或配體的組合可以產(chǎn)生更復(fù)雜的低聚金屬絡(luò)合物。除非下文另外說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“金屬絡(luò)合物”和“低聚金屬絡(luò)合物”互換地使用。與組分單體形式金屬絡(luò)合物以及不同低聚物種類之間相比，低聚金屬絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)有可能賦予不同的結(jié)合特征。另外，由于低聚金屬絡(luò)合物具有更大的三維復(fù)雜性，因此這提供了比單體金屬絡(luò)合物更大的設(shè)計(jì)靈活性。本發(fā)明在于選擇最合適的低聚金屬絡(luò)合物或其混合物，以便實(shí)現(xiàn)靶分子和基材之間所希望的結(jié)合相互作用，其中對(duì)于單體金屬絡(luò)合物而言，所述結(jié)合相互作用可能沒有適度強(qiáng)大的螯合種類?？紤]到這一點(diǎn)，認(rèn)為就金屬類型和低聚形式而言，本發(fā)明具有針對(duì)一系列不同低聚金屬絡(luò)合物的適用性，并且這些金屬絡(luò)合物的變體代表了允許更靈活實(shí)施本發(fā)明的多樣性觀點(diǎn)。據(jù)信這種金屬絡(luò)合物借以促進(jìn)結(jié)合靶分子，更準(zhǔn)確地說(shuō)結(jié)合靶分子區(qū)域的機(jī)制涉及靶分子替換與低聚金屬絡(luò)合物締合的一個(gè)或多個(gè)配體。為了這種情況發(fā)生，與一個(gè)或多個(gè)現(xiàn)存的配位配體相比時(shí)，靶分子必須能夠與金屬絡(luò)合物的金屬離子形成優(yōu)選締合，其中所述的現(xiàn)存配位配體與靶分子相互作用之前已經(jīng)與金屬離子締合存在。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，可以相對(duì)于靶分子操縱金屬離子的結(jié)合特征，以便實(shí)現(xiàn)所希望的結(jié)合相互作用。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，選擇與金屬離子締合的一個(gè)或多個(gè)配體，以便按要求控制革巴分子的結(jié)合。低聚金屬絡(luò)合物可以通過如上文連同靶分子所描述的相似配體替換機(jī)制促進(jìn)與基材結(jié)合，并且也可以根據(jù)需要操縱金屬離子相對(duì)于基材的結(jié)合特征。鑒于提出的機(jī)制，可以理解，在金屬離子結(jié)合靶分子時(shí)所形成的種類可以被視為金屬絡(luò)合物，因?yàn)樵诮Y(jié)合時(shí)，靶分子是與金屬離子締合的配位配體。對(duì)于金屬離子與基材結(jié)合時(shí)所形成的種類，同樣可以這樣認(rèn)為。然而，為避免混淆，除非另外指出或明顯的，術(shù)語(yǔ)“金屬絡(luò)合物”將在本文中用來(lái)指在任何類結(jié)合事件已經(jīng)發(fā)生之前的低聚金屬絡(luò)合物和締合的配位配體。這里，除非另外指出，術(shù)語(yǔ)配位和結(jié)合和配位和結(jié)合的相互作用互換使用。如討論，使用低聚金屬絡(luò)合物賦予更大的結(jié)合穩(wěn)定性，這歸因于該低聚金屬絡(luò)合物和基材或靶分子之間的多重結(jié)合相互作用。取決于絡(luò)合物結(jié)構(gòu)(金屬離子數(shù)目和它們對(duì)一些配體的各自固有結(jié)合親和力)和使用條件，配位鍵的強(qiáng)度是可調(diào)的，從基本上不可逆性共價(jià)鍵至弱結(jié)合相互作用。本發(fā)明的方法可能在其中需要將一個(gè)或多個(gè)靶分子固定在固體基材上或出于鑒定目的需要用一些可檢測(cè)“標(biāo)簽”標(biāo)記靶分子(在所謂的捕獲測(cè)定法中)的固相測(cè)定法中具有特別的適用性。本發(fā)明也可以用于親和層析、2D凝膠電泳、表面等離子體共振、體外和體內(nèi)成像、遞送治療性物質(zhì)或過程(processe)和其中已知靶分子與基材結(jié)合時(shí)有用的任何其他應(yīng)用中。本發(fā)明擴(kuò)展至所述方法在這些實(shí)用環(huán)境下的應(yīng)用。如本文所用，除非上下文要求，否則術(shù)語(yǔ)“包含”和該術(shù)語(yǔ)的變體，如“包含著” (comprising)、“包含了”(comprises)和“被包含”(comprised)不意在排除其他添加物、組分、整數(shù)或步驟。前述段落中所述的本發(fā)明其他方面和這些方面的其他實(shí)施方案將從以舉例方式給出的以下描述中并且參考附圖而變得清楚。附圖簡(jiǎn)述圖I.水解性鉻低聚物的結(jié)構(gòu)。圖2.取決于是否使用單體或低聚鉻離子來(lái)使基材與GAM抗體結(jié)合，山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體捕獲小鼠單克隆抗體-熒光素的結(jié)合容量變化。圖3.用IOOmM高氯酸鉻/乙二胺絡(luò)合物在pH 3處理的具有大約30%單體組分的Ademtech珠顯示聚集/結(jié)塊，喪失布朗運(yùn)動(dòng)。圖4.用IOmM高氯酸鉻/乙二胺絡(luò)合物在pH 3處理的具有大約30%單體組分的Ademtech珠顯示聚集/結(jié)塊，喪失布朗運(yùn)動(dòng)。圖5.用IOOmM高氯酸鉻/乙二胺絡(luò)合物在pH 4處理的具有大約10%單體組分的Ademtech珠顯示聚集/結(jié)塊，喪失布朗運(yùn)動(dòng)。圖6.用IOmM高氯酸鉻/乙二胺絡(luò)合物在pH 4處理的具有大約10%單體組分的Ademtech珠不顯示聚集/結(jié)塊，并且維持與其中未修飾的珠可比的充分布朗運(yùn)動(dòng)。圖7.雖然聚集和布朗運(yùn)動(dòng)隨珠的不同處理而變化(圖3至6)，但是在這個(gè)實(shí)例中，捕獲小鼠單克隆抗體-HRP的山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體的結(jié)合容量是相似的。圖8.山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體捕獲小鼠單克隆抗體_熒光素的結(jié)合容量隨用來(lái)使基材與GAM抗體結(jié)合的不同鉻低聚混合物(分別命名為X型、Y型和Z型)變化。圖9.小鼠單克隆抗體捕獲山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體-熒光素的結(jié)合容量隨用來(lái)使基材與小鼠抗體結(jié)合的不同鉻低聚混合物(分別命名為X型、Y型和Z型)變化。

圖10.使用相同摩爾濃度的不同配體形成不同低聚絡(luò)合物改變了山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體捕獲小鼠單克隆抗體-熒光素的結(jié)合容量。圖11.可以通過在結(jié)合靶分子之前預(yù)處理金屬-基材絡(luò)合物，實(shí)現(xiàn)山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體捕獲小鼠單克隆抗體-熒光素的結(jié)合容量增加超過2倍。在這個(gè)實(shí)例中，通過在形成低聚金屬-基材后改變pH (小于2pH單位)，實(shí)現(xiàn)不同的結(jié)果。圖12.低聚金屬絡(luò)合物有效使抗體結(jié)合在二氧化硅表面上，無(wú)論這個(gè)表面是否具有-OH或-COOH官能團(tuán)。這個(gè)實(shí)例顯示使用低聚金屬絡(luò)合物的一種特殊制品時(shí)與聚合珠的可比性能。圖13.使用與圖12中相同的低聚金屬-基材絡(luò)合物，結(jié)合性鏈霉親和素顯示它捕獲生物素酰化分子的容量超過二氧化硅-COOH表面2倍。圖14.用來(lái)偶聯(lián)低聚金屬珠絡(luò)合物的不同偶聯(lián)緩沖液改變了山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體捕獲小鼠單克隆抗體-熒光素的結(jié)合容量。圖15.活化的鉻低聚物珠絡(luò)合物是穩(wěn)定的，顯示與山羊抗小鼠(GAM)抗體立即或在180日貯存后偶聯(lián)時(shí)相同的性能。甚至假定摧毀結(jié)合作用的PBS中貯存產(chǎn)生了 GAM捕獲小鼠單克隆抗體-熒光素的較好性能?！?br> 實(shí)施方案的具體說(shuō)明現(xiàn)在將詳細(xì)地參照本發(fā)明的某些實(shí)施方案。盡管將結(jié)合實(shí)施方案描述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明將不限于這些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明意在涵蓋全部替代形式、修改和等同物，它們可以被包括于如權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明范圍內(nèi)部。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)出與本文所述的那些方法和材料相似或等同的許多方法和材料，它們可以用于本發(fā)明的實(shí)施。本發(fā)明無(wú)論如何不限于至所述的方法和材料。應(yīng)當(dāng)理解，本說(shuō)明書中披露和限定的本發(fā)明擴(kuò)展至所提到或從文本或附圖中明顯的兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)特征的全部替代性組合。這些不同組合的全體構(gòu)成本發(fā)明的多種替代性方面。在導(dǎo)致本文所述的本發(fā)明的工作中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)金屬絡(luò)合物組合物的某些操作，如PCT/AU2005/00966 (公開為WO 2006/002472)中描述的那些，能夠形成具有具有下述表面的合成基材，其中所述表面具有改進(jìn)的靶分子結(jié)合親和力、或改進(jìn)的所結(jié)合靶分子的取向容量或?qū)Π蟹肿庸δ艿膿p害更少，并且最重要地，增加修飾基材的改進(jìn)貨架期的穩(wěn)健性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。對(duì)處于操作和未操作形式下的組合物的性質(zhì)的進(jìn)一步研究已經(jīng)揭示，在一個(gè)實(shí)施方案中，關(guān)鍵差異是與基材結(jié)合的金屬低聚物的比例。具體而言，如本文實(shí)例中所述，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)PCT/AU2005/00966 (公開為WO 2006/002472)的方法所制備的組合物和基材傾向于具有較低含量的低聚金屬絡(luò)合物(約70%或更小)和較高含量的單體金屬絡(luò)合物(直至約30%)。相反，本文中披露的組合物和基材具有大于70%和高于90%的低聚金屬絡(luò)合物含量及低至10%或更小的單體金屬絡(luò)合物含量。采用本文所述的多種實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明人已經(jīng)顯示，關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)即修飾的靶分子結(jié)合作用和活化基材(即，通過這種方法過程適配用于結(jié)合靶的基材)的改進(jìn)的增加的穩(wěn)健性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可能源自較高含量的低聚金屬絡(luò)合物。這是在做出本發(fā)明時(shí)未預(yù)料到的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種使合成基材適配用于在其上固定祀分子的方法。這種方法包括以下步驟-提供一種合成基材；-提供金屬離子用于與這種基材結(jié)合，其中所述金屬離子不與一種靶分子絡(luò)合；-使這些金屬離子與這種基材在靶分子不存在的情況下接觸，從而形成其中基材與金屬離子的配位位點(diǎn)結(jié)合的一種配位絡(luò)合物；
-在這種基材存在的情況下從這些金屬離子中形成低聚金屬絡(luò)合物，從而基本上全部的與這種基材配位絡(luò)合的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式； 因而適配這種基材用于在其上固定靶分子。這個(gè)實(shí)施方案總體上涉及在基材表面上形成金屬絡(luò)合物的涂層或?qū)?，這個(gè)涂層或?qū)拥奶卣髟谟冢@個(gè)涂層或?qū)又械幕旧先拷饘俳j(luò)合物以低聚絡(luò)合物形式提供。如本文中進(jìn)一步討論，這個(gè)過程的產(chǎn)物可以稱作“活化的基材”，其意義在于，使低聚金屬絡(luò)合物在其上布置的基材隨后能夠與靶分子結(jié)合用于使靶分子在其上固定。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，總體上可以通過提供形成給電子基團(tuán)用于橋接或連接或結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)金屬離子的條件，形成低聚金屬絡(luò)合物。這可以通過向組合物提供約3. 3至11、優(yōu)選地約4至10、優(yōu)選地約4至8或4、5、6或7的pH做到，其中所述組合物因而金屬絡(luò)合物與基材接觸而形成。在PCT/AU2005/00966 (公開為WO 2006/002472)中，pH條件總體上低于3，并且通過在鹽水溶液中進(jìn)行反應(yīng)避免任何調(diào)節(jié)?！?br> 可以將上述實(shí)施方案的方法工藝步驟作為一個(gè)單步驟實(shí)施。重要地，應(yīng)當(dāng)理解，一旦金屬離子和基材已經(jīng)彼此接觸并且已經(jīng)將相關(guān)組合物的PH調(diào)節(jié)至上述范圍，則與基材和金屬離子形成配位絡(luò)合物并且金屬離子的低聚化總體上同時(shí)出現(xiàn)。盡管不想受假設(shè)約束，但是認(rèn)為在上述實(shí)施方案中，所實(shí)現(xiàn)的相對(duì)較高的pH范圍例如在基材上并且還在隨金屬離子一起存在的(在下文進(jìn)一步描述的)橋接配體中形成給電子基團(tuán)，從而輔助低聚化和基材和低聚金屬絡(luò)合物之間配位絡(luò)合物的形成?？梢栽诎蟹肿硬淮嬖诘那闆r下實(shí)施以下步驟在基材存在的情況下從金屬離子中形成低聚金屬絡(luò)合物，從而基本上全部的與這種基材配位絡(luò)合的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式?？梢岳斫?，可以產(chǎn)生金屬離子以便與基材接觸之前形成低聚金屬絡(luò)合物。在這些環(huán)境下，形成一種組合物，其中將組合物中的基本上全部金屬離子以低聚金屬絡(luò)合物形式提供用于與基材接觸。因此在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種使合成基材適配用于在其上固定靶分子的方法。這種方法包括以下步驟-提供金屬離子用于與基材結(jié)合，其中所述金屬離子不與一種靶分子絡(luò)合；-在基材不存在的情況下從金屬離子中形成低聚金屬絡(luò)合物，從而基本上全部的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式；-使該低聚金屬絡(luò)合物與該基材在靶分子不存在的情況下接觸，從而形成其中該基材與低聚金屬絡(luò)合物的金屬離子的配位位點(diǎn)結(jié)合的一種配位絡(luò)合物；因而適配這種基材用于在其上固定靶分子?？梢栽诎蟹肿硬淮嬖诘那闆r下實(shí)施以下步驟在基材不存在的情況下從金屬離子中形成低聚金屬絡(luò)合物，從而基本上全部的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式。在這個(gè)實(shí)施方案中，低聚物優(yōu)選地因提供用于形成給電子基團(tuán)以便橋接或連接組合物中兩個(gè)或更多個(gè)金屬離子的條件而從單體金屬絡(luò)合物中形成。這可以通過向組合物提供約3. 3至約11、優(yōu)選地約4至10、優(yōu)選地約4至8或4、5、6或7的pH做到。如本文所述的，可以通過提供鹽或橋接配體提供相關(guān)的pH條件?！胞}”通常是由金屬原子或電正性原子團(tuán)替換酸的一個(gè)或多個(gè)氫原子所產(chǎn)生的化合物。在這種情境下，鹽的實(shí)例包括Na0H、K0H或NH4OH和其他堿性鹽?？傮w上，那些優(yōu)選的鹽是將升高金屬絡(luò)合物組合物的PH的那些鹽，并且特別提供反離子的那些鹽，所述鹽能夠在與基材的相關(guān)配位絡(luò)合物中充當(dāng)配位配體。轉(zhuǎn)向相關(guān)的橋接配體，這些橋接配體可以處于含有一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的化合物、通常有機(jī)化合物的形式，所述官能團(tuán)具有給電子潛能，尤其在上文所述的PH-范圍?？梢詫⑦@些配體描述為“堿性”或“酸性”配體。后者在上述pH范圍內(nèi)處于去質(zhì)子形式。本文中描述了堿性配體的實(shí)例并且優(yōu)選的配體包括含有胺或亞胺基團(tuán)的那些，尤其乙二胺。在上述實(shí)施方案中有用的金屬離子的實(shí)例如下文描述。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明在于形成和鑒定能夠?qū)崿F(xiàn)靶基材和靶分子之間預(yù)定和所需的結(jié)合相互作用的低聚金屬絡(luò)合物和/或它們的混合物。在這個(gè)方面，可以將低聚金屬絡(luò)合物視為一種形式的交聯(lián)劑，這種交聯(lián)劑促進(jìn)靶分子與靶基材結(jié)合。通過多組分結(jié)合，意圖在低聚金屬絡(luò)合物、所靶向的基材和靶分子彼此暴露的條件下實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的涉及這些種類的結(jié)合相互作用。結(jié)合相互作用也必須在實(shí)際應(yīng)用本發(fā)明的條件(如診斷測(cè)定法等)下是 穩(wěn)定的?？梢岳斫?，在實(shí)施本發(fā)明中有用的低聚金屬絡(luò)合物是一種低聚金屬絡(luò)合物，它能夠經(jīng)歷熱動(dòng)力穩(wěn)定的配體替換，從而與基材并且與靶分子在這些種類彼此暴露的條件(如pH、溫度、離子強(qiáng)度等)下和在與其中使用本發(fā)明方法的實(shí)際應(yīng)用(例如，測(cè)定法)相關(guān)的條件下形成穩(wěn)定的結(jié)合相互作用(即配位鍵)。這借助低聚絡(luò)合物內(nèi)部的多重金屬螯合作用實(shí)現(xiàn)，所述多重金屬螯合作用組合在一起維持所希望的穩(wěn)定性。在這個(gè)方面，基材-金屬、金屬-靶分子和靶基材-金屬-靶分子結(jié)合相互作用因足夠數(shù)目的金屬結(jié)合相互作用而是熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的，從而所希望的相互作用比這種金屬根據(jù)主要實(shí)用條件否則可能經(jīng)歷的其他可能的(配位配體)結(jié)合相互作用占優(yōu)，其中這種(些)結(jié)合相互作用在所述主要實(shí)用條件下發(fā)生。例如，這意味金屬和靶基材之間相互作用的性質(zhì)是這樣的，從而借助低聚金屬絡(luò)合物和/或它們的混合物與靶基材-金屬絡(luò)合物結(jié)合后，靶分子不從靶基材-金屬絡(luò)合物解離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明中有用的低聚絡(luò)合物是一種低聚絡(luò)合物，它與靶分子形成足夠強(qiáng)的相互作用，但是可以隨后從基材上的低聚絡(luò)合物中脫離。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，低聚金屬絡(luò)合物包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)合配體，這些結(jié)合配體被選擇為測(cè)定最終低聚金屬絡(luò)合物的總體分子量分布和尺寸范圍，并且因而改變金屬絡(luò)合物對(duì)基材和/或靶分子的總體結(jié)合特征。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，低聚金屬絡(luò)合物和祀基材在暴露于祀分子之前彼此結(jié)合。在這個(gè)實(shí)施方案中，靶分子的添加可以在形成低聚物金屬-基材絡(luò)合物之后立即進(jìn)行，或作為替代方案在低聚物金屬-基材絡(luò)合物貯存一段時(shí)間時(shí)進(jìn)行。這里，本發(fā)明的方法包括形成一種低聚物金屬-基材絡(luò)合物，它是可貯存的并且一旦使預(yù)定的金屬-靶基材絡(luò)合物暴露于含有靶分子的分析物時(shí)有效結(jié)合靶分子。選擇合適的低聚金屬絡(luò)合物以形成金屬-靶基材絡(luò)合物將取決于多種因素。據(jù)信金屬-靶基材絡(luò)合物借以與靶分子，更準(zhǔn)確的說(shuō)靶分子區(qū)域結(jié)合的機(jī)制涉及靶分子替換與低聚金屬絡(luò)合物締合的一個(gè)或多個(gè)配體。為了這種情況發(fā)生，與一個(gè)或多個(gè)現(xiàn)存的配位配體相比時(shí)，靶分子必須能夠與金屬-靶基材絡(luò)合物的金屬離子形成優(yōu)選締合，其中所述的現(xiàn)存配位配體與靶分子相互作用之前已經(jīng)與金屬絡(luò)合物締合。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，可以相對(duì)于長(zhǎng)期貯存和靶分子操縱金屬離子的結(jié)合特征，以便實(shí)現(xiàn)所希望的結(jié)合相互作用。
可以使用的金屬離子的實(shí)例包括過渡金屬如鈧、鈦、釩、鉻、釕、鉬、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鑰和鋅的離子。優(yōu)選鉻、釕、鐵、鈷、鋁和銠。本發(fā)明金屬的效能可以取決于金屬的氧化狀態(tài)而改變。例如，鉻(III)可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案中?？梢栽诘途劢饘俳j(luò)合物中包括一個(gè)或多個(gè)結(jié)合配體以測(cè)定最終低聚金屬絡(luò)合物的總體分子量分布和尺寸范圍。含有給電子種類的配體可以用來(lái)形成低聚金屬絡(luò)合物。簡(jiǎn)單離子如or或MT至更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)物可以用作橋接配體?？梢允褂脡A性和酸性配體。含有一個(gè)或多個(gè)孤對(duì)電子的配體可以是胺、亞胺、羰基、醚、酯、肟、醇、硫醚，連同其他。堿性配體的其他實(shí)例包括吡啶、咪唑、苯并咪唑、組氨酸或吡啶、最優(yōu)選地是乙二胺?？梢栽趤G失質(zhì)子時(shí)與金屬絡(luò)合物配位的酸性配體可以是羧酸、磺酸、磷酸、烯醇基、酚基、硫烯醇或硫代苯酚基，連同其他。酸性配體的其他實(shí)例包括亞氨基二酸、次氨基三乙酸、草酸或水楊酸。也可以使用橋接配體的組合。例如，胺配體可以選自包括但不限于氨、乙胺、乙二胺、二亞乙基三胺、雙氨基丙二胺等的組。在這個(gè)類別中，0H—或NH2-均可以充當(dāng)橋接配體?？梢酝ㄟ^添加其他橋接配體(如含有羧酸以形成更多絡(luò)合物結(jié)構(gòu)的那些)進(jìn)一步操作這類低聚金屬絡(luò)合物。能夠跨越2個(gè)或更多個(gè)金屬離子橋接的任何配體可以用來(lái)形成低聚金屬 絡(luò)合物，并且作為結(jié)果，低聚金屬絡(luò)合物結(jié)合靶基材和/或靶分子的結(jié)合作用進(jìn)一步受到影響。低聚金屬絡(luò)合物可以通過已經(jīng)在靶基材上存在的單齒、兩齒或多齒配體與靶基材結(jié)合。任何給電子基團(tuán)可以與低聚金屬絡(luò)合物結(jié)合。可以使用堿性或酸性配體。含有一個(gè)或多個(gè)孤對(duì)電子的配體可以是胺、亞胺、羰基、醚、酯、肟、醇、硫醚，連同其他?？梢栽趤G失質(zhì)子時(shí)與金屬絡(luò)合物配位的酸性配體可以是羧酸、磺酸、磷酸、烯醇基和酚基，連同其他。盡管已知一些這類配體不與單體金屬絡(luò)合物形成強(qiáng)結(jié)合相互作用，但是可以通過低聚金屬絡(luò)合物內(nèi)部的多重相互作用實(shí)現(xiàn)強(qiáng)結(jié)合穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以選擇用于本發(fā)明方法中低聚物的金屬離子濃度，從而相關(guān)方法的產(chǎn)物是非聚集的基材，例如其中基材處于珠形式的情況下，為非聚集的珠。低聚金屬絡(luò)合物中包括的反離子可以選自但不限于氯化物、乙酸鹽、溴化物、磷酸鹽、硝酸鹽、高氯酸鹽、明礬和硫酸鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與基材結(jié)合的單體金屬離子絡(luò)合物可以(通過對(duì)其合適的暴露)低聚化以形成(低聚金屬離子絡(luò)合物基材)_ (靶基材)綴合物。隨后通過使這種綴合物暴露于靶分子而交聯(lián)這種基材，綴合物的金屬離子部分因與基材結(jié)合時(shí)替換(仍)與金屬離子締合的一個(gè)或多個(gè)配位配體而經(jīng)歷與靶分子的結(jié)合相互作用。用于如上文所述的金屬絡(luò)合物的相似選擇標(biāo)準(zhǔn)將適用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，低聚金屬離子絡(luò)合物(通過對(duì)其合適的暴露)與靶分子結(jié)合以形成(金屬離子)_ (靶分子)綴合物。隨后通過使這種綴合物暴露于基材而交聯(lián)這種靶分子，綴合物的金屬離子絡(luò)合物部分因與靶分子結(jié)合時(shí)替換(仍)與金屬離子絡(luò)合物締合的一個(gè)或多個(gè)配位配體而經(jīng)歷與靶基材的結(jié)合相互作用。用于如上文所述的低聚金屬絡(luò)合物的相似選擇標(biāo)準(zhǔn)將適用。對(duì)于這些情況，反應(yīng)混合物也可以含有緩沖劑和或防腐劑，典型地來(lái)自分析物，以穩(wěn)定靶分子。為了本發(fā)明如預(yù)期那樣發(fā)揮作用，重要的是，任何緩沖劑或防腐劑或來(lái)自緩沖劑或防腐劑的配體/離子不論發(fā)生的結(jié)合事件的任何順序不利地干擾靶分子與基材結(jié)合所必需的結(jié)合相互作用。對(duì)于任何給定的系統(tǒng)，可能需要操縱配體化學(xué)以便確保所希望的相互作用比否則將折衷所需的結(jié)合相互作用的相互作用占優(yōu)。無(wú)論使用的確切方法是什么，重要的是，基材和靶分子能夠借助低聚金屬絡(luò)合物彼此相互作用以便實(shí)現(xiàn)所希望的結(jié)合效果。在這個(gè)方面，低聚金屬絡(luò)合物作為分子一種“膠水”發(fā)揮作用?；诎谢暮桶蟹肿釉诘途劢饘俳j(luò)合物存在下彼此暴露的主要條件，基材和靶分子借助低聚金屬絡(luò)合物的優(yōu)選結(jié)合將大體上由熱動(dòng)力學(xué)條件(thermodynamicconsideration)決定。在測(cè)定法的情況下,這將顯然取決于該測(cè)定法進(jìn)行的條件并取決于含有靶分子的分析物的特征。 在慣例中，可以借助一種發(fā)現(xiàn)過程，使用不同種類組合的文庫(kù)(library)鑒定在本發(fā)明中待使用的合適低聚金屬絡(luò)合物，包括數(shù)目和類型。根據(jù)這個(gè)過程，基于所用的低聚物金屬化合物、基材、靶分子和主要條件，在多種不同的排列范圍內(nèi)評(píng)估特定金屬化合物形成低聚金屬絡(luò)合物的能力、不同低聚物群體形成的條件和低聚金屬絡(luò)合物使特定基材與特定靶分子結(jié)合的能力?？梢栽u(píng)估基材借助低聚金屬絡(luò)合物通過相互作用對(duì)靶分子的親和力，以便鑒定產(chǎn)生可取結(jié)果的變量的組合。通過以這種方式繼續(xù)進(jìn)行，實(shí)際上可能根據(jù)觀察到的針對(duì)給定靶分子的結(jié)合功效，評(píng)定變量的組合。這種發(fā)現(xiàn)過程提供了巨大的手段靈活性。例如，可能希望的是基于特定靶分子產(chǎn)生一種可操作的結(jié)合系統(tǒng)。在此，在發(fā)現(xiàn)過程中，在操作其他可能變體的同時(shí)，靶分子自始至終維持恒定，以便鑒定對(duì)這種靶分子和標(biāo)記物特異的潛在有用組合。可以理解這種手段具有廣泛潛力和范圍，而不脫離構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的總體構(gòu)思，即，使用低聚金屬絡(luò)合物實(shí)現(xiàn)基材與靶分子結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子是一種過渡金屬。實(shí)例包括錯(cuò)、鉬、鈧、招、鈦、銀、鉻、釕、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鑰或鋅。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些金屬化合物產(chǎn)生在所述發(fā)現(xiàn)過程中總體上用作先導(dǎo)物的絡(luò)合物(在水溶液中)。多種金屬如Fe (III)、Co (III)、Al (III)、Cr(III)和Ru(IV)可以在由金屬中心之間μ-羥橋和μ-氧橋所形成的更小低聚物種類的分布下存在，以便產(chǎn)生二聚體、三聚體、四聚體和更高級(jí)別低聚物，但是低聚金屬不只限于這些金屬離子，低聚物形成也不只限于μ-羥橋和μ-氧橋。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鉻低聚物特別適于實(shí)施本發(fā)明。在另一個(gè)實(shí)施方案，可以通過添加其他螯合配體如氨、乙胺、乙二胺等和/或乙酸、琥珀酸等形成其他低聚物種類，并且低聚物形成的實(shí)際條件改變多種形式的群體分布。低聚絡(luò)合物的可能多樣性大大地?cái)U(kuò)展，并且借助多重結(jié)合相互作用，具有低給電子潛力的基材和靶分子現(xiàn)在能夠形成用于實(shí)際應(yīng)用本發(fā)明的穩(wěn)定相互作用。形成和使用多樣金屬低聚物群體的能力未曾用來(lái)改善需要靶分子與靶基材結(jié)合的應(yīng)用的性能。因此，不存在這樣的應(yīng)用，其中篩選不同的低聚金屬絡(luò)合物群體以便檢驗(yàn)一旦與用于色譜、固相測(cè)定法、診斷成像、治療藥物遞送和其他目的應(yīng)用中的一些基材結(jié)合時(shí)靶分子的性能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過添加不同濃度的堿和/或潛在螯合配體，使用不同的鉻低聚物群體在免疫測(cè)定法中產(chǎn)生不同的結(jié)果。這個(gè)觀察結(jié)果基于使用特定靶分子的實(shí)驗(yàn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，配體在形成低聚金屬絡(luò)合物時(shí)的性質(zhì)有助于確定金屬絡(luò)合物的組成，并且也可以控制靶分子替換的“可用性”，以便按要求操縱結(jié)合作用。例如，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶分子的給定官能團(tuán)或區(qū)域?qū)μ囟ń饘俳j(luò)合物或金屬-標(biāo)記絡(luò)合物顯示特殊的結(jié)合親和力時(shí)，可以通過在絡(luò)合物中包含與靶分子的相互作用發(fā)生時(shí)更容易替換的一個(gè)或多個(gè)配體而增強(qiáng)(或減弱)這種結(jié)合親和力。以這種方式或類似方式，有可能通過變動(dòng)存在于用來(lái)結(jié)合靶分子的絡(luò)合物中的配位配體的類型，向給定靶分子的一些官能團(tuán)或區(qū)域提供選擇性。本發(fā)明還提供了一種用于在基材上固定靶分子的組合物，所述組合物包含-具有能夠與基材結(jié)合的配位位點(diǎn)的金屬離子，其中基本上全部的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)樣品中分析物的合成基材，所述合成基材包含-具有與基材和靶分子結(jié)合的配位位點(diǎn)的金屬離子，其中以低聚金屬絡(luò)合物的形 式提供基本上全部的金屬離子。本發(fā)明還提供了一種用于樣品是否含有分析物的合成方法，所述方法包括-提供一種如上文所述并且使靶分子固定在其上的基材；-使基材與其中待確定存在或不存在分析物的樣品在靶分子結(jié)合分析物條件下接觸；-確定靶分子是否已經(jīng)結(jié)合分析物；從而確定樣品是否含有分析物。本發(fā)明還提供了一種用于在基材上固定靶分子的試劑盒，所述試劑盒包含-具有能夠與基材結(jié)合的配位位點(diǎn)的金屬離子，其中基本上全部的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式。應(yīng)當(dāng)理解，本說(shuō)明書中披露和限定的本發(fā)明擴(kuò)展至所提到或從文本或附圖中明顯的兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)特征的全部替代性組合。這些不同組合的全體構(gòu)成本發(fā)明的多個(gè)替代性方面。實(shí)例在以下非限制性實(shí)例中顯示本發(fā)明的實(shí)施方案。實(shí)例I :基材與單體鉻絡(luò)合物或與低聚鉻絡(luò)合物的結(jié)合。將使用單體鉻離子使靶分子結(jié)合到珠基材上與含有0%單體形式的低聚鉻絡(luò)合物的一個(gè)實(shí)例比較。a.鉻單體溶液簡(jiǎn)言之，將六水合高氯酸鉻(2. 3g)溶解于50mL純水中并且徹底混合直至全部固體溶解。使用Beckman Coulter ProteomeLab PA800毛細(xì)管電泳(CE)儀和其推薦的操作方案，發(fā)現(xiàn)這種溶液具有大約99%單體，pH為2. I。鉻低聚物溶液高氯酸鉻與雙(3-氨基丙基)二乙胺。簡(jiǎn)言之，將六水合高氯酸鉻(2. 3g)溶解于25mL純水中并且徹底混合直至全部固體溶解。類似地，將545 μ I雙(3-氨基丙基)二乙胺溶液添加至25mL純水。將這些溶液合并并且在室溫?cái)嚢?日。將已知濃度的新鮮制備的六水合高氯酸鉻水溶液在CE上運(yùn)行，以便獲得單體鉻種類的計(jì)算峰面積以產(chǎn)生>0. 9999的線性相關(guān)。使用這條標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過CE分析法對(duì)高氯酸鉻/雙(3-氨基丙基)二乙胺絡(luò)合物的分析沒有顯示可檢測(cè)的單體種類。溶液具有pH4. 3。
b.添加鉻溶液至磁珠(Bangs)。ProMag羧基封端的磁珠(目錄號(hào)PMC3N/9080)從Bangs, IN, USA供應(yīng)。為制備這些珠子，允許它們達(dá)到室溫并且將這些珠子渦旋混合30秒，隨后超聲處理另外60秒。將2X50 μ L珠濃縮物分配至2 X I. 7mL微管中。將這些管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加每管50 μ L相應(yīng)的鉻溶液。在室溫留置I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。c.山羊抗小鼠多克隆抗體與鉻連接珠表面的偶聯(lián)從轉(zhuǎn)子中取出鉻活化的Bangs ProMag珠并且將懸液渦旋混合30秒。將這些管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向每管添加50 μ I的50mM MES緩沖液(pH 5.2)。重復(fù)渦旋混合，移出上清液并且另外添加兩(2)次MES。在移出上清液后，
將50mM MES中的50μ1 I. Omg/ml山羊抗小鼠Fe特異性多克隆抗體(Lampire Biological,目錄號(hào)7455527，USA)添加至珠粒。將珠溶液渦旋混合30秒。將管在室溫孵育I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。在渦旋混合懸液30秒后，將多個(gè)管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加50yL150mM鹽水，同時(shí)向管添加O. 025%Proclin 300溶液。渦旋混合并且在鹽水溶液中反復(fù)洗滌另外2次。d.進(jìn)行抗體載量測(cè)定。根據(jù)以下方法進(jìn)行磁珠上的抗體載量測(cè)定。簡(jiǎn)言之，材料和方法如下所述。測(cè)定法組分抗體偶聯(lián)的珠。檢測(cè)抗體小鼠-IgG-FITC(2mgs/ml,Jackson, USA)洗滌緩沖液10mMPBS, pH 7. 4，含有 O. 05%Tween 20分析緩沖液10mMPBS, pH 7. 4，含有 1%BSA, 0. 05%Tween 20微板96孔 Millipore 0. 42um 濾板(Millipore, USA)測(cè)定操作方案在45 μ I分析緩沖液中稀釋2. 5 μ I每種珠樣品。在渦旋混合至少30秒后，取出40 μ I懸液并且在760 μ I分析緩沖液中再次稀釋。在分析緩沖液中稀釋小鼠IgG-FITC檢測(cè)抗體至工作濃度 ο μ g/ml。在渦旋混合稀釋的珠懸液至少30秒后，向孔添加100 μ I抗體包被的珠。使用真空過濾設(shè)備從孔中移除珠溶液。在添加50 μ I檢測(cè)抗體至適宜的孔后，在室溫在平板搖床上于黑暗下孵育60分鐘。使用真空過濾設(shè)備從孔中移除檢測(cè)抗體溶液。添加200 μ I洗滌緩沖液至平板的每個(gè)孔并且將平板置于平板搖床上30秒。從孔中移除200 μ I上清液。添加200 μ I洗滌緩沖液至每個(gè)孔，在FACS Canto II (BD Biosciences，USA)上對(duì)珠讀數(shù)。e.結(jié)果實(shí)例。比較使用單體鉻離子對(duì)低聚物鉻離子與磁珠結(jié)合的山羊抗小鼠抗體，顯示十分不同的結(jié)合小鼠抗體的容量。在相同的條件下，低聚制品產(chǎn)生五(5)倍的小鼠抗體結(jié)合(見圖2)。胺添加物可以通過二種可能的作用模式啟動(dòng)低聚化。具體而言，雙(3-氨基丙基)二乙胺絡(luò)合物中存在可以允許金屬離子之間潛在橋接的4個(gè)氨基。另外，pH 4. 3可以允許金屬離子之間形成水解性連接。
實(shí)例2 比較不同的純化鉻低聚物。a.鉻二聚體和三聚體的分級(jí)
根據(jù)Spiccia, L.，Marty, W.和 Giovanol i, R. Hydrolytic TrimerofChromium(IIl). Synthesis through Chromite Cleavage and Use in thePreparationof the" Active" Trimer Hydroxide(水解性鉻(III)三聚體.借助亞鉻酸鹽切割的合成和在制備“活性”三聚體氫氧化物中的用途)，Inorganic Chemistry, 1988，27，2660-2666，以及 Stunzi, H.和 Marty, W. Early Stages of the Hydrolysis of Chromium(IIl) inAqueous Solution I. Characterization of a Tetrameric Species (7_K溶液中絡(luò)(IIl)7jC解的早期階段· I.四聚種類的表征)，Inorganic Chemistry, 1983, 22, 2145-2150中描述的方法分離鉻二聚體、三聚體和其他低聚物。簡(jiǎn)言之，將Cr3+(5mL，0. 5M)在酸(大約O. 66M HClO4)中的溶液轉(zhuǎn)移至容量瓶(50mL)中并且添加Na0H(10mL，2M)，同時(shí)劇烈和連續(xù)地?cái)嚢?。通過添加HClO4 (35mL，2M)立即酸化所產(chǎn)生的綠色溶液。將這種溶液在25° C留置24小時(shí)。隨后取出一個(gè)等分試樣(3mL)，用水稀釋90mL，并且添加IOmL O. 7M HC104。使所得到的溶液吸附到SPS印hadex陽(yáng)離子交換柱(lX5cm)上。通過添加ImL O. 5M NaC10+0. OlM HClO啟動(dòng)洗脫。當(dāng)洗脫液中上清液的水平降至2mm時(shí)，添加另外ImL這種O. 5M NaClO4,隨后添加ImL IM NaC104+0. OlMHClO4，并且再次添加這種最終溶液的另外6mL部分。此時(shí)，藍(lán)-紫色單體帶已經(jīng)明顯向下移動(dòng)，并且藍(lán)-綠二聚體已經(jīng)在樹脂頂部與綠色聚合物分開。洗脫用ImL并且隨后用6mL 2MNaC104+0 . 02M HClO4 繼續(xù)，并且隨后用 ImL 4M NaC104+0 . 04M HClO4 繼續(xù)。同時(shí)，單體和二聚體已經(jīng)徹底洗脫并且三聚體的綠色帶已經(jīng)抵達(dá)柱底部。用這種4M NaClO4溶液進(jìn)一步洗脫產(chǎn)生了這種三聚體。通過UV/Vis分析需來(lái)自柱的溶液并且發(fā)現(xiàn)它含有不同但是濃度相似的不同UV/Vis活性種類(見表I)。b.添加鉻單聚體、二聚體和三聚體至Iuminex珠。為制備這些珠子，允許它們達(dá)到室溫并且將這些珠子渦旋混合20秒，隨后超聲處理另外20秒。必須將這些珠懸浮為單分散的單個(gè)粒子。如果觀察到任何聚集珠，則重復(fù)渦旋混合和超聲波處理直至觀察不到聚集物。將100 μ I珠濃縮物分配至I. 7mL微管中。將珠溶液以14，000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，此后，取出管并且溫和彈擊它，以便使管側(cè)壁上的珠脫落，隨后離心另外5分鐘。將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加從柱中洗脫的100 μ I鉻低聚物溶液。在添加后，超聲波處理和渦旋混合，使懸液靜置60分鐘，偶爾混合。在這段時(shí)間后，將珠子在去離子水中洗滌3次。c. TSH捕獲抗體與鉻連接珠表面的偶聯(lián)使用在50mM乙酸鹽緩沖液(ρΗ5.0)中濃度100 μ g/mL的TSH捕獲抗體(OEMConc印ts抗體，克隆#057-11003)。向旋轉(zhuǎn)向下成塞狀物(plug)的無(wú)上清液的250μ1鉻包被珠添加250 μ I抗體溶液。將溶液渦旋混合并超聲處理，并且靜置I小時(shí)，伴以偶爾渦旋混合。將溶液用150mM鹽水洗滌一次。在進(jìn)行測(cè)定法之前，抗體偶聯(lián)的珠在4° C貯存于含有0. 05%疊氮化物的鹽水中。d.通過酰胺偶聯(lián)法(對(duì)照)偶聯(lián)TSH捕獲抗體使用推薦的Luminex方法，將抗TSH單克隆抗體(OEM Concepts抗體，克隆#057-11003)與Luminex xMAP微球體偶聯(lián)。允許這些珠子達(dá)到室溫，渦旋混合20秒，隨后超聲處理另外20秒。必須將這些珠懸浮為單分散的單個(gè)粒子。如果觀察到任何聚集珠，則重復(fù)渦旋混合和超聲波處理直至觀察不到聚集物。將100 μ I珠濃縮物分配至I. 7mL微管中。將珠溶液以14，000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，此后，取出管并且溫和彈擊它，以便使管側(cè)壁上的珠脫落，隨后離心另外5分鐘。將上清液從珠粒小心地移出并棄去。用pH 6. 3的O. IM磷酸鈉緩沖液重復(fù)洗滌過程。對(duì)于已經(jīng)如所述那樣旋轉(zhuǎn)向下的每100 μ I珠濃縮物(I. 25χ106個(gè)珠)，添加50 μ I的I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(S-NHS)在O. IM磷酸鈉緩沖液(pH 6. 3)中的50mg/ml溶液，并且在室溫于黑暗下靜置20分鐘，伴以偶爾渦旋混合。珠隨后用200 μ I O. 05Μ 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液，pH 5. O洗滌兩次。
·
用超聲波處理和渦旋混合在200 μ I MES緩沖液中重懸珠子后，添加75 μ L抗體(MES緩沖液中200μ g/mL)并且留在柔和搖床上在室溫孵育2小時(shí)。這些珠隨后用含有O. 05%Tween的2 X 200 μ L IOmM PBS洗滌。最后，將珠子貯存于含有1%BSA和O. 05%疊氮化物(pH 7. 4)的 100 μ IlOmM PBS 中。e.進(jìn)行抗體載量測(cè)定根據(jù)Luminex方法進(jìn)行多微珠(multiplexed bead)上的TSH測(cè)定。簡(jiǎn)言之,材料和方法如下所述。測(cè)定法組分抗體偶聯(lián)的珠添加10 μ I濃縮物至590 μ I分析緩沖液檢測(cè)抗體使用EZ-連接-Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce)，使抗TSH檢測(cè)單克隆抗體(Medix Biochemica抗體，克隆#5403)生物素?；９ぷ魅芤菏窃诤?%BSA的IOmMPBS 中 20 μ g/mL在含有1%BSA的IOmM PBS中制備TSH標(biāo)準(zhǔn)物鏈霉親和素-R-藻紅蛋白在含有1%BSA的IOmM PBS中20 μ g/mL洗滌緩沖液含有1%BSA的IOmM PBS分析緩沖液含有4%BSA的IOmM PBS測(cè)定操作方案通過將100 μ I洗滌緩沖液置入每個(gè)孔并且施加足以溫和清空孔的真空，使濾板預(yù)濕潤(rùn)。添加20 μ I TSH標(biāo)準(zhǔn)物至適宜的微量滴定孔。添加分析緩沖液至零(0uIU/ml)孔。添加10 μ I稀釋的珠混合物至適宜的微量滴定孔。在室溫于黑暗下以500轉(zhuǎn)/分鐘搖動(dòng)濾板I小時(shí)，隨后添加20 μ I抗TSH檢測(cè)抗體溶液至適宜的微量滴定孔。在室溫于黑暗下以500轉(zhuǎn)/分鐘搖動(dòng)濾板30分鐘，隨后添加20 μ I稀釋的鏈霉親和素-R-藻紅蛋白溶液至適宜的微量滴定孔。在室溫于黑暗下以500轉(zhuǎn)/分鐘搖動(dòng)濾板15分鐘。通過施加足以溫和清空孔的真空從孔中移除溶液。添加100 μ L洗滌緩沖液至每個(gè)孔并且施加足以溫和清空孔的真空。重復(fù)洗滌過程，隨后添加100 μ I洗滌緩沖液至每個(gè)孔并且搖動(dòng)60秒。將平板載入Luminex ΧΥΡ 平臺(tái)并讀數(shù)。f.結(jié)果實(shí)例。如表2中所示，當(dāng)使用不同的鉻種類以便使抗TSH抗體與Luminex珠結(jié)合時(shí)，TSH測(cè)定的結(jié)果明顯不同。采用單體鉻離子時(shí)的不良信號(hào)表明抗體結(jié)合不良或表明這些低聚物種類與抗體上的不同位點(diǎn)結(jié)合，從而改變其對(duì)TSH抗原的結(jié)合容量。實(shí)例3 :增加低聚物形成胺和氫氧化物結(jié)合配體的組合。a.形成不同的鉻溶液。鉻低聚物溶液(含有30%單體)。簡(jiǎn)言之，將六水合高氯酸鉻(2. 3g)溶解于25mL純水中并且徹底混合直至全部固體溶解。類似地，將190 μ I乙二胺溶液添加至25mL純水。將這些溶液合并并且在室溫?cái)嚢柽^夜。通過CE，這種溶液含有大約30%單體并且pH穩(wěn)定在大約pH 3.0。通過用去離子水稀釋制備IOOmM溶液和IOmM溶液兩者。鉻低聚物溶液(含有10%單體)。向上述溶液(20ml)，逐滴添加I. 5M氫氧化鈉溶液，從而它不超過pH 5并且在12小時(shí)后穩(wěn)定在pH 4。通過CE，這種pH調(diào)節(jié)過的溶液含有 小于10%單體。通過用去離子水稀釋制備IOOmM溶液和IOmM溶液。b.添加鉻溶液至磁珠(Ademtech)Ademtech羧基封端的磁珠(目錄號(hào)0215)從Ademtech, Fra.供應(yīng)。為制備這些珠子，允許它們達(dá)到室溫并且將這些珠子渦旋混合30秒以重懸珠子。取出200 μ I母懸液(IOmg微球體)至I. 5-ml微管。將管置于磁分離器上至少60秒，并且小心不要擾動(dòng)微球體小粒，移除并棄去Ademtech MasterBeads溶液。從磁分離器中取下管并且在I. Oml去離子水中重懸微球體。通過渦旋混合30秒重懸微球體，并且在單獨(dú)的管中將其分成4Χ250μ I。將這些管置于磁分離器上至少60秒以便允許微球體與洗滌溶液徹底分離。小心不要擾動(dòng)微球體小粒，移除并棄去洗滌溶液。在4Χ 250 μ I多種鉻溶液中重懸微球體。通過潤(rùn)旋混合30秒重懸微球體。在使微球體保持懸浮的管轉(zhuǎn)動(dòng)器中使用翻滾轉(zhuǎn)動(dòng)，在室溫孵育鉻低聚物溶液中的微球體60分鐘。珠子可以在相同的溶液中貯存在4° C。在3至6圖中顯示通過不同低聚物溶液處理的珠的顯微鏡圖片。c.山羊抗小鼠多克隆抗體與鉻連接珠表面的偶聯(lián)從轉(zhuǎn)子中取出鉻活化的Ademtech珠并且將懸液渦旋混合30秒。將這些管置于磁分離器上至少60秒以便允許鉻活化的Ademtech珠與溶液徹底分離。小心不要擾動(dòng)微球體小粒，移除并棄去溶液。從磁分離器中取下管并且在含有O. 01%Tween 20的250 μ I去離子水中重懸微球體30秒。將管置于磁分離器上至少60秒以便允許珠與溶液徹底分離。從磁分離器中取下管。再一次重復(fù)洗滌過程。在含有O. 01%Tween 20的去離子水中制備lmg/ml的I. OmL GAM抗體溶液。添加(含有250 μ g GAM抗體的)250 μ I GAM抗體溶液至鉻活化多種Ademtech珠粒。通過渦旋混合20秒重懸微球體。在管轉(zhuǎn)動(dòng)器上使用翻滾轉(zhuǎn)動(dòng)，在室溫孵育微球體60分鐘。將含有微球體的這些管置于磁分離器上至少60秒以便允許微球體與GAM抗體溶液徹底分離。小心不要擾動(dòng)微球體顆粒，移除并棄去GAM抗體溶液。從磁分離器中取下管并且在含有O. 05%Tween20，O. 3%PF-127 和 O. 025%Proclin (貯存溶液)的 250 μ I 50mM TBS pH 8 中重懸微球體 30秒。渦旋混合30秒。將管置于磁分離器上至少60秒以便允許微球體與溶液徹底分離。小心不要擾動(dòng)微球體顆粒，移除并棄去溶液。從磁分離器中取下管。再一次重復(fù)洗滌過程。添加250 μ I貯存溶液至GAM抗體偶聯(lián)的微球體。通過渦旋混合30秒，重懸10mg/ml的GAM抗體偶聯(lián)的珠。在4° C貯存GAM抗體偶聯(lián)的Ademtech珠。
d.進(jìn)行抗體載量測(cè)定。根據(jù)以下方法進(jìn)行磁珠上的抗體載量測(cè)定。簡(jiǎn)言之，材料和方法如下所述。測(cè)定法組分抗體偶聯(lián)的珠檢測(cè)抗體小鼠抗兔IgG_HRP(0. 8mgs/ml, Jackson, USA)洗滌緩沖液10mMPBS, pH 7. 4，含有 0. 05%Tween 20分析緩沖液10mMPBS, pH 7. 4，含有 1%BSA, 0. 05%Tween 20 微板96孔聚丙烯白色平板-U形(BioSciencej Germany)Adem-Mag 96 平板磁體(Ademtech, France)PS-atto-基材(Lumigen, USA)測(cè)定操作方案在90 μ I分析緩沖液中稀釋10 μ I每種珠樣品。在渦旋混合至少30秒后，取出50 μ I懸液并且在950 μ I分析緩沖液中再次稀釋。在分析緩沖液中稀釋小鼠抗兔IgG-HRP檢測(cè)抗體至工作濃度I. 56ng/mL。在潤(rùn)旋混合稀釋的珠懸液至少30秒后，向孔添加50 μ I抗體包被的珠。將平板留在平板磁體上5分鐘后，從孔中移除珠溶液。在添加50 μ I檢測(cè)抗體至適宜的孔后，在室溫在平板搖床上于黑暗下孵育60分鐘。使用板磁體從孔中移除檢測(cè)抗體溶液。添加200 μ I洗滌緩沖液至平板的每個(gè)孔并且將平板置于平板搖床上30秒。從孔中移除200 μ I上清液。再一次重復(fù)這種洗滌。添加100 μ I PS-atto至每個(gè)孔。在FLUOstar 上使用 Luminescence 法(BMGLABTECH, Germany)對(duì)珠讀數(shù)。e.結(jié)果實(shí)例不同的低聚組合物給予基材不同的特征。IOmM和IOOmM高氯酸鉻/乙二胺絡(luò)合物在pH 3導(dǎo)致珠聚集，同時(shí)布朗運(yùn)動(dòng)消失(見圖3和圖4)。類似地，IOOmM高氯酸鉻/乙二胺絡(luò)合物在pH 4也導(dǎo)致珠聚集，同時(shí)布朗運(yùn)動(dòng)消失(見圖5)。然而，IOmM濃度在pH 4 (通過CE顯示含有大約10%單體的制品)沒有顯示可觀察的聚集并且維持與未修飾珠可比的完全布朗運(yùn)動(dòng)(見圖6)。在這些實(shí)例中，在山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體捕獲小鼠抗兔抗體-HRP的結(jié)合容量方面不存在差異(見圖7)，這表明調(diào)節(jié)pH至pH4并沒有不利地影響GAM偶聯(lián)反應(yīng)。實(shí)例4 :增加低聚物形成增加胺配體濃度。在保留一種特定鉻鹽和配體的同時(shí)，評(píng)估可能隨后影響靶分子與鉻低聚物-表面結(jié)合的不同配體濃度的影響。通過用另一種磁珠測(cè)試高氯酸鉻-乙二胺，例舉不同乙二胺濃度的影響?？贵w結(jié)合作用可以根據(jù)如載量測(cè)定法所測(cè)定的配體濃度變動(dòng)。a.高氯酸鉻-乙二胺溶液的制備。將六水合高氯酸鉻(3X I. 15g)溶解于3X25mL純水中并且徹底地?fù)u動(dòng)小瓶直至全部固體溶解。添加67 μ I、134 μ I和167. 5μ I乙二胺溶液至3種鉻溶液。在添加時(shí)將形成沉淀物。將所得到的溶液在平臺(tái)混合器上搖動(dòng)48小時(shí)。應(yīng)當(dāng)見不到沉淀物。應(yīng)當(dāng)通過將溶液離心并且保留上清液除去任何殘留的沉淀物。通過CE分析，命名為X、Y和Z的3種不同樣品分別含有在低聚絡(luò)合物中的30%、10%和0%單體組分。相關(guān)的pH點(diǎn)是2. 7,3. O和3. 3。b.添加鉻低聚物至磁珠。
BcMag羧基封端的磁珠(目錄號(hào)FB-101)從Bioclone，CA，USA供應(yīng)。為制備這些珠子，允許它們達(dá)到室溫并且將這些珠子渦旋混合30秒，隨后超聲處理另外60秒。必須將這些珠懸浮為單分散的單個(gè)粒子。如果觀察到任何聚集珠，則重復(fù)渦旋混合和超聲波處理直至觀察不到聚集物。將50 μ I珠濃縮物分配至I. 7mL微管中。將全部管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加50 μ I不同的鉻溶液(分別命名為X型、Y型和Z型)并且將管渦旋混合30秒，并且隨后將懸液靜置60分鐘，伴以偶爾混合。c.山羊抗小鼠多克隆抗體與鉻連接珠表面的偶聯(lián)從轉(zhuǎn)子中取出鉻活化的BcMag珠并且將懸液渦旋混合30秒。將12. 5 μ I每種類型的活化珠等分取樣至另一個(gè)管中。將管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加50 μ I 50mM MES緩沖液至該管。渦旋混合并且重復(fù)mES緩沖液洗滌另外2次。在移除上清液后，添加50 μ I 500 μ g/ml山羊抗小鼠Fe特異性多克隆抗體 (LampireBiological, USA)并且將懸液渦旋混合30秒，并且隨后將懸液靜置60分鐘，伴以偶爾混合。在渦旋混合懸液30秒后，將全部管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加50yL150mM鹽水，同時(shí)向管添加O. 025%Proclin 300溶液。渦旋混合并且在鹽水溶液中反復(fù)洗滌另外2次。d.小鼠單克隆抗體與鉻連接珠表面的偶聯(lián)從轉(zhuǎn)子中取出鉻活化的BcMag珠并且將懸液渦旋混合30秒。將12. 5 μ I每種類型的活化珠等分取樣至另一個(gè)管中。將管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加50 μ I 50mM MES緩沖液至該管。渦旋混合并且重復(fù)MES緩沖液洗滌另外2次。在移除上清液后，添加50 μ I 500 μ g/ml 3A1-小鼠單克隆抗體(Agen，Australia)并且將懸液渦旋混合30秒，并且隨后將懸液靜置60分鐘，伴以偶爾混合。在渦旋混合懸液30秒后，將全部管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加50 μ L150mM鹽水，同時(shí)向管添加O. 025%Proclin 300溶液。渦旋混合并且在鹽水溶液中反復(fù)洗滌另外2次。e.進(jìn)行抗體載量測(cè)定。根據(jù)以下方法進(jìn)行磁珠上的抗體載量測(cè)定。簡(jiǎn)言之，材料和方法如下所述。測(cè)定法組分抗體偶聯(lián)的珠檢測(cè)抗體山羊抗小鼠-IgG-R-藻紅蛋白(250μ g/ml, Sigma, USA)小鼠-IgG-FITC(2mgs/ml, Jackson, USA)洗滌緩沖液10mMPBS, pH 7. 4，含有 0. 05%Tween 20分析緩沖液10mMPBS, pH 7. 4，含有 1%BSA, 0. 05%Tween 20微板PP白色，U 形式(Greinerbio, USA)測(cè)定操作方案在60 μ I分析緩沖液中稀釋2. 5 μ I每種珠樣品。在渦旋混合至少60秒后，取出20 μ I懸液并且在480 μ I分析緩沖液中再次稀釋。在分析緩沖液中稀釋小鼠IgG-FITC檢測(cè)抗體至工作濃度20 μ g/ml。在分析緩沖液中稀釋山羊抗小鼠IgG-RPE檢測(cè)抗體至工作濃度 I μ g/mlο
在渦旋混合稀釋的珠懸液至少60秒后，向孔添加50 μ I抗體包被的珠。在添加50 μ I檢測(cè)抗體至適宜的孔后，在室溫于黑暗下孵育60分鐘。將珠平板置于磁平板上2分鐘，并且從孔中移除100 μ I上清液。添加100 μ I洗滌緩沖液至每個(gè)孔，并且將珠平板置于磁平板上2分鐘，并且從孔中移除100 μ I上清液。在添加100 μ I分析緩沖液后，在FACSCanto II (BDBiosciences, USA)上對(duì)珠讀數(shù)。f.結(jié)果實(shí)例如8圖中所示，山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體捕獲小鼠單克隆抗體-熒光素的結(jié)合容量隨用來(lái)使GAM抗體與基材結(jié)合的不同鉻低聚混合物(分別命名為X型、Y型和Z型)變化。
類似地在9圖中，小鼠單克隆抗體捕獲山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體-藻紅蛋白的結(jié)合容量隨用來(lái)使小鼠抗體與基材結(jié)合的不同鉻低聚混合物(分別命名為X型、Y型和Z型)變化。實(shí)例5 :增加低聚物形成不同的胺配體。a.形成不同的鉻低聚物。高氯酸鉻與乙二胺。簡(jiǎn)言之，將六水合高氯酸鉻(2. 3g)溶解于25mL純水中并且徹底混合直至全部固體溶解。類似地，將190 μ I乙二胺溶液添加至25mL純水。將這些溶液合并并且在室溫?cái)嚢柽^夜。通過CE，這種溶液含有30%單體高氯酸鉻以及雙(3-氨基丙基)二乙胺。pH是2. 3。簡(jiǎn)言之，將六水合高氯酸鉻(2. 3g)溶解于25mL純水中并且徹底混合直至全部固體溶解。類似地，將545 μ I雙(3-氨基丙基)二乙胺溶液添加至25mL純水。將這些溶液合并并且在室溫?cái)嚢?日。通過CE，這種特殊溶液不顯示與鉻單體對(duì)應(yīng)的峰。pH是4.8。b.添加鉻低聚物至磁珠(Bangs)。ProMag羧基封端的磁珠(目錄號(hào)PMC3N/9080)從Bangs, IN, USA供應(yīng)。為制備這些珠子，允許它們達(dá)到室溫并且將這些珠子渦旋混合30秒，隨后超聲處理另外60秒。將2 X 550 μ L珠濃縮物分配至2 X I. 7mL微管中。將這些管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加每管550 μ L相應(yīng)的鉻低聚物溶液。在室溫留置I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。c.山羊抗小鼠多克隆抗體與鉻連接珠表面的偶聯(lián)從轉(zhuǎn)子中取出鉻低聚物活化的Bangs ProMag珠并且將懸液渦旋混合30秒。將這些管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向每管添加550 μ I的50mM MES緩沖液(pH 5.2)。重復(fù)渦旋混合，移出上清液并且另外添加兩(2)次MES。在移出上清液后，將50mM MES中的550μ1 lmg/ml山羊抗小鼠Fe特異性多克隆抗體(LampireBiological,目錄號(hào)7455527，USA)添加至珠粒。將珠溶液渦旋混合30秒。將管在室溫孵育I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。在渦旋混合懸液30秒后，將多個(gè)管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加550 μ L 150mM鹽水，同時(shí)向管添加O. 025%Proclin 300溶液。渦旋混合并且在鹽水溶液中反復(fù)洗滌另外2次。d.進(jìn)行抗體載量測(cè)定。根據(jù)以下方法進(jìn)行磁珠上的抗體載量測(cè)定。簡(jiǎn)言之，材料和方法如下所述。
測(cè)定法組分抗體偶聯(lián)的珠。檢測(cè)抗體小鼠-IgG-FITC(2mgs/ml, Jackson, USA)洗滌緩沖液10mMPBS, pH 7. 4，含有 O. 05%Tween 20分析緩沖液10mMPBS, pH 7. 4，含有 1%BSA, 0. 05%Tween 20微板96孔 Millipore 0. 42um 濾板(Greinerbio, USA)測(cè)定操作方案在50 μ I分析緩沖液中稀釋2. 5 μ I每種珠樣品。在渦旋混合至少30秒后，取出10 μ I懸液并且在490 μ I分析緩沖液中再次稀釋。在分析緩沖液中稀釋小鼠IgG-FITC檢測(cè)抗體至工作濃度10 μ g/ml O在渦旋混合稀釋的珠懸液至少30秒后，向孔添加50 μ I抗體包被的珠。使用真空過濾設(shè)備從孔中移除珠溶液。在添加50 μ I檢測(cè)抗體至適宜的孔后，在室溫在平板搖床上于黑暗下孵育60分鐘。使用真空過濾設(shè)備從孔中移除檢測(cè)抗體溶液。添加200 μ I洗滌緩沖液至平板的每個(gè)孔并且將平板置于平板搖床上30秒。從孔中移除200 μ I上清液。添加100 μ I洗漆緩沖液至每個(gè)孔，在FACS Canto II (BD Biosciences, USA)上對(duì)珠讀數(shù)。e.結(jié)果實(shí)例。如10圖中所示，使用相同摩爾濃度的不同配體形成了不同的低聚絡(luò)合物并且改變了山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體捕獲小鼠單克隆抗體-熒光素的結(jié)合容量。實(shí)例6 :操縱低聚金屬-基材絡(luò)合物的水解性低聚物形成。在結(jié)合靶分子之前使用緩沖液預(yù)處理活化的金屬-基材絡(luò)合物。使用在金屬-基材絡(luò)合物中具有大約30%單體組分的制品作為模型，以便確定改變絡(luò)合物中給電子條件的影響和其對(duì)靶分子結(jié)合作用和其性能的后續(xù)作用。通過比較MES緩沖液PH5. 2與MES緩沖液pH7，例舉不同洗滌緩沖液的影響。抗體與表面結(jié)合的鉻低聚物的結(jié)合可以根據(jù)如載量測(cè)定法所測(cè)定的洗滌緩沖液PH選擇而變動(dòng)。a.鉻種類選擇。使用具有大約30%單體組分的高氯酸鉻與乙二胺絡(luò)合物(見實(shí)例5a)。 b.添加洗滌緩沖液至磁珠(Dynal)。M-270羧基封端的磁珠(目錄號(hào)143. 16D)從Dynal, IN, Norway供應(yīng)。為制備這些珠子，允許它們達(dá)到室溫并且將這些珠子渦旋混合30秒，隨后超聲處理另外60秒。將2 X 140 μ I珠濃縮物分配至2X1. 7mL微管中。將這些管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加添加420 μ I高氯酸鉻/乙二胺溶液。在室溫留置I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。從轉(zhuǎn)子中取出高氯酸鉻/乙二胺活化的DynabeadsM-270珠并且將懸液渦旋混合30秒。將50 μ I溶液分配至2個(gè)管中。將這些管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向每個(gè)館添加50 μ I洗滌緩沖液，50mM MES (pH5. 2)或50mM MES (pH7. 0)。重復(fù)渦旋混合，移出上清液并且重復(fù)MES (pH 5. 2或pH 7.0)洗滌另外兩(2)次。c.山羊抗小鼠多克隆抗體與鉻連接珠表面的偶聯(lián)在移出上清液后，將50mM MES (pH5. 2或ρΗ7· 0)中的50 μ I 0. 5mg/ml山羊抗小鼠Fe特異性多克隆抗體(Lampire Biological,目錄號(hào)7455527，USA)添加至珠粒。將珠溶液渦旋混合30秒。將管在室溫孵育I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。在渦旋混合懸液30秒后，將多個(gè)管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加50yL 50mM TBS緩沖液(pH8. 0)，同時(shí)向管添加O. 025%Proclin300。渦旋混合并且在TBS緩沖液中反復(fù)洗滌另外2次。d.進(jìn)行抗體載量測(cè)定。根據(jù)如實(shí)例5d中先前所述的方法進(jìn)行磁珠上的抗體載量測(cè)定。e.結(jié)果實(shí)例。如11圖中所示，在形成低聚物金屬-基材絡(luò)合物之后和在添加GAM多克隆抗體形式的靶分子之前通過改變PH條件對(duì)金屬-基材絡(luò)合物的后處理可以用來(lái)進(jìn)一步調(diào)節(jié)低聚金屬組合物并且隨后改變靶分子的結(jié)合作用和性能。實(shí)例7 :不同表面和材料對(duì)形成最佳金屬低聚物-基材絡(luò)合物的影響。使用具有大約30%單體組分的制品作為模型，以便顯示基材的表面特性可以顯著改變靶分子結(jié)合特性和其性能。a.鉻種類選擇。使用具有大約30%單體組分的高氯酸鉻與乙二胺絡(luò)合物(見實(shí)例5a)作為模型。b.選擇珠上的不同表面。出于比較目的，將具有羥基和羧基官能團(tuán)的二氧化硅珠與聚合珠比較?！roMag-COGH (目錄號(hào) PMC3N/9885 )來(lái)自 Bangs, IN, USASilica-OH (目錄號(hào) SS06N)來(lái)自 Bangs, IN, USASilica-COOH (目錄號(hào) SC05H)來(lái)自 Bangs, IN, USAc.添加高氯酸鉻/乙二胺至磁珠。全部珠按照如實(shí)例5b中所述的相似方式處理。從轉(zhuǎn)子中取出鉻低聚物活化的珠(250μ I)并且將懸液渦旋混合30秒。將這些管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向每管添加250 μ I的50mM MES緩沖液(pH 5.2)。重復(fù)渦旋混合，移出上清液并且另外添加兩(2)次MES。d.山羊抗小鼠多克隆抗體與不同的鉻連接珠表面的偶聯(lián)在移出上清液后，將50mM MES中的250 μ I lmg/ml山羊抗小鼠Fe特異性多克隆抗體(Lampire Biological,目錄號(hào)7455527，USA)添加至珠粒。將珠溶液渦旋混合30秒。將管在室溫孵育I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。在渦旋混合懸液30秒后，將多個(gè)管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加250 μ L 150mM鹽水，同時(shí)向管添加O. 025%Proclin 300溶液。渦旋混合并且在鹽水溶液中反復(fù)洗滌另外2次。e.進(jìn)行抗體載量測(cè)定。根據(jù)如實(shí)例5d中先前所述的方法進(jìn)行磁珠上的抗體載量測(cè)定。f.鏈霉親和素與不同的鉻連接珠表面的偶聯(lián)從轉(zhuǎn)子中取出鉻低聚物活化的珠(250 μ I)并且將懸液渦旋混合30秒(見實(shí)例6b)。將多個(gè)管(對(duì)于磁珠)置于磁架上I分鐘或?qū)⒍鄠€(gè)管(對(duì)于非磁珠)置于微量離心機(jī)中以12，000SPR持續(xù)3分鐘，并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向每管添加250 μ I的50mM MES緩沖液(pH 5.2)。重復(fù)渦旋混合，移出上清液并且另外添加兩(2)次MES。在移出上清液后，將50mM MES中的250 μ I O. 5mg/ml鏈霉親和素(Prozyme，目錄號(hào)SA10，USA)添加至珠粒。將珠溶液渦旋混合30秒。將管在室溫孵育I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。在渦旋混合懸液30秒后，將多個(gè)管置于磁架上I分鐘或置于微量離心機(jī)中以12，000SPR持續(xù)3分鐘，并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加250 μ L 150mM鹽水，同時(shí)向管添加0.025%Proclin 300溶液。渦旋混合并且在鹽水溶液中反復(fù)洗滌另外2次。g.進(jìn)行生物素-RPE載量測(cè)定。根據(jù)以下方法在鏈霉親和素偶聯(lián)的珠上進(jìn)行生物素-藻紅蛋白(生物素-RPE)載量測(cè)定。簡(jiǎn)言之，材料和方法如下所述。測(cè)定法組分鏈霉親和素偶聯(lián)的珠。 檢測(cè)生物素-PE(4mgs/ml,目錄號(hào)P811, Invitrogen, USA)洗滌緩沖液10mMPBS, pH 7. 4，含有 O. 05%Tween 20分析緩沖液10mMPBS, pH 7. 4，含有 1%BSA, O. 05%Tween 20微板:96孔 Millipore O. 42um 濾板(Millipore, USA)測(cè)定操作方案在25 μ I分析緩沖液中稀釋5 μ I每種珠樣品。在渦旋混合至少30秒后，取出20 μ I懸液并且在480 μ I分析緩沖液中再次稀釋。在分析緩沖液中稀釋生物素-RPE至工作濃度O. 4 μ g/mlo在渦旋混合稀釋的珠懸液至少30秒后，向孔添加100 μ I鏈霉親和素包被的珠。使用真空過濾設(shè)備從孔中移除珠溶液。在添加50 μ I檢測(cè)生物素-RPE至適宜的孔后，在室溫在平板搖床上于黑暗下孵育60分鐘。使用真空過濾設(shè)備從孔中移除檢測(cè)生物素-RPE溶液。添加200 μ I洗滌緩沖液至平板的每個(gè)孔并且將平板置于平板搖床上30秒。從孔中移除200 μ I上清液。添加100 μ I洗滌緩沖液至每個(gè)孔，在FACS Canto Il(BDBiosciencesjUSA)上對(duì)珠讀數(shù)。h.結(jié)果實(shí)例。如12圖中所示，低聚金屬絡(luò)合物有效使抗體結(jié)合在二氧化硅表面上，無(wú)論這個(gè)表面是否具有-OH或-COOH官能團(tuán)。這個(gè)實(shí)例顯示使用低聚金屬絡(luò)合物的一種具體制品時(shí)與聚合珠的可比較性能。相同的低聚金屬-基材絡(luò)合物也有效結(jié)合鏈霉親和素，但是性能改善曲線依賴基材和依賴低聚金屬絡(luò)合物(見圖13)。實(shí)例8 :操縱與靶分子結(jié)合組合的低聚金屬-基材絡(luò)合物的水解性低聚物形成。使用具有大約30%單體組分以形成金屬-基材絡(luò)合物的制品作為模型，以便確定在絡(luò)合物中改變給電子條件的影響。在實(shí)例8中，通過比較pH和離子強(qiáng)度差異，例舉靶分子偶聯(lián)條件的影響。a.鉻種類選擇。使用具有大約30%單體組分的高氯酸鉻與乙二胺絡(luò)合物(見實(shí)例5a)。b.添加鉻低聚物至磁珠(Dynal )。M-270羧基封端的磁珠(目錄號(hào)143. 16D)從Dynal, IN, Norway供應(yīng)。為制備這些珠子，允許它們達(dá)到室溫并且將這些珠子渦旋混合30秒，隨后超聲處理另外60秒。將2 X 170 μ I珠濃縮物分配至2X1. 7mL微管中。將這些管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加510 μ L相應(yīng)的鉻低聚物溶液。在室溫留置I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。從轉(zhuǎn)子中取出鉻低聚物活化的DynabeadsM-270珠并且將懸液渦旋混合30秒。將50 μ I溶液分配至5個(gè)管中。將這些管置于磁架上I分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向每個(gè)管添加50 μ I不同的偶聯(lián)緩沖液25mM MES (pH 6. 5)、50mM MES (pH6. 0、6. 5和pH7. 0)和IOOmM MES(pH 6. 5)。重復(fù)渦旋混合，移出上清液并且使用相同的MES洗滌條件額外兩(2)次。c.使用不同的偶聯(lián)緩沖液pH，山羊抗小鼠多克隆抗體與鉻連接珠表面的偶聯(lián)在移出上清液后，將相同的相應(yīng)MES緩沖液中的50 μ I O. 5mg/ml山羊抗小鼠Fe特異性多克隆抗體(Lampire Biological,目錄號(hào)7455527，USA)添加至珠粒。將珠溶液渦旋混合30秒。將管在室溫孵育I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。
移出并棄去。向珠粒添加50yL 50mM TBS緩沖液(pH8. 0)，同時(shí)向管添加O. 025%Proclin300。渦旋混合并且在TBS中反復(fù)洗滌另外2次。d.進(jìn)行抗體載量測(cè)定。根據(jù)如實(shí)例5d中先前所述的方法進(jìn)行磁珠上的抗體載量測(cè)定。e.結(jié)果實(shí)例。如14圖中所示，針對(duì)低聚金屬珠絡(luò)合物使用不同的偶聯(lián)緩沖液改變了山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗體捕獲小鼠單克隆抗體-熒光素的結(jié)合容量。實(shí)例9 :操縱低聚金屬-基材絡(luò)合物的水解性低聚物形成。形成穩(wěn)定但是活躍的金屬-基材絡(luò)合物。使用具有大約30%單體組分以形成金屬-基材絡(luò)合物的制品作為模型，以便確定在絡(luò)合物中改變給電子條件的影響，及其根據(jù)貯存條件對(duì)低聚物金屬-基材絡(luò)合物長(zhǎng)期貯存的后續(xù)影響。通過比較dH20、MES緩沖液pH5. 2和MES緩沖液pH7，例舉不同洗滌緩沖液的影響?？贵w與表面結(jié)合的鉻低聚物的結(jié)合可以根據(jù)如載量測(cè)定法所測(cè)定的貯存條件而變動(dòng)。a.鉻種類選擇使用具有大約30%單體組分的高氯酸鉻與乙二胺絡(luò)合物(見實(shí)例5a)。b.添加鉻低聚物至二氧化硅-COOH珠(Bangs)。羧基封端的二氧化硅珠(11^上0807226)從8&叩8，1隊(duì)”4供應(yīng)。為制備這些珠子，允許它們達(dá)到室溫并且將這些珠子渦旋混合30秒，隨后超聲處理另外60秒。將2 X 600 μ I珠濃縮物分配至2X1. 7mL微管中。將全部管置于微量離心機(jī)中以2000轉(zhuǎn)/分鐘持續(xù)5分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加600 μ I鉻低聚物溶液。在室溫留置I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。將鉻低聚物活化的二氧化硅珠分成3管。在管I中，將珠用含有O. 025%ProClin 300的200 μ I dH20洗滌并且重復(fù)額外兩(2)次。將鉻低聚物活化的二氧化硅珠貯存在含有O. 025%ProClin 300的200 μ IdH2O中。在管2中，將珠用含有
O.025%ProClin 300的200 μ I 50mM MESpH5. 2洗滌并且重復(fù)額外兩(2)次。將鉻低聚物活化的二氧化硅珠貯存在含有O. 025%ProClin 300的200 μ I 50mM MES pH5. 2中。在管3中，將珠用含有O. 025%ProClin 300的200 μ I IOmM PBS ρΗ7. 4洗滌并且重復(fù)額外兩(2)次。將鉻低聚物活化的二氧化硅珠貯存在含有O. 025%ProClin300的200 μ I IOmM PBS pH7. 4中。將鉻活化的不同Bangs 二氧化硅COOH珠貯存不同時(shí)間(O日、7日、30日和180日)
并且監(jiān)測(cè)抗體結(jié)合作用。c.山羊抗小鼠多克隆抗體與鉻連接珠表面的偶聯(lián)從轉(zhuǎn)子中取出鉻低聚物活化的DynabeadsM-270珠并且將懸液渦旋混合30秒。將全部管置于微量離心機(jī)中以2000轉(zhuǎn)/分鐘持續(xù)5分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向每個(gè)管添加50 μ I 50mM MES·
單體 Sln~ 575. 3O. 1642407. 6 O. 1836I. 118~ 78
二聚體 Sln 584. IO. 0611417. 3 O. 0608O. 995~ W
三聚體 Sln 581O. 1054421. I O. 1666I. 581 ~ 496. I(ΡΗ5.2)。重復(fù)渦旋混合，移出上清液并且另外添加兩(2)次MES。在移出上清液后，將50mM MES (pH5. 2)中的50 μ I lmg/ml山羊抗小鼠Fe特異性多克隆抗體(LampireBiological,目錄號(hào)7455527，USA)添加至珠粒。將珠溶液渦旋混合30秒。將管在室溫孵育I小時(shí)伴以轉(zhuǎn)動(dòng)。將懸液渦旋混合30秒后，將全部管置于微量離心機(jī)中以2000轉(zhuǎn)/分鐘持續(xù)5分鐘并且將上清液從珠粒小心地移出并棄去。向珠粒添加50 μ L 150mM鹽水，同時(shí)向管添加
O.025%Proclin 300溶液。渦旋混合并且在鹽水溶液中反復(fù)洗滌另外2次。d.進(jìn)行抗體載量測(cè)定。根據(jù)如實(shí)例5d中先前所述的方法進(jìn)行磁珠上的抗體載量測(cè)定。e.結(jié)果實(shí)例如15圖中所示，活化的鉻低聚物珠絡(luò)合物是穩(wěn)定的，顯示與山羊抗小鼠(GAM)抗體立即或在180日貯存后偶聯(lián)時(shí)相同的性能。甚至假定摧毀結(jié)合作用的PBS中貯存產(chǎn)生了GAM捕獲小鼠單克隆抗體-熒光素的較好性能。表I.表I由UV/Vis光譜法所分析的鉻單體、二聚體和三聚體溶液。表2表2.在借助不同的鉻溶液與抗TSH抗體偶聯(lián)的Luminex珠上的TSH測(cè)定法產(chǎn)生
明顯不同的結(jié)果。與低聚物相比，鉻單體產(chǎn)生最差的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種使合成基材適配用于在其上固定靶分子的方法，包括 -提供一種合成基材； -提供金屬離子用于與該基材結(jié)合，其中這些金屬離子不與一種靶分子絡(luò)合； -使這些金屬離子與該基材在靶分子不存在的情況下接觸，從而形成其中基材與這些金屬離子的配位位點(diǎn)結(jié)合的一種配位絡(luò)合物； -在該基材存在的情況下從這些金屬離子中形成低聚金屬絡(luò)合物，從而基本上全部的與該基材配位絡(luò)合的這些金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式； 因而適配這種基材用于在其上固定靶分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，包括步驟提供用于形成給電子基團(tuán)的條件，以便在這些金屬離子與該基材接觸時(shí)橋接兩個(gè)或更多個(gè)金屬離子，因而在該基材存在的情況下從這些金屬離子中形成低聚金屬絡(luò)合物，從而基本上全部的與該基材配位絡(luò)合的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中通過在這些金屬離子與該基材接觸時(shí)提供約3.3至11、優(yōu)選地約4至10的pH，提供用于形成給電子基團(tuán)的條件。
4.一種使合成基材適配用于在其上固定靶分子的方法，包括 -提供金屬離子用于與一種基材結(jié)合，其中這些金屬離子不與一種靶分子絡(luò)合； -在該基材不存在的情況下從這些金屬離子中形成低聚金屬絡(luò)合物，從而基本上全部的這些金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物形式； -使這些低聚金屬絡(luò)合物與該基材在靶分子不存在的情況下接觸，從而形成其中該基材與這些低聚金屬絡(luò)合物的金屬離子的配位位點(diǎn)結(jié)合的一種配位絡(luò)合物； 因而適配所述基材用于在其上固定一種靶分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中以一種組合物的形式提供這些金屬離子并且在基材不存在的情況下從這些金屬離子中形成低聚金屬絡(luò)合物的步驟包括向該組合物提供用于形成給電子基團(tuán)的條件以便橋接該組合物中的兩個(gè)或更多個(gè)金屬離子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中通過向該組合物提供約3.3至11、優(yōu)選地約4至10的pH，提供用于形成給電子基團(tuán)的條件。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其中該pH條件通過提供一種堿性鹽提供。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中該堿性鹽是NaOH、KOH或ΝΗ40Η。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括提供處于一種具有酸性基團(tuán)的化合物形式的橋接配體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該酸性基團(tuán)是羧基、磺基、磷基、烯醇基、酚基、硫烯醇或硫代酚基。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該結(jié)合配體是亞氨基二酸、次氨基三乙酸、草酸或水楊酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其中這些pH條件通過添加一種處于具有堿性基團(tuán)的化合物形式的橋接配體提供。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該堿性基團(tuán)是一種胺或亞胺。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該結(jié)合配體是吡啶、咪唑、苯并咪唑、組氨酸或吡啶。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該結(jié)合配體是乙二胺。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該金屬離子是一種過渡金屬。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中該金屬是銠、鉬、鈧、鋁、鈦、釩、鉻、釕、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鑰或鋅。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中該金屬是鐵、鈷、鋁、鉻或釕。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中該金屬是鉻III。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些金屬離子以一種組合物的形式提供，該組合物包含根據(jù)權(quán)利要求12所述的一種橋接配體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中該組合物包含鉻金屬離子和乙二胺。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該組合物進(jìn)一步包含一種反離子，優(yōu)選地氯化物、乙酸鹽、溴化物、硝酸鹽、高氯酸鹽、磷酸鹽、明礬或硫酸鹽。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中優(yōu)選地多于75%、優(yōu)選地多于80%、優(yōu)選地多于85%、優(yōu)選地多于90%、優(yōu)選地多于95%、優(yōu)選地多于98或99%與該基材配位絡(luò)合的金屬離子處于低聚金屬絡(luò)合物的形式。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些低聚絡(luò)合物包含多于一種類型的金屬離子。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該基材處于一種珠、膜、多孔板、載玻片或毛細(xì)管柱的形式。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該基材從二氧化娃、玻璃、金或其他金屬、聚丙烯、聚乙烯和聚氟乙烯中產(chǎn)生。
27.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中該基材包含羥化的二氧化硅表面、聚乙烯醇表面或甲基丙烯酸酯表面。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該基材含有羧酸官能化、酰胺官能化、胺官能化、羥基官能化、醛官能化基團(tuán)或其他給電子基團(tuán)。
全文摘要
使合成基材適配用于在其上固定靶分子的方法。
文檔編號(hào)C07K17/14GK102947340SQ201180031172
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
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