專利名稱：一種克隆類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其涉及一種克隆類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法及類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因任意倍數的克隆方法。
背景技術：
家蠶絲素蛋白，又稱絲素蛋白，是一種結構蛋白，由包括絲素重鏈(H鏈)蛋白、絲素輕鏈(L鏈)蛋白和糖蛋白P25三個部分組成的復合體，屬于結晶高聚物，分為結晶態(tài)和無定形態(tài)兩大部分。其中，絲素蛋白重鏈是絲素蛋白的主要部分，全長5363個氨基酸，包括20種氨基酸，富含甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸，其主要包括N末端151個氨基酸殘基的非重復區(qū)域、核心區(qū)域和C末端55個氨基酸殘基的非重復區(qū)域三個組成部分。而絲素重鏈的核心區(qū)域又分為富含甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)的高度重復區(qū)域和非重復的間隔區(qū)，其中，高度 重復區(qū)域內一般以GAGAGS重復開始，以GAAS終止。非重復間隔區(qū)，又稱非結晶區(qū)，主要為GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFG 的非重復序列。研究表明家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)氨基酸組成中主要為親水性氨基酸，其編碼的多肽用作美容用品應具有比絲素粉更優(yōu)的護膚保濕的功效，但是家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)氨基酸組成中含有光照易生色的酪氨酸和色氨酸，不適合用作護膚品。為了使家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)能獲得更好的應用效果(如護膚品、敷料類生物材料等的功能肽)，本發(fā)明人設計了去除了家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)中的酪氨酸和色氨酸的編碼的多肽，其氨基酸序列為GSSGFGPVANGGSGEASSESDFG,命名為類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)。為了更好地研究類家蠶絲素非結晶區(qū)及其應用，需要獲得大量的高純度的類家蠶絲素非結晶區(qū)的蛋白及不同聚合度類家蠶絲素非結晶區(qū)的蛋白。采用合成肽的方法獲得類家蠶絲素非結晶區(qū)的蛋白價格昂貴，不適合類家蠶絲素非結晶區(qū)蛋白的大量生產。另一方面由于類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)的氨基酸發(fā)生了改變，使類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因不同于與家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因，因此按照現有的基因工程技術利用現有的家蠶絲素的cDNA為模板進行克隆，有誤差，無法獲得與類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)核苷酸序列一致的目的片段。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡便，準確性高的克隆類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法。為實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術方案—種克隆類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法，包括以下步驟A、合成分別編碼SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的LinkU Link2、Link3三個雙鏈DNA分子；其中Linkl的5，端和3，端分別含有BglII和NheI的粘末端堿基；Link2的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，緊接HindIII位點的上游含有NheI位點；Link3的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端喊基；B、將Linkl、Link2、Link3連接到質粒pSLFA1180FA中，轉化感受態(tài)細胞，挑克隆，抽提質粒，酶切篩選并測序鑒定獲得正確質粒，Nhel/Hindlll雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收小片段即得。本發(fā)明通過對類家蠶絲素重鏈核心區(qū)的非結晶區(qū)氨基酸序列及其編碼基因的分析，將類家蠶絲素非結晶區(qū)氨基酸序列分為如SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO:2,SEQ ID N0:3所示的三段氨基酸序列，設計了編碼SEQ ID NO: K SEQID NO:2, SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的Linkl、Link2、Link3三個雙鏈DNA分子。本發(fā)明所述Linkl、Link2、Link3三個雙鏈DNA分子的5’端和3’端含有可以配對的同尾酶， 如Linkl的3’端限制性核酸內切酶NheI與Link2的5’端限制性核酸內切酶SpeI是一對同尾酶；Link2的3’端和Link3的5’端也是一對同尾酶Nhel/Spel。當三段基因連接后，兩對同尾酶的位點NheI和SpeI被限制性內切酶切除后連接，形成符合非結晶區(qū)氨基酸的丙氨酸Ala和絲氨酸Ser的三聯密碼子。優(yōu)選的，所述將Linkl、Link2、Link3連接到質粒pSLFA1180FA中的具體步驟包括a、用限制性核酸內切酶Nhel/Bglll消化質粒pSLFA1180FA，收集大片段，與雙鏈DNA分子Linkl混合，T4DNA連接酶連接后得到質粒PSLl ；b、用限制性核酸內切酶Nhel/Hindlll消化質粒PSL1，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link2混合，T4DNA連接酶連接后得到質粒PSL2 ；C、用限制性核酸內切酶Nhel/Hindlll消化質粒PSL2，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link3混合，T4DNA連接酶連接即得。本發(fā)明步驟a先用限制性核酸內切酶Nhel/Bglll消化質粒pSLFA1180FA，收集質粒pSLFA1180FA中BglII與NheI之間的大片段，與雙鏈DNA分子Linkl混合，T4DNA連接酶連接后得到含有雙鏈DNA分子Linkl的質粒PSLl。其中，所述的質粒pSLFA1180FA為具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列質粒。本發(fā)明步驟b用限制性核酸內切酶Nhel/Hindlll消化含有雙鏈DNA分子Linkl的質粒PSLl，收集HindIII與NheI之間的大片段，所述HindIII與NheI之間大片段含有雙鏈DNA分子Linkl，然后與雙鏈DNA分子Link2混合，T4DNA連接酶連接后得到含有雙鏈DNA分子Linkl和Link2的質粒PSL2。本發(fā)明步驟c用限制性核酸內切酶Nhel/Hindlll消化含有雙鏈DNA分子Linkl和Link2質粒PSL2，收集HindIII與NheI之間的大片段，所述HindIII與NheI之間大片段含有雙鏈DNA分子Linkl和Link2，然后與雙鏈DNA分子Link3混合，T4DNA連接酶連接得到含有雙鏈DNA分子Linkl、Link2和Link3的質粒F (I)，即含有完整的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒。將含有完整的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒轉化感受態(tài)細胞，挑克隆，抽提質粒，酶切篩選并測序鑒定獲得正確，Nhel/Hindl 11雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收小片段即得完整的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因。優(yōu)選的，本發(fā)明所述雙鏈DNA分子Linkl的編碼鏈鏈具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列。優(yōu)選的，本發(fā)明所述雙鏈DNA分子Link2的編碼鏈具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。優(yōu)選的，本發(fā)明所述雙鏈DNA分子Link3的編碼鏈具有如SEQ ID NO: 7所示的核
苷酸序列。為了更好地研究絲素蛋白非結晶區(qū)的結構和功能，需要獲得不同聚合度類絲素非結晶區(qū)的蛋白，本發(fā)明還提供了一種克隆多倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法。一種克隆多倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法，包括以下步驟I、合成分別編碼SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的Link4、Link5、Link6三個雙鏈DNA分子；其中Link4的5’端和3’端分別含有BglII和NheI的粘末端堿基，在緊接其BglII位點的下游含有AgeI的識別位點；Link5的5’端和3’端
分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，緊接HindIII位點的上游含有NheI位點；Link6的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，在緊接其HindIII位點的上游含有NgoMIV的識別位點；II、將Link4、Link5、Link6連接到質粒pSLFA1180FA中，得到含有單倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(I)；III、用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化步驟II得到的質粒F(I)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F(I)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有二倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(2)；IV、重復步驟III，用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化質粒F(I)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F (2)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有三倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(3);用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化質粒F(2)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F (2)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有四倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(4)；V、分別將質粒F⑴、F⑵、F(3)和F(4)轉化感受態(tài)細胞，挑克隆，抽提質粒，酶切篩選并測序鑒定獲得正確質粒，Agel/HindHI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收小片段即得單倍、二倍、三倍和四倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因。本發(fā)明設計了編碼SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的Link4、Link5、Link6三個雙鏈DNA分子。與上述克隆單倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法的方案相似，所述Link4、Link5、Link6三個雙鏈DNA分子的5’端和3’端含有可以配對的同尾酶，如Link4的3’端限制性核酸內切酶NheI與Link5的5’端限制性核酸內切酶SpeI是一對同尾酶；Link5的3’端和Link6的5’端也是一對同尾酶Nhel/Spel。當三段基因連接后，兩對同尾酶的位點NheI和SpeI被限制性內切酶切除后連接，形成符合非結晶區(qū)氨基酸的丙氨酸Ala和絲氨酸Ser的三聯密碼子。優(yōu)選的，本發(fā)明所述克隆方法步驟II將Link4、Link5、Link6連接到質粒PSLFA1180FA中的具體步驟包括i、用限制性核酸內切酶Nhel/Bglll消化質粒pSLFA1180FA，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link4混合，T4DNA連接酶連接后得到質粒PSL3 ；i i、用限制性核酸內切酶Nhel/Hindl 11消化質粒PSL3，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link5混合，T4DNA連接酶連接后得到質粒PSL4 ；iii、用限制性核酸內切酶Nhel/Hindlll消化質粒PSL4，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link6混合，T4DNA連接酶連接即得。本發(fā)明步驟i先用限制性核酸內切酶Nhel/Bglll消化質粒pSLFA1180FA，收集質粒pSLFA1180FA中BglII與NheI之間的大片段，與雙鏈DNA分子Link4混合，T4DNA連接酶連接后得到含有雙鏈DNA分子Link4的質粒PSL3。本發(fā)明步驟ii用限制性核酸內切酶Nhel/Hindlll消化含有雙鏈DNA分子Link4的質粒PSL3，收集HindIII與NheI之間的大片段，所述HindIII與NheI之間大片段含有雙鏈DNA分子Link4，然后與雙鏈DNA分子Link5混合，T4DNA連接酶連接后得到含有雙鏈DNA分子Link4和Link5的質粒PSL4。本發(fā)明步驟iii用限制性核酸內切酶Nh el/Hindlll消化含有雙鏈DNA分子Link4和Link5的質粒PSL4，收集HindIII與NheI之間的大片段，所述HindIII與NheI之間大片段含有雙鏈DNA分子Link4和Link5，然后與雙鏈DNA分子Link6混合，T4DNA連接酶連接得到含有雙鏈DNA分子Link4、Link5和Link6的質粒F (1)，即含有完整的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒。此外，本發(fā)明合成的三個雙鏈DNA分子中，在Link4的5’端緊接BglII位點的下游還含有AgeI的識別位點，在Link6的3’端緊接HindIII位點的上游還含有NgoMIV的識別位點，AgeI和NgoMIV是一對同尾酶。在一個完整的非結晶區(qū)基因克隆完成后，獲得一個含有類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F (1)，然后利用Link4的5’端和Link6的3’端設計的同尾酶進行類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的加倍克隆。具體方法是用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化質粒F (I )，收集大片段，插入BamHI/NgoMIV消化F (I)獲得的小片段，T4DNA連接酶連接。由于AgeI和NgoMIV為同尾酶，酶切連接后，AgeI和NgoMIV 2個位點均消失，形成了符合非結晶區(qū)氨基酸的丙氨酸Ala和甘氨酸Gly的密碼子，得到含有二倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)編碼基因的質粒F (2)。按照上述方法，用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化質粒F(I)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F (2)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有三倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(3);用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化質粒F(2)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F(2)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有四倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F (4)。同理，按照上述方法，用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化含有奇數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化含有偶數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有奇數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒；用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化含有偶數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化含有偶數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有偶倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒。當然，按照上述方法用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化含有奇數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化含有奇數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接后也可得到含有偶數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒；用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化含有偶數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化含有奇數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接后也可得到含有奇數倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒。本領域技術人員可以按照上述方法，自由選擇用限制性核酸內切酶BamHI與AgeI和BamHI與NgoMIV酶切含有不同倍數類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，得到含有任意倍數的非結晶區(qū)編碼基因的質粒F (η)。本發(fā)明在步驟V將質粒F(1)、F(2)、F(3)和F(4)轉化感受態(tài)細胞，挑克隆，抽提質粒，酶切篩選并測序鑒定獲得正確質粒，Agel/Hindlll雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收小片段分別得到單倍、二倍、三倍和四倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因。同理，本領域技術人員可以按照上述方法將含有任意倍數的非結晶區(qū)編碼基因的質粒F (η)轉化感受態(tài)細胞，挑克隆，抽提質粒，酶切篩選并測序鑒定獲得正確質粒，Agel/Hindlll雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收小片段即得任意倍數的非結晶區(qū)編碼基因。之后，將得到任意倍數的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因轉入表達載體pGEX-Agel 中表達即可獲得不同聚合度的類家蠶絲素非結晶區(qū)蛋白。在具體實施方式
中，所述將完整的不同倍數的非結晶區(qū)基因轉入表達載體中表達的方法具體為用Agel/Hindlll酶切表達載體pGEX-Agel，插入Agel/Hindlll酶切得到的任意倍數的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因，構建表達載體，然后轉化大腸桿菌BL21 (DE3)誘導表達類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因即得。其中，所述的表達載體PGEX-AgeI為具有SEQID N0:8所示的核苷酸序列載體。優(yōu)選的，本發(fā)明所述雙鏈DNA分子Link4的編碼鏈具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。優(yōu)選的，本發(fā)明所述雙鏈DNA分子Link5的編碼鏈具有如SEQ ID NO: 10所示的核
苷酸序列。優(yōu)選的，本發(fā)明所述雙鏈DNA分子Link6的編碼鏈具有如SEQ ID NO: 11所示的核
苷酸序列。在具體實施方式
中，本發(fā)明通過對構建的含有單倍、雙倍、四倍、八倍和十二倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F (1)、F (2)、F (4)、F (8)和F (12)分別采用限制核酸性內切酶BamHI和限制核酸性內切酶Bglll/Hindlll進行單酶切和雙酶切消化，然后將酶切產物進行DNA瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，與提供的標準DNA分子量(M)對比，所有質粒酶切后得到的條帶均符合理論值。對質粒進行DNA測序鑒定，結果顯示所有質粒中的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因全部正確，沒有發(fā)生任何基因缺失或基因突變，表明本發(fā)明所述方法克隆的準確性高。本發(fā)明提供了一種克隆類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法和一種克隆多倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法。本發(fā)明所述方法操作簡便，通過本發(fā)明所述方法獲得的單倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因和多倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因準確性高，轉入表達載體中表達即可獲得類家蠶絲素非結晶區(qū)蛋白和不同聚合度的類家蠶絲素非結晶區(qū)蛋白，適合于類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)蛋白的大量生產。


圖I示克隆單倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的流程圖2示克隆多倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的流程圖；圖3示質粒pSLFA1180FA的圖譜；圖4示表達載體pGEX-Age I的圖譜；圖5示實施例3對構建的含有單倍及多倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒的BamHI酶切凝膠電泳圖，其中，泳道F (12)為含有十二倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，泳道F (8)為含有八倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，泳道F (4)為含有四倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，泳道F (2)為含有二倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，泳道F (I)為含有單倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，泳道M為DL2000DNA分子量標準(購自Takara公司)；圖6示實施例4對構建的含有單倍及多倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒 的Bglll/Hindlll酶切凝膠電泳圖，其中，泳道F (12)為含有十二倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，泳道F (8)為含有八倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，泳道F
(4)為含有四倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，泳道F (2)為含有二倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，泳道F (I)為含有單倍的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，泳道M為DL2000DNA分子量標準(購自Takara公司)。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了一種克隆類家蠶絲素非結晶區(qū)基因的方法。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發(fā)明技術。為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明提供的方法進行詳細說明。實施例I :I、編碼類家蠶絲素重鏈核心區(qū)的非結晶區(qū)氨基酸序列的DNA分子片段的設計與合成根據絲素蛋白主要組成部分的重鏈核心區(qū)域非結晶區(qū)氨基酸序列及其編碼基因信息，設計并合成(Invitrogen公司)了三個雙鏈DNA分子，分別命名為Linkl、Link2和Link3。Linkl的5’端和3’端分別含有BglII和NheI的粘末端堿基；Link2的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，緊接HindIII位點的上游含有NheI位點；Link3的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基。其中，所述雙鏈DNA分子Linkl的編碼鏈具有如SEQID NO: 5所示的核苷酸序列，所述雙鏈DNA分子Link2的編碼鏈具有如SEQID N0:6所示的核苷酸序列，所述雙鏈DNA分子Link3的編碼鏈具有如SEQID N0:7所示的核苷酸序列。2、用限制性內切酶Nhel/Bgl 11消化pSLFAl 180FA質粒(所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品)，反應體系如下pSLFA1180FA 質粒l.ug
FastDiges產NheI (IFDU)I μ L
FastDigest^Bglii (IFDU)ΙμΙ
ΟχFastDigestrt Buffer2μΙ.
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20μΕ。在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收?；厥掌闻c合成的雙鏈DNA分子Linkl混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系
雙鏈 DNA 分子 Link I6μ (I OOmM)
酶切后的pSLFA1180FA質粒 2pL(l%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)
Τ4 DNA 連接SIΙμΕ
IOx連接酶 BLiffcrIpL
連接體系總量為ΙΟμ 。將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素抗生素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(Invitrogen公司)鑒定獲得正確質粒，即中間質粒PSLl。3、用限制性內切酶Nhel/Hindlll消化中間質粒PSLl質粒(所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品)，反應體系如下
PSLl 質粒IiUg
FastDigestiiNheI (IFDU)Ιμ
FastDigestftHindIIi (IFDU )I μ
lOxFastDigesf" Buffer2μΙ
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20μL.在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收?；厥掌闻c合成的雙鏈DNA分子Link2混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系、雙鏈 DNA 分子 Link2 6‘uL (I OOmM)
酶切后的PSLl質粒 2μ χ %瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)
Τ4 DNA連接酶IpL
I Ox連接酶 BufferΙμ
連接體系總量為lOpL。將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素抗生素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(Invitrogen公司)鑒定獲得正確質粒，即中間質粒PSL2。4、用限制性內切酶Nhel/Hindlll消化中間質粒PSL2質粒(所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品)，反應體系如下
PSL2 質粒I pg
FastDigest^NheI (IFDU)I μL
FastDigestwHindIII (IFDU)I μ.L
I Ox FastDigest'1 Buffer2(liL
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20pL。在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收。回收片段與合成的雙鏈DNA分子Link3混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系
雙鏈 DNA 分子 Link3 6μΙ. (IOOmM)
酶切后的PSL2質粒2μΙ^1%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)
Τ4 DNA連接酶Ιμ
I Ox連接酶 BufferΙμΕ
連接體系總量為l0μL.將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素抗生素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(InvitiOgen公司)鑒定獲得含有完整單倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒。5、將含有完整的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒轉化ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素抗生素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽提質粒，Nhel/Hindlll雙酶切，反應體系如下質粒I pg
FastDigest^ Nhel( I FDU)I μ
FastDigest^ HindIII (I FDU)I μL
I Οχ FastDigest i7 Buffer2^iL
加入滅菌蒸鎦水補足體系總量至20pL。
在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行DNA凝膠電泳，回收小片段即得完整的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因。實施例2 I、編碼類家蠶絲素重鏈核心區(qū)的非結晶區(qū)氨基酸序列的DNA分子片段的設計與合成根據絲素蛋白主要組成部分的重鏈核心區(qū)域非結晶區(qū)氨基酸序列及其編碼基因信息，設計并合成(Invitrogen公司)了三個雙鏈DNA分子，分別命名為Link4、Link5和Link6。Link4的5，端和3，端分別含有BglII和NheI的粘末端堿基，在緊接其BglII位點的下游含有AgeI的識別位點；Link5的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，緊接HindIII位點的上游含有NheI位點；Link6的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，在緊接其HindIII位點的上游含有NgoMIV的識別位點。其中，所述雙鏈DNA分子Link4的編碼鏈具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，所述雙鏈DNA分子Link5的編碼鏈具有如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列，所述雙鏈DNA分子Link6具有如SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。2、用限制性內切酶Nhel/Bgl 11消化pSLFAl 180FA質粒(所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品)，反應體系如下
pSLFA1180FA 質粒Ipg
FastDigest^NheI (IFDU)IμL
FastDigestwBglII (I FDU)I pL
I Ox FastDigestif Buffer2μΙ
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20pL。在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收?；厥掌闻c合成的雙鏈DNA分子Link4混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。 連接反應體系雙鏈 DNA 分子 Lmk46‘uL (I OOmM)
酶切后的pSLFA1180FA質粒2pL(l%琮脂糖凝膠電泳回收的上清液)
Τ4 DNA連接酶 I Ox連接酶 BufferIiLiL
連接體系總量為ΙΟμΙ將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素抗生素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素抗生素的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(Invitrogen公司)鑒定獲得正確質粒，即中間質粒PSL3。
3、用限制性內切酶Nhel/Hindlll消化中間質粒PSL3質粒(所用內切酶及相應緩 沖液為fermentas產品)，反應體系如下
PSL3 質粒I .Hg
FastDigestitfNheI (I FDlJ)I μ L
FastDigest li HindIII (I FDU)I μL
I Ox FastDigestti Buffer2 μ. L
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20μΕο在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收?；厥掌闻c合成的雙鏈DNA分子Link5混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。
連接反應體系
雙鏈 DNA 分子 Link5 6‘uL (I OOmM)
酶切后的PSL3質粒 2pL(l%瓊脂糖凝肢電泳回收的上清液)
Τ4 DNA連接酶1μ[
1()χ連接酶 BufferΙμ
連接體系總量為_L。將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素抗生素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素抗生素的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(Invitrogen公司)鑒定獲得正確質粒，即中間質粒PSL4。 4、用限制性內切酶Nhel/Hindlll消化中間質粒PSL4質粒(所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品)，反應體系如下PSL4 質粒l.ug
FastDigesiirt NheI (I FDU)I μL
FastDigestirt HindIII (I FDU)I μL
I OxFastDigestlrt Buffer2μ[
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20μLo
在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收?；厥掌闻c合成的雙鏈DNA分子Link6混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系
雙鏈 DNA 分子 Link66^iL (IOOmM)
酶切后的PSL4質粒2pL(l%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)
Τ4 DNA連接酶IpL
I Ox連接酶 Buffer1μ[
連接體系總量為10μ 將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素抗生素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素抗生素的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(InvitiOgen公司)鑒定獲得含有單倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F (I)。5、用限制性內切酶BamHI/Agel消化F(I)質粒(所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品)，反應體系如下
F⑴質粒
FastDigestifl BamH I (IFDU)I μL
FastDiges產Agel (I FDU)I ‘liL
I Οχ FastDigestii Buffei-2μ L
加入滅菌蒸德水補足體系總量至20μL<>在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BamHI與AgeI之間大片段。用限制性內切酶BamHI/NgoMIV (所用BamHI及相應緩沖液為fermentas產品,所用NgoMIV及相應緩沖液為promega產品)消化F⑴質粒,反應體系如下F⑴質粒Ιμ$
FastDigesPBamHI (15υ/μ )IiLiL
Οχ FastDigestlrt Buffer2(uL
加入滅菌蒸鎦水補足體系總量至20pL。在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀抽提DNA，再配置如下反應體系NgoMIV (lOU/μ L)I μ LIOXBuffer2 μ L
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μ Lo在37°C恒溫水浴f2h進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BamHI與NgoMIV之間小片段將BamHI與AgeI之間大片段與BamHI與NgoMIV之間小片段混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系
BamHI與AgeI之間大片段 3pL(l%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)BamHI與NgoMIV之間小片段5pL(l%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)
Τ4 DNA連接酶I .uL
I Οχ連接酶 BufferIpL
連接體系總量為ΙΟμ 。將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素抗生素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素抗生素的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(InvitiOgen公司)鑒定獲得含有雙倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F (2)。6、用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化雙倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F (2)，收集BamHI與AgeI之間大片段，與BamHI/NgoMIV消化F (2)獲得的BamHI與NgoMIV之間小片段混合，T4DNA連接酶連接后得到含有四倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F (4)。重復上述操作，用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化F (4)，收集BamHI與AgeI之間大片段，與BamHI/NgoMIV消化F(4)獲得的BamHI與NgoMIV之間小片段混合，T4DNA連接酶連接后得到含有八倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(S)。用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化F (8)，收集BamHI與AgeI之間大片段，與BamHI/NgoMIV消化F (4)獲得的BamHI與NgoMIV之間小片段混合，T4DNA連接酶連接后得到含有十二倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(12)。實施例3:用限制性核酸內切酶BamHI對實施例2獲得的F (I)、F (2)、F (4)、F (8)和F
(12)進行酶切消化，反應體系如下質粒Ipg
FastDigest' BamH (IFDU)I μL
IOxF astD i gesf" B uffer2 μ L
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20μ 。在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行DNA瓊脂糖凝膠電泳，用EB染色觀察，結果如圖5。圖5結果可見，與提供的標準DNA分子量(M)對比，質粒F (I)、F (2)、F (4)、F(8)和F (12)酶切后得到了條帶大小正確，與3381bp、3513bp、3777bp、4305bp和4833bp的理論值相符合，表明所有質粒單酶切后得到的條帶均符合理論值。實施例4: 用限制性核酸內切酶Bglll/Hindlll對實施例2獲得的F (I)、F (2)、F (4)、F
(8)和F (12)進行酶切消化，反應體系如下
質粒I Pg
FasiDigest^BglII (IFDU)Ιμ
FastDiges產HindIiI (I FDU)I pL
IOxFastDigestii Buffer2^iL
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20μΙ。在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行DNA瓊脂糖凝膠電泳，用EB染色觀察，結果如圖6。圖6結果可見，質粒F (I)、F (2)、F (4)、F (8)和F (12)酶切后均得到了 2個條帶，與提供的標準DNA分子量(M)對比，所有質粒酶切后的大片段均為3237bp，與理論值相符，所有質粒酶切后的小片段分別為144、276、540、1068和1596bp，與理論值相符。表明所有質粒雙酶切后得到的條帶均符合理論值。實施例5:將實施例2 獲得的 F (I)、F (2)、F (4)、F (8)和 F (12)送 Invitrogen 公司測序，結果顯示各含有類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒中的非結晶區(qū)基因與設計的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的核苷酸片段序列一致，沒有發(fā)生任何基因缺失或基因突變。實施例6:用限制性內切酶Agel/Hindl 11酶切表達載體pGEX-Agel質粒(所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品),反應體系如下
pGEX-Age丨質粒Hig
FastDiges產AgeI (I FDU)I μL
FastDiges產HindIII (IFDU)Iμ
I Οχ FastDigesf Buffer2μΙ
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20μΕ。
在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行DNA瓊脂糖凝膠電泳，并進行DNA凝膠回收?；厥掌畏謩e與質粒F (1)、F (2)、F (4)、F (8)和 F (12) Agel/Hindlll 雙酶切后獲得的完整的單倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)編碼基因或不同倍數的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系
任意倍數的非結晶區(qū)DNA 5μL (I %瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液) 酶切后的pGEX-Agel3μ χ %瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液) Τ4 DNA連接酶IpL
I Ox連接酶 BufferIiLiL
連接體系總量為_L。將連接產物轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導表達類家蠶絲素非結晶區(qū)蛋白。以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。
權利要求
1.一種克隆類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法，其特征在于，包括以下步驟 A、合成分別編碼SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的Linkl、Link2、Link3三個雙鏈DNA分子；其中Linkl的5，端和3，端分別含有BglII和NheI的粘末端堿基；Link2的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，緊接HindIII位點的上游含有NheI位點；Link3的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基； B、將Linkl、Link2、Link3連接到質粒pSLFA1180FA中，轉化感受態(tài)細胞，挑克隆，抽提質粒，酶切篩選并測序鑒定獲得正確質粒，Nhel/Hindl 11雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳回收小片段即得。
2.根據權利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述將Linkl、Link2、Link3連接到質粒pSLFA1180FA中的具體步驟包括 a、用限制性核酸內切酶Nhel/Bglll消化質粒pSLFA1180FA，收集大片段，與雙鏈DNA分子Linkl混合，T4DNA連接酶連接后得到質粒PSLl ； b、用限制性核酸內切酶Nhel/Hindlll消化質粒PSL1，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link2混合，T4DNA連接酶連接后得到質粒PSL2 ； C、用限制性核酸內切酶Nhel/Hindlll消化質粒PSL2，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link3混合，T4DNA連接酶連接即得。
3.根據權利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述雙鏈DNA分子Linkl的編碼鏈具有如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述雙鏈DNA分子Link2的編碼鏈具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
5.根據權利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述雙鏈DNA分子Link3的編碼鏈具有如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列。
6.一種克隆多倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法，其特征在于，包括以下步驟 I、合成分別編碼SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的Link4、Link5、Link6三個雙鏈DNA分子；其中Link4的5’端和3’端分別含有BglII和NheI的粘末端堿基，在緊接其BglII位點的下游含有AgeI的識別位點；Link5的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，緊接HindIII位點的上游含有NheI位點；Link6的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，在緊接其HindIII位點的上游含有NgoMIV的識別位點； II、將Link4、Link5、Link6連接到質粒pSLFA1180FA中，得到含有單倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(I)； III、用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化步驟II得到的質粒F(I)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F(I)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有二倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(2)； IV、重復步驟III，用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化質粒F(I)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F (2)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有三倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(3);用限制性核酸內切酶BamHI/Agel消化質粒F(2)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F(2)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有四倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒F(4)；V、分別將質粒F(2)、F(3)和F(4)轉化感受態(tài)細胞，挑克隆，抽提質粒，酶切篩選并測序鑒定獲得正確質粒，Agel/Hindl 11雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收小片段即得二倍、三倍和四倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因。
7.根據權利要求6所述克隆方法,其特征在于,所述將Link4、Link5、Link6連接到質粒pSLFA1180FA中的具體步驟包括 i、用限制性核酸內切酶Nhel/Bglll消化質粒pSLFA1180FA，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link4混合，T4DNA連接酶連接后得到質粒PSL3 ； ii、用限制性核酸內切酶Nhel/Hindlll消化質粒PSL3，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link5混合，T4DNA連接酶連接后得到質粒PSL4 ； iii、用限制性核酸內切酶Nhel/Hindlll消化質粒PSL4，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link6混合，T4DNA連接酶連接即得。
8.根據權利要求6所述克隆方法，其特征在于，所述雙鏈DNA分子Link4的編碼鏈具有如SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
9.根據權利要求6所述克隆方法，其特征在于，所述雙鏈DNA分子Link5的編碼鏈具有如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。
10.根據權利要求6所述克隆方法，其特征在于，所述雙鏈DNA分子Link6的編碼鏈具有如SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，公開一種克隆類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法以及克隆不同倍數的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的方法。所述方法為將人工合成的末端分別含有可以配對的同尾酶的三個雙鏈DNA分子連接到質粒中，兩對同尾酶的位點分別被限制性內切酶切除后再連接，形成符合非結晶區(qū)氨基酸的三聯密碼子，轉化、篩選獲得含有完整類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒，再利用在完整的類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因5’端和3’端設計的同尾酶進行加倍克隆，轉化、篩選獲得含有多倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因的質粒。最后雙酶切后得到單倍和多倍類家蠶絲素蛋白非結晶區(qū)基因。本發(fā)明所述方法操作簡便，獲得的基因準確性高。
文檔編號C12N15/66GK102703488SQ20121014994
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權日2012年5月15日
發(fā)明者盧神州, 李明忠, 楊云星, 王建南, 裔洪根, 黃海燕 申請人:蘇州大學