專利名稱：三-4，4′，4″-叔丁基苯基甲基在核苷合成中作為保護基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在其基本結(jié)構(gòu)中帶有被三-4，4′，4″-叔丁基苯基甲基所保護的伯羥基的核苷，核苷酸和低聚核苷酸，還涉及所述的核苷和核苷酸的制備方法，低聚核苷酸的制備方法和所述的被保護的核苷，核苷酸和低聚核苷酸的使用。
由于低聚核苷酸具有與核酸(即反義低聚核苷酸)相互作用的能力和與此相關(guān)的生物活性，它們很受關(guān)注，在低聚核苷酸的合成之前，所使用的核苷和核苷類似物在它們的5′-位上用保護基進行保護。代表性的這些基團是苯基呫噸-9-基和三苯甲基保護基[Beaucage，S.L.，Iyer，R.，四面體482223-2311(1992)]。就苯基呫噸-9-基以及二-對-茴香基苯基甲基(DMTr)和對-茴香基二苯基甲基(MMTr)而言，由于區(qū)域選擇性差造成產(chǎn)率的降低，甚至在引入這些基團時也是這樣。帶有較長的O-烷基鏈的這些三苯甲基基團的另一個缺點是，盡管由它們形成的低聚核苷酸的色譜純化變得更容易了，但被所述基團保護的核苷單體只具有較小的形成固體或晶狀固體的趨勢，因此嚴(yán)重地限制了它們的技術(shù)使用[Takenaka，S.，Dohtsu，K.，Takagi，M.，分析科學(xué)(Anal.Sci)83-7(1992)]。
三-4，4′，4″-甲氧基三苯甲基對低聚核苷酸的合成來說太不穩(wěn)定并且可在亞磷酸三酯方法的偶合條件下被除去[Beaucage，S.L.，Iyer，R.，四面體482233(1992)]。因為制備和消除的條件較復(fù)雜，特別是在其自動化合成中，所以4，4′，4″-三(苯甲酰氧基)三苯甲基(TBTr)和4，4′，4″-三(4，5-二氯苯二甲酰亞氨基)三苯甲基(CPTr)對一般性使用來說太麻煩[Beaucage，S.L.，Iyer，R.，四面體482235(1992)]。其它的三苯甲基保護基團[Beaucage，S.L.，Iyer，R.，四面體482236(1992)]使核苷單體僅以適度的產(chǎn)率進行衍生。衍生物的結(jié)晶通常是不可能的。
令人驚奇的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過用三-4，4′，4″-叔丁基苯基甲基(＝三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基或TTTr)保護5′-羥基能將核苷和核苷類似物制成易于純化的無定形或晶狀固體。還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)在5′-位置上帶有TTTr基團的低聚核苷酸基本上是易于純化的，特別是用色譜方法如反相HPLC。
作為本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及帶有取代的或未取代的核酸堿基B的殘基和一個被保護的伯羥基的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或由至少兩種這樣的相同或不同的核苷酸和/或核苷酸類似物制得的低聚核苷酸，保護基是TTTr。
TTTr基團本身是已知的。Marvel等人[Marvel，C.S.，Kaplan，J.F.，Himel，C.M.，J.Am.Chem.Soc.63;1892～1896(1941)]公開了與烷基取代的六芳基乙烷的離解行為有關(guān)的TTTrCl，TTTrOH和TTTr基團的過氧化物。Ashton等人[Ashton，P.R.，Philip，D.，Spencer，N.，Stoddart，J.F.，J.Chem.Soc.Chem.Commun.1124-1128(1992)]描述了TTTr基團在處于納米范圍的機制的建立中，尤其是在叫做rotaxanes和假rotaxanes的建立中作為保護基。
作為核酸化學(xué)中新的保護基，TTTr保護基的特點是它可以驚人地易于引入，可以比通常的DMTr和苯基呫噸-9-基高的區(qū)域選擇性實現(xiàn)該基團的引入。核苷和核苷類似物經(jīng)常可以不用色譜法而從反應(yīng)混合物中分離出來，因此它們可以非常有利地用于大規(guī)模制備用于DNA合成(自動化合成)的核苷單元。此外，新的低聚核苷酸能夠比那些帶有通常的保護基的低聚核苷酸更容易地用已知的方法，比較方便的是用反相HPLC進行純化。
TTTr基能與低聚核苷酸化學(xué)中標(biāo)準(zhǔn)的已知的保護基[Beaucage，S.L.，Iyer，R.，四面體48表1～3(1992)]，比較方便的是與在核酸堿基中游離氨基的保護基同時使用，例如，與未取代的或取代的含有3～12，優(yōu)選4～8，最好5或6個環(huán)碳原子的環(huán)烷基羰基一起使用，優(yōu)選的是與環(huán)己烷羧基(CC)一起使用，或是與脒保護基，典型的是二甲基氨基亞甲基一起使用。本發(fā)明的核苷和核苷類似物適用于以固相方法，甚至以溶液方法合成低聚核苷酸。
在本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選地帶有用于連接核苷酸鍵的仲羥基的所有適宜的核苷，核苷類似物，核苷酸，核苷酸類似物或低聚核苷酸是已知的并在技術(shù)文獻中，例如，在Townsedn，L.B.(Hrsg.)，核苷和核苷酸化學(xué)1，PlenumPress，NewYork(1988)中有述，或者能用已知的方法制備。它們通?？梢杂梢粋€被-O-或-S-間隔開的開鏈碳骨架組成或由一個碳環(huán)或帶有一個核酸堿基B的O-或S-雜環(huán)結(jié)構(gòu)組成。核苷可以是天然的或合成的核苷。
開鏈碳骨架可以適當(dāng)?shù)睾?～12，優(yōu)選3～6個碳原子。碳環(huán)和雜環(huán)結(jié)構(gòu)代表性地可以是含有3～12，優(yōu)選3～8，最好4或5個環(huán)碳原子的單環(huán)系。它們也可以是含有5～16，優(yōu)選8～16個碳原子的雙環(huán)至四環(huán)系。這些結(jié)構(gòu)可以進一步含有取代基，代表性的是被保護的羥基。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中核苷是5元碳環(huán)或呋喃化合物。
如果核酸堿基B是一個嘌呤基或它的類似物，所說的基團可以是式Ⅰ，Ⅰa，Ⅰb，Ⅰc，Ⅰd或Ⅰe的基團
其中R1是H，Cl，Br，NH2或OH，R2，R3和R4各自獨立地為H，OH，SH，NH2，NHNH2，NH2OH，1～12個碳原子的NHO-烷基，F(xiàn)，Cl，Br，1～12個碳原子的烷基或羥基烷基或氨基烷基或烷氧基或烷硫基，其中羥基和氨基是未取代的或被保護基取代的或是苯基，芐基，含有1～20個碳原子的伯氨基或含有2～30個碳原子的仲氨基，R5是H或C1-C4烷基。
伯氨基優(yōu)選含有1～12，最好含有1～6個碳原子，仲氨基優(yōu)選含有2～12，最好含有2～6個碳原子。
優(yōu)選含有1-6個碳原子的烷基，烷氧基，烷硫基，羥基烷基和氨基烷基的說明性實例是甲基、乙基和丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基的異構(gòu)體，以及相應(yīng)的烷氧基、烷硫基、羥基烷基和氨基烷基。烷基、烷氧基、烷硫基、羥基烷基和氨基烷基優(yōu)選地每個含有1～4個碳原子。優(yōu)選地烷基、烷氧基、烷硫基、羥基烷基和氨基烷基是甲基、乙基、正-和異-丙基、正-、異-和叔-丁基、甲氧基、乙氧基、甲硫基和乙硫基、氨基甲基、氨基乙基、羥甲基和羥乙基。
伯氨基和仲氨基代表性地可以是式R6R7N的基團，其中R6是H或獨立地具有R7的含義，R7是烷基部分含有1～20，優(yōu)選1～12，最好1～6個碳原子的烷基、氨基烷基、羥基烷基;羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基部分含有2～8個碳原子，烷基部分含有1～6，優(yōu)選1～4個碳原子;2～20，優(yōu)選2～12，最好2～6個碳原子的鏈烯基;苯基、單或二(C1-C4烷基)苯基或二(C1-C4烷氧基)苯基、芐基、單或二(C1-C4烷基)芐基或二(C1-C4烷氧基)芐基;或1，2-，1，3-，或1，4-咪唑基-C1-C6烷基，或R6和R7合并為四-或五亞甲基，3-氧雜-1，5-亞戊基，-CH2-NR8-CH2CH2-或-CH2CH2-NR8-CH2CH2-，其中R8是H或C1-C4烷基。在氨基烷基中的氨基可以被1或2個C1-C4烷基或C1-C4羥烷基取代。在羥烷基中的羥基是游離的或用C1-C4烷基醚化的。
烷基的實例已在上文引述。氨基烷基的說明性實例是氨基甲基、氨基乙基、1-氨基丙-2-或-3-基、1-氨基丁-2-，-3-或-4-基、N-甲基-或N，N-二甲基-或N-乙基或N，N-二乙基-或N-乙-羥乙基-或N，N-二-2-羥乙基氨基甲基、-氨基乙基、-氨基丙基或-氨基丁基。羥基烷基代表性的是羥甲基、1-羥基-乙-2-基、1-羥基丙-2-或-3-基、1-羥基丁-2-、-3-或-4-基。羧基烷基的實例是羧甲基、羧乙基、羧丙基和羧丁基，烷氧羰基烷基代表性的是用甲基或乙基酯化了的烷氧羰基烷基。鏈烯基代表性地是烯丙基、丁-1-烯-3-或-4-基、戊-3-或-4-烯-1-或-2-基、己-3-或-4-或-5-烯-1-或-2-基。烷基-和烷氧基苯基及烷基-和烷氧基芐基的說明性實例是甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、二乙基苯基、甲基芐基、二甲基芐基、乙基芐基、二乙基芐基、甲氧基苯基、二甲氧基苯基、乙氧基苯基、二乙氧基苯基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基、乙氧基芐基、二乙氧基芐基。咪唑基烷基(其中烷基部分優(yōu)選地含有2～4個碳原子)代表性地可以是1，2-，1，3-或1，4-咪唑基乙基或-正丙基或-正丁基。R8優(yōu)選的是H、甲基或乙基。
伯氨基或仲氨基優(yōu)選的實例是甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、烯丙基氨基、單一或二-(1-羥基-乙-2-基)氨基、苯基-或芐基氨基、乙酰基氨基或苯甲?；被?br> 在一個優(yōu)選的實施方案中R1是氫。在另一優(yōu)選的實施方案中R4是氫。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中R2和R3互相獨立地為H、F、Cl、Br、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、甲基氨基、二甲基氨基、苯甲?；被?、甲氧基、乙氧基和甲硫基。
除了嘌呤以外，嘌呤系列類似物的代表性實例是腺嘌呤、N-甲基腺嘌呤、N-芐基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲硫基腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、3-碳酰腺嘌呤、7-碳酰腺嘌呤、1-碳酰腺嘌呤、6-羥基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-甲硫基嘌呤、2-氨基-6-羥基嘌呤、3-碳酰-6-氯嘌呤、鳥嘌呤、2-甲基鳥嘌呤。腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤和鳥嘌呤是特別優(yōu)選的。
如果核酸堿基B是嘧啶類似物基團，則所說的基團是式Ⅱ、Ⅱa和Ⅱb的基團
其中R5是H或C1-C4烷基，R6、R7和R9互相獨立地具有前述給定的R2的含義，包括優(yōu)選的定義，在式Ⅱb中NH2基上的氫原子可以被C1-C6烷基或苯甲?；〈?，式Ⅱ、Ⅱa和Ⅱb基團的二氫衍生物也是這樣。優(yōu)選地R6是H、C1-C6烷基或羥基烷基、F、Cl、Br、NH2、苯甲?；被?、單-或二-C1-C6烷基氨基，R7優(yōu)選的是H、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基或C1-C6羥基烷基、F、Cl、Br、NH2、苯甲酰基氨基、單-或二-C1-C6烷基氨基。
R5優(yōu)選的是H或甲基。R6優(yōu)選的是H、F、Cl、Br、NH2、NHCH3、N(CH3)2或C1-C4烷基。R7優(yōu)選的是H、C1-C4烷基，更優(yōu)選的是甲基、或NH2、NHCH3或(CH3)2N。
嘧啶類似物的說明性實例是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，核酸堿基的保護基應(yīng)該被認(rèn)為是在本領(lǐng)域中公知的保護基。這樣的保護基的代表性實例是C1-C8烷基;單-或二-環(huán)C1-C12芳烷基;單-或二-環(huán)C7-C12芳烷氧基;單-或二-環(huán)C7-C12鹵代芳烷基;二苯基甲基;被1～4個甲基或甲氧基取代的二苯基甲基;三苯基甲基;被1-6個甲基或甲氧基取代或被1-3個叔丁基取代的三苯基甲基;被苯基或萘基取代的呫噸基;-Si(R10)(R11)和(R12)，其中(R10)、(R11)和(R12)互相獨立地是C1-C20烷基、芐基或苯基;R-C(O)-，其中R是C1-C6烷基、芐基、被甲基、甲氧基或鹵素取代的芐基;C1-C12烷氧基、被下列基團取代的C1-C12烷氧基氟、苯氧基、被甲基、甲氧基或鹵素取代的苯氧基、芐氧基或被甲基、甲氧基或鹵素取代的芐氧基;R13-SO2-，其中R13是C1-C12烷基，C5-C6環(huán)烷基、苯基、被C1-C12烷基或鹵素取代的苯基、芐基或被C1-C12烷基或鹵素取代的芐基;C1-C12烷氧基乙?；蚴俏幢蝗〈幕虮灰粋€或一個以上相同或不同的選自下面的基團取代的苯氧基乙酰基，這些基團是直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、鹵素、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、硝基和氰基;含有3-12個環(huán)碳原子的環(huán)烷基羰基;含有3～12個環(huán)碳原子的被C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代的環(huán)烷基羰基;或脒保護基，例如，二甲基氨基亞甲基。
如上所述，優(yōu)選的保護基是含有3～12，優(yōu)選4～8，最好5或6個環(huán)碳原子的環(huán)烷基羰基，特別是環(huán)己烷羧基，和二甲基氨基亞甲基。
C1-C8烷基代表性的是甲基、乙基、正-或異丙基、正-、異-和叔丁基;單環(huán)C7-C12芳烷基代表性的是芐基、甲基芐基、二甲基芐基;單環(huán)或雙環(huán)C7-C12芳烷氧基可以是甲氧基芐基、二甲氧基芐基;單環(huán)或雙環(huán)C7-C12鹵代烷基是溴代芐基;取代的二苯基甲基代表性的是二(甲基苯基)甲基，二(二甲基苯基)甲基、二(甲氧基苯基)甲基、二(二甲氧基苯基)甲基;取代的三苯基甲基代表性的是二(甲基苯基)甲基、三(二甲基苯基)甲基、三(甲氧基苯基)甲基、三(二甲氧基苯基)甲基，單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三-對-叔丁基苯基甲基;甲硅烷基代表性地包括三苯基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三正丙基甲硅烷基、異丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、正辛基二甲基甲硅烷基和(1，1，2，2-四甲基乙基)二甲基甲硅烷基;R-C(O)-基團代表性的是乙?；⑷阴；?、丙?；⒍□；⑽祯；?、己?；⒈郊柞；?、甲基苯甲酰基、甲氧基苯甲酰基、氯代苯甲?；宕郊柞；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、正-或異丙氧羰基或正-、異-或叔丁氧基羰基、或苯氧基羰基、芐氧基羰基、甲基苯氧基羰基或甲氧基苯氧基羰基或氯代苯氧基-或-芐氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、肉桂酰氧基羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、三甲基甲硅烷基乙氧基羰基、氯代乙氧基羰基、溴代乙氧基羰基、嗎啉代乙氧基羰基;R13-SO2-基團代表性的是甲基磺?；⒁一酋；?、丙基磺?；?、丁基磺?；?、苯基磺酰基、芐基磺?；?、對溴磺酰基、對甲氧磺?；蛯谆交酋；?烷氧基乙?；捅窖趸阴；硇缘氖羌籽趸阴；?、乙氧基乙?；⒈窖趸阴；?對-甲基苯氧基)乙?；?對-叔丁基苯氧基)乙?；?。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，特別適宜的核苷或核苷酸具有下面式Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc和Ⅲd之一的結(jié)構(gòu)
其中R14是氫或一個形成核苷酸連接基的基團，R15是氫或環(huán)己基羰基。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)、特別適宜的核苷酸是那些在式Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc和Ⅲd中的R14是式Ⅳa、Ⅳb或Ⅳc的含磷基團的核苷酸 它形成核苷酸連接基團，其中
Z1是氧或硫;
X、X′和X″互相獨立地是帶有負(fù)電荷的氧或硫，所帶的反離子是Li、Na、K、Cs、叔或季銨;或X′和X″互相獨立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;
X'''是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;
Rb是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基;
R18和R19互相獨立地是氫、C1-C12烷基、C2-C12鏈烯基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基或C7-C20烷芳基;
在R18、R19和Rb定義中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未取代的或是被烷氧基、烷硫基、鹵素、-CN，-NO2，苯基、硝基苯基或鹵代苯基取代。
叔和季銨應(yīng)被認(rèn)為是指式RfRgRhRiN的離子，其中陽離子N可以是飽和的或不飽和的單環(huán)至三環(huán)系中的一員，Rf是烷基或氨基烷基，烷基部分是1～20，優(yōu)選1～12，最好1～6個碳原子;羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基含有2～8個碳原子，烷基含有1～6，優(yōu)選1-4個碳原子;含有2～20，優(yōu)選2～12，最好2～6個碳原子的鏈烯基;苯基、單-或二(C1-C4烷基)苯基或二(C1-C4烷氧基)苯基、芐基、單-或二(C1-C4)芐基或二(C1-C4烷氧基)芐基;或1，2-，1，3-或1，4-咪唑基-C1-C6烷基;Rg、Rh和Ri互相獨立地是氫或具有Rf的含意，或Rf和Rg合并成亞烷基、四-或五-亞甲基，3-氧雜-1，5-亞戊基、-CH2-NRe-CH2CH2-或-CH2CH2-NRe-CH2CH2-，其中Re是H或C1-C4烷基，Rh和Ri互相獨立地具有Rf的含意。在氨基烷基中的氨基可以被1個或2個C1-C4烷基取代。
羧基烷基的說明性實例是羧甲基、羧乙基、羧丙基和羧丁基，烷氧羰基烷基代表性的是用甲基或乙基酯化的烷氧羰基烷基。鏈烯基代表性的是烯丙基、丁-1-烯-3-或-4-基、戊-3-或-4-烯-1-或-2-基、己-3-或-4-或-5-烯-1-或-2-基。烷基-和烷氧基苯基及烷基-和烷氧基芐基代表性的實例是甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、二乙基苯基、甲基芐基、二甲基芐基、乙基芐基、二乙基芐基、甲氧基苯基、二甲氧基苯基、乙氧基苯基、二乙氧基苯基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基、乙氧基芐基、二乙氧基芐基。咪唑基烷基(其中烷基部分優(yōu)選含有2～4個碳原子)代表性地可以是1，2-、1，3-或1，4-咪唑基乙基或-正丙基或-正丁基。
作為烷基的R18、R19和Rb的說明性實例是甲基、乙基和丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基的異構(gòu)體。作為芳基的R18、R19和Rb代表性的是苯基和萘基。作為鏈烯基的R18和R19代表性地是烯丙基和(C1-C4烷基)-CH＝CH-CH2-。作為芳烷基的R18、R19和Rb的說明性實例是苯基-CnH2n-，其中n是1～6的整數(shù)，優(yōu)選芐基。作為烷芳基的R18、R19和Rb的代表性實例是單-、二-和三(C1-C4烷基)。優(yōu)選的取代基是氯、溴、甲氧基、-NO2、-CN、2，4-二氯苯基和4-硝基苯基。Rb的代表性實例是2，2，2-三氯乙基、4-氯苯基、2-氯苯基和2，4-二氯苯基。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，Rb是β-氰基乙基，R18和R19是二(異丙基)，X'''是O。
核苷酸和低聚核苷酸可以通過連接基團以共價鍵鍵合于一種固體載體材料上，適宜的載體材料代表性地硅膠、可控多孔玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚氨基甲酸乙酯、聚烯烴、聚酰胺，聚醚和醚化或?；睦w維素衍生物。根據(jù)對載體材料的選擇，可以從二元羧酸、二氨基甲酸乙酯或烷氧基甲硅烷基氨基甲酸乙酯中衍生出連接基團。精制、載荷載體材料是商業(yè)上可得到的。
TTTr保護基的引入通常是按照Gait等人[Gait，M.J.，Matthes，H.W.D.，Singh，M.Sproat，B.S.，Titmas.，R.C.，inGassen，H.G.，Lang，A.(Hrsg.)基團片段的化學(xué)和酶促合成(ChemicalandEnzymaticSynthesisofGeneFragments)VerlagChemie，Weinheim1-42(1982)]所描述的方法進行的。通常在引入TTTr基之前引入氨基保護基，優(yōu)選?；?。為了做到這一點，未被保護的核苷能夠在適宜的質(zhì)子惰性、極性、堿性溶劑如吡啶、N-甲基嗎啉、二甲基甲酰胺、乙腈或四氫呋喃中于室溫下用三烷基氯硅烷，例如三甲基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷或三異丙基氯硅烷，或四烷基二硅氧烷，代表性的是1，1，3，3-四異丙基-1，3-二氯二硅氧烷處理進行完全的甲硅烷基化。甲硅烷基化后優(yōu)選地與一種未取代的或取代的環(huán)烷基碳酰氯或與二甲基氨基亞甲基進行反應(yīng)，此時只有核酸堿基的氨基官能團被?；又眠m宜的親核試劑，代表性地用水溶液中的銨、 優(yōu)選氟化銨水溶液處理進行甲硅烷基的溶劑分解。除去溶劑后，?；暮塑湛梢院苋菀椎馗鶕?jù)它們的溶解特性進行分離。
TTTr基團的引入可通過將優(yōu)選酰化了的核苷與三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯，方便地在存在有空間位阻叔胺的適宜的質(zhì)子惰性、極性、堿性溶劑如吡啶，N-甲基嗎啉、二甲基甲酰胺、乙腈或四氫呋喃(優(yōu)選吡啶)中進行反應(yīng)來實現(xiàn)。離析物的溶解度特性使得產(chǎn)物很容易被分離。過量的三苯甲基化試劑用石油醚，優(yōu)選地用40～60℃沸程的餾分經(jīng)加熱浸提來除去。
新的核苷能夠用已知的方法進一步轉(zhuǎn)化成氨基磷酸酯。H-膦酸酯或三酯衍生物。這些化合物適于低聚核苷酸的固相法合成和溶液法合成。
本發(fā)明的另一方面是涉及一種制備式(Ⅴ)的低聚核苷酸的方法其中U和V是相同的或不同的天然或合成的核苷殘基，m和n互相獨立地為0或1～200的整數(shù)，m和n之和為2～200，該方法為
(a)將式Ⅵ化合物其中R20是一個保護基，U′和V′具有U和V的含意，m′和n′相互獨立地為0或1～199的整數(shù)，m′與n′之和為2～199，R21是式Ⅳa、Ⅳb或Ⅳc的含磷基團 它形成核苷酸連接基團，其中Z1是氧或硫;
X、X′和X″互相獨立地是帶有負(fù)電荷的氧或硫，所帶的反離子是Li、Na、K、Cs、叔或季銨;或X′和X″互相獨立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;
X'''是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基，-ORb或-SRb;
Rb是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基;
R18和R19互相獨立地為氫、C1-C12烷基、C2-C12鏈烯基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基或C7-C20烷芳基;
在R18、R19和Rb定義中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未取代的或是被烷氧基、烷硫基、鹵素、-CN，-NO2，苯基、硝基苯基或鹵代苯基取代的，與式Ⅶ化合物進行反應(yīng)式Ⅶ中U″和V″具有U和V的含意，m″和n″互相獨立地是0或1～198的整數(shù)，m″與n″之和為2～198，R22是(ⅰ)式Ⅳb的基團，其中Z是氧或硫;X′和X″互相獨立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;Rb是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、定義為Rb的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未被取代的或是被烷氧基、烷硫基、鹵素、-CN、-NO2、苯基、硝基苯基或鹵代苯基取代的;
(ⅱ)羥基保護基;或(ⅲ)通過一個連接基團連接于固體載體材料上的連接鍵;
(b)如有必要，重復(fù)步驟(a)直到形成所需長度的低聚核苷酸，在每次偶合前除去保護基R20，將存在的任何游離羥基封端，然后將生成的亞磷酸酯氧化成磷酸酯，(c)如果需要，除去或分離出低聚核苷酸，和(d)除去剩余的保護基R20，所說的保護基R20是TTTr。
本方法的一個特別優(yōu)選的實施方案包括制備式V的低聚核苷酸，其中m與n之和為2～50，優(yōu)選2～30。在低聚核苷酸中的核苷通常是通過酯基連接的。說明性實例是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸酯、膦酸氫酯、磷酸酯、碳酸酯和氨基甲酸酯。
該方法可用固相法或溶液法加以實施。兩種方法本身均是已知的并且通常是在-20℃～100℃，優(yōu)選10℃～60℃的溫度范圍內(nèi)進行的，較方便的是在惰性溶劑存在下進行。隋性溶劑的說明性實例是乙腈、吡啶、二噁烷、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲基醚、二乙二醇二甲基醚、氯仿、三氯乙烷、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、四氫呋喃、二丁基醚和二乙基醚。如果以固相法實施本方法，則較方便地用商業(yè)上可得到的DNA合成儀使用各制造商所述的并且同樣能從相應(yīng)生產(chǎn)廠家獲得的試劑，如溶劑、封端溶液，氧化溶液、偶合試劑和脫三苯甲基化溶液，以及制得的式Ⅶ化合物進行合成。
關(guān)于R21的羥基保護基應(yīng)被認(rèn)為是指核酸堿基的保護基，不包括脒類化合物。
上文已敘述了固體載體材料。用飽和氨水溶液可以從載體材料上除去最終的低聚核苷酸，同時將低聚核苷酸的核酸堿基上的保護基除去。該方法也適用于同時除去環(huán)烷基羧酸保護基。
TTTr保護基可以方便地在酸性條件下除去，較方便的是使用二氯乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、乙酸、ZnBr2、三氟化硼二乙醚合物。
用已知的方法，方便的是使用乙酸酐、N-甲基咪唑或2，6-二甲基吡啶將存在的任何游離羥基封端。
用碘的水溶液或叔丁基過氧化氫的乙腈溶液可以方便地將亞膦酸酯氧化成磷酸酯。
最終的低聚核苷酸可用色譜法或電泳法加以分離。用反相HPLC分離是有利的。
另一方面，本發(fā)明涉及新的核苷，核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物和低聚核苷酸在制備式Ⅴ的低聚核苷酸化合物的方法中的應(yīng)用。
對于低聚核苷酸的純化來說使用TTTr基團是特別有利的?，F(xiàn)已進一步發(fā)現(xiàn)新的被保護的低聚核苷酸的特點在于在中性水溶液緩沖劑體系中其穩(wěn)定性比被通常的4，4′-二甲氧基三苯甲基保護的低聚核苷酸的穩(wěn)定性大，因此在純化過程中，特別是在HPLC純化中，去三苯甲基化的損失較低。
下列實施例更說細(xì)地說明了本發(fā)明。
A起始化合物的制備實施例A1N2-環(huán)己基羰基-2′-脫氧鳥苷的制備28克脫氧鳥苷溶于3×200毫升無水吡啶中，在真空下于50℃將溶液濃縮至干。用340毫升二異丙基乙基胺提取核苷并向溶液中加入127毫升三甲基氯硅烷。混合物在室溫下攪拌2小時，然用用1小時加入100毫升無水四氫呋喃(THF)和20.4毫升環(huán)己烷碳酰氯的溶液。16小時后反應(yīng)混合物冷卻至0℃，用1小時加入100毫升甲醇，接著加入180毫升35%氟化銨水溶液。氟化物加完1小時后，在真空下于50℃蒸發(fā)除去揮發(fā)性成分。剩余的吡啶與2×200毫升甲苯共蒸發(fā)除去。粗產(chǎn)物與700毫升冰水一起攪拌30分鐘，然后過濾。濾餅用700毫升沸騰的乙醇/水(73V/V)溶液處理。熱過濾除去不溶物。題目化合物從冷卻的濾液中析出，將其真空干燥。
1H-NMR(DMSO)8.14s，H8;6.21t，1′;5.34，4.972Hs(寬)OH;4.88m，3′;3.8m，4′;2.52H2′-，H1(CC基團);2.26m，2′;1.1-1.910H，m，CC基團。
實施例A2N4-環(huán)己基羰基-2′-脫氧胞苷的制備5.3克脫氧胞苷溶于3×100毫升無水吡啶中并在高真空下于55℃下濃縮至干。干燥的離析物溶于100毫升無水吡啶中并向溶液中加入25.4毫升三甲基氯硅烷。將混合物攪拌2小時，然后滴加6.3克環(huán)己烷碳酰氯在40毫升無水THF中的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時，然后，在用冰冷卻的同時，慢慢加入20毫升甲醇。通過加入36毫升水從35%氟化銨水溶液中實施去甲硅烷基化。60分鐘后，反應(yīng)混合物在真空下于55℃濃縮至干。剩余的吡啶用2×100毫升水共蒸發(fā)除去。粗產(chǎn)物溶于100毫升水中并用3×100毫升正丁醇萃取，合并丁醇相，用硫酸鈉干燥，并在真空下55℃濃縮至油狀。油狀物在500毫升乙醚中攪拌5小時，此時題目化合物的晶體析出。晶體用抽濾法收集并在高真空下干燥。
1H-NMR(CD3OD)8.47d，H6;7.44d，H5;6.22q，1′;4.4，4.033′，4′;3.7-3.92H，m，5′;2.35～2.552H，m，2′，C-1，CC基團，2.07～2.25m，2′;1.4-1.9，1.1-1.6510H，m，CC基團。
實施例A3N6-環(huán)己基羰基-2′-脫氧腺苷的制備5.4克的脫氧腺苷溶于3×100毫升無水吡啶中，然后在高真空下于55℃將溶液濃縮至干。將干燥的離析物溶于100毫升無水吡啶中并向溶液中加入68毫升二異丙基乙基胺。然后加入25.4毫升三甲基氯硅烷。將混合物攪拌2小時，然后向混合物中滴加6.3克環(huán)己烷碳酰氯在40毫升無水THF中的溶液。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時，然后，在用冰冷卻的同時，緩慢地加入20毫升甲醇。通過加入36毫升水從35%氟化銨的水溶液中實施去甲硅烷基化。60分鐘后，反應(yīng)混合物在真空下于55℃濃縮至干。粗產(chǎn)物溶于100毫升乙酸乙酯中并連接用100毫升碳酸氫鈉水溶液和100毫升鹽水萃取溶液。有機相用硫酸鈉干燥并在真空下于55℃濃縮至油狀。從二乙醚中沉淀制得題目化合物。
1H-NMR(CDCl3)8.35，8.33，2s，腺嘌呤;6.25t，1′;4.34m，3′;3.78m，4′;3.52H，m，5′;2.55，2.4，2.23H，3m，2′，C-1 CC基團;1.85-1.110Hm，CC基團。
N6-環(huán)己基羰基-2′-脫氧腺苷對用亞磷酸三酯法合成DNA的碘氧化的穩(wěn)定性1克N6-環(huán)己基羰基-2′-脫氧腺苷用含有3%碘、2%水、20%吡啶和75%THF的溶液處理22小時。22小時之后，反應(yīng)混合物的薄層色譜表明未發(fā)生反應(yīng)。
B本發(fā)明化合物的制備實施例B15′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)-N2-環(huán)己基羰基-2′-脫氧鳥苷的制備27克N2-環(huán)己基羰基-2′-脫氧鳥苷溶于3×200毫升無水吡啶中，然后在高真空下于50℃將溶液濃縮至干。將核苷溶于600毫升無水吡啶中并向溶液中加入100毫升三乙胺，然后加入34.4克三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯。將反應(yīng)混合物攪拌18小時并過濾除去沉淀。濾液在真空下于50℃濃縮至干。剩余物溶于600毫升二氯甲烷中并用2×500毫升冷的飽和碳酸氫鈉溶液萃取，然后用500毫升鹽水萃取。有機相用硫酸鈉干燥，過濾除去鹽，在100～200托下將濾液濃縮至干。產(chǎn)物懸浮于100毫升甲醇中。將懸浮液過濾并將濾液冷卻至0℃，于是新鮮的產(chǎn)物析出。在500毫升石油醚中將產(chǎn)物劇烈攪拌2小時，用過濾法分離出題目化合物并在60℃/30～50托的真空干燥器中干燥。
1H-NMR(CD3OD)7.95H8，7.1512H，TTTr;6.22t，1′;4.47m，3′;3.95m，4′;2.65m，2′;2.2～2.45m，2′，H1(CC基團);1.8-1.110H，m，CC基團;1.1327H，2s，TTTr基團。
實施例B25′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)-N2-環(huán)己基羰基-2′-脫氧鳥苷-3′-(氰乙基)二異丙基氨基磷酸酯的制備在干氬氣氣氛下，向在800毫升無水乙腈中的27.7克5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)-N2-環(huán)己基羰基-2′-脫氧鳥苷中加入20.6毫升二(二異丙基氨基氰乙基)膦和2.67克四唑，將混合物攪拌18小時。然后加入8毫升三乙胺并在真空下于50℃除去溶劑。粗產(chǎn)物溶于500毫升乙酸乙酯中并用2×500毫升冷的飽和碳酸氫鈉萃取，然后用500毫升鹽水萃取一次。有機相在真空下于50℃濃縮至干，產(chǎn)生一種油狀物，它可以進一步直接用于N-甲基嗎啉-5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)-N2-環(huán)己基羰基-2′-脫氧鳥苷-3′-(氰乙基)硫代磷酸酯的制備(實施例B3)。為了純化，將產(chǎn)物在硅膠上進行快速色譜。產(chǎn)物用正己烷乙酸乙酯N-甲基嗎啉(30691，V/V/V)進行洗脫。從合并的餾分中獲得的題目化合物在真空下于50℃濃縮至干。在高真空下進一步蒸發(fā)溶劑剩余物得到白色泡沫體。
31P-NMR(CDCl3)148.3，147.6;1H-NMR(CDCl3)7.76，7.722s H8(鳥嘌呤);7.38，7.212H，2m，TTTr基團;6.121′;4.65m，3′;2.55，2.6;2tCNE 1.2227H，s，TTTr基團;1.1，0.9812H，異丙基(amidite)。
實施例B3N-甲基嗎啉-5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)-N2-環(huán)己基羰基-2′-脫氧鳥苷-3′-(O)-氰乙基硫代磷酸酯的制備在干氬氣氣氛下，向在1200毫升無水乙腈中的92.2克5′-(三-叔丁基三苯甲基)-N2-環(huán)己基羰基-2′-脫氧鳥苷中加入84毫升二(二異丙基氨基氰乙基)膦和422毫升0.5M四唑溶液，將混合物攪拌18小時。然后加入16毫升三乙胺并于50℃在真空下除去溶劑。粗產(chǎn)物溶于1200毫升乙酸乙酯中并用2×1200毫升冷的飽和碳酸氫鈉萃取，然后用1200毫升鹽水萃取一次。有機相在真空下于50℃濃縮至干，得到油狀物。用10×200毫升甲苯濃縮能夠除去產(chǎn)物中的一些雜質(zhì)，因此得到白色泡沫狀的粗氨基磷酸酯。粗氨基磷酸酯分兩批進一步反應(yīng)，為了進一步加工與200克粗amidite混合。粗amidite溶于1.2升乙腈中并加入3.7毫升水和77克四唑。將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，然后加入77克硫和1.2升吡啶。將反應(yīng)液在室溫攪拌17小時并于50℃在真空下濃縮至干。粗產(chǎn)物用600毫升1M N-甲基嗎啉碳酸氫鹽的水溶液和600毫升乙酸乙酯萃取，過濾除去析出的硫。有機相再用2×600毫升的1M N-甲基嗎啉碳酸氫鹽水溶液萃取一次。有機相用硫酸鈉干燥并于50℃在真空下濃縮至干。粗產(chǎn)物然后用快速色譜提純，所用的柱為4Kg硅膠(230～400目)柱。產(chǎn)物用乙酸乙酯甲醇N-甲基嗎啉(9091，V/V/V)洗脫。合并的產(chǎn)物餾分在真空下于50℃濃縮至干。油狀產(chǎn)物在500毫升正戊烷中攪拌5小時，得到粉狀的題目化合物。31P-NMR(CDCl3)57.21，56.80ppm。
實施例B45′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷的制備3.6克的胸腺嘧啶脫氧核苷溶于3×25毫升的無水吡啶中并在真空下于55℃濃縮。向如此獲得的干燥產(chǎn)物中于0℃用1小時的時間加入14.8克三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯在25ml二氯甲烷中的溶液。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時，然后在高真空下濃縮。產(chǎn)生的白色泡沫狀產(chǎn)物溶于100毫升二氯甲烷中并用2×100毫升冷的飽和碳酸氫鈉水溶液萃取，然后用100毫升鹽水萃取。用硫酸鈉干燥有機相，然后濃縮至白色泡沫狀。該泡沫狀物從甲醇和水的混合物(7030，V/V)中重結(jié)晶。抽濾白色晶狀產(chǎn)物并在高真空下干燥。
1H-NMR8.12N3-H;7.65H-6;7.2512H，m，TTTr基團;6.45t，1′;4.66m，3′;4.034′;3.52-3.382H，m，5′;2.4m，2′;1.563H，CH53;1.327H，s;TTTr基團。
實施例B55′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(氰乙基)二異丙基氨基磷酸酯的制備57克的5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷溶于3×25毫升無水吡啶中，溶液在高真空下于50℃濃縮。這樣獲得的干燥離析物溶于1升無水乙腈中。向此溶液中加入50毫升二(二異丙基氨基)氰乙基膦和7.9克(113mmol)四唑。將反應(yīng)混合物攪拌17小時。然后加入38毫升三乙胺。反應(yīng)混合物在真空下于50℃濃縮。生成的油狀產(chǎn)物溶于500毫升乙酸乙酯中并用2×500毫升冷的碳酸氫鈉飽和水溶液萃取，然后用500毫升鹽水萃取。有機相用硫酸鈉干燥，然后濃縮至油狀。將此油狀物溶于1升由99%甲醇和1% N-甲基嗎啉組成的溶液中。在連接攪拌和冰冷卻下，慢慢地滴加水直至產(chǎn)物以白色晶體的形式析出。用過濾法分離出題目化合物并在高真空下用P4O10/KOH干燥。
1H-NMR(CDCl3)7.752s，H6;7.3312H，s，TTTr基團;1.48m，1′;4.78m，3′;4.16，4.232m，4′;3.95～3.32H，mCNE基團，2H，m異丙基(amidite)，2H，m5′;2.9-2.44H2H，m2′，2H，2t，CNE基團;1.45-1.1542H叔丁基，TTTr基團，CH3，amidite，CH53;31P-NMR148.4，148.2。
實施例B65′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)-N2-環(huán)己基羰基-2′-脫氧鳥苷-3′-(O)-氰乙基-(S)-2，4-二氯芐基硫代磷酸酯的制備避光，于室溫下將1.4克N-甲基嗎啉-5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)-N2-環(huán)己基羰基-2′-脫氧鳥苷-3′-(O)-氰乙基硫代磷酸酯與0.8毫升2，6-二甲基吡啶和1.95毫升2，4-二氯芐基氯在50毫升氯仿中攪拌4天。產(chǎn)物混合物在真空下于50℃濃縮至油狀。此油狀物溶于100毫升二氯甲烷中并連續(xù)用飽和碳酸氫鈉水溶液洗兩次和用100毫升鹽水洗一次。有機相用硫酸鈉干燥并在真空下濃縮至油狀，將油狀物在石油醚/吡啶中攪拌5小時。抽濾這樣獲得的固體題目化合物并用P4O10/KOH干燥。
31P-NMR(CDCl3)27.0，27.6ppm;PD-MS[M-DCB+n]-＝936;[M+Na+]+＝1120;[TTTr]+＝412;[GCC]+＝263。
實施例B75′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(O)-氰乙基-(S)-2，4-二氯芐基硫代磷酸酯的制備避光，在室溫下將2.7克N-甲基嗎啉5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(O)-氰乙基硫代磷酸酯與1.8毫升2，6-二甲基吡啶和4.4毫升2，4-二氯芐基氯在35毫升氯仿中攪拌4天。將混合物在真空下于50℃濃縮至油狀。該油狀物溶于100毫升二氯甲烷中并連續(xù)用碳酸氫鈉飽和水溶液洗兩次和用100毫升鹽水洗一次。有機相用硫酸鈉干燥并在真空下濃縮至油狀，將此油狀物在石油醚/吡啶中攪拌5小時。這樣制得的固體標(biāo)題化合物用抽濾法過濾并用P4O10/KOH干燥。
31P-NMR(DCCl3)27.42;27.24;H1-NMR(CDCl3)8.6NH;7.52H6;7.1615H，m，TTTr;6.45m，1′;5.23m，3′;3.95-4.154H，m，CNE基，DCBn基;3.322Hm，5′;2.3.2.654H，m，CNE基;2′;1.230H，2s，TTTr基，CH53。
8克5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(O)-氰乙基-(S)-2，4-二氯芐基硫代磷酸酯溶于25毫升3%二氯乙酸在二氯甲烷中的溶液中并將其加入到裝有硅膠的快速色譜柱中。用二氯甲烷甲醇DCA(9811，V/V/V)洗脫三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基甲基醚和三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基醇。此后用二氯甲烷甲醇(91，V/V)洗脫產(chǎn)物。在真空下于55℃將餾分濃縮至油狀。然后將此油狀物溶于250毫升乙酸乙酯中，用5×250毫升1M乙酸鈉水溶液洗至無二氯乙酸鹽并用硫酸鈉干燥。然后在真空下除去溶劑，得到胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(O)-氰乙基-(S)-2，4-二氯芐基硫代磷酸酯。
31P-NMR(CDCl3)28.15，27.79;1H-NMR(CDCl3)8.48NH;7.45，7.174H，DCBn基，H6;6.05m，1′;5.133′，m;4.0-4.35H，DCBn基，4′，CNE基;3.78m，5′;2.7m，m，CNE基;2.352′;1.87s，CH53。
實施例B8三乙基銨5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(S)-二氯芐基硫代磷酸酯的制備16克5′(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(O)-氰乙基-(S)-2，4-二氯芐基硫代磷酸酯溶于500毫升乙腈/三乙胺(91，V/V)的溶液中。兩小時后將溶液在真空下濃縮，剩余物在500毫升乙醚中攪拌2小時。用抽濾法過濾產(chǎn)物并在高真空下干燥，得到題目化合物。
31P-NMR(CDCl3)16.69;1H-NMR(CDCl3)7.58s，H6;7.1515H，m，TTTr;6.34m，1′;5.05m，3′;3.85-4.13H，m，4′，DCBn;3.155′;2.926H，q，三乙胺;2.22，2.3;2′;0.9-1.35m，39H，TTTr，三乙胺，CH53。
實施例B95′-(三4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)-N6-吡咯烷基亞甲基-2′-脫氧腺苷的制備233毫克N6-吡咯烷基亞甲基脫氧腺苷溶于3×10毫升無水吡啶中，然后將溶液在真空下濃縮至干，在此過程中溫度不超過50℃。此后產(chǎn)物溶于10毫升無水吡啶中。在攪拌下，于0℃用1小時向此溶液中加入343.8毫克TTTrCl和10毫升二氯甲烷的溶液。60小時后將反應(yīng)混合物濃縮至2毫升并將此剩余物轉(zhuǎn)移至100毫升水中。沉淀溶于100毫升二氯甲烷中。有機相用2×100毫升碳酸氫鈉飽和水溶液萃取，然后用100毫升鹽水萃取。洗過的有機相用硫酸鈉干燥。除去鹽并將產(chǎn)物濃縮至干。固體產(chǎn)物在100毫升石油醚(高沸點)中研制1小時。用過濾法將產(chǎn)物分離，母液冷卻至0℃并經(jīng)過濾進一步分離產(chǎn)物。然后用0℃的冷的石油醚(高沸點)洗濾餅并在高真空下干燥得到題目化合物。
1H-NMR(CDCl3)9.28s，脒;8.62;s，腺嘌呤;7.412H，m，TTTr;6.62m，1′;4.77m，3′;4.22m，4′;3.3，3.822m，4H，吡咯烷基;3.54d，2H，5′;2.88，2.552m，2′;2H，2.06m，4H，吡咯烷基;1.4s，27H，TTTr。
實施例B105′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)-N2-二甲基氨基亞甲基-2′-脫氧鳥苷的制備967毫克N2-二甲基氨基亞甲基脫氧鳥苷溶于3×10毫升無水吡啶中，然后在真空下將溶液濃縮至干，此時溫度不超過50℃。此后產(chǎn)物溶于10毫升無水吡啶中。在攪拌下于0℃用1小時向此溶液中加入2950毫克TTTrCl和10毫升二氯甲烷的溶液。60小時后將反應(yīng)混合物濃縮至2～3毫升并將此剩余物轉(zhuǎn)移至100毫升水中。沉淀溶于100毫升二氯甲烷中。有機相用2×100毫升碳酸氫鈉飽和水溶液萃取，然后用100毫升鹽水萃取。洗過的有機相用硫酸鈉干燥。除去鹽并將產(chǎn)物濃縮至干。固體產(chǎn)物在100毫升石油醚(高沸點)中研制1小時。用過濾法分離產(chǎn)物，將母液冷卻至0℃并用過濾法進一步分離產(chǎn)物。然后用0℃冷的石油醚(高沸點)洗濾餅并在高真空下干燥得到題目化合物。
1H-NMR(DMSOD6)11.2，8.46，7.752s，脒，鳥嘌呤;7.0812H，m，TTTr;6.12m，1′;5.22s，OH;4.37m，3′;3.75m，4′;2.96m，5H，5′，脒;2.89s，3H，脒;2.5，2.152m，2′;1.08s，27H，TTTr基。
實施例B11N-(1-甲基-2-亞吡咯烷基)-5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)腺苷的制備將50克干的腺苷，20克分子篩(3 )，800毫升無水甲醇和80毫升無水吡啶在室溫下攪拌并加入29.04克蒸餾過的N-甲基吡咯烷酮二甲基乙縮醛。過濾除去分子篩。濾液在真空下濃縮。剩余物用3×100毫升乙腈提取、濃縮并干燥。將此物料溶于450毫升無水吡啶中并向溶液中加入50克分子篩(5 )。將反應(yīng)混合物在60℃下攪拌并加入100.3克固體三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯甲烷，攪拌15小時后，將反應(yīng)溫度升高到70℃保持5小時。過濾除去分子篩并將濾液濃縮至干。將剩余物加入到硅膠柱中(乙酸乙酯/甲醇/N-甲基嗎啉2020.1;直徑8厘米)。收集含有題目化合物的餾分，濃縮并干燥。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)1.27(s，c.27H，3(CH3)3C-ar);2.04(m，3H);2.37(m，2H);2.90～3.15(m，2H);3.18(s，NCH3);3.2-3.3(m，2H);3.39(t，c.1H);3.51(t-like m，J＝8，3H);3.69(s，2H);4.37(d-like m，J＝5，1H)，4.45(br.s，1H);4.82(t，J＝5，1H);5.99(d，J＝7，H-C(1′);6.72(br.s，1H);7.20(s，12H);8.23(s)和8.54(S)(H-C(2.8))。
實施例B125′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)-6-甲基尿嘧啶的制備將40毫摩爾的6-甲基尿嘧啶溶于75毫升無水吡啶中。溶液加熱到60℃并加入44毫摩爾固體三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯甲烷。在60℃攪拌6小時后，真空除去溶劑并用甲苯將剩余物濃縮一次，用乙腈濃縮兩次。粗產(chǎn)物溶于600毫升氯代甲烷中并用200毫升飽和NaHCO3溶液洗。有機相用Na2SO4干燥并在真空下除去溶劑。剩余物溶于220毫升熱的乙醇/水混合物(32)中并在0℃結(jié)晶。熔點169～170℃。
1H NMR(250MHz，CDCl3)1.29(s，c.27H，3(CH3)3C-ar);1.38(s，3H，CH3C(5));3.14(br.d，1H);3.47(ABM體系，2H，H2C(5′));4.22(d-like m，1H)和4.47(m，2H)(HC(2′，3′，4′);5.13(br.s，1H);5.96(d，J＝4，1H，HC(1′));7.15-7.35(m，c.12H，H-(ar));7.81(s，HC(6));9.75(br.s，HN(3))。
實施例B135′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)尿苷的制備將200毫摩爾核糖尿苷溶于375毫升無水吡啶中。溶液加熱至60℃并加入220毫摩爾固體三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯代甲烷。在60℃攪拌6小時后，真空下除去溶劑，剩余物用甲苯濃縮一次，用乙腈濃縮兩次。粗產(chǎn)物溶于600ml氯代甲烷中并用200毫升飽和碳酸氫鹽溶液洗。剩余物溶于220毫升熱的乙醇/水混合物(32)中并在0℃結(jié)晶。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)1.29(s，c.27H，3(CH3)3C-ar);3.14(br.d，1H);3.54(ABM體系，2H，H2C(5′));4.18(d-like m，1H)，4.33(m，1H)和4.45(q-like m，1H)(HC(2′，3′，4′);5.23(d，J＝8，1H，HC(5));5.35(br.s，1H);5.91(d，J＝2，1H，HC(1′));7.15-7.35(m，c.12H，H-(ar);8.10(d，J＝8，1H，HC(6));10.06(br.s，HN(3))。
實施例C15′-(5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(S)-2，4-二氯芐基亞硫酰胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(O)-氰乙基-(S)-2，4-二氯芐基硫代磷酸酯的制備將3.2克胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(S)-二氯芐基-(O)-氰乙基硫代磷酸酯和5.85克5′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(O)-氰乙基-(S)-2，4-二氯芐基硫代磷酸酯溶于4.25毫升無水N-甲基咪唑和8.1克三異丙基苯磺酰氯在125毫升無水吡啶的溶液中?；旌衔镌谑覝財嚢?.5小時，然后加入10毫升水。反應(yīng)混合物在55℃濃縮至油狀。粗產(chǎn)物溶于500毫升乙酸乙酯中并連續(xù)用2×250毫升N-甲基嗎啉碳酸氫鹽水溶液萃取和用500毫升鹽水萃取一次。有機相用硫酸鈉干燥，除去鹽后，真空下于55℃蒸發(fā)至干。產(chǎn)物溶于乙醚并從石油醚中析出。過濾將沉淀分離并從正戊烷中重結(jié)晶，得到固體題目化合物。
31P-NMR(CDCl3)28.1，27.8，27.7，27.3(4-非對映異構(gòu)體);1H-NMR(CDCl3)8.5-9，NH;7.581H，H6;7.26-7.416H，m，DCBn基，TTTr基，H6;6.44，6.152H，2m，1′;5.05-5.2;5.26-5.422H，2m，3′;4.05-4.458H，m，DCBn基，CNE基，5′，4′，3.3-3.52H，m，5′;2.65-2.75，2.38-2.66H，CNE基，2′;1.843H，s，CH53;1.3，s，30H，TTTr基，CH53。
實施例C25′-(三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基)胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(氰乙基)二異丙基氨基磷酸酯在用亞磷酸三酯法自動合成DNA中的應(yīng)用用商業(yè)上可得到的DNA合成儀(AppliedBiosystemInc，(ABI)使用制造商所述的試劑，即，乙腈，封端溶液，氧化溶液，偶合試劑(四唑)和脫三苯甲基化溶液，CDG-DMTrT載體進行合成。除了將脫三苯甲基化時間加倍外，實施生產(chǎn)廠家所述的合成方案。
進行下列合成用TTTr amidite合成T10，T20和T30。作為對比，序列T10用已知的DMTr amidites使用相同的合成試劑進行合成。在全部低聚核苷酸的合成中，5′-末端保護基，即TTTr基或，在對照序列中，DMTr基，在最后的偶合步驟之后被留在聚合物上。當(dāng)合成完全時，在55℃用15小時用飽和氨水溶液從載體上將低聚核苷酸除去。過濾掉CPG載體后，將產(chǎn)物溶液凍干。產(chǎn)物混合物溶于HPLC緩沖劑中，過濾并用商業(yè)上的C-18反相柱進行分離。
HPLC色譜圖分析表明TTTramidites與已知的DMTramidites一樣適用于用亞磷酸三酯法合成低聚核苷酸。在相同條件下，TTTr端基保護的低聚核苷酸在C-18反相HPLC柱上具有更長的保留時間，因此在使用TTTr基團時只需要一個較低的柱效就可分離不合格的序列。
權(quán)利要求
1.一種在其基本結(jié)構(gòu)中帶有未取代的或取代的核酸堿基B殘基和一個被保護的伯羥基的核苷、核苷類似物，核苷酸、核苷酸類似物或從至少兩種這樣的相同或不同的核苷酸和/或核苷酸類似物制得的低聚核苷酸，所說的保護基為三-4，4′，4″-叔丁基苯基甲基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，它們均是額外地被一個含有3～12個環(huán)碳原子的環(huán)烷基羰基保護的并且是未取代的或是被C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代的，或是被脒保護基取代的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中環(huán)烷基羰基含有3～12個環(huán)碳原子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中環(huán)烷基羰基含有5或6個環(huán)碳原子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中環(huán)烷基羰基是環(huán)己烷羧基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中核酸堿基B是式Ⅰ，Ⅰa，Ⅰb，Ⅰc，Ⅰd或Ⅰe的基團 其中R1是H、Cl、Br、NH2或OH，R2，R3和R4互相獨立地為H、OH、SH、NH2、NHNH2、NHOH、NHO-1～12個碳原子的烷基、F、Cl、Br、1～12個碳原子的烷基或羥烷基或羥烷基或氨基烷基或烷氧基或烷硫基，在這些基團中的羥基和氨基是未取代的或是被一個保護基取代的，或是苯基、芐基、含有1～20個碳原子的伯氨基或含有2～30個碳原子的仲氨基，R5是H或C1-C4烷基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中伯氨基含有1～12個碳原子，仲氨基含有2～12個碳原子。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中伯氨基和仲氨基是式R6R7N的基團，其中R6是H或獨立地具有R7的含意，R7是每個均含有1～20個碳原子的烷基、氨基烷基、羥基烷基;羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基部分含有2～8個碳原子，烷基部分含有1～6個碳原子;2～20個碳原子的鏈烯基;苯基、單或二(C1-C4烷基)苯基或二(C1-C4烷氧基)苯基、芐基、單或二(C1-C4烷基)芐基或二(C1-C4烷氧基)芐基;或1，2-，1，3或1，4-咪唑基-C1-C6烷基，或R6和R7合并成為四或五亞甲基、3-氧雜-1，5-亞戊基、-CH2-NR8-CH2CH2-或-CH2CH2-NR8-CH2CH2-，其中R8是H或C1-C4烷基，在氨基烷基中的氨基可以是被一個或兩個C1-C4烷基或C1-C4羥烷基取代的，在羥烷基中的羥基是游離的或是用C1-C4烷基醚化的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中伯氨基和仲氨基是甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、烯丙基氨基、一或二(1-羥基乙-2-基)氨基、苯基-和芐基氨基、乙?；被惗□；?和苯甲酰基氨基。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中式Ⅰ、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd和Ⅰe中的R1是氫。
11.根據(jù)權(quán)利要求6的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中式Ⅰd中的R4是氫。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中在式Ⅰ、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd和Ⅰe中的R2和R3互相獨立地是H、F、Cl、Br、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、甲基氨基、二甲基氨基、苯甲酰基氨基、甲氧基、乙氧基和甲硫基。
13.根據(jù)權(quán)利要求6的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中B是嘌呤基或是如下嘌呤類似物的基團，包括腺嘌呤、N-甲基腺嘌呤、N-苯甲?；汆堰?、2-甲硫基腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2-羥基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-甲硫基嘌呤、鳥嘌呤和N-異丁酰基鳥嘌呤。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中核酸堿基B是式Ⅱ、Ⅱa或Ⅱb的基團 其中R5是H或C1-C4烷基，R6、R7和R9互相獨立地是H、OH、SH、NH2、NHNH2、NHOH、NHO-1～12個碳原子的烷基、F、Cl、Br、烷基部分含有1～12個碳原子的烷基或羥基烷基或氨基烷基或烷氧基或烷硫基，羥基和氨基是未取代的或是被一個保護基取代的，或是苯基、芐基、1～20個碳原子的伯氨基或2～30個碳原子的仲氨基，在式Ⅱb中NH2基上的氫原子可以被C1-C6烷基或苯甲?；〈蛩鼈兊亩溲苌?。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中R6是H、C1-C6烷基或C1-C6羥烷基、F、Cl、Br、NH2、苯甲?；被?、一或二-C1-C6烷基氨基。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中R7是H、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基或C1-C6羥烷基、F、Cl、Br、NH2、苯甲酰基氨基、一或二-C1-C6烷基氨基。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中R7是H、F、Cl、Br、NH2、NHCH3、(CH3)2N或C1-C4烷基。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中R7是H、C1-C4烷基、NH2、NHCH3或(CH3)2N。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中B是嘧啶基或是下列嘧啶類似物的基團，包括尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、二氫尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，它們具有下式Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc或Ⅲd之一的基團 其中R14是氫或形成核苷酸連接基的基團，R15是氫或環(huán)己基羰基。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的核苷、核苷類似物、核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸，其中R14是式Ⅳa、Ⅳb或Ⅳc的含磷基團 它形成核苷酸連接基團，其中Z是氧或硫;X、X′和X″互相獨立地是帶有負(fù)電荷的氧或硫，其反離子是Li、Na、K、Cs、叔或季銨;或X′和X″互相獨立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;X'''是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;和;Rb是C1-12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基;R18和R19互相獨立地是氫、C1-C12烷基、C2-C12鏈烯基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基或C7-C20烷芳基;在R18、R19和R6的定義中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未取代的或是被烷氧基、烷硫基、鹵素、-CN，-NO2，苯基、硝基苯基或鹵代苯基取代的。
22.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1的核苷或核苷類似物的方法，該方法包括在空間位阻叔胺存在下于適當(dāng)?shù)馁|(zhì)子隋性、極性、堿性溶劑中使核苷或核苷類似物與三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯反應(yīng)。
23.一種制備式V的低聚核苷酸的方法其中U和V是相同或不同的、天然或合成的核苷殘基，m和n互相獨立地為0或1～200的整數(shù)，m與n之和為2～200，該方法包括(a)使式Ⅵ化合物與式Ⅶ化合物反應(yīng)，式Ⅵ中R20是保護基，U′和V′具有U和V的含意，m′和n′互相獨立地為0或1～199的整數(shù)，m′與n′之和為2～199，R21是式Ⅳa、Ⅳb或Ⅳc的含磷基團 它形成核苷酸連接基團，其中Z1是氧或硫;X、X′和X″互相獨立地是帶有負(fù)電荷的氧或硫，所帶反離子是Li、Na、K、Cs、叔或季銨;或X′和X″互相獨立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;X'''是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基，-ORb或-SRb;Rb是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基;R18和R19互相獨立地是氫、C1-C12烷基、C2-C12鏈烯基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基或C7-C20烷芳基;在R18、R19和R6的定義中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未取代的或是被烷氧基、烷硫基、鹵素、-CN，-NO2，苯基、硝基苯基或鹵代苯基取代的，式Ⅶ中U″和V″具有U和V的含意，m″和n″互相獨立地是0或1～198的整數(shù)，m″與n″之和為2～198，R22是(ⅰ)式Ⅳb的基團，其中Z是氧或硫;X′和X″互相獨立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;Rb是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、作為Rb定義的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未被取代的或是被烷氧基、烷硫基、鹵素、-CN、-NO2、苯基、硝基苯基或鹵代苯基取代的;(ⅱ)羥基保護基;或(ⅲ)通過連接基團連接于固體載體材料上的連接鍵;(b)如有必要，重復(fù)步驟(a)直到形成所需長度的低聚核苷酸，在每次偶合前除去保護基R20，將存在的任何游離羥基封端，然后將生成的亞磷酸酯氧化成磷酸酯，(c)如果需要，除去或分離出低聚核苷酸，和(d)除去剩余的保護基R20，所說的保護基R20是TTTr。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中m與n之和為2～50。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中m與n之和為2～30。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸、核苷酸類似物或低聚核苷酸在式Ⅴ的低聚核苷酸的制備中的應(yīng)用其中U和V是相同或不同的天然或合成的核苷殘基，m與n互相獨立地為是0或1～200的整數(shù)，m與n之和為2～200。
27.根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中脒保護基是二甲基氨基亞甲基。
全文摘要
本發(fā)明涉及在其基本結(jié)構(gòu)中帶有被三-4，4′，4″-叔丁基苯基甲基保護的伯羥基的核苷、核苷酸和低聚核苷酸，還涉及一種所述核苷和核苷酸的制備方法，也涉及一種低聚核苷酸的制備方法和所說的被保護的核苷、核苷酸和低聚核苷酸的應(yīng)用。
文檔編號C07H19/04GK1111249SQ94115390
公開日1995年11月8日 申請日期1994年9月16日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月17日
發(fā)明者W·K·D·布里爾 申請人:希巴-蓋吉股份公司