一種紫草酸的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從丹參中大量制備紫草酸單體(98％)的方法，屬于中藥活性組分的分離純化【技術領域】。該方法按照以下步驟進行：首先，采用水或者乙醇溶液提取丹參藥材中的丹酚酸B、紫草酸等組分；第二，調節(jié)提取液pH至堿性，使丹參提取液中的丹酚酸B水解，生成紫草酸，增加其中紫草酸的含量；最后，采用大孔吸附樹脂分離純化紫草酸，得到純度超過98％的紫草酸溶液，溶液進一步經過干燥得到紫草酸單體粉末。最終紫草酸的純度超過98％，得率超過1％(以丹參干藥材計算)。該工藝操作簡單，易于放大，適用于紫草酸的大量工業(yè)制備。
【專利說明】一種紫草酸的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中藥活性組分的分離純化方法，尤其涉及一種從丹參中分離純化紫草酸的方法。
【背景技術】[0002]丹參是一種臨床常用的中藥，廣泛應用于心腦血管疾病、肝病、腎病、神經系統(tǒng)疾病和腫瘤的預防與治療。由于中藥的傳統(tǒng)的使用方法以水煎煮為主，所以丹參中水溶性活性組分吸引了大家的廣泛關注。丹參中水溶性活性組分包括丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、丹參素等(附圖1)。
[0003]紫草酸是丹參中主要的活性組分之一，文獻報道，其具有抗氧化、抗炎、抗HIV活性，可以應用于心腦血管疾病、肝病、腎病、神經系統(tǒng)疾病的治療和預防作用。另外，紫草酸具有抗HIV病毒整合酶的活性，是一種無毒的HIV病毒抑制劑，可以用于抗AIDS藥物的構效關系、結構修飾尋找活性更高化合物等研究。
[0004]紫草酸具有極強的水溶性，加上丹參水溶性組分結構相似，性質相近，其純品的分離純化及其困難，目前尚沒有其純品的大量制備方法報道。中國專利CN102993143報道了一種采用制備高效液相色譜制備紫草酸單體的方法，可以制備純度達98%的紫草酸樣品。然而，高效液相色譜法只適用于少量樣品的制備，且其制備成本高，難以放大至工業(yè)生產，無法滿足紫草酸做為藥物開發(fā)的需求。
[0005]因此，本領域的技術人員致力于開發(fā)一種簡單、高效、成本低廉、環(huán)境友好的紫草酸制備方法，用來滿足紫草酸的新藥開發(fā)研究，尤其是做為注射制劑原料藥的生產工藝。

【發(fā)明內容】

[0006]有鑒于現有技術的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種簡單、高效、成本低廉、環(huán)境友好的紫草酸制備方法。
[0007]為實現上述目的，本發(fā)明提供了一種制備紫草酸的方法，包括以下步驟:
[0008]步驟一、制備丹參提取液
[0009]向丹參藥材中加入提取劑，經過加熱提取后，提取液經過濾濃縮，得丹參提取液，所述提取劑為水、甲醇水溶液或乙醇水溶液；
[0010]步驟二、制備紫草酸粗品溶液
[0011]將丹參提取液調節(jié)至PH10-14，在10-50°c范圍內攪拌反應2_10小時，得到紫草酸粗品溶液；
[0012]步驟三、大孔吸附樹脂分離純化紫草酸
[0013]調節(jié)紫草酸粗品溶液至PH6-10，經過大孔吸附樹脂柱吸附后，采用水洗脫，分步收集洗脫液，HPLC檢測，合并純度超過98%的紫草酸溶液。
[0014]步驟四、濃縮干燥
[0015]純度超過98%的紫草酸溶液經過濃縮干燥，得到紫草酸粉末。[0016]優(yōu)選的，步驟一提取溶劑為水時，提取溫度為80-100°C。
[0017]提取溶劑為乙醇或甲醇溶液時，提取溫度為50_70°C。提取液的固液分離，采用過濾、離心或者抽濾的方法。優(yōu)選提取劑為體積分數40-70%的乙醇水溶液。
[0018]優(yōu)選的，步驟二中pH調節(jié)，選用鹽酸、醋酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣等常見的非氧化性酸、堿。[0019]優(yōu)選地，步驟二中還包括將所得的紫草酸粗品溶液調pH為2-4，減壓濃縮至粗品溶液原體積的10-10%。更優(yōu)選的，所得的紫草酸粗品溶液調pH為2-3，減壓濃縮溫度為40-60°C。將紫草酸粗品溶液減壓濃縮，有利于在后續(xù)分離純化步驟中獲得較好的分離度，但是 申請人:發(fā)現，直接將紫草酸粗品溶液進行減壓濃縮處理，濃縮后的紫草酸粗品溶液中，雜質含量有很大提高且紫草酸含量有所下降，而將PH調為2-4后，再進行減壓濃縮，則紫草酸粗品溶液中的雜質含量沒有明顯的變化，紫草酸的含量也沒有明顯的變化。
[0020]優(yōu)選的，步驟三中的大孔吸附樹脂，選用聚苯乙烯-聚乙烯苯為骨架的樹脂，吸附后采用水洗脫樹脂。更優(yōu)選的，所述大孔吸附樹脂型號為Hz816、XAD-4或者大孔吸附樹脂微球I號。
[0021]優(yōu)選的，步驟三中pH調節(jié)至6-8，選用鹽酸、醋酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣等常見的非氧化性酸、堿。 申請人:發(fā)現，步驟三中對PH的調節(jié)，對與本發(fā)明中制備高純度的紫草酸非常重要，如果濃縮液上柱PH低于6或者高于8，則紫草酸的收率會顯著降低。
[0022]優(yōu)選的，步驟三中樹脂柱的高徑比為3-15:1。
[0023]優(yōu)選的，步驟三中水洗脫體積為柱體積的3-10倍。
[0024]步驟四中純度超過98 %的紫草酸樣品溶液，經過濃縮干燥，得到紫草酸粉末。濃縮方法可以是常壓、低壓真空濃縮、噴霧干燥法、冷凍干燥法中單一的方法或者是這幾種方法的混合。
[0025]進一步地，本發(fā)明步驟二中，采用兩步法制備紫草酸粗品溶液，步驟如下:
[0026]a)將丹參提取液pH調節(jié)至12-14，30_50°C攪拌反應1_2小時；
[0027]b)步驟a)中所得溶液pH調節(jié)至10-11在10_30°C范圍內攪拌反應2_5小時，
[0028]得到紫草酸粗品溶液。
[0029]優(yōu)選地，步驟a)中將丹參提取液pH調節(jié)至13，35_40°C攪拌反應1_2小時。
[0030]優(yōu)選地，步驟b)中將a)中所得溶液pH調節(jié)至10.5在10_25°C范圍內攪拌反
[0031]應2-5 小時。
[0032] 申請人:在實驗過程中偶然的發(fā)現，上述兩步調節(jié)pH分段加熱的方法，能夠顯著增加紫草酸粗品溶液中的紫草酸含量，與僅調節(jié)一次PH至10-14反應2-10小時相比，所得的紫草酸粗品溶液中的紫草酸含量能夠提高30-50 %，且紫草酸粗品溶液中雜質含量明顯減少，非常有利于后續(xù)的分離純化。
[0033]本發(fā)明克服了已有紫草酸純化方法中產物純度低、產量小、生產工藝復雜、生產成本高等缺點，最終紫草酸的純度超過98%，得率超過1% (以丹參干藥材計算)。
[0034]本發(fā)明采用的HPLC檢測條件為:安捷倫高效液相色譜儀(HPllOO)，采用C18色譜柱，流動相組成為(乙腈:1%甲酸水溶液=30:70)，流動相流速0.8mL / min，檢測波長286nm,進樣體積5 μ L?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0035]圖1是實施例1中丹參水提取物的HPLC圖譜；1為丹酚酸B，2為紫草酸，3為迷迭香酸。
[0036]圖2是實施例1中經堿處理后的丹參提取液的HPLC圖譜；1為丹酚酸B，2為紫草酸，4為原紫草酸，5為丹參素。
[0037]圖3是實施例1中制備的紫草酸的HPLC圖譜，紫草酸純度99.3%。
[0038]圖4是實施例1制備的紫草酸和紫草酸對照品共進樣的HPLC圖譜。
[0039]圖5是實施例20中經堿處理后的丹參提取液的HPLC圖譜；1為丹酚酸B，2為紫草酸，4為原紫草酸，5為丹參素。
[0040]圖6是實施例20制備的紫草酸和紫草酸對照品共進樣的HPLC圖譜。
[0041]本發(fā)明中紫草酸對照品購自上海同田生物技術有限公司，其他試劑及材料均可從市售渠道購買獲得。
【具體實施方式】
[0042]實施例1
[0043]步驟一、取丹參藥材100g，加入1L70%的乙醇水溶液，70°C提取I小時，過濾，濾渣
以相同的方法再提取一次，合并兩次`濾液。
[0044]步驟二、以氫氧化鈉調節(jié)濾液至pH12，于室溫下攪拌5小時，得紫草酸粗品溶液，HPLC檢測圖譜如圖2所示。將提取液調節(jié)pH至2，旋轉蒸發(fā)儀50°C減壓濃縮至原體積的10-30% mL。將pH調至2能夠降低樣品中的雜質含量。
[0045]步驟三、500mL大孔吸附樹脂微球I號(上海華震科技有限公司)，裝柱，高徑比5:
I。調節(jié)濃縮液至PH6.5，過柱吸附，8倍柱體積水洗脫樹脂柱，分步收集，HPLC檢測。
[0046]步驟四、合并紫草酸純度超過98%的樣品溶液，冷凍干燥，得純度99.3%的紫草酸 1.82g。
[0047]實施例2
[0048]將實施例1步驟一中提取丹參藥材的溶劑換為水，其余同實施例1，最終得到純度98.2%的紫草酸1.218。
[0049]實施例3
[0050]將實施例1步驟一中提取丹參藥材的溶劑換為10%的乙醇，其余同實施例1，最終得到98.5%的紫草酸1.41g
[0051]實施例4
[0052]將實施例1步驟一中提取丹參藥材的溶劑換為90%的乙醇，其余同實施例1，最終得到99.0%的紫草酸1.55g。
[0053]實施例5
[0054]將實施例1步驟一中提取丹參藥材的溶劑換為10%的甲醇，其余同實施例1，最終得到98.3%的紫草酸1.05g。
[0055]實施例6
[0056]將實施例1步驟一中提取丹參藥材的溶劑換為90%的甲醇，其余同實施例1，最終得到98.8%的紫草酸1.33g。[0057]實施例7
[0058]將實施例1步驟一中提取丹參藥材的溫度換為50°C，其余同實施例1，最終得到
98.5%的紫草酸1.28g。
[0059]實施例8
[0060]將實施例1步驟二中丹參提取液pH換為pHIO，其余同實施例1，最終得到98.9%的紫草酸1.03g。
[0061]實施例9
[0062]將實施例1步驟二中丹參提取液pH換為pH14，其余同實施例1，最終得到99.3%的紫草酸1.43g
[0063]實施例10
[0064]將實施例1步驟二中丹參提取液堿促反應時間換為2小時，其余同實施例1，最終得到99.0%的紫草酸1.02g。
[0065]實施例11
[0066]將實施例1步驟二中丹參提取液堿促反應時間換為10小時，其余同實施例1，最終得到98.8%的紫草酸1.72g。
[0067]實施例12
[0068]將實施例1步驟二中丹 參提取液堿促反應溫度換為10°C，其余同實施例1，最終得到 99.1 %的紫草酸1.15g。
[0069]實施例13
[0070]將實施例1步驟二中丹參提取液堿促反應溫度換為50°C，其余同實施例1，最終得到98.3%的紫草酸1.55g。
[0071]實施例14
[0072]將實施例1步驟三中的樹脂換成Hz816(上海華震科技有限公司)，其余同實施例1，最終得到98.1 %的紫草酸1.23g。
[0073]實施例15
[0074]將實施例1步驟三中的樹脂換成XAD_4(上海羅門哈斯化工有限公司)，其余同實施例I，最終得到98.8%的紫草酸1.53g。
[0075]實施例16
[0076]將實施例1步驟三中樹脂高徑比調節(jié)至3:1，其余同實施例1，最終得到98.0%的紫草酸1.55g。
[0077]實施例17
[0078]將實施例1步驟三中樹脂高徑比調節(jié)至15:1，其余同實施例1，最終得到99.2%的紫草酸1.Sg。
[0079]實施例18
[0080]將實施例1步驟三中水洗脫體積調節(jié)至3倍柱體積，其余同實施例1，最終得到
98.2%的紫草酸1.02g。
[0081]實施例19
[0082]將實施例1步驟三中水洗脫體積調節(jié)至3倍柱體積，其余同實施例1，最終得到
98.7%的紫草酸1.52g。[0083]實施例20
[0084]將實施例1步驟二改為采用兩步法制備紫草酸粗品溶液，步驟如下:
[0085]a)將丹參提取液pH調節(jié)至13，40°C攪拌反應I小時；
[0086]b)步驟a)中所得溶液pH調節(jié)至10.5在20°C攪拌反應5小時，得到紫草酸粗
[0087]品溶液，HPLC檢測圖譜如圖5所示。
[0088]其余同實施例1，最終得到99.5%的紫草酸2.56g。
[0089]實施例21
[0090]將實施例1步驟二改為采用兩步法制備紫草酸粗品溶液，步驟如下:
[0091]a)將丹參提取液pH調節(jié)至14，30°C攪拌反應2小時；
[0092]b)步驟a)中所得溶液pH調節(jié)至10在25°C攪拌反應3小時，得到紫草酸粗品
[0093]溶液。
[0094]其余同實施例1，最終得到99.2%的紫草酸2.32g。
[0095]實施例22
[0096]將實施例1步驟二改為采用兩步法制備紫草酸粗品溶液，步驟如下:
[0097]a)將丹參提取液pH調節(jié)至12，50°C攪拌反應1.5小時；
[0098]b)步驟a)中所得溶液pH調節(jié)至11在15°C攪拌反應4小時，得到紫草酸粗品
[0099]溶液。
[0100]其余同實施例1，最終得到98.6%的紫草酸1.96g。
[0101]對比例I
[0102]將實施例1步驟二中所得紫草酸粗品溶液，不調pH，直接進行減壓濃縮，其余同實施例I，最終得到97.8%的紫草酸1.Hg。
[0103]對比例2
[0104]將實施例1步驟二中所得紫草酸粗品溶液，不進行減壓濃縮處理，直接進行步驟三，其余同實施例1，最終得到98.2%的紫草酸1.32g。
[0105]對比例3
[0106]將實施例1步驟三中的紫草酸濃縮液，調節(jié)pH4過柱吸附，其余同實施例1，最終得到98.3%的紫草酸0.93g。
[0107]對比例4
[0108]將實施例1步驟三中的紫草酸濃縮液，調節(jié)pHll過柱吸附，其余同實施例1，最終得到97.6%的紫草酸0.87g。
[0109]以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據本發(fā)明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術領域】中技術人員依本發(fā)明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種紫草酸的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 步驟一、制備丹參提取液 向丹參藥材中加入所述提取劑，經過加熱提取后，提取液經過濾濃縮，得丹參提取液，所述提取劑為水、甲醇水溶液或乙醇水溶液； 步驟二、制備紫草酸粗品溶液 將丹參提取液PH調節(jié)至10-14，在10-50°c范圍內攪拌反應2-10小時，得到紫草酸粗品溶液； 步驟三、大孔吸附樹脂分離純化紫草酸 調節(jié)紫草酸粗品溶液至PH5-10，經過大孔吸附樹脂吸附后，采用水洗脫，分步收集洗脫液，HPLC檢測，合并純度超過98%的紫草酸溶液。 步驟四、濃縮干燥 純度超過98%的紫草酸溶液經過濃縮干燥，得到紫草酸粉末。
2.如權利要求1所述的方法，其中步驟一中提取劑為40-70%(V / V)的乙醇水或甲醇水溶液，提取溫度為50-100°C。
3.如權利要求1所述的方法 ，其中步驟二中還包括將所得的紫草酸粗品溶液調pH為2-4，減壓濃縮至粗品溶液原體積的10-10%。
4.如權利要求1所述的方法，其中步驟二中采用兩步法制備紫草酸粗品溶液，步驟如下: a)將丹參提取液pH調節(jié)至12-14，30-50°C攪拌反應1_2小時； b)步驟a)中所得溶液pH調節(jié)至10-11在10-30°C范圍內攪拌反應2-5小時， 得到紫草酸粗品溶液。
5.如權利要求4所述的方法，其中，步驟a)中將丹參提取液pH調節(jié)至13，35-40°C攪拌反應1-2小時。
6.如權利要求4所述的方法，其中，步驟b)中將步驟a)中所得溶液pH調節(jié)至10.5在10-25°C范圍內攪拌反應2-5小時。
7.如權利要求1所述的方法，其中步驟三采用的大孔吸附樹脂是以聚苯乙烯-聚乙烯苯為骨架的大孔吸附樹脂。
8.如權利要求6所述的方法，其中所述大孔吸附樹脂為型號為Hz816、XAD-4或者大孔吸附樹脂微球I號。
9.如權利要求6所述的方法，其中步驟三中柱層析時，色譜柱的高徑比為3-15:1。
10.如權利要求6所述的方法，其中步驟三水洗脫中水的用量為3-10倍柱體積。
【文檔編號】C07D307/84GK103570654SQ201310487764
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權日:2013年10月17日
【發(fā)明者】闞士東 申請人:蘭赫(上海)生物科技有限公司