一種具皮膚活性的多肽的合成方法
【專利摘要】一種具皮膚活性的多肽的合成方法，本發(fā)明涉及H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的制備方法，所述方法包括以下步驟：(1)使Fmoc-L-Dab(Boc)-OH與2-Cl-Trt樹脂連接；(2)對(1)中制得的產物的氨端進行脫保護；(3)使(2)中制得的產物與Fmoc-L-Pro-OH在縮合劑存在下進行縮合反應；(4)對(3)中制得的產物的氨端進行脫保護；(5)使(4)中制得的產物與Boc-β-Ala-OH在縮合劑存在下進行縮合反應；(6)對(5)中制得的產物進行切割；(7)使(6)中制得的產物與芐胺在縮合劑存在下進行縮合反應；(8)對(7)中制得的產物進行脫保護，本發(fā)明方法的產率比單獨液相合成提高10%以上。
【專利說明】一種具皮膚活性的多肽的合成方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽的制備方法。更具體地講，本發(fā)明涉及H-β -Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的制備方法。
【背景技術】
[0002]H- β -Ala-Pro-Dab-NH-Bzl是一種模擬蛇毒毒素Waglerin I活性的小分子多肽，臨床試驗表明該多肽可以通過抑制肌肉收縮而減少皺紋的產生，具有優(yōu)秀的光滑和迅速祛皺性能。H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl作用于突觸后膜，是肌肉煙堿乙酰膽堿受體(mmAChR)可逆轉的拮抗劑。尋找一種合適的合成方法對于該小分子多肽的產業(yè)化具有重要意義。
[0003]多肽合成常用的化學合成方法有液相合成和固相合成。對于小分子多肽，一般氨基酸小于10個氨基酸的多肽，通用的方法是采用液相合成的方法，但是液相合成的方法步驟較多，比較繁瑣，全部采用液相的合成方法得到的粗品的純度不高，總產率也不高。采用固相合成，除去難度較大之外，成本效益比也極低。完全采用固相合成或完全采用液相合成都不可避免各方法的局限性。

【發(fā)明內容】

[0004]我們分析了 H- β -Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的結構，選擇液相和固相結合的反應方式會具有一定優(yōu)勢，先將Dab羧端連接到氯樹脂上，然后逐步接肽，接肽完成后再用弱酸將全保護多肽從樹脂上切割下來后再用液相方法連接芐胺，最后脫保護得到粗品肽。
[0005]首先我們將Fmoc-Dab(Boc)-OH與2_Cl_Trt樹脂結合制得Fmoc-Dab (Boc)-2-Cl-Trt樹脂，氯樹脂的優(yōu)勢在于其可以在較低的酸性下即可將多肽從樹脂上切割下來，從而不影響氨基酸的保護基而得到全包護多肽。
[0006]在制得Fmoc-Dab (Boc) -2-Cl-Trt樹脂后，依次用哌啶DMF溶液脫除Fmoc保護，接上 Fmoc-Pro-OH 和 Boc-β -Ala-OH,制得 Boc-β -Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt樹脂。然后用三氟乙醇和低濃度的三氟乙酸將全包護多肽從樹脂上切割下來，得到Boc- β -Ala-Pro-Dab (Boc) -OH,再與芐胺在縮合劑存在下進行縮合反應，制得Boc-β -Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl。
[0007]最后米用HCl/乙酸乙酷或者二氣乙酸將Boc-β -Ala-Pro-Dab (Boc) -NH-Bzl的保護基脫除得到H-β -Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的鹽酸鹽或者三氟乙酸鹽。
[0008]本發(fā)明提供了一種采用固相液相結合的方法合成Η-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的方法，所述方法包括以下步驟:
[0009]首先我們將Fmoc-Dab(Boc)-OH與2_Cl_Trt樹脂結合制得Fmoc-Dab (Boc)-2-Cl-Trt樹脂，氯樹脂的優(yōu)勢在于其可以在較低的酸性下即可將多肽從樹脂上切割下來，從而不影響氨基酸的保護基而得到全包護多肽。
[0010]在制得Fmoc-Dab (Boc) -2-Cl-Trt樹脂后，依次用哌啶DMF溶液脫除Fmoc保護，接上 Fmoc-Pro-OH 和 Boc-β -Ala-OH,制得 Boc-β -Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt樹脂。然后用三氟乙醇和低濃度的三氟乙酸將全包護多肽從樹脂上切割下來，得到Boc-β -Ala-Pro-Dab(Boc)-OH。
[0011]最后采用HCl/乙酸乙酯或者三氟乙酸的有機溶劑溶液將Boc- β -Ala-Pro-Dab (Boc) -OH 的保護基脫除得到 H-β -Ala-Pro-Dab-NH-Bzl 鹽酸鹽粗品。
[0012]進一步的，所述方法還包括將制得的H-β -Ala-Pro-Dab-NH-Bzl鹽酸鹽粗品經C18反相柱用洗脫液洗脫，包括用低壓柱和高壓柱(HPLC)得到精制的H-β -Ala-Pro-Dab-NH-Bzl。
[0013]所述洗脫液為含有0.1~2%的HOAC或0.1~1%的TFA等反離子酸，并且含有一定濃度的有機溶劑如乙腈、甲醇和乙醇的水溶液，洗脫方式可以采用等度或梯度洗脫，將收集的洗脫液進行濃縮，冷凍干燥。
[0014]我們對三肽H-β -Ala-Pro-Dab-NH-Bzl進行了收率及純度分析，結果證明，本發(fā)明的方法優(yōu)于單獨的固相合成或液相合成，相比單純液相合成方法操作簡單，有效地防止了副反應的發(fā)生，粗肽的純度也大幅度提高，相應的產率也比單獨液相合成提高10%以上，取得了意想不到的技術效果。
【具體實施方式】
[0015]盡管不希望受任何理論的限制，但是認為本發(fā)明是以下面的事實為基礎:由于I)DAB三肽為僅含有三個氨基酸殘基的小肽；2)DAB的羧端與芐胺形成了酰胺鍵，因此在合成過程中可以采用固液相結合的辦法來合成。
[0016] 申請人:將Fmoc-DAB-OH, Fmoc-Pro-OH, Boc- β -Ala-OH與氣樹脂進彳了逐步接妝，在弱酸三氟乙醇或1%三氟乙酸將保護三肽從樹脂上切割下來，然后與芐胺縮合得到全保護三肽，最后脫去保護得到三肽的三氟乙酸鹽，采用C18反相脫鹽純化，凍干得到DAB三肽純
品O
[0017]1.Fmoc-Dab (Boc)-OH和氯樹脂偶聯的制備
[0018]2-Cl-Trt樹脂用DCM溶脹，將Fmoc-Dab (Boc) -OH用有機溶劑溶解后加入到樹脂中，加入有機堿調節(jié)PH值至一定值，震蕩反應超過10個小時，最后用甲醇/DIPEA/DCM封閉得到 Fmoc-Dab (Boc) -2-Cl-Trt 樹脂。
[0019]在該步反應中采用Fmoc-作為氨基保護劑，此外所述氨基保護劑還可選自常用于多肽合成中的任意保護劑，如節(jié)氧羰基(Z)。
[0020]所用的溶劑可選自N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、NMP等，優(yōu)選使用二氯甲烷。
[0021]所用的有機堿可選自N-甲基嗎啉(NMM)、三乙胺和DIPEA(二異丙基乙基胺)等，優(yōu)選使用二異丙基乙基胺。
[0022]反應溫度可為-10°C至室溫。
[0023]2.脫保護
[0024]Fmoc保護的氨基酸樹脂的脫保護可采用哌啶/DMF或二乙胺/DMF等脫保護試劑來實施，但較優(yōu)選哌啶/DMF。
[0025]3.Fmoc-Pro-Dab (Boc) -2-Cl-Trt 樹脂的制備
[0026]Fmoc-Pro-OH及HOBt用DMF或DCM溶解，冰水浴冷卻，加入DIC活化，將活化后的氨基酸加入上述已脫保護好的樹脂當中，反應2~3小時。[0027]所用的溶劑可選自N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、NMP等，優(yōu)選使用N，N-二甲基甲酰胺。
[0028]所用的耦合體系可選為DIC/HOBt，HBTU/DIPEA 或 HATU/DIPEA 或 DCC/H0BT 或PyBop等,優(yōu)選使用DIC/HOBt。
[0029]反應溫度可為(TC~30°C。
[0030]4.H-Pro-DAB (Boc) -2-Cl-Trt 樹脂的制備
[0031]Fmoc的脫保護與⑵類似
[0032]5.Boc- β -Ala-Pro-DAB (Boc) -2-Cl-Trt 樹脂的制備
[0033]Boc-β -Ala的偶聯與(3)類似
[0034]6.Boc- β -Ala-Pro-DAB (Boc) -OH 的制備
[0035]取干燥的肽樹脂于干燥的圓底燒瓶中。加冰凍冷卻的三氟乙醇或1%三氟乙酸/DMF切割液。以8ml/g樹脂的量加入中。冰浴冷卻切割反應0.5h，室溫切割1.5h。過濾，濾液冰乙醚沉淀出全包護粗肽。離心分離出粗肽。
[0036]切割試劑可以選自三氟乙醇或1%三氟乙酸/DMF，但優(yōu)選三氟乙醇。
[0037]7.Boc- β -Ala-Pro-DAB (Boc) -NH-Bzl 的制備
[0038]將Boc-β -Ala-Pr0-DAB(B0c)-OH用溶劑溶解，加入縮合劑，隨后在一定溫度下與芐胺的有機溶液混合反應，在反應過程中采用有機堿維持P H值在一定范圍內。得到Boc-β -Ala-Pro-DAB(Boc)-NH-Bzl。
[0039]所用的溶劑可選自四氫呋喃、重蒸的DMF、NMP等，優(yōu)選使用四氫呋喃。
[0040]所用的有機堿可選自N-甲基嗎啉(NMM)、三乙胺和DIEA(二異丙基乙基胺)等，優(yōu)選使用NMM。
[0041]在該步反應中選用DCC/HOBt作為縮合劑，此外所述縮合劑還可選自DIC、HBTU,BOP等常用于多肽合成中的任意縮合劑。
[0042]在反應過程中，當pH較低時，反應產物的純度將降低，而pH太高時，將使產率降低。因此，優(yōu)選將pH控制在8~9范圍內。
[0043]反應溫度可為-10°C至室溫。
[0044]8.HCl.H- β -Ala-Pro-DAB-NH-Bzl 的制備
[0045]脫保護可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/ 二氯甲烷等脫保護試劑來實施，但較優(yōu)選使用HCl/乙酸乙酯作為脫保護試劑。
[0046]9.精制凍干
[0047]將制得的HCl.H- β -Ala-Pro-DAB - NH-Bzl粗產品先預處理，即用水溶解并過濾后調節(jié)pH至5~6，采用C18反相柱進行脫鹽純化，凍干得終產品為H- β -Ala-Pro-DAB -NH-Bzl0
[0048]利用C18反相柱進行脫鹽純化可采用等度或梯度洗脫，洗脫液為含有0.5~1.5%的HOAC或0.1%的TFA等反離子酸，并且含有濃度范圍在O~30%的乙腈水溶液，為了方便操作，本發(fā)明的一個實施例中采用三步梯度洗脫，洗脫液分別為含I % HOAC和2 %乙腈的水溶液、含I % HOAC和3%乙腈的水溶液、含I % HOAC和4%乙腈的水溶液。也可以采用乙醇或甲醇等與水混溶的溶劑，一般說來選用乙腈的分離效果要好于醇類溶劑；三氟乙酸也可以替代醋酸作為反離子，雖然其分離效果要比醋酸好，但是由于產品中一般不能殘留三氟乙酸所以我們避免了三氟乙酸而選擇了醋酸。關于選擇這種梯度我們確實經過了一定的摸索，選擇該梯度分離效果較佳，洗脫時間適宜。PH值為根據該肽的等電點以除去鹽酸鹽來選擇的，流速沒有意義，和柱子的大小長短有關。
[0049]將收集的洗脫液進行冷凍干燥48小時得最終產品。
[0050]在本文中，所用試劑的縮寫為:
[0051]DIC: 二異丙基碳二亞胺
[0052]DCC: 二環(huán)己基碳二亞胺
[0053]HOBt: 1-羥基苯并三氮唑
[0054]NMM:N-甲基嗎啉
[0055]DMF: N, N- 二甲基甲酰胺 [0056]實施例1.Fmoc-Dab (Boc) -2-Cl-Trt 樹脂的制備
[0057]稱取2-Cl-Trt 樹脂 80g(88mmol)和 Fmoc-Dab (Boc)-0H38.75g(88mmol)，將其加入磨口圓底燒瓶中，然后加入DIPEA157ml (880mmol)和DCM800ml，搖勻，密封后在搖床上震蕩反應17h。用DMF洗滌樹脂，加入DCM850ml,甲醇100ml，DIPEA50ml混合液封閉20min。封閉結束后用DMF600ml洗滌樹脂四次，DCM600ml洗滌樹脂二次。抽走溶劑。Me0H600ml，300ml，300ml收縮樹脂三次。真空抽干。稱重90.72g。干燥低溫保存。
[0058]實施例2.Fmoc-Pro-Dab (Boc) -2-Cl-Trt 樹脂的制備
[0059]稱取干燥Fmoc-Dab (Boc)-2-Cl-Trt樹脂90.72g (40mmo1)于固相反應合成柱中。800ml DCM 溶脹樹脂 20min，抽走。用 400ml DMF 洗滌樹脂三次。用 400ml20%piperidine/DMF 脫 Fmoc 二次。400ml DMF*4，400ml DCM*2 洗滌樹脂。抽走溶劑。
[0060]稱取Fmoc-Ser (tBu) _0H、H0BT.H2O于干燥500ml廣口三角瓶中。加適量DMF溶劑溶解。置于冰水浴中冷卻。加DIC活化3min，避免水汽。將活化后的氨基酸加入上一步樹脂中反應2h。抽走反應液。用適量DMF洗漆樹脂2min*3次。
[0061]實施例3.Boc- β -Ala-Pro-Dab (Boc) -2-Cl-Trt 樹脂的制備
[0062]Fmoc-Pro-Dab (Boc)-2-Cl-Trt 樹脂用 400ml20%piperidine/DMF 脫 Fmoc 二次。400ml DMF*4，400ml DCM*2洗滌樹脂。抽走溶劑。
[0063]稱取Boc-β-Ala-OH、HOBT.H2O于干燥500ml廣口三角瓶中。加適量DMF溶劑溶解。置于冰水浴中冷卻。加DIC活化3min，避免水汽。將活化后的氨基酸加入上一步樹脂中反應2h。抽走反應液。用適量DMF洗滌樹脂2min*3次。
[0064]實施例4.Boc- β -Ala-Pro-Dab (Boc) -OH 的制備
[0065]稱取干燥至恒重的Boc-β -Ala-Pro-Dab Ooc)-2-Cl-Trt樹脂肽樹脂,加適當的三氟乙醇裂解液(lg/10mL)切割反應45min。反應結束后，用砂芯漏斗過濾分離樹脂。將濾液旋干，得到全保護粗肽。置于真空干燥器干燥至恒重。
[0066]實施例5.Boc- β -Ala-Pro-Dab (Boc) -NH-Bzl 的制備
[0067]Boc- β -Ala-Pro-Dab (Boc) -OH, HOBt 用 250ml 無水四氫呋喃溶解，冷至 0°C,緩慢加入DCC，0°C攪拌5分鐘，然后加入芐胺及N-甲基嗎啉。0°C攪拌2小時，用N-甲基嗎啉維持pH8~9，室溫攪拌12小時，TLC (氯仿/甲醇/乙酸，20/1/0.4)顯示原料點消失。反應混合物過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用石油醚反復研磨，得到的固體加1500ml乙酸乙酯溶解，分別用飽和NaHCO3水溶液(75ml X 3)，飽和NaCl水溶液(75ml XI),5% KHSO4水溶液(75ml X 3)，飽和NaCl水溶液(15ml X 3)洗滌，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓旋干得到粗品(產率98% )。
[0068]實施例6.HCl.H- β -Ala-Pro-Dab - NH-Bzl 的制備
[0069]Boc-β -Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl,(TC下緩慢加入 250ml4M HCl/ 乙酸乙酯，于(TC攪拌1.5小時，反應液出現大量沉淀，TLC(氯仿/甲醇，10/1)顯示原料點消失，過濾，沉淀用乙酸乙酯(50mlX3)和無水乙醚(50mlX3)反復洗滌至無HC1，得目標化合物粗品(85% )。
[0070]實施例7.精制
[0071]采用C18反相柱純化脫鹽。
[0072]粗品預處理:60g HCl.Η- β -Ala-Pro-Dab - NH-Bzl分成5份，分別用5ml水溶解，過濾。
[0073]填料:C18,柱長800mm,內徑 50mm，
[0074]洗脫條件:梯度洗脫，流速2ml/min，先用2%乙腈I % HOAC水溶液洗脫，硝酸銀溶液檢測氯離子，接收液無氯后換為10%乙腈1% HOAC水溶液，I小時后再轉換為15%乙腈1% HOAC水溶液。
[0075]收集樣品:采用TLC茚三酮顯色方法檢測樣品的流出情況，并根據HPLC檢測數據收集主成分，合并洗脫液，冷凍干燥24小時后，再次加入蒸餾水溶解續(xù)凍干48小時得37g終產品白色凍干粉末(產率68%，純度99.8%)。
[0076]已經通過非限定性實施例對本發(fā)明作出了舉例說明。但本領域的技術人員會理解，在沒有偏離本發(fā)明的宗旨和范圍下，可以對本發(fā)明作出各種修改、替換和變更。
【權利要求】
1.一種制備具有以下結構的三肽的合成方法:
2.權利要求1的方法，其中還包括在步驟(8)后將制得的產物經C18反相柱純化脫鹽，任選將收集的洗脫液進行濃縮并冷凍干燥。
3.權利要求2的方法，C18反相純化可以為低壓制備或高壓制備(HPLC)。
4.權利要求2的方法，其中所述用洗脫液為含有0.1~2%的HOAC或0.1~1%的TFA等反離子酸，并且含有一定濃度的有機溶劑如乙腈、甲醇和乙醇的水溶液，洗脫方式可以采用等度或梯度洗脫。
5.權利要求4的方法，其中所述梯度洗脫程序為:含1%H0AC、2%乙腈的水溶液，含1% H0AC、3%乙腈的水溶液，含1% H0AC、4%乙腈的水溶液。
6.權利要求1的方法，其中在步驟(3)、步驟(5)和步驟(7)中所用的縮合劑為DIC/HOBt。
7.權利要求1的方法，其中在步驟(3)、步驟(5)和步驟(J)中所用的縮合劑為HBTU/DIPEA 或 HATU/DIPEA 或 DCC/H0BT 或 PyBop。
8.權利要求1的方法，其中在步驟(2)和步驟(4)中的脫保護采用5%~50%哌啶的有機溶劑溶液。
9.權利要求1的方法，其中在步驟(6)的切割反應采用三氟乙醇或者I~10%三氟乙酸。
10.權利要求1的方法，其中在步驟(8)的脫保護采用HCl/乙酸乙酯或三氟乙酸/有機溶劑，所述有機溶劑選自四氫呋喃、DMF、NMP、二氯甲烷。
【文檔編號】C07K1/04GK103570804SQ201310412975
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權日:2013年9月11日
【發(fā)明者】丁文鋒 申請人:深圳市維琪醫(yī)藥研發(fā)有限公司