一種合成西那普肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領(lǐng)域，具體涉及一種合成西那普肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 西那普肽是一種人工設(shè)計(jì)的21肽，于2012年3月被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，臨床用于 治療新生兒呼吸窘迫綜合征，其氨基酸肽序如下：
[0003]H-Lys1-Leu2-Leu3-Leu4-Leu5-Lys6-Leu7-Leu8-Leu9-Leu10-Lys11-Leu12-Leu13-Leu14-Leu15-Lys16-Leu17-Leu18-Leu19-Leu20-Lys21-〇H
[0004] 新生兒呼吸窘迫綜合征，又稱新生兒肺透明膜病，指新生兒出生后不久即出現(xiàn)進(jìn) 行性呼吸困難和呼吸衰竭等癥狀，主要是由于缺乏肺泡表面活性物質(zhì)所引起，導(dǎo)致肺泡進(jìn) 行性萎陷，患兒于生后4~12小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難、呻吟、發(fā)紺、吸氣三凹征，嚴(yán)重者 發(fā)生呼吸衰竭。發(fā)病率與胎齡有關(guān)，胎齡越小，發(fā)病率越高，體重越輕病死率越高。
[0005] 現(xiàn)有關(guān)于西那普肽的合成方法國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道。美國(guó)專利US5260273采用基因工 程進(jìn)行制備，該方法工藝成本較高且繁瑣。限制了西那普肽的生產(chǎn)效率。為此，我國(guó)專利 CN102850440A以及CN104098656A均公開(kāi)了一種西那普肽的合成方法，以此降低成本和工 藝繁瑣程度。其中CN104098656A公開(kāi)的是按照西那普肽C端到N端的肽序逐一合成的技 術(shù)方案，但是這種合成策略一方面周期長(zhǎng)，另一方面總收率較低，為47. 9% ;CN102850440A 公開(kāi)了一種片段合成策略，但是根據(jù)其記載的技術(shù)方案合成的多肽和最終的西那普肽并不 一致，而且其總收率更低，僅為40%。
[0006] 不同的合成策略對(duì)最終產(chǎn)品的純度、雜質(zhì)含量和收率有很大影響，如何在保證純 度和收率的前提下，盡可能的降低合成工藝的復(fù)雜程度、雜質(zhì)以及縮短合成周期，是當(dāng)下技 術(shù)人員的研宄重點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種合成西那普肽的方法，使得本發(fā)明所述方 法能夠顯著提高西那普肽合成的總收率，并保證西那普肽具有較高純度和較低的單一雜質(zhì) 含量，同時(shí)縮短合成周期。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0009] 一種合成西那普肽的方法，包括以下步驟：
[0010] 步驟1、將保護(hù)的LyS與樹(shù)脂偶聯(lián)，獲得在Lys的N端及其側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基、在 其C端偶聯(lián)有樹(shù)脂的肽樹(shù)脂1 ;
[0011] 步驟2、將在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列N端偶聯(lián)有保護(hù)基的多肽片段1的C 端與肽樹(shù)脂1的N端進(jìn)行偶聯(lián)，而后將保護(hù)的Lys再與片段1的N端偶聯(lián)，獲得在SEQID NO: 2所示氨基酸序列N端、Lys側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基，在C端偶聯(lián)有樹(shù)脂的肽樹(shù)脂2 ;
[0012] 步驟3、將在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列N端偶聯(lián)有保護(hù)基的多肽片段1的C 端與肽樹(shù)脂2的N端進(jìn)行偶聯(lián)，而后將保護(hù)的Lys再與片段1的N端偶聯(lián)，獲得在SEQID NO: 3所示氨基酸序列N端、Lys側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基，在C端偶聯(lián)有樹(shù)脂的肽樹(shù)脂3 ;
[0013] 步驟4、將在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列N端偶聯(lián)有保護(hù)基的多肽片段1的C 端與肽樹(shù)脂3的N端進(jìn)行偶聯(lián)，而后將保護(hù)的Lys再與片段1的N端偶聯(lián)，獲得在SEQID NO: 4所示氨基酸序列N端、Lys側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基，在C端偶聯(lián)有樹(shù)脂的肽樹(shù)脂4 ;
[0014] 步驟5、將在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列N端偶聯(lián)有保護(hù)基的多肽片段1的C 端與肽樹(shù)脂4的N端進(jìn)行偶聯(lián)，而后將保護(hù)的Lys再與片段1的N端偶聯(lián)，獲得在SEQID NO: 5所示氨基酸序列N端、Lys側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基，在C端偶聯(lián)有樹(shù)脂的西那普肽樹(shù)脂；
[0015] 步驟6、西那普肽樹(shù)脂酸解脫除C端樹(shù)脂和所有保護(hù)基得到西那普肽粗品，粗品純 化轉(zhuǎn)醋酸鹽，獲得西那普肽成品。
[0016] 西那普肽主鏈氨基酸有21個(gè)，采用片段方法進(jìn)行合成存在很多種形式，但只有合 適的片段方法才能保證較高的西那普肽的總收率以及純度，同時(shí)又能降低雜質(zhì)的產(chǎn)生。為 此，申請(qǐng)人根據(jù)長(zhǎng)期的試驗(yàn)研宄，提出了本發(fā)明所述方法來(lái)制備西那普肽，在保證純度的前 提下，進(jìn)一步提高總收率以及降低合成方法的雜質(zhì)的產(chǎn)生。
[0017] 在本發(fā)明所述方法中，按照西那普肽主鏈C端至N端的氨基酸順序交替合成Lys 和（Leu) 4，以西那普肽主鏈N端到C端的氨基酸順序編號(hào)，如下式：
[0018] H-Lys1-Leu2-Leu3-Leu4-Leu5-Lys6-Leu7-Leu8-Leu9-Leu10-Lys11-Leu12-Leu13-Leu14-Leu15-Lys16-Leu17-Leu18-Leu19-Leu20-Lys21-〇H
[0019] SEQIDN0:1所示氨基酸序列即為上式中編號(hào)2-5、7-10、12-15、17-20的多肽序 列，SEQIDN0:2所示氨基酸序列即為上式中編號(hào)16-21的多肽序列，SEQIDN0:3所示氨 基酸序列即為上式中編號(hào)11-21的多肽序列，SEQIDN0:4所示氨基酸序列即為上式中編 號(hào)6-21的多肽序列，SEQIDN0:5所示氨基酸序列即為上式中編號(hào)1-21的多肽序列。
[0020] 本發(fā)明合成的肽樹(shù)脂2是在SEQIDNO: 2所示氨基酸序列基礎(chǔ)上，在其N端、Lys 側(cè)鏈上分別偶聯(lián)有保護(hù)基，在其C端偶聯(lián)有樹(shù)脂；合成的肽樹(shù)脂3是在SEQIDNO: 3所示氨 基酸序列基礎(chǔ)上，在其N端、Lys側(cè)鏈上分別偶聯(lián)有保護(hù)基，在其C端偶聯(lián)有樹(shù)脂；合成的肽 樹(shù)脂4是在SEQIDNO:4所示氨基酸序列基礎(chǔ)上，在在其N端、Lys側(cè)鏈上分別偶聯(lián)有保護(hù) 基，在其C端偶聯(lián)有樹(shù)脂；合成的西那普肽樹(shù)脂是在SEQIDNO: 5所示氨基酸序列基礎(chǔ)上， 在其N端、Lys側(cè)鏈上分別偶聯(lián)有保護(hù)基，在其C端偶聯(lián)有樹(shù)脂；
[0021] 本發(fā)明所述保護(hù)基是在氨基酸合成領(lǐng)域常用的保護(hù)氨基酸主鏈以及側(cè)鏈上氨基、 羧基等干擾合成的基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)，防止氨基、羧基等在制備目標(biāo)產(chǎn)物過(guò)程中發(fā)生反應(yīng)，生 成雜質(zhì)，而被保護(hù)基保護(hù)的氨基酸稱為保護(hù)氨基酸，如保護(hù)的Lys。對(duì)于本發(fā)明中需要保護(hù) 側(cè)鏈的氨基酸來(lái)說(shuō)，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)以及知曉采用常用保護(hù)基來(lái)保護(hù)氨基 酸側(cè)鏈上的氨基、羧基等基團(tuán)，作為優(yōu)選，本發(fā)明以Fmoc保護(hù)基保護(hù)Lys以及（1^11)4的N 端，以Boc保護(hù)基保護(hù)Lys的側(cè)鏈。
[0022] 在合成肽樹(shù)脂1中，保護(hù)的Lys與樹(shù)脂偶聯(lián)所形成的肽樹(shù)脂取代值優(yōu)選為0. 2~ 1. 0mmol/g肽樹(shù)脂，更優(yōu)選的取代值為0. 3~0. 5mmol/g肽樹(shù)脂。
[0023] 本發(fā)明偶聯(lián)時(shí)，每個(gè)保護(hù)氨基酸或多肽片段用量?jī)?yōu)選為肽樹(shù)脂摩爾數(shù)的1-6倍， 更優(yōu)選為2. 5-3. 5倍；所述偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為60~300分鐘，更優(yōu)選為100~140分鐘。
[0024] 在偶聯(lián)中，由于每個(gè)氨基酸N端都有保護(hù)基，因此需要先脫除N端保護(hù)基再偶聯(lián)， 這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知常識(shí)。本發(fā)明優(yōu)選用PIP/DMF(哌啶/N，N-二甲基甲酰胺） 混合溶液脫除N端保護(hù)基，混合溶液中含哌啶為10~30% (V)，其余為DMF。去N端保護(hù)基 試劑的用量為每克肽樹(shù)脂5~15mL，更優(yōu)選的為每克肽樹(shù)脂8~12mL;去N端保護(hù)基時(shí)間 為10~60分鐘，優(yōu)選的為15~25分鐘。
[0025] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所述肽樹(shù)脂指任意個(gè)數(shù)保護(hù)氨基酸或氨基酸按照西那普肽 氨基酸順序和樹(shù)脂相連接形成的肽樹(shù)脂，這其中不僅包括獨(dú)立權(quán)利要求中的肽樹(shù)脂1-4、西 那普肽樹(shù)脂，還包括在合成肽樹(shù)脂1-4、西那普肽樹(shù)脂過(guò)程中形成的肽樹(shù)脂。
[0026] 作為優(yōu)選，所述樹(shù)脂為Trityl-Cl(三苯甲基氯）類樹(shù)脂或羥基類樹(shù)脂。更優(yōu)選地， 所述Trityl-Cl類樹(shù)脂為Trityl-Cl樹(shù)脂、4-Methyltrityl-Cl(4-甲基三苯甲基氯）樹(shù)脂、 4-Methoxytrityl-Cl(4-甲氧基三苯甲基氯）樹(shù)脂或2-C1Trity-Cl(2-氯三苯甲基氯）樹(shù) 月旨；所述羧基類樹(shù)脂為Wang(王）樹(shù)脂或HMP(對(duì)羥甲基苯氧甲基聚苯乙烯）樹(shù)脂。
[0027] 作為優(yōu)選，步驟1所述偶聯(lián)采用偶聯(lián)試劑偶聯(lián)，所述偶聯(lián)試劑為N，N-二異丙基乙 胺（DIPEA)、N，N-二異丙基碳二亞胺/I-羥基苯并三唑/4-N，N-二甲基吡啶（DIC/HOBt/ DMAP)兩種之一。其中，進(jìn)一步優(yōu)選地，當(dāng)樹(shù)脂載體為Trityl-Cl類樹(shù)脂時(shí)，保護(hù)氨基酸 Fmoc-Lys(Boc)-〇H與載體樹(shù)脂的偶聯(lián)方法為：保護(hù)氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-〇H的羧基與樹(shù) 脂中的C1-代烷基在DIPEA的作用下發(fā)生酯化反應(yīng)而接入保護(hù)氨基酸；當(dāng)載體樹(shù)脂為羥基 類型樹(shù)脂時(shí)，F(xiàn)moc-Lys(Boc) -0H與載體樹(shù)脂的偶聯(lián)方法為：Fmoc-Lys(Boc) -0H的羧基與樹(shù) 脂中的羥基在DIC/HOBt/DMAP的作用下發(fā)生酯化反應(yīng)而接入保護(hù)氨基酸。
[0028] 作為優(yōu)選，步驟2至步驟5所述偶聯(lián)均采用縮合試劑和活化試劑偶聯(lián)，所述縮 合試劑優(yōu)選為N，N-二異丙基碳二亞胺（DIC)、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)，六氟磷酸 苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有機(jī)堿（PyBOP/有機(jī)堿）、2-(7_氮雜-1H-苯 并三氮唑-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲六氟磷酸酯/有機(jī)堿（HATU/有機(jī)堿）、苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸鹽/有機(jī)堿（HBTU/有機(jī)堿）、0-苯并三氮 唑-N，N，N'，N'_四甲基脲四氟硼酸酯/有機(jī)堿（TBTU/有機(jī)堿）中的一種。所述縮合試劑 的摩爾用量?jī)?yōu)選為肽樹(shù)脂中總摩爾數(shù)的1~6倍，更優(yōu)選為2. 5~3. 5倍。所述活化試劑 為1-羥基苯并三唑（