人pgi抗原表位肽、抗原、抗體、用途及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及人PGI抗原表位肽、抗原、抗體、用途及試劑盒。本發(fā)明的人PGI抗原表位肽的氨基酸序列，為序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列之一。本發(fā)明的PGI抗原由人PGI抗原表位肽與載體蛋白偶聯(lián)制得。本發(fā)明的PGI單克隆抗體或多克隆抗體由本發(fā)明的PGI抗原制得。本發(fā)明的PGI單克隆抗體或多克隆抗體用于制備PGI體外診斷試劑盒。本發(fā)明的人PGI抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制備的抗原（免疫原）免疫動物能夠產(chǎn)生高度特異性的單克隆抗體和多克隆抗體，從而可應(yīng)用于人PGI的體外檢測。
【專利說明】人PGI抗原表位肽、抗原、抗體、用途及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多肽化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人胃蛋白酶原I (PGI)抗原表位肽、 用該抗原表位肽制備的PGI特異性抗原和相應(yīng)的單克隆抗體或多克隆抗體、所述抗體在制 備人PGI體外診斷試劑盒上的用途、人PGI體外診斷試劑盒，以及一種用于定量檢測待測物 中人PGI蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 胃蛋白酶原（PG)是胃液中胃蛋白酶的無活性前體。人胃蛋白酶原按其電泳遷移 率由快至慢,可分為PGl至PG7七種同工酶原，并且根據(jù)其生化性質(zhì)、免疫原性、細(xì)胞來源以 及組織內(nèi)分布可分為PGI和PGII兩個亞群。七種同工酶原中的PGl至PG5免疫原性近似， 稱為胃蛋白酶原I (PGI)，其主要由胃腺的主細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞分泌；PG6至PG7被稱為胃 蛋白酶原II (PGII)，除了由胃體和胃底黏膜的泌酸腺的主細(xì)胞分泌外，泌酸腺的黏液頸細(xì) 胞、賁門腺和胃竇的幽門腺的黏液細(xì)胞以及十二指腸上段的Brunner腺也能產(chǎn)生PGII。胃 幾乎是PG的唯一來源，并且在分泌階段的分泌量會發(fā)生變化。血清PGI和PGII反映了胃 粘膜不同部位的分泌功能。合成后的PG大部分進(jìn)入胃腔，在酸性胃液作用下活化成胃蛋白 酶，只有少量PG (約1%)透過胃黏膜毛。因此，血清PG濃度可以反映其分泌水平。正常人 血清中的PGI是PGII的6倍，當(dāng)胃黏膜發(fā)生病理變化時，血清PG含量也隨之發(fā)生改變。
[0003] 血清PG含量與幽門螺桿菌（HP)感染、慢性胃炎、胃癌等相關(guān)。在不同胃部疾病中， 血清PGI、PGII和PGI/PGII的值發(fā)生相應(yīng)變化，其升高、降低還是不變并不一致，作為診斷 或治療結(jié)果指標(biāo)的靈敏度和特異度也各不相同。因此，對于不同胃部疾病，血清PGI、PGII 和PGI/PGII的值也有不同的判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0004] PGI是檢測胃泌酸腺（胃底腺）細(xì)胞功能的指針，胃酸分泌增多，則PGI升高；胃酸 分泌減少或胃粘膜腺體萎縮，則PGI降低。例如，在胃酸分泌過多的淺表性胃炎和幽門螺 桿菌（HP)感染的胃炎中，PGI的分泌會增加；而在慢性嚴(yán)重萎縮性胃炎中，當(dāng)主細(xì)胞減少時 PGI含量下降。高濃度的PGI還作為十二指腸潰瘍及并發(fā)癥危險性的亞臨床指征，并且還可 以作為觀察HP (幽門螺旋桿菌）感染根除治療療效的一個指標(biāo)。
[0005] 胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其病死率居各種惡性腫瘤之首，其早期診斷、早 期治療成為提高患者生存質(zhì)量、降低病死率的唯一途徑。國內(nèi)外學(xué)者對胃癌患者血清PG變 化作了大量的研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)患胃癌時，血清PGI水平降低，PGII水平基本保持正?；蛏?， 進(jìn)而，測定血清PGI的水平和PGI/PGII的比值有助于胃癌的鑒別診斷，過低的PGI和PGI/ PGII應(yīng)警惕早期胃癌。由于血清PG的含量直接反映胃黏膜的功能，因此胃癌患者血清PGI 水平明顯下降，表明胃癌患者胃黏膜分泌能力下降。80%以上的胃癌伴有萎縮性胃炎，而萎 縮性胃炎可導(dǎo)致胃黏膜主細(xì)胞丟失，從而影響其分泌功能；胃癌患者血清PGI水平明顯下 降與胃癌患者胃黏膜萎縮、腸化從而分泌降低有關(guān)。因此血清PGI及PGI/PGII明顯下降對 監(jiān)測早期胃癌具有重要的臨床意義，可有效應(yīng)用于胃癌高發(fā)區(qū)人群的初步篩查。PG檢測作 為非侵入性方法，可降低胃病患者或胃癌高危人群檢查的痛苦，并且簡便、經(jīng)濟(jì)，具有重大 意義。
[0006] 檢測血清中的PGI水平的最理想的方法是免疫測定。因此，尋找合適的具有免疫 原性的PGI抗原表位肽、制備特異性的PGI抗原及抗體即成為了重點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明提供了一種人PGI抗原表位肽，用 該抗原表位肽制備的PGI特異性抗原和相應(yīng)的單克隆抗體或多克隆抗體，其在制備人PGI 體外診斷試劑盒上的用途，以及人PGI體外診斷試劑盒。
[0008] 具體而言，本發(fā)明提供了：
[0009] -種人PGI抗原表位肽，其中所述PGI抗原表位肽的氨基酸序列為如下兩者之
[0010] (I)Tyr-Lys-Val-Pro-Leu-Ile-Arg-Lys-Lys-Ser-Leu-Arg-Arg ；
[0011] (2)Tyr-Lys-Asn-Phe-Thr-Val-Phe-Asp-Arg-Ala-Asn-Asn-Gln。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種PGI抗原，其是通過使所述的人PGI抗原表位肽（1)與載體 蛋白偶聯(lián)制備而成的。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種PGI抗原，其是通過使所述的人PGI抗原表位肽（2)與載體 蛋白偶聯(lián)制備而成的。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種人PGI抗體，其是由所述的PGI抗原制備而成的單克隆抗體 或多克隆抗體，其中所述PGI抗原是通過使所述的人PGI抗原表位肽（1)與載體蛋白偶聯(lián) 制備而成的。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種人PGI抗體，其是由所述的PGI抗原制備而成的單克隆抗體 或多克隆抗體，其中所述PGI抗原是通過使所述的人PGI抗原表位肽（2)與載體蛋白偶聯(lián) 制備而成的。
[0016] 本發(fā)明還提供了根據(jù)所述的人PGI抗體在制備人PGI體外診斷試劑盒上的用途。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種人PGI體外診斷試劑盒，其包含所述的人PGI抗體作為包被 抗體，其中所述包被抗體優(yōu)選為單克隆抗體。
[0018] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包含結(jié)合抗體，所述結(jié)合抗體為所述的人PGI抗體，并且該 結(jié)合抗體優(yōu)選為多克隆抗體，并且當(dāng)所述結(jié)合抗體來源于所述的人PGI抗原表位肽（1)和 (2)中的一者時，所述包被抗體來源于所述的人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的另一者。 [0019] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包含酶標(biāo)記的第二抗體。
[0020] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和積極效果：
[0021] 1.本發(fā)明的人PGI抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制備的抗原(免疫原)免疫 動物能夠產(chǎn)生高度特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。
[0022] 2.用本發(fā)明制備的PGI單克隆抗體和多克隆抗體能夠高度特異地與血液樣本中 的PGI結(jié)合。
[0023] 3.本發(fā)明的人PGI體外診斷試劑盒可以有效地監(jiān)測血清中的PGI的水平，并且制 備方法簡單，成本低，適于規(guī)?；a(chǎn)。
[0024] 4.本發(fā)明將熒光分析技術(shù)與快速層析免疫技術(shù)相結(jié)合，提供了一種用于定量檢測 待測物中人PGI蛋白的熒光免疫層析試紙，用該試紙檢測待測物中的人PGI蛋白，操作簡 便、快速，只需10分鐘就能完成樣品檢測，并且檢測范圍寬、特異性高、靈敏度好，能夠迅速 及時地幫助診斷病情，監(jiān)測預(yù)后。
[0025] 5.本發(fā)明在制備所述人PGI蛋白的熒光免疫層析試紙的過程中，通過大量的試驗 摸索，優(yōu)化了各方面的制備條件，使得用本發(fā)明的熒光免疫層析試紙進(jìn)行檢測時，熒光信背 比大大提高，從而提高了檢測靈敏度和結(jié)果可信度；此外，本發(fā)明還通過試紙的檢測區(qū)與質(zhì) 控區(qū)的熒光強(qiáng)度比值的變化來反應(yīng)樣品中PGI的含量，這與傳統(tǒng)的層析技術(shù)只考查檢測區(qū) 的絕對熒光強(qiáng)度相比，最大程度上減少了外界條件和背景等的影響，進(jìn)一步提高了檢測結(jié) 果可信度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為示出本發(fā)明的人PGI體外診斷試劑盒的檢測結(jié)果與已知試劑盒的檢測結(jié)果 的相關(guān)性的圖，其中橫坐標(biāo)為用已知試劑盒測得的樣品中PGI濃度的值，單位為ng/ml，縱 坐標(biāo)為用本發(fā)明試劑盒測得的樣品中PGI濃度的值，單位為ng/ml。

【具體實施方式】
[0027] 以下通過【具體實施方式】的描述并參照附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對 本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只 要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0028] 一、人PGI抗原表位肽
[0029] 本文中所述的人PGI蛋白是本領(lǐng)域已知的，其氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的，可以 在NCBI等專業(yè)數(shù)據(jù)庫中查到。
[0030] 本發(fā)明提供了一種人PGI抗原表位肽（1)和（2)，其氨基酸序列分別如序列表SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示，為：
[0031] (I)Y-K-V-P-L-I-R-K-K-S-L-R-R ;和
[0032] (2)Y-K-N-F-T-V-F-D-R-A-N-N-Q。
[0033] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的理論研究和實驗摸索，篩選得到兩個具有良好的抗原 性的抗原表位肽。
[0034] PGI抗原表位肽⑴以人PGI蛋白（PG3)N端第19至30位的一段含12個氨基酸 殘基的肽段作為抗原決定簇，并且在其N端添加有Y。在N端加 Y是為了使該抗原表位肽 通過BDB (Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交聯(lián)到載體蛋白（例如血藍(lán)蛋白（KLH)) 上，從而作為抗原來制備抗體。PGI抗原表位肽（1)具有親水性高、抗原性強(qiáng)并且易于合成 的特點。
[0035] PGI抗原表位肽⑵以人PGI蛋白（PG3)C端第372至381位的一段含10個氨基 酸殘基的肽段作為抗原決定簇，并且在其N端添加有3個氨基酸殘基：Y、K、N。這樣構(gòu)成的 PGI抗原表位肽（2)也具有親水性高、抗原性強(qiáng)并且易于合成的特點。
[0036] 目前，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的PGI抗原表位肽具有如下功能：
[0037] 1.具有抗原性；2.與載體蛋白連接后作為免疫原刺激動物產(chǎn)生特異性的抗體； 3.用抗原表位肽制備的抗體可特異性地與人PGI結(jié)合。
[0038] 本發(fā)明的PGI抗原表位肽的制備方法可用化學(xué)合成法：利用美國ABI431A型多肽 自動合成儀，通過固相法合成抗原表位肽。本發(fā)明的抗原表位肽（1)和（2)的分子量分別 為1657. 24和1616. 93,可用質(zhì)譜進(jìn)行確定，并通過多肽序列測定鑒定所合成的抗原表位肽 序列。肽段的純度用薄層色譜和高效液相色譜進(jìn)行評定，并測定抗原表位肽的濃度。
[0039]二、PGI 抗原
[0040] 本發(fā)明還提供了一種PGI抗原，其通過使本發(fā)明的人PGI抗原表位肽（1)和（2)中 的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。具體而言，本發(fā)明提供了 PGI抗原（1)和（2)，所述PGI 抗原（1)通過使本發(fā)明的人PGI抗原表位肽（1)與載體蛋白偶聯(lián)制備而成；所述PGI抗原 (2)通過使本發(fā)明的人PGI抗原表位肽（2)與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。本發(fā)明的PGI抗原 具有免疫原性和特異性，是一種免疫原，可用來免疫動物從而制備特異性的PGI抗體。在本 發(fā)明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白）、牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白 OVA等。由于KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白）免疫原性強(qiáng)，結(jié)合位點多，免疫效果較好，并且與免疫動 物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，用其作為載體蛋白不易引起交叉反應(yīng)，因此是優(yōu)選的。
[0041] 三、PGI單克隆抗體、PGI多克隆抗體和人PGI體外診斷試劑盒
[0042] 本發(fā)明還提供了人PGI單克隆抗體和人PGI多克隆抗體，所述抗體可以分別利用 本發(fā)明的PGI抗原（1)和（2)(免疫原）免疫動物制備而得。制備方法可采用本領(lǐng)域的常 規(guī)技術(shù)，具體可參見實施例2。
[0043] 本發(fā)明的PGI單克隆抗體和多克隆抗體可以用于制備人PGI體外診斷試劑盒，該 試劑盒可以基于免疫方法對血液標(biāo)本中的PGI進(jìn)行檢測。
[0044] 因此，本發(fā)明提供了一種人PGI體外診斷試劑盒，其包含本發(fā)明的人PGI單克隆抗 體或多克隆抗體。
[0045] 目前已知可用于臨床檢驗的免疫實驗方法主要包括以下幾種：ELISA法、化學(xué)發(fā) 光法、熒光層析法、膠體金免疫測定法等。
[0046] 而ELISA法包括以下幾種類型：雙抗體夾心法檢測抗原、雙抗原夾心法檢測抗體、 間接法測抗體、競爭法測抗體、競爭法測抗原、捕獲包被法測抗體等。
[0047] 本發(fā)明的人PGI體外診斷試劑盒優(yōu)選采用ELISA雙抗體夾心法來檢測PGI蛋白。 該試劑盒可以包含包被抗體、結(jié)合抗體、酶標(biāo)記的第二抗體和/或必要的工具和試劑等。
[0048] 優(yōu)選的是，所述人PGI體外診斷試劑盒采用本發(fā)明的人PGI單克隆抗體作為包被 抗體。在此，術(shù)語"包被抗體"是指包被于固相的酶標(biāo)板上的抗體。此外，所述人PGI體外 診斷試劑盒還優(yōu)選包含人PGI多克隆抗體以作為結(jié)合抗體，其中，當(dāng)所述結(jié)合抗體來源于 本發(fā)明的人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的一者時，所述包被抗體來源于所述抗原表位肽 (1)和⑵中的另一者。在此，術(shù)語"結(jié)合抗體"是指試劑盒中可與待測抗原及酶標(biāo)記第二 抗體結(jié)合的特異性抗體。所述試劑盒還可以包含酶標(biāo)記的第二抗體，該第二抗體可以為羊 抗兔IgG抗體，所述酶標(biāo)記可以為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等。
[0049] 在本發(fā)明的試劑盒中，還可以包含檢測所需的任何試劑或工具，例如預(yù)包被板、洗 滌液、顯色劑、終止液等。
[0050] 四、用于定量檢測人PGI蛋白的熒光免疫層析試紙
[0051] 本發(fā)明還提供了一種用于定量檢測待測物中人PGI蛋白的熒光免疫層析試紙，該 試紙通過雙抗體夾心法檢測所述人PGI蛋白，其中：
[0052] 所述雙抗體夾心法采用標(biāo)記有熒光微球的第一 PGI單克隆抗體作為捕獲抗體，所 述第一 PGI單克隆抗體來源于人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的一者；并且
[0053] 所述雙抗體夾心法還采用第二PGI單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二PGI單克 隆抗體來源于人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的另一者；
[0054] 所述人PGI抗原表位肽（1)和（2)分別為：
[0055] (I)Tyr-Lys-Val-Pro-Leu-Ile-Arg-Lys-Lys-Ser-Leu-Arg-Arg ；
[0056] (2)Tyr-Lys-Asn-Phe-Thr-Val-Phe-Asp-Arg-Ala-Asn-Asn-Gln。
[0057] 在本發(fā)明中，在雙抗體夾心法熒光免疫層析試紙中，"捕獲抗體"是指能夠首先特 異性識別待測抗原的抗體，其通常包被在結(jié)合墊上；"檢測抗體"是指另一種能夠特異性識 別待測抗原的抗體，其與捕獲抗體分別識別待測抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固 定在反應(yīng)膜的檢測區(qū)上。
[0058] 在本發(fā)明中，所述第一 PGI單克隆抗體可以由第一 PGI抗原制備而成，該第一 PGI 抗原可以通過使所述人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成；并 且所述第二PGI單克隆抗體可以由第二PGI抗原制備而成，該第二PGI抗原可以通過使所 述人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的另一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。
[0059] 在本發(fā)明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白）、牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白）免疫原性強(qiáng)，結(jié)合位點多，免疫效果較 好，并且與免疫動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，用其作為載體蛋白不易引起交叉反應(yīng)，因此是優(yōu)選的。
[0060] 優(yōu)選地，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙中所用的熒光微球的粒徑為320nm至400nm， 優(yōu)選為360nm，熒光微球上的熒光物質(zhì)可為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰 酸羅丹明或X-羅丹明等，其中優(yōu)選為X-羅丹明（可購自上海晶純公司）。熒光微球的微球 材料可以為由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯與其它單體共聚形成的共聚 物，其它單體的例子為苯乙烯等。突光微球的激發(fā)波長可以為350?600nm，優(yōu)選為390nm ; 發(fā)射波長可以為500?700nm，優(yōu)選為615nm。
[0061] 在本發(fā)明中，熒光微球的最大激發(fā)波長與發(fā)射波長差值較大，說明熒光微球有較 大的斯托克斯（Stokes)位移，這樣，熒光試紙的背景干擾較低，以該微球做免疫層析標(biāo)記物 有較強(qiáng)的優(yōu)勢。
[0062] 在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙具有底板，并且在該底板 上沿使用時的層析方向依次以接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙，所述樣 品墊用于在使用時加載待測樣品，所述結(jié)合墊包被有所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 PGI單 克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)包被有所述第二PGI單克隆抗體， 所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 PGI單克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗 體。
[0063] 優(yōu)選地，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙的樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙可以沿 使用時的層析方向依次搭接設(shè)置在底板上。反應(yīng)膜上間隔設(shè)置的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)可以為， 但不限于，線、帶、塊等形式，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)優(yōu)選間隔3mm至8mm。
[0064] 在本發(fā)明中，反應(yīng)膜優(yōu)選為在大于550nm的波長下基本上不發(fā)熒光的硝酸纖維素 膜。此外，底板優(yōu)選基本上不具有熒光性質(zhì)。
[0065] 通常，常規(guī)的層析試紙組件(反應(yīng)膜、底板等)在550nm波長下具有較明顯的熒光背 景，這對熒光信號的檢測產(chǎn)生很大干擾。本發(fā)明通過采用在大于550nm的波長下基本上不 發(fā)熒光的硝酸纖維素膜和低熒光性質(zhì)的底板，從而克服了常規(guī)熒光試紙的缺陷。此外，本發(fā) 明所用的熒光物質(zhì)X-羅丹明可產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號，從而進(jìn)一步大大提高了熒光信背比， 使得能夠很好地區(qū)分信號和背景，進(jìn)而提高檢測靈敏度。
[0066] 在本發(fā)明中，樣品墊和結(jié)合墊的材料可采用本領(lǐng)域通常使用的材料，例如，樣品墊 和結(jié)合墊可以為玻璃纖維。
[0067] 本發(fā)明所采用的能與標(biāo)記有熒光微球的第一 PGI單克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗 體可以為羊抗鼠 IgG單克隆抗體或兔抗鼠 IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選為羊抗鼠 IgG單克隆 抗體，與多克隆抗體相比，單克隆抗體特異性更高。
[0068] 在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙在使用時，在樣品墊上滴 加樣品液(如含有PGI的血樣)，在毛細(xì)管作用下，樣品液向吸水濾紙一端移動，在結(jié)合墊處 與所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 PGI單克隆抗體形成免疫復(fù)合物，該免疫復(fù)合物進(jìn)一步移 動，在檢測線上與所述第二PGI單克隆抗體結(jié)合形成雙抗體夾心的免疫復(fù)合物，而未形成 免疫復(fù)合物的標(biāo)記有熒光微球的第一 PGI單克隆抗體則與質(zhì)控線上的抗抗體結(jié)合。此過程 需要10分鐘至15分鐘，之后，用熒光檢測儀進(jìn)行檢測，如果質(zhì)控線處未出現(xiàn)條帶，則說明試 紙失效；如果質(zhì)控線處出現(xiàn)條帶，而檢測線處未出現(xiàn)條帶，則說明樣品中不含人PGI蛋白； 如果在質(zhì)控線和檢測線上均出現(xiàn)條帶，則說明樣品中含有人PGI蛋白。
[0069] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種制備用于定量檢測待測物中人PGI蛋白的熒光 免疫層析試紙的方法，其包括以下步驟：
[0070] 1)提供標(biāo)記有突光微球的第一 PGI單克隆抗體；
[0071] 2)提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 PGI單克 隆抗體；
[0072] 3)提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時的層析方向間隔固定第二PGI單克 隆抗體和抗抗體，以分別形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；和
[0073] 4)在底板上沿使用時的層析方向依次以接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述 反應(yīng)膜、吸水濾紙，從而制成所述熒光免疫層析試紙。
[0074] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可以根據(jù)實際需要對上述步驟的順序進(jìn)行調(diào)整， 例如步驟3)可以在步驟1)之前，或在步驟1)和2)之間。
[0075] 本發(fā)明的方法還可以包括將制成的熒光免疫層析試紙切割成適當(dāng)寬度的步驟5)。
[0076] 本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的試驗摸索，優(yōu)化了制備本發(fā)明的用于檢測人PGI蛋白 的熒光免疫層析試紙的方法的各個步驟的條件，從而使得本發(fā)明的熒光免疫層析試紙能夠 針對人PGI蛋白獲得符合臨床檢測要求的結(jié)果，S卩，檢測范圍寬、特異性高、靈敏度好。
[0077] 因此，優(yōu)選的是，在本發(fā)明的方法中，所述步驟1)包括：
[0078] a)用碳二亞胺活化熒光微球，優(yōu)選地，將熒光微球的水分散液或MES緩沖液分散 液經(jīng)超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述熒光微球；
[0079] b)洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光 微球用N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液洗滌、分散，并經(jīng)超聲波處理；
[0080] C)用步驟b)所獲得的熒光微球標(biāo)記第一 PGI單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟b)所獲 得的熒光微球與第一 PGI單克隆抗體混合，用BSA-乙醇胺緩沖液封閉，離心，用BSA-吐溫 水溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標(biāo)記有熒光微球的第一 PGI單克隆抗體。
[0081] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述步驟1)包括：
[0082] a)用碳二亞胺活化熒光微球，其中，取I (w/v) %的熒光微球水分散液，IOOOOrpm至 15000rpm低溫(例如KTC )離心5至10分鐘，去上清，將沉淀物分散到500 μ 1的蒸餾水或 初洗緩沖液（〇. IM的MES水溶液）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，重復(fù)以上過程三次， 加入碳二亞胺IOmg至50mg，攪拌10?15分鐘，從而活化所述突光微球；
[0083] b)洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，其中，將步驟a)所獲得的活化的熒光 微球在IOOOrpm至15000rpm下離心5至10分鐘，將沉淀物分散到Iml偶聯(lián)緩沖液（20? IOOmM的N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，重 復(fù)以上過程二次；
[0084] C)用步驟b)所獲得的熒光微球標(biāo)記第一 PGI單克隆抗體，其中，按照1μ 1至3μ 1 抗體（10mg/ml) /100 μ 1所述活化的熒光微球的比例，將步驟b)所獲得的熒光微球與第一 PGI單克隆抗體混合，室溫（25°C)下攪拌1. 5?3小時(優(yōu)選2小時)，加入Iml封閉緩沖液 (I (w/v) %BSA_0. 05M乙醇胺)，繼續(xù)攬拌1小時，在IOOOOrpm至15000rpm下離心5至10分 鐘，重復(fù)離心3次，將沉淀物分散到500 μ 1終洗緩沖液（0. 5 (w/v) %BSA-〇. 11 (v/v) %吐溫水 溶液）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，用所述終洗緩沖液定容至500 μ 1。
[0085] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，所述步驟2)包括：將標(biāo)記有熒光微球的第一 PGI單克 隆抗體用抗體稀釋液（1% (w/v) BSA-0. OlM PBS (ρΗ7. 2)緩沖液)進(jìn)行稀釋，以稀釋至0. 5? 2mg/ml，優(yōu)選為lmg/ml，然后用微量移液器均勻噴涂在結(jié)合墊上，之后烘干或真空冷凍干 燥。在本發(fā)明的方法的步驟2)中，所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 PGI單克隆抗體的包被濃 度為0· 5?2mg/ml，優(yōu)選為lmg/ml。
[0086] 優(yōu)選地，所述步驟3)包括：用噴金機(jī)將所述第二PGI單克隆抗體和抗抗體劃到硝 酸纖維素膜（固相載體)上以作為檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，使檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的間隔為3_至8_， 所述第二PGI單克隆抗體和所述抗抗體的濃度分別為0. 5?2mg/ml，優(yōu)選為lmg/ml。
[0087] 優(yōu)選地，結(jié)果檢測利用專用的熒光檢測儀(可購自深圳市安群生物工程有限公司， 型號AQ-3000)對質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)進(jìn)行檢測，檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)熒光強(qiáng)度的比值和待測樣品中 的PGI的含量成正比。采用檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)熒光強(qiáng)度的比值而不是直接采用檢測區(qū)的絕對 熒光值可盡可能地減少反應(yīng)條件、基質(zhì)等的影響，并盡量避免背景干擾。
[0088] 以下通過例子的方式進(jìn)一步解釋或說明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些例子不應(yīng)被理解為 對本發(fā)明的保護(hù)范圍的限制。
[0089] 實施例
[0090] 除非另有說明，以下所述溶液均為水溶液，溶液中的百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。
[0091] 實施例I :PGI抗原表位肽⑴和⑵的制備。
[0092] 制備方法用化學(xué)合成法：利用美國ABI431A型多肽自動合成儀，通過固相法分別 合成PGI抗原表位肽（1)和（2)?？乖砦浑牡募兌扔酶咝б合嗌V進(jìn)行評定，并測定肽段 的濃度。本發(fā)明的抗原表位肽（1)和（2)的分子量分別為1657. 24U616. 93,利用質(zhì)譜進(jìn)行 確定，通過多肽序列測定鑒定所合成的多肽序列。
[0093] -、PGI抗原表位肽（1)和（2)的合成
[0094] 上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先將所要合成肽鏈的羧基 末端氨基酸的羧基以共價鍵形式同一個不溶性的高分子化合物（樹脂）相連接，然后以此 結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份，經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組份 反應(yīng)，接長肽鏈。這樣的步驟可以反復(fù)地多次進(jìn)行下去，最后達(dá)到所需要合成的肽鏈的長 度。這個合成過程如下所示。
[0095]

【權(quán)利要求】
1. 一種人PGI抗原表位肽，其中所述PGI抗原表位肽的氨基酸序列為如下兩者之一： (1) Tyr-Lys-Val-Pr〇-Leu-Ile-Arg-Lys-Lys-Ser-Leu-Arg-Arg ； (2) Tyr-Lys-Asn-Phe-Thr-Val-Phe-Asp-Arg-Ala-Asn-Asn-Gln〇
2. -種PGI抗原，其是通過使權(quán)利要求1所述的人PGI抗原表位肽（1)與載體蛋白偶 聯(lián)制備而成的。
3. -種PGI抗原，其是通過使權(quán)利要求1所述的人PGI抗原表位肽（2)與載體蛋白偶 聯(lián)制備而成的。
4. 一種人PGI抗體，其是由權(quán)利要求2所述的PGI抗原制備而成的單克隆抗體或多克 隆抗體。
5. -種人PGI抗體，其是由權(quán)利要求3所述的PGI抗原制備而成的單克隆抗體或多克 隆抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的人PGI抗體在制備人PGI體外診斷試劑盒上的用途。
7. -種人PGI體外診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求4或5所述的人PGI抗體作為包被抗 體，其中所述包被抗體優(yōu)選為單克隆抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的人PGI體外診斷試劑盒，其中所述試劑盒還包含結(jié)合抗體，所 述結(jié)合抗體為權(quán)利要求4或5所述的人PGI抗體，并且該結(jié)合抗體優(yōu)選為多克隆抗體，并且 當(dāng)所述結(jié)合抗體來源于所述的人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的一者時，所述包被抗體來 源于所述的人PGI抗原表位肽（1)和（2)中的另一者。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的人PGI體外診斷試劑盒，其中所述試劑盒還包含酶標(biāo)記的第 二抗體。
【文檔編號】C07K7/08GK104418939SQ201310370223
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】朱建安 申請人:朱建安