治療性犬免疫球蛋白及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了制備適用于治療犬的犬抗體的方法。特別是，提供了可以對其結合靶抗原時是否介導下游補體介導的免疫激活的特性進行選擇的免疫球蛋白。本發(fā)明提供了包含特定重鏈同種型的犬衍生抗體。本發(fā)明延伸至本發(fā)明的免疫球蛋白在治療犬的諸如疼痛、炎性病癥和癌性病癥的方法中的用途。
【專利說明】治療性犬免疫球蛋白及其使用方法
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及用作可溶性細胞外介質和/或細胞表面受體拮抗劑的犬抗體或犬衍生抗體，其具有特定的重鏈恒定結構域。本發(fā)明延伸至所述抗體或其片段在用于選擇性治療犬個體的諸如炎癥、疼痛、癌癥或感染等病癥的方法中的治療用途。[0002]發(fā)明背景
[0003]使用免疫球蛋白的恒定結構域片段(constant domain fragment)構建的重組免疫球蛋白和融合蛋白用于治療許多人類疾病，包括炎性疾病(例如風濕性關節(jié)炎、銀屑病、炎性腸病)、過敏(例如哮喘)、癌癥(例如淋巴癌、乳腺癌、腸癌)、感染性疾病(例如RSV感染)、疼痛(例如骨關節(jié)炎疼痛、癌性疼痛、下背痛)和眼病(例如老年性黃斑變性)。
[0004]用于治療的分子革巴標包括細胞因子和趨化因子(例如白細胞介素-1 (IL-1)、白細胞介素-5 (IL-5)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)、生長因子(例如神經生長因子(NGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF))、細胞表面受體(例如HER_2、VEGFR、EGFR、CD20)、細胞表面結合生長因子(例如未加工的腫瘤壞死因子)、病毒(例如RSV)和補體級聯成分(例如C5)。有證據表明參與疾病過程的許多其它革巴標是已知的(例如，如2011年12月14日的1.3.1版頂GT/MAb-DB數據庫中所沭(URL: www.1mgt.0rg/mAb-DB/query),其內容通過引用并入本文)。
[0005]天然免疫球蛋白產生不同的主要亞型，包括免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M (IgM)或免疫球蛋白E (IgE)，為了應對感染，這些免疫球蛋白在通過結合靶抗原的病原體識別、中和、破壞和消除中起到各種作用。免疫球蛋白G產生幾種不同的同種型(也稱為亞型)，例如(在人類中)IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。這些抗體同種型在結構上、尤其在恒定結構域的氨基酸序列方面有差異，特別是在Cl域和C2域之間的恒定結構域(Fe)的鉸鏈區(qū)附近有差異。
[0006]不同的抗體同種型在抗體介導的下游效應子功能方面也存在不同。例如，抗體的恒定區(qū)序列可以在抗體的例如效應子功能(ADCC，補體募集固定和激活)、藥代動力學和物理性質的特性上介導強大的影響。具有不同同種型的抗體在結合免疫細胞上的IgG Fe受體的能力上也存在不同。對于人類來說，IgGl和IgG3積極參與募集補體以通過血液中補體酶的級聯來幫助靶標破壞(CDC:補體依賴性細胞毒性作用)，類似地，IgGl和IgG3結合以結合抗原作為靶標的免疫細胞上的Fe受體，通過抗體介導細胞毒性作用(ADCC)破壞結合抗原。相比之下，IgG2和IgG4不募集補體或激活ADCC介導的攻擊，僅以高親合力簡單地結合到抗原以抑制或抵消其活性。
[0007]當考慮用于疾病干預的靶標時，設計重組免疫球蛋白及由其制成的融合蛋白以考慮Fe同種型的活性。例如，當考慮旨在使用靶向殺死人癌細胞的抗體的治療途徑時，優(yōu)選由IgGl或IgG3同種型Fe域構建重組免疫球蛋白，因為這些同種型的使用會驅動免疫介導破壞機制，例如CDC和ADCC。相比之下，當將敏感人體組織情況下的可溶性介質作為靶標時，Fe域被省略(例如，在人老年性黃斑變性的治療中，優(yōu)選靶向VEGF的Fab片段)，或者使用IgG2或IgG4Fc域進行構建(例如，靶向神經病理性疼痛或炎癥性疼痛情況下的神經生長因子，或腎炎、銀屑病或風濕性關節(jié)炎病癥下的補體C5)。這些考慮也適用于免疫球蛋白融合蛋白，例如基于人IgGlFc療法，在例如風濕性關節(jié)炎的病癥的治療中的可溶性TNF受體Fe融合蛋白。
[0008]在犬和例如鼠和馬的其它物種中，免疫球蛋白亞型同樣存在，但相互之間不具有足夠的同源性以通過推理確定哪條序列在引發(fā)例如⑶C或ADCC的下游效應子功能方面是活躍的或不活躍的。而且，免疫球蛋白的數量隨物種的不同而變化(例如，犬中有四個IgG免疫球蛋白，為 calgG-A、calgG-B> calgG-C 和 calgG-D (Tang et al., 2001)。在馬中有七個 IgG 同種型(Wagner, 2006))。
[0009]單獨由序列分析或序列同源性不可能確定非人類物種的特定免疫球蛋白同種型在介導受體結合和下游效應子功能方面是否為活躍或不活躍。但是，如果這些是已知的，將具有極大的價值，由于為了提供抗體或基于療法的抗體的療效，例如抗體結合片段或融合蛋白，用于抗體產生的同種型恒定結構域的選擇可能是關鍵因素。
[0010]發(fā)明概述
[0011]經過大量實驗，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現，犬IgG免疫球蛋白的同種型具有在人IgG抗體中觀察到的特性，即某些IgG抗體同種型在激活免疫效應子功能方面是活躍的，而其它的IgG抗體同種型不激活免疫效應子功能，因而是不活躍的。此外，對于四種已知的犬重鏈免疫球蛋白(被稱為 HCA(calgG-A)、HCB(calgG-B)、HCC(calgG-C)和 HCD(calgG-D))，發(fā)明人出人意料地發(fā)現，當構建為靶向不同藥靶的各種重組形式時，該四種犬重鏈免疫球蛋白中的兩種(calgG-B和calgG-C)的重鏈恒定結構域令人吃驚地與補體結合,而其它兩種(calgG-A 和 calgG-D)沒有。[0012]因此，本發(fā)明限定了某些重組犬免疫球蛋白或由其制成的融合蛋白，其可用于期望靶標破壞的犬治療中(例如癌癥或傳染病的治療)；以及某些其它同種型，其可以優(yōu)選用于只為祀標中和(target neutralisation)而非祀標破壞的犬類治療中(例如疼痛治療)。
[0013]由此，本發(fā)明提供了重組犬免疫球蛋白，基于它們的重鏈恒定結構域的同種型，其可通過結合補體級聯的第一組分的能力或其它而區(qū)分。因此，首次不管出于通過補體介導細胞毒性效應(CDC ;例如用于殺死活體中的犬腫瘤)選擇用于免疫介導破壞的預定靶標，還是出于在不存在不希望的免疫介導破壞(例如，在神經附近或在眼中)的情況下僅選擇用于中和的靶標，重組犬免疫球蛋白都可以根據它們在犬疾病治療中的預期用途來選擇。
[0014]本發(fā)明的第一個方面提供了用于犬治療的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:11或SEQ IDNO: 13的重鏈恒定結構域，其中當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時，所述重鏈的氨基酸序列使下游免疫系統效應子功能的激活最小化。
[0015]在某些實施方式中，所述犬的治療涉及疼痛或炎癥或與其相關病癥的治療，例如關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥。
[0016]本發(fā)明的另一個方面提供了包含具有氨基酸序列SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13的重鏈恒定結構域的抗體、融合蛋白或其結合片段在制備用于治療犬個體中疼痛或炎癥或與其相關的病癥例如關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥的藥物中的用途，個體當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時，所述重鏈的氨基酸序列使下游免疫系統效應子功能的激活最小化。[0017]本發(fā)明的再一個方面提供了用于治療、抑制或減輕需要其的犬個體中的疼痛或炎癥或與其相關的病癥例如關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥的方法，所述方法包括下列步驟:
[0018]提供特異性結合在治療或預防疼痛或炎癥中具有特定功能的靶抗原的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或其結合片段具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:8, SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 13的重鏈恒定結構域，且其中所述抗體、融合蛋白或其結合片段不激活下游免疫系統效應子功能；以及
[0019]將治療有效量的所述抗體、融合蛋白或其結合片段施用至犬個體。
[0020]本發(fā)明的再一個方面提供了具有包含氨基酸序列SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13的重鏈恒定結構域的犬衍生抗體、融合蛋白或其結合片段，用于制備治療、抑制或減輕犬個體的疼痛或炎癥的藥物。 [0021]在某些實施方式中，所述疼痛為神經病理性疼痛。特別是，所述疼痛可以為圍術期疼痛、術后(post-operative)疼痛或外科治療后(post-surgical)疼痛。術后(post-operative)疼痛會導致下列任何手術過程，在犬中可以包括但不限于，矯形外科手術、軟組織外科手術、卵巢子宮切除術或閹割手術等。在某些另外的實施方式中，所述疼痛為與癌癥或癌性疾病狀相關的慢性痛(腫瘤痛)。在某些另外的實施方式中，所述疼痛與風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、發(fā)炎或瘙癢相關或由其導致。
[0022]本發(fā)明的再一個方面提供了治療犬個體中關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥的方法，所述方法包括下列步驟:
[0023]提供特異性結合在治療或預防疼痛或炎癥中具有特定功能的靶抗原的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或其結合片段具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:8, SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 13的重鏈恒定結構域，且其中所述抗體、融合蛋白或其結合片段不激活下游免疫系統效應子功能；以及
[0024]將治療有效量的所述抗體、融合蛋白或其結合片段施用至有需要的犬個體。
[0025]在某些實施方式中，本發(fā)明的前述方法進一步包括:共同施用至少另一種可以增強和/或補助本發(fā)明抗體效力的藥劑的步驟。例如，所述抗體或其抗原結合片段可以與至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID (非留體抗炎藥)、阿片類藥物、皮質類固醇或類固醇共同施用。合適的鎮(zhèn)痛劑的實例包括但不限于，布托啡諾(bu t orphano I)、IO 丁丙諾啡(bupr enorph i ne )、芬太尼(fentanyl)、氟胺煙酸葡胺(flunixin meglumine)、莫哌唳(merpidine)、嗎啡(morphine)、納布啡(nalbuphine)和它們的衍生物。合適的NSAID包括但不限于,醋氨酹(acetaminophen)、乙酸水楊酸(acetyl sal icy lie acid)、卡洛芬(carprofen)、依托度酸(etodolac)、麗基布洛芬(ketoprofen)、美洛昔康(meloxicam)、非羅考昔(f irocoxib)、羅本納考昔(robenacoxib)和德拉考昔(deracoxib)等。
[0026]在某些實施方式中，前述方法可以伴隨至少一種其它藥劑的施用。所述藥劑可以是治療活性劑，其可以是選自以下的一種或多種:抗生素、抗真菌劑、抗原蟲劑、抗病毒劑或類似的治療劑。此外，所述至少一種其它藥劑可以是炎癥介質抑制劑，例如PGE受體拮抗劑；免疫抑制劑，例如環(huán)孢素；抗炎性糖皮質激素。在某些另外的方面，所述至少一種其它藥劑可以是用于治療認知紊亂或損傷，例如老齡犬中日益普遍的失憶或相關病癥的藥劑。此外，所述至少一種其它藥劑可以是用于治療心血管功能紊亂，例如治療高血壓、心肌缺氧和充血性心臟衰竭等的抗高血壓藥物或其它化合物。另外，所述至少一種其它藥劑可以是利尿劑、血管擴張劑、β -腎上腺素受體拮抗劑、血管緊張素-1I轉化酶抑制劑、鈣通道阻滯劑和HMG-CoA還原酶抑制劑。
[0027]在本發(fā)明前述方面的某些實施方式中，所述下游免疫系統效應子功能選自:補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、和抗體依賴細胞病理(ADCP)0在具體的實施方式中，所述重鏈恒定結構域的氨基酸序列抑制重鏈結合Clq，這防止引起補體級聯和補體依賴性細胞毒性(CDC)。
[0028]在某些實施方式中，所述靶抗原是可溶性介質。在某些實施方式中，所述靶抗原是神經生長因子(NGF)。在某些實施方式中，所述抗體特異性結合并抵消介導疼痛或炎癥的受體。在某些其它實施方式中，所述靶抗原可以選自細胞因子或趨化因子(例如，白細胞介素-1和相關的白細胞介素IL-2至IL-35、粒細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、紅細胞生成素、促血小板生成素(thrombopoetin)、白血病抑制因子、睫狀神經營養(yǎng)因子、抑癌蛋白M)、生長因子(例如，神經生長因子(NGF)、腦衍生神經營養(yǎng)因子(BDNF)、神經營養(yǎng)因子-3、神經營養(yǎng)因子-4、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF))、細胞表面受體(例如，HER-2、VEGFR、EGFR、⑶20 )、細胞表面結合生長因子(例如，未加工的腫瘤壞死因子)、病毒(例如，RSV)和補體級聯的組分(例如，C5、C5a)，但不限于此。
[0029]本發(fā)明的另外方面，提供了用于治療犬的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10或SEQ IDNO: 14的重鏈恒定結構域，其中當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原上時，所述重鏈的氨基酸序列介導下游免疫系統效應子功能的激活。
[0030]在某些實施方式中，所述犬的治療涉及癌性或惡性病癥的治療。
[0031]本發(fā)明的其他方面提供了包含具有氨基酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQID NO: 14的重鏈恒定結構域的抗體、融合蛋白或其結合片段在制備用于治療犬個體中癌性或惡性病癥的藥物中的用途，其中當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時，所述重鏈的氨基酸序列介導下游免疫系統效應子功能的激活。
[0032]本發(fā)明的其他方面提供了用于治療或預防犬個體中癌性或惡性病癥的方法，所述方法包括下列步驟:
[0033]提供特異性結合在治療或預防癌性或惡性病癥中具有特定功能的靶抗原的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或其結合片段具有包含氨基酸序列SEQID N0:9、SEQ ID N0:10或SEQ ID NO: 14的重鏈恒定結構域，且其中所述抗體、融合蛋白或其結合片段不激活下游免疫系統效應子功能；以及
[0034]將治療有效量的所述抗體、融合蛋白或其結合片段施用至有需要的犬個體。
[0035]在某些實施方式中，本發(fā)明的前述方法進一步包括:共同施用至少另一種可以增強和/或補助本發(fā)明抗體效力的藥劑的步驟。
[0036]本發(fā)明的其他方面提供了犬衍生抗體、融合蛋白或其結合片段在制備用于治療犬個體的癌性或惡性病癥的的藥物中的用途，所述抗體、融合蛋白或其結合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 14的重鏈恒定結構域。
[0037] 在本發(fā)明前述方面的某些實施方式中，所述下游免疫系統效應子功能選自:補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)和抗體依賴性細胞病理(ADCP)0在具體的實施方式中，所述重鏈恒定結構域的氨基酸序列提供了重鏈與Clq的結合，這防止引發(fā)補體級聯和補體依賴性細胞毒性(⑶C)。在某些實施方式中，所述重鏈恒定結構域提供了與Fe受體的結合，其反過來可以介導ADCP和/或ADCC免疫反應。
[0038]在某些實施方式中，所述靶抗原是癌特異性抗原。在本發(fā)明的某些另外的實施方式中，所述靶抗原可以選自在犬腫瘤細胞上表達的膜結合蛋白。在本發(fā)明的另外的實施方式中，所述膜結合犬腫瘤蛋白可以選自包括CD2、CD4、CD8、CD20、EGFR、VEGFR和HER2等的蛋白質的組。在某些另外的實施方式中，所述靶抗原可以選自但不限于:細胞因子和趨化因子(例如白細胞介素-1 (IL-1)、IL-2、IL-3和從數字上直至IL-35的白細胞介素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、紅細胞生成素、促血小板生成素(thrombopoetin)、白血病抑制因子、睫狀神經營養(yǎng)因子、抑癌蛋白M)、生長因子(例如,神經生長因子(NGF)、腦衍生神經營養(yǎng)因子(BDNF)、神經營養(yǎng)因子-3、神經營養(yǎng)因子-4、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF))、細胞表面受體(例如，HER-2、VEGFR、EGFR、⑶20)、細胞表面結合生長因子(例如，未加工的腫瘤壞死因子)、病毒(例如，RSV)和補體級聯的組分(例如，C5、C5a)。
[0039]本發(fā)明的另外的方面提供了用于治療犬的病癥的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合 蛋白或結合片段具有當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時不結合Clq的重鏈恒定結構域，且其中所述抗體、融合蛋白或結合片段可以用蛋白質A層析純化。
[0040]在某些實施方式中，所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ IDNO: 13的重鏈恒定結構域。在某些實施方式中，所述抗體、融合蛋白或結合片段具有選自SEQID NO:6, SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 15 的重鏈恒定結構域。
[0041]本發(fā)明的另外的方面提供了包含重鏈恒定結構域的抗體、融合蛋白或結合片段在制備用于治療與犬的疼痛和/或炎癥相關病癥的藥物中的用途，當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時，所述重鏈恒定結構域不結合Clq，且其中所述抗體、融合蛋白或結合片段可以用蛋白質A層析純化。
[0042]在某些實施方式中，所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ IDNO: 13的重鏈恒定結構域。在某些實施方式中，所述抗體、融合蛋白或結合片段具有選自由SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 15組成的組的重鏈恒定結構域。
[0043]本發(fā)明的另外的方面提供了用于治療、抑制或減輕需要其的犬個體的疼痛或炎癥或與此相關的病癥例如關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥的方法，所述方法包括下列步驟:
[0044]提供包含重鏈恒定結構域的抗體、融合蛋白或結合片段，當所述抗體結合其靶抗原時，所述重鏈恒定結構域不結合Clq，且其中所述抗體可以用蛋白質A層析純化；以及
[0045]將治療有效量的所述抗體、融合蛋白或其結合片段施用至所述犬個體。
[0046]在某些實施方式中，所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ IDNO: 13的重鏈恒定結構域。在某些實施方式中，所述抗體、融合蛋白或結合片段具有選自SEQID NO:6, SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 15 的重鏈恒定結構域。
[0047]在各種其他方面中，本發(fā)明延伸至:(i )編碼本發(fā)明任何前述抗體、融合蛋白或結合片段的核酸，(ii)攜帶所述核酸的載體，(iii)攜帶所述載體的宿主細胞。本發(fā)明進一步延伸至用于產生本發(fā)明前述中限定的抗體和融合蛋白的方法。在另外的方面中，本發(fā)明延伸至包含本發(fā)明的抗體或融合蛋白以及至少一種載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。[0048]本發(fā)明的另一方面提供了重組抗體、融合蛋白或其結合片段，其可在治療上施用于犬以特異性結合靶抗原并且且進一步介導免疫反應，所述免疫反應的特征在于Clq補體結合所述抗體、融合蛋白或其結合片段和相關的補體依賴性細胞毒性，其中所述抗體、融合蛋白或其結合片段的重鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型B (HCB，calgG-B)、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 10的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型C (HCC，calgG-C)或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14的無糖基犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型C (HCC，calgG-C)。
[0049]本發(fā)明的另一方面提供了包含具有氨基酸序列SEQ ID N0:9的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型B (HCB，calgG-B)、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 10的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型C (HCC，calgG-C)或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14的無糖基犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型C (HCC，caIgG-C)的抗體、融合蛋白或其結合片段，在制備用于治療需要特異性結合靶抗原且期望發(fā)生免疫反應的病癥的藥物中的用途，所述免疫反應的特征在于Clq補體結合所述抗體、融合蛋白或其結合片段和相關的補體依賴性細胞毒性。
[0050]本發(fā)明的另一方面提供了治療犬個體中的癌性狀況的方法，所述方法包括以下步驟:
[0051]提供對腫瘤特異性抗原具有結合特異性且進一步包含具有氨基酸序列SEQ IDN0:9的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型B (HCB, calgG-B)、具有氨基酸序列SEQ IDNO: 10的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型C (HCC，caIgG-C)或具有氨基酸序列SEQ IDNO: 14的無糖基犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型C (HCC，calgG-C)的免疫球蛋白、融合蛋白或其結合片段；以及
[0052]-將治療有效量所述免疫球蛋白、融合蛋白或結合片段施用至需要其的犬個體。
[0053]在各種另外的方面中，本發(fā)明延伸至結合期望的靶抗原且包含不結合Clq的重鏈恒定結構域且因此不介導包括補體依賴性細胞毒性的免疫反應的抗體或融合蛋白。
[0054]因此，在本發(fā)明的另一方面提供了可以在治療上施用于犬以特異性結合靶抗原的重組抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體或融合蛋白的恒定結構域不結合Clq補體，且其中所述恒定結構域的重鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID N0:8的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型A (HCA，caIgG-A)、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型D (HCD，calgG-D)或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的無糖基犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型B (HCB*, calgG-B)。
[0055]本發(fā)明的另一方面提供了包含具有氨基酸序列SEQ ID N0:8的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型A (HCA，caIgG-A)、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型D (HCD，calgG-D)或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的無糖基犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型B (HCB*, calgG-B)的抗體、融合蛋白或其結合片段,在制備用于治療需要特異性結合靶抗原且不希望發(fā)生免疫反應的病癥的藥物中的用途，所述免疫反應的特征在于Clq補體結合所述抗體、融合蛋白或其結合片段和相關的補體依賴性細胞毒性。 [0056]本發(fā)明的另一方面提供了用于治療犬個體中病癥的方法，所述方法包括下列步驟:
[0057]提供對腫瘤特異性抗原具有結合特異性且進一步包含具有氨基酸序列SEQ IDN0:8的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型A (HCA，calgG-A)、具有氨基酸序列SEQ IDNO: 11的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型D (HCD，caIgG-D)或具有氨基酸序列SEQ IDNO: 13的無糖基犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型B (HCB*，calgG-B)的免疫球蛋白、融合蛋白或其結合片段；以及
[0058]將治療有效量所述免疫球蛋白、融合蛋白或結合片段施用至需要其的犬個體。
[0059]在某些實施方式中，設計用于在沒有CDC活性時進行抗體構建的非糖基化恒定結構域是丙氨酸取代的具有氨基酸序列SEQ ID N0:6的非糖基化重鏈HCB(表示為HCB*)。在本發(fā)明的各種其他方面中，包含HCA、HCB或HCD的重鏈HCA、HCD或CDC不活躍非糖基化形式(HCA*、HCB* 或 HCD*:SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15)的抗體涉及犬生長因子、荷爾蒙、細胞因子、趨化因子或其它可溶性介質，例如補體級聯的組分。在某些實施方式中，包含重鏈HCA、HCD或HCB*的抗體涉及用于抵消犬中的犬NGF生物活性而不引起⑶C的的犬神經生長因子(NGF)。 [0060]在本發(fā)明前述方面的某些實施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在某些另外的實施方式中，所述抗體是嵌合抗體。在一些實施方式中，所述抗體是犬源化抗體，即，該抗體具有已去免疫的氨基酸序列，使得當施用于犬個體時，不會產生針對其的中和抗體。通常，所述抗體的重鏈恒定結構域通過氨基酸取代或缺失的方式選擇或修飾，使得所述恒定結構域不介導下游效應子功能。在某些實施方式中，所述抗體可以綴合于至少一個受體分子。
[0061 ] 在某些另外的實施方式中，可以取代或缺失本發(fā)明前述方面的抗體或融合蛋白的恒定結構域中的至少一個殘基，以防止該殘基的糖基化。在本發(fā)明的另一方面中，所述犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域可以全部或部分融合細胞因子或趨化因子受體或其它跨膜蛋白質(例如TNF受體)的胞外域，使得在期望所述犬胞外域-免疫球蛋白重鏈融合蛋白不激活CDC的情況下(例如，其中TNF受體Fe融合蛋白被設計用于中和可溶性TNF的情況)，所述犬免疫球蛋白恒定結構域的全部或片段選自組HCA、HCD或HCB* ;或反之，在期望所述犬胞外域-免疫球蛋白重鏈融合蛋白激活的情況下，(例如，TNF受體Fe融合蛋白被設計以殺死具有炎性細胞的膜相關TNF的情況)所述犬免疫球蛋白恒定結構域選自組HCB、HCC或HCC*。
[0062]在本發(fā)明的另外的方面中，所述犬受體-Fe融合蛋白可以選自在融合到犬免疫球蛋白結構域重鏈Fe區(qū)的犬細胞上發(fā)現的膜結合受體的胞外結構域。在本發(fā)明的另外的方面中，包含重鏈HCB、HCC或HCC*的抗體涉及⑶20，以通過這些抗體與犬⑶20表達細胞例如犬淋巴瘤細胞表面上的CD20結合引起所述細胞的CDC的。
[0063]此外，優(yōu)選的是，所述犬源化的抗體不與犬中存在的任何其它表位交叉反應，而且當施用于犬時，并不產生針對本發(fā)明的抗體的中和抗體。
[0064]在某些另外的實施方式中，可對本發(fā)明的抗體或融合蛋白進行所述重鏈恒定結構域的氨基酸序列的修飾。所述修飾可以包括添加、取代或缺失一個或多個氨基酸殘基。通常進行上述氨基酸變化修飾是為了修飾所述抗體的功能特性。例如，可以進行氨基酸修飾，例如通過阻止所述抗體結合Fe受體的能力、激活補體或誘導ADCC，以阻止抗體恒定結構域介導的下游效應子功能。此外，可以對所述重鏈恒定結構域的鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基進行修飾，以在施用于犬時調節(jié)抗體的循環(huán)半衰期。
[0065]在一些實施方式中，本發(fā)明提供了包含以不同的結合特異性綴合或結合其他抗體的本發(fā)明的抗體或結合片段的多重特異性或多價抗體，以用于聯合治療。多重特異性抗體包含針對第一表位的至少一個抗體或結合片段，以及針對存在于該抗原上的另一個表位或另一抗原的至少一個結合位點。多價抗體包含對相同表位具有結合特異性的抗體或抗體結合片段。因此，在某些實施方式中，本發(fā)明延伸至包含四個或更多個本發(fā)明抗體的Fv區(qū)或Fab區(qū)的抗體融合蛋白。在某些另外的實施方式中，本發(fā)明延伸至雙特異性抗體，其中本發(fā)明的抗體或其結合片段連接到對第二靶標具有結合特異性的第二抗體或其結合片段，所述靶標不是第一抗原。這種多價抗體、雙特異性抗體或多重特異性抗體可以通過為本領域技術人員熟知的多種重組方法制得。
[0066]在某 些實施方式中，將所述抗體、融合蛋白或抗原結合片段以約0.01mg/kg體重至10mg/kg體重、特別是約0.03mg/kg體重至3mg/kg體重的劑量范圍施用于犬,作為前述方法的一部分。
[0067]在各種其他的方面中，本發(fā)明延伸至包含本發(fā)明任何前述方面的抗體、融合蛋白或其結合片段的組合物。在某些實施方式中，所述組合物進一步包含至少一種藥學上可接受的載體。在某些實施方式中，所述組合物可以進一步包含至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片類藥物、皮質類固醇或類固醇。
[0068]在各種其他的方面中，本發(fā)明延伸至編碼本發(fā)明抗體、融合蛋白或抗體結合片段的分離的核酸。因此，本發(fā)明的另一方面提供了編碼本發(fā)明任何前述方面的抗體、融合蛋白或抗原結合片段的分離的核酸。在某些實施方式中，所述分離的核酸還編碼與其可操作地連接的一個或多個調控序列。
[0069]本發(fā)明的另一方面提供了包含編碼本發(fā)明的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域或重鏈恒定結構域和/或輕鏈恒定結構域的多核苷酸的表達載體。在某些實施方式中，所述表達載體進一步包含一個或多個調控序列。在某些實施方式中，所述載體是質?；蚰孓D錄病毒載體。本發(fā)明的另一方面提供了合并本發(fā)明前述方面的表達載體的宿主細胞。本發(fā)明的另一方面提供了產生本發(fā)明任何前述方面的抗體的宿主細胞。
[0070]本發(fā)明的又一方面提供了用于產生本發(fā)明的抗體或融合蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明前述方面的宿主細胞以允許該細胞表達抗體的步驟。本發(fā)明的又一方面提供了產生本發(fā)明的抗體或融合蛋白的方法，所述方法包括下列步驟:在合適的宿主細胞中表達本發(fā)明前述方面的一個或多個多核苷酸/核酸或載體，其表達本發(fā)明的抗體的輕鏈和/或重鏈；回收(recovering)表達的多肽,其可在一個宿主細胞中共同表達,或在不同的宿主細胞中分別表達；以及分離抗體。本發(fā)明的又一方面提供了用于治療、減輕或抑制犬疼痛的方法，所述方法包括將有效量的編碼具有含氨基酸序列SEQ ID N0:8-SEQ ID NO: 11的重鏈恒定結構域的抗體或融合蛋白的多核苷酸施用至犬的步驟。
[0071]犬抗體純化
[0072]在沒有不需要的免疫效應子活性而期望靶標中和的犬抗體中，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現，缺乏⑶C活性的犬重鏈的原生同種型也非常弱地結合葡萄球菌蛋白A，如果確是如此，則這種純化抗體的常用方法不能用于其制備。本發(fā)明人提出三種方法來克服這一限制，通過使用替代的純化策略并通過重鏈的突變來阻止生產過程中的糖基化。通過這些方法制備的純化抗體由本發(fā)明人制得，并顯示出在狗體內具有期望的安全性和有效性，而沒有不想要的免疫原性。
[0073]本發(fā)明的再一方面提供了用于從源混合物純化犬衍生免疫球蛋白或免疫球蛋白或融合蛋白的方法，其包含具有氨基酸序列SEQ ID N0:8的同種型A (HCA，calgG-A)的犬重鏈恒定結構域或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的同種型D (HCD，calgG-D)的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域，所述方法包括下列步驟:
[0074](i)提供包含靶免疫球蛋白或融合蛋白的源混合物；
[0075](ii)對所述源混合物進行陰離子交換層析；
[0076](iii)對所述源混合物進行疏水作用層析；以及
[0077](iv)對所述源混合物進行尺寸排阻層析。
[0078]在某些實施方式中，所述方法包括將緩沖液更換為磷酸鹽緩沖液中的步驟。典型地，所述方法產生出分級為高純度和高生物活性的純化抗體。
[0079]本發(fā)明的另一方面提供了產生非糖基化犬抗體的方法，所述非糖基化抗體可以通過蛋白質A層析純化。
[0080]在本發(fā)明的各種其他的方面中，提供了根據本文限定的任何方法產生的犬抗體或犬衍生抗體或融合蛋白，用于犬的治療。在各種其他的方面中，提供了抗犬NGF抗體在制備用于治療犬中免疫介導病癥或與疼痛相關的病癥的藥物中的用途。
[0081]本發(fā)明的另一方面提供了用于從源混合物純化犬衍生免疫球蛋白或免疫球蛋白或融合蛋白的方法，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的同種型A (HCA，calgG-A)的犬重鏈恒定結構域或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的同種型D (HCD，calgG-D)的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域，所 述方法包括下列步驟:
[0082](i)提供包含靶免疫球蛋白的源混合物；
[0083](ii)對所述源混合物進行captoadhere親和層析；以及
[0084](iii)對所述源混合物進行陰離子交換層析。
[0085]本發(fā)明的另一方面延伸至由本發(fā)明前述方面的純化方法產生的抗體或融合蛋白，用于犬的治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0086]圖1A通過ELISA顯示了使用犬重鏈的四種不同的同種型(HCA、HCB、HCC、HCD)構建的抗NGF抗體(表示為轉染CHO細胞的上清液)對鼠NGF的等效結合；以及圖1B顯示了TF-1細胞的NGF增殖的等效抑制。
[0087]圖2顯示了以抗Clq ELISA測量的補體對NGF-結合抗犬NGF抗體同種型的差別
[0088]圖3a和3b顯示了以抗Clq ELISA測量的NGF捕獲的糖基化的和非糖基化的犬源化抗NGF單克隆抗體對補體的結合。
[0089]圖4顯示了通過抗Clq ELISA測量的NGF捕獲的犬源化抗NGF單克隆抗體(MAb)、抗犬VEGF MAb和抗人⑶20/犬HCB嵌合MAb對補體的結合。特別是，圖4A、4B和4C顯示了補體對使用各種犬重鏈同種型構建的抗體的結合。犬源化單克隆抗體(MAb)在CHO細胞中表達，并測試其結合補體Clq的能力。板A-犬源化抗NGF抗體(caN-HCB、caN-HCC)與人源化抗體同種型(huN-Gl、huN-G4)相比較；板B-用犬HCA (caV_HCA)和HCB (caV-HCB)同種型構建的抗VEGF抗體；板C-使用HCB同種型(mub-HCA)構建的抗⑶20抗體與小鼠IgG2a同種型(muB-2a)相比較。[0090]圖5顯示了通過蛋白質A純化并使用抗犬多克隆免疫球蛋白通過蛋白質印跡檢測的抗NGF抗體同種型的相對回收。使來自圖1的上清液經過蛋白質A柱并特異性結合洗脫材料。使等體積的洗脫液經歷SDS-PAGE。犬同種型HCA、HCC和HCD弱結合蛋白質A，如洗漆和流通分級(wash and flow through fractions)中所示。圖A_D顯示了通過蛋白質A相對回收犬抗體同種型HCA、HCB、HCC和HCD:L，加載(load) ;W，洗滌(wash) ;P，純化(purified) ;F,流通(flow through)。來自圖1中抗NGF抗體上清液用于此實驗。
[0091 ] 圖6A和6B顯示了使用三步法(方法I)定量純化抗犬NGF抗體(HCA同種型)，該三步法(方法I)包括(I)陰離子交換層析、(2)疏水作用層析和(3)尺寸排阻層析。圖6A顯示了通過尺寸排阻HPLC的分級結果。圖6B顯示了每一步驟后級分的還原性SDS-PAGE凝膠。圖6C和6D顯示了使用兩步法(方法II)定量純化本發(fā)明的抗犬NGF抗體，該兩步法(方法II)包括Captoadhere層析和陰離子交換層析。圖6C顯示了在非還原和還原條件下的SDS-PAGE分析。在圖6C中，泳道I是麗S，泳道2是2 μ g/mL抗犬NGF抗體和O μ I還原劑，泳道3是4 μ g/mL抗犬NGF抗體和O μ I還原劑，泳道4是抗6 μ g/mL犬NGF抗體和O μ I還原劑，泳道5是麗S，泳道6是2 μ g/mL抗犬NGF抗體和3 μ I還原劑，泳道7是4 μ g/mL抗犬NGF抗體和3 μ I還原劑， 泳道8是6 μ g/mL抗犬NGF抗體和3 μ I還原劑，以及泳道9是麗S。圖6D:純化的抗犬NGF抗體的尺寸排阻層析。
[0092]圖7顯示了通過方法I和II純化的抗犬NGF抗體(HCA同種型)的對比。圖7Α:通過非還原和還原SDS-PAGE的對比。圖7Β:通過抗NGF ELISA的對比。
[0093]圖8顯示了對狗靜脈給藥抗犬NGF抗體(HCA同種型，通過方法I純化)后體重(上表)和溫度(下表)保持穩(wěn)定。
[0094]圖9顯示了對狗靜脈注射后血漿抗犬NGF單克隆抗體濃度的動力學分析。以2mg/kg將抗NGF抗體靜脈注射入比格犬，在指示的時間采集血漿樣品且用NGF ELISA檢測抗NGF單克隆抗體。該抗犬NGF單克隆抗體具有約9天的出奇長的消除(β )相半衰期。
[0095]圖10顯示了抗犬NGF單克隆抗體(HCA同種型，通過方法I純化)減輕了狗的炎性疼痛。在-1天時將高嶺土注射入比格犬的墊腳中，在O天進行抗體或媒介對照，并通過目測評分量表判斷跛足程度。
[0096]發(fā)明詳述
[0097]經過大量實驗，本發(fā)明人使用不同的重量恒定結構域同種型設計并構建了幾種犬單克隆抗體，且令人驚奇地顯示出，有益的性質從它們介導下游效應子功能的能力(或其它方面)、特別是從它們結合補體的能力可以推斷出有益的特性。因此，本發(fā)明人已鑒定出不同的犬免疫球蛋白同種型介導的不同的生物效應。對于補體結合犬抗體同種型，這種有益的特性在用于體內補體調控細胞毒性(CDC)的相同抗體結合的調控(directing)細胞中。需要這種功能特性的一個實例是在犬癌癥治療中，其中針對腫瘤抗原的抗體隨后會引導補體系統靶向已被該抗體結合的細胞，用于破壞。
[0098]相比之下，在不需要補體活性的情況下，例如在神經附近、在眼中或在已發(fā)炎的組織中，或僅僅出于降低抗體無法預料的副作用風險的考慮，優(yōu)選不結合補體從而不導致CDC的抗體同種型。
[0099]因此，預測哪種犬同種型適合于設計并適合使用犬抗體治療能力，無疑是非常需要和有用的。[0100]已經描述了四種不同的犬免疫球蛋白G同種型(caIgG_A(犬免疫球蛋白G同種型 A)、calgG-B、calgG-C 和 calgG-D-Tang et al.，2001)。為簡單起見(以允許不同抗體構建上的區(qū)別并來自輕鏈組分)，該重鏈恒定結構域被稱為HCA(calgG-A)、HCB(calgG-B)、HCC(calgG-C)和 HCD(calgG-D)。
[0101]杭體的鈍化
[0102]本發(fā)明人在純化期望的抗NGF抗體的HCA和HCD同種型的過程中意外地發(fā)現，以蛋白質A親和柱層析的形式用于工業(yè)生產規(guī)模以生產大規(guī)模純化治療用蛋白質的配體也不結合蛋白質A。圖5顯示了通過蛋白質A親和層析小規(guī)模地相對回收抗NGF抗體的HCA、HCB、HCC和HCD同種型。因此，需要其它方法來純化HCA或HCD同種型，因為這些不能通過蛋白質A親和層析進行純化。經過大量實驗，
【發(fā)明者】令人驚奇地發(fā)現了可以用于純化caN-HCA-kLC抗體構建或具有HCA或HCD重鏈同種型的其它犬抗體的兩種替代方法(這里稱為方法I和方法II)。
[0103]第一種方法包括陰離子交換層析、疏水作用層析和排阻層析的組合。第二種方法包括captoadhere親和層析和陰離子交換層析的組合。圖6說明了通過兩種方法的每一種純化含有抗NGF抗體的HCA。通過每種方法都獲得了高純度的材料，且通過NGF ELISA顯示兩種方法產生了具有相似生物活性的材料(圖7)。由于HCA和HCD同種型相互之間比與HCB和HCC同種型更為類似，上述方法可用于該兩種同種型。
[0104]在對抗體純化的進一步探索中，本發(fā)明人意外地發(fā)現非糖基化HCB*同種型抗NGF抗體，如HCB同種型，仍然能夠結合蛋白質A，因此具有缺乏CDC活性并且通過蛋白質A層析純化的期望特性。
[0105] 犬安全性試驗
[0106]為了說明被設計成沒有不想要的CDC活性的本發(fā)明的抗體對狗是安全的，將高度純化的抗NGF的HCA同種型抗體通過靜脈注射注入三只狗中(following prior approvalby the Institutional Animal Ethics Committee-CRL, Ireland,經過公共動物倫理委員會-CRL事先批準后)。圖8顯示了除了由獸醫(yī)觀察到的沒有行為變化之外，這三只狗在注射HCA同種型抗體(單只2mg/kg的劑量)之后沒有顯示出體重變化或發(fā)熱。
[0107]這三只狗的HCA同種型抗體的血漿動力學與包括約9天的長beta半衰期的兩相分布和消除相符合(圖9)。在14天的追蹤期間內快速清除的缺少與它們對于犬抗體的無抗抗體反應相符合。相比之下，人類免疫球蛋白重鏈恒定結構域在狗中產生免疫性，且在注入后 8 或 9 天從血漿中快速清除(Richterl999，Drug Met.Disp.27，21-25)。
[0108]炎癥犬樽型
[0109]在社會倫理委員會(Institutional Ethics Committee,CRL,愛爾蘭)的預先批準下進行所有的實驗。將高嶺土(kaolin)注入(-1天時)比格犬的一條后腿的墊腳中，從而在約24小時后開始自身化解炎癥，這導致狗暫時性跛足。在該模型中，一旦對高嶺土的初始炎性反應減弱，在約1-2周內該狗的跛足程度將穩(wěn)定地減小，然后全部恢復。
[0110]通過靜脈注射將抗犬NGF單克隆抗體以每千克體重200 μ g或作為媒介對照的磷酸鹽緩沖液注入(O天時)到3只狗的組中。7天后，通過目測評分方法評價狗的跛足程度:O分，沒有跛足(全負重)；1分，輕微跛足(非全負重但行走正常)；2分，中等跛足(輕微負重且行走不正常)；3分，嚴重跛足(無負重)。觀察者不了解哪只狗接受了注射。[0111]圖10示出了該結果。與媒介對照組相比，注射3天后，接受抗NGF單克隆個抗體的狗的跛足評分減小，這表明與僅用媒介相比，抗NGF單克隆抗體具有降低狗的疼痛的效果。延遲的活性與抗犬NGF單克隆抗體的血漿藥物動力學一致，這表明約30小時的慢的組織分布相和墊腳區(qū)相對差的血管形成。圖10示出的結果表明，本發(fā)明的抗犬NGF抗體在降低跛足的同時降低了狗的炎性疼痛。
[0112]本發(fā)明人描述的所有結果共同表明，使用CDC不活躍HCA同種型構建的純化的犬抗體對于犬是安全和有效的，且具有令人滿意的長半衰期。
[0113]通過引用將本發(fā)明提及的所有文獻并入本文中。在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，對本發(fā)明的實施方案進行各種修飾和變化對本領域技術人員是顯而易見的。雖然就具體優(yōu)選的實施方案進行了描述本發(fā)明，但是應該理解，請求保護的本發(fā)明不應該不適當地限制為這些具體的實施方案。事實上，本發(fā)明意圖涵蓋對本領域技術人員顯而易見的實施本發(fā)明的方式的各種修改。
[0114]定義
[0115]除非另有限定，本文使用的所有技術術語和科學術語具有本領域技術人員通常理解的含義。術語的含義和范圍應當清楚，然而，在發(fā)生歧義的情況下，本文給出的定義優(yōu)先于任何字典或外在的定義。
[0116]在全文中，除非上下文另有要求，術語“包含(comprise)”或“包括(include)”或其他變體例如“包含(comprises) ”或“包含(comprising) ”、“包括(includes) ” “包括(including) ”應理解為表示包含所述整數或整數組,但并不排除任何其他的整數或整數組。
[0117]如本文所使用的 ，除非文中明確要求，諸如“a (—個/種)”、“an (—個/種)”以及“the (該/所述)”的術語包括單數個或復數個參照物。因此，例如，提到“一種活性劑(an active agent) ”或“一種藥學活性劑”包括一種單一的活性劑和兩種或以上不同的活性劑組合，而提到“載體”，其包括兩種或以上載體以及單一載體的混合物等。而且，除非文中另有要求，單數的術語包括復數并且復數的術語也包括單數。
[0118]如本文所限定的，術語“疼痛”指與實際的或潛在的組織損傷相關的或按照這樣的損傷描述的不愉快的感覺和情感體驗。
[0119]關于手術或手術后疼痛，US動物福利法(Animal Welfare Act2002.AffAregulations, CFR, Title9(Animals and Animal Products), Chapterl(Animal and PlantHealth Inspection Service, Department of Agriculture).Subchapter A(AnimalWelfare), Partsl-4)將疼痛的過程規(guī)定為合理地預期將引起應用該過程的人類超過輕微或短暫疼痛或悲痛的任何過程，也就是說，超過通過注射或其他小的手術引起的疼痛。因此，如果犬經歷疼痛的外科手術，則該動物應該施用術后鎮(zhèn)痛劑。
[0120]在另外的情況下，由于有關的醫(yī)療狀況例如風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、炎性或癌性或惡性病癥，犬可能經歷嚴重的疼痛或慢性痛。
[0121]術語“傷害性感受”指傷害刺激的感覺。本文限定的“神經病理性疼痛”(也被稱為神經痛)指來自有神經信號問題的疼痛。其可能由于影響軀體感覺系統的損害或疾病而發(fā)生。存在數種神經疼痛的原因并且其可能與自發(fā)發(fā)生的、被稱為感覺遲鈍的感覺異常有關?？蛇x地，其可能與觸摸痛有關，當正常不發(fā)生疼痛的接觸或刺激使得疼痛發(fā)生或轉壞時，將引起觸摸痛。例如，如果有三叉神經痛，則輕微地觸碰臉將引發(fā)疼痛，或者如果有糖尿病性神經病，則床上用品的壓迫可能引發(fā)疼痛。神經病理性疼痛也可以由觸摸痛導致，其中當正常不發(fā)生疼痛的接觸或刺激使得疼痛發(fā)生或轉壞時，將引起疼痛。例如，如果個體患有三叉神經痛，則輕微地觸碰臉將引發(fā)疼痛。與痛覺有關的神經病理性疼痛指正常只引起輕微的不適的刺激或接觸所產生的嚴重的疼痛，而感覺異常指，即使當沒有任何東西與引起疼痛的區(qū)域接觸時發(fā)生的不舒服的或痛苦的感覺，例如四肢發(fā)麻。神經病理性疼痛的其他形式包括瘙癢或發(fā)癢，其可以與皮膚中的過敏反應或炎癥反應以及由組織損傷和募集過程產生的炎性痛有關。
[0122]如本文所限定的，術語“NGF中和抗體”或類似的術語描述了能夠中和NGF的生物激活和信號傳導的抗體。中和抗體也可以稱為拮抗性抗體或阻斷抗體，其特異性優(yōu)選選擇性地結合NGF并抑制NGF的一種或多種生物活性。例如，中和抗體可以抑制NGF與其靶配體的結合，例如細胞膜結合TrkA或p75受體。
[0123]如本文所使用的，術語“生物活性”指分子的任何一種或多種內在的生物學特性(不管是體內發(fā)現天然存在的還是通過重組方法給予或激活的)。生物學特性包括但不限于受體結合和/或激活、誘導細胞信號傳導或細胞增殖、抑制細胞生長、誘導細胞因子或趨化因子產生、誘導細胞凋亡和酶活性。
[0124]如本文使用的，術語“互補性決定區(qū)(CDR) ”指一起限定天然免疫球蛋白結合位點的天然Fv區(qū)的結合親和性和特異性的氨基酸序列，如同Kabat et al.(Kabat, E.A., ffu, Τ.T., Perry, H., Gottesman, K.and Foeller, C.(1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition.NIH Publication N0.91-3242,免疫學研究的蛋白質的序列)中所述的。如本文所使用的，術語“框架區(qū)(FR)”指插入在CDR之間的氨基酸序列。抗體的這些部分用來將⑶R保持在合適的方向(允許⑶R結合抗原)。[0125]如本文所使用的，術語“恒定區(qū)(CR)”指抗體分子賦予效應子功能的部分。在本發(fā)明中，恒定區(qū)通常指犬的恒定區(qū)，也就是說，主題犬源化抗體的恒定區(qū)來源于犬免疫球蛋白。
[0126]本文所用的術語“嵌合抗體”指含有衍生自兩種不同抗體的序列的抗體，所述不同抗體通常為不同物種的。最典型的是，嵌合抗體包含衍生自供體物種且特異性結合靶表位的可變結構域和從施用該抗體的靶物種獲得的抗體衍生的恒定結構域。
[0127]本文所用的術語“免疫原性”指當施用至接受者時引起免疫反應(體液的或細胞的)的尋靶蛋白或治療部分的能力的估量。本發(fā)明涉及主題犬源化抗體的免疫原性。優(yōu)選本發(fā)明的抗體不具有免疫原性，也就是說，當施用至犬時，將不會產生針對它們的中和抗體，并且進一步，沒有通過抗體的Fe區(qū)介導的效應子功能。
[0128]本文所用的術語“同一性”或“序列同一性”指在比對的序列中任何特定的氨基酸殘基位置處，氨基酸殘基在比對的序列間是相同的。本文所用的術語“相似性”或“序列相似性”表示，在比對的序列的任何特定的位置，氨基酸殘基在這些序列之間具有相似的類型。例如，亮氨酸可以被異亮氨酸或纈氨酸取代。這可以被稱為保守取代。優(yōu)選地，當本發(fā)明的氨基酸序列通過其中包含的任一氨基酸的保守取代來修飾時，與未修飾的抗體相比，這些變化對所產生的抗體的結合特異性或功能活性沒有影響。
[0129]本發(fā)明的(天然)多肽及其功能衍生物的序列同一性涉及，在比對序列并且在必要時引入缺口以實現最大百分比同源性且不將任何保守取代視為序列同一性的一部分之后，候選序列中與對應的天然多肽的殘基相同的氨基酸殘基的百分比。不管是N端或C端的延長，還是插入，都不應該解釋為降低序列同一性或同源性。用于實施兩個或以上氨基酸序列的比對和用于確定它們的序列同一性或同源性的方法和計算機程序，是本領域技術人員熟知的。例如，使用算法例如 BLAST (Altschul et al.1990) >FASTA(Pearson&Lipmanl988)或Smith-Waterman algorithm (史密斯-沃特曼算法，Smith&ffatermanl981)可以容易地計算2個氨基酸序列的同一性或相似性的百分比。
[0130]如本文所用的，提到與第二氨基酸殘基具有最高同源性的氨基酸殘基，指與第二氨基酸殘基共有最多的特征和特性的氨基酸殘基。在確定氨基酸殘基與第二氨基酸殘基是否具有最高同源性時，評定通?？梢杂筛鞣N因素組成，例如但不限于電荷、極性、疏水性、側臂質量和側臂尺寸。
[0131]術語“對應的位置”在本文中用來表示存在于第二序列的與第一序列中的特定氨基酸對應的某位置的氨基酸殘基，且該術語用于表示，當比對兩條序列以允許兩條序列之間的最大序列同一性時，與第一序列的位置相同的第二序列中的位置。對應位置處的氨基酸殘基具有相同的Kabat編號。 [0132]本文所用的術語“基本上由…組成”或“基本上由…組成”表示，多肽可以含有除所描述的以外的其他要素或元素，條件是這樣的要素或元素并不會實質地影響抗體或抗體片段特異性結合犬NGF的能力。也就是說，包含多肽的抗體或抗體片段可以具有不干擾抗體或抗體片段結合犬NGF的能力和不抵消犬NGF功能活性的能力的其他要素或元素。可以將這樣的修飾引入氨基酸序列中，從而降低抗體的免疫原性。例如，基本上由特定序列組成的多肽在該序列的一端或兩端可以含有一個、兩個、三個、四個、五個或以上額外缺失或取代的氨基酸，條件是這些氨基酸并不干擾、抑制、阻斷或干擾抗體或片段結合犬NGF和隔離其生物功能的作用。同樣，有助于抵消本發(fā)明的抗體的犬NGF的多肽分子可以被一個或多個官能團化學修飾，條件是這類官能團不干擾抗體或抗體片段結合犬NGF和抵消其功能的能力。
[0133]本文所用的術語“有效量”或“治療有效量”指實現治療效果所需的本發(fā)明的藥物、結合化合物、小分子、融合蛋白或藥物篩選化合物(peptidomimetic)的量。
[0134]本文中術語“多肽”、“肽”或“蛋白”可交換地用來表示通過相鄰殘基的α氨基和羰基之間的肽鍵連接的線性氨基酸殘基。氨基酸殘基通常是天然的“L”同分異構形式。然而，只要通過多肽保留期望的功能特性，“D”同分異構形式的殘基可以取代任何L-氨基酸殘基。
[0135]如本文所限定的，“抗體”包含特異性結合目的靶抗原的抗原-結合蛋白，所述靶抗原具有可以被重組制備或通過免疫球蛋白基因編碼的一個或多個多肽，在本文中該靶抗原是犬神經生長因子。術語“抗體”包含單克隆抗體和嵌合抗體，特別是犬源化抗體，并且進一步包含多克隆抗體或任何類或子類的抗體?！翱贵w”進一步延伸至雜合抗體、雙特異性抗體、異種抗體以及其保留抗原結合的功能片段。
[0136]短語“特異性結合”指抗體與存在于異源蛋白群中的特定蛋白或靶的結合。因此，當存在于免疫測定條件時，抗體結合特定蛋白而并不大量地結合樣品中存在的其他蛋白，在本文中該特定蛋白指犬NGF。[0137]如本文所限定的，“犬”還可以指“狗”。犬可以被歸類為學名家犬(Canisfamiliaris domesticus)或澳洲野犬(Canis lupus dingo)的亞種。犬包括任何種類的狗，并且包括野生品種和寵物品種，寵物品種還被稱為伴侶動物。
[0138]現將參考以下實施例描述本發(fā)明，所提供的實施例用于說明的目的并非意圖用于限制本發(fā)明。除非另有指明，通常根據本領域熟知的常規(guī)方法和如本發(fā)明引用和討論的各種一般文獻和詳細文獻中所描述的方法來實施本發(fā)明的方法和技術。
[0139]神經病理性疼痛神經病理性疼痛神經病理性疼痛神經病理性疼痛導致神經病理性疼痛【具體實施方式】
[0140]實施例1一設計并產生具有不同犬同種型的抗犬NGF抗體
[0141]使用連接至選自HCA(SEQ ID NO:1)、HCB(SEQ ID NO:2)、HCC(SEQ ID N0:3)或HCD (SEQ ID NO: 4)的重鏈恒定結構域(CH2和CH3)的相同的可變重鏈結構域(VH)，設計并構建針對犬NGF的抗體(稱為caN抗體)。可變輕鏈(VL)連接至犬κ恒定結構域(SEQ IDNO:5)。通過密碼子優(yōu)選和完整的化學基因合成將該組合的氨基酸序列轉換為哺乳動物細胞中的可表達形式并克隆入哺乳動物細胞表達載體PCDNA3.1+。具體而言，所設計的氨基酸序列被構建成合成的cDNA-可表達形式并被克隆入哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1 (+)中。通過組合犬源化可變結構域序列和C-端犬恒定重鏈序列或恒定輕鏈序列來產生完整的抗體序列。該犬源化的aDllVH結構域與四個重鏈同種型HCA、HCB、HCC和HCD(SEQ IDNO: 1-SEQ ID NO:4)中的每一個結合，以及該犬源化的aDllVL結構域與犬κ輕鏈恒定結構域(SEQ ID NO:5)結合。通過密碼子優(yōu)選和完整的化學基因合成并克隆入哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1+，將所組合的氨基酸序列換為哺乳動物細胞中的可表達形式。
[0142]使犬源化的重鏈cDNA質粒和輕鏈cDNA質粒的組合(caN-HCA_kLC使用 SEQ ID NO: 5 加 SEQ ID NO:1 (HCA) ; caN-HCB-kLC 使用 SEQ ID NO: 5 加 SEQ IDNO: 2 (HCB) ; caN-HCC-kLC 使用 SEQ ID NO: 5 加 SEQ ID NO: 3 (HCC)以及 caN-HCD-kLC 使用SEQ ID NO: 5加SEQ ID NO: 4 (HCD))轉染入CHO細胞，收集上清液并以ELISA模式使其與與NGF進行反應。在孵育和清洗步驟后，通過與連接辣根過氧化物酶(HRP)的山羊-抗犬IgG特異性多克隆抗體的反應性來檢測結合的犬抗體并使用TMB使其顯影。在450nm下測量所得的產物的光密度，并將其與來自模擬空白載體轉染的上清液(圖1中表示為“模擬”)的光密度進行比較。圖1顯示四種犬源化抗體同種型結合NGF的結果。這些抗體的每一種都具有相同的輕鏈(caN-kLC-Ι)，即為包含犬K恒定結構域的輕鏈。每一種抗體都具有不同的重鏈恒定結構域。因此，將一種特定的重鏈可變結構域與四種不同的恒定結構域(caN-HCA、caN-HCB、caN-HCC或caN_HCD)之一組合。觀察每一種犬重鏈同種型對NGF的等效結合。
[0143]通過ELISA試驗測試抗體上清液對NGF的結合(圖1A)，并通過TF-1細胞增殖抑制試驗測試NGF中和(圖1B)。由圖1中可見，在這些試驗中，四種同種型相互之間具有相當的活性，即它們都特異性結合犬NGF。
[0144]實施例2:NGF捕獲的犬源化抗體誘導的補體沉積
[0145]然后當使用補體Clq ELISA結合NGF時，評價含有四種抗體的上清液結合補體的能力。用100 μ I/孔的5 μ g/ml小鼠NGF涂覆板，并用5%BSA/PBS封阻該板。于室溫下用細胞培養(yǎng)物上清液將涂覆的孔孵育I小時，并且將其在PBS/l%BSA(100l.! I/孔)中稀釋，其中該細胞培養(yǎng)物上清液含有重組的犬源化抗NGF IgG0洗滌該板，并在室溫下用在含有0.5mMMgCl2,2mM CaCl2,0.05%吐溫_20、0.1%明膠和0.5%BSA的弗羅那緩沖鹽水中1/100稀釋的100 μ I/孔的人血清孵育該板I小時。洗滌后，用100 μ I的在PBS/1%BSA中1/800稀釋的綿羊抗-Clq-HRP(抗體)孵育該板。洗滌后，通過加入1001 TMB底物(Thermo Scientifi)使該板顯影。所有補體Clq的結合表示為A450—熱滅活補體的背景。通過加入100 μ I的2Ν H2SO4停止顯影并在450nm處讀出吸光度。
[0146]圖2示出該結果。這些結果顯示了 Clq與固定的犬源化HCB和HCC型抗體的結合，且沒有Clq與犬源化的HCA和HCD型抗體結合。因而，該結果出乎意料地表明，不同的犬衍生的重鏈顯示出不同的補體結合和激活特征，并且出乎意料地證明，具有HCA和HCD型重鏈的犬源化抗體優(yōu)選用于抵消犬NGF。由于特異性結合NGF且在表達NGF的細胞附近介導免疫反應的抗體是非常不期望的，因此，產生特異性結合犬NGF且不介導CDC的抗體的能力是非常有利的。 [0147]實施例3:用HCB和HCC重鏈同種型比較抗犬NGF單克隆抗體的N糖基化(N-glycosyIatecD 變體SN巨糖基ih (aglycosylated)變體與 NGF 結合
[0148]將具有HCB和HCC重鏈同種型的抗犬NGF單克隆抗體的N糖基化(N-glycosylated)變體和非糖基化(aglycosylated)變體與NGF的結合進行比較。使編碼SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:7(HCB)、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:16(HCB*)、SEQ ID NO:5 和EQ ID NO:8 (HCC)、或SEQ ID N0:5和SEQ ID NO: 17 (HCC*)描述的輕鏈和重鏈對的表達載體共轉染到CHO細胞，并通過與小鼠NGF的結合ELISA比較上清液。結果顯示于圖3中。左邊的圖表顯示了通過ELISA檢測用HCB重鏈(HCB )、無糖基HCB重鏈(HCB* )、HCC重鏈(HCC)或無糖基HCC重鏈(HCC*)構建的抗NGF MAb的表達的一空白框顯示未稀釋的上清液，陰影框顯示1/10稀釋的上清液，以及C顯示未稀釋的陰性對照上清液。觀察到與NGF等效結合。
[0149]類似地，將設計為除去HCB和HCC的恒定結構域N-連接的糖基化位點的抗體(被稱為HCB*(SEQ ID NO:6)和HCC*(SEQ ID NO:7))與輕鏈共表達，并評價補體活性(圖3)以試圖消除其補體結合。令人驚奇地，非糖基化的HCB*不能結合補體，但是非糖基化的HCC*仍然能夠結合補體。由于NGF是涉及傷害感受的可溶性介質，因此，對不介導補體募集結合的犬衍生糖基化的和非糖基化的重鏈的識別是特別有利的發(fā)現。
[0150]使用實施例2描述ClqELISA試驗測試CHO細胞轉染上清液募集補體的能力。
[0151]圖3-右欄示出該結果。通過除去B型重鏈(HCB*)中的N-連接糖基化位點，廢除募集補體Clq的能力，并且通過C型重鏈(HCC*)中的類似突變削弱該能力。
[0152]因此，本文出乎意料地證明，當本發(fā)明的抗體具有HCA或HCD亞型或非糖基化HCB*亞型時的犬衍生的重鏈時，抗體與犬NGF的結合并不引起補體激活(以及其他下游的效應子功能，例如ADCC)。因此，在通過防止犬NGF與膜結合TrkA或p75受體的結合抵消靶標例如犬NGF的生物功能活性時，所述抗體抑制相關的下游細胞內的信號級聯。而且，由于NGF表達頻繁地發(fā)生在神經等的附近，本發(fā)明的NGF抵消或中和抗體，其具有HCA或HCD亞型或HCB*亞型的犬衍生重鏈，能夠在沒有募集更寬泛的免疫反應的情況下隔絕犬NGF的生物活性。因此，該結果出人意料地表明，不同的犬衍生重鏈展示出不同的補體結合和激活特性，且具有HCA和HCD型重鏈的犬源化抗體已出人意料地顯示出優(yōu)選用于抵消犬NGF。由于NGF是可溶性介質，因此，對不介導補體結合的犬衍生重鏈的識別是非常有利的發(fā)現。這樣的功能特性是意想不到的，也是非常期望的。
[0153]實施例4:針對其它抗原VEGF和CD20的具有犬重鏈恒定結構域的抗體的產生以及其與補體的結合
[0154]考慮到令人驚訝的結果，即不同的犬重鏈同種型具有對補體的有差別的結合，使用以CHO細胞表達的犬重鏈恒定結構域并用如實施例1中描述的相同的方法類似地構建抗VEGF和抗⑶20抗體。圖4示出由這些抗體上清液在補體ELISA中得到的試驗結果。將這些結果與上面描述的抗NGF抗體在結合它們的同源抗原之后募集補體的能力進行比較。
[0155]這些結果顯示于圖4中。圖表A顯示了將使用犬重鏈同種型B和C構建的犬源化抗NGF MAb和使用人重鏈同種型IgGl和IgG4構建的人源化抗體捕獲到NGF涂覆板上，用人血清培養(yǎng)，并使用綴合于HRP的抗Clq多克隆抗體通過ELISA檢測結合的Clq。圖表B顯示了補體Clq結合使用犬重鏈同種型A和B (SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)構建的VEGF捕獲的犬源化抗VEGF MAbs的結果。圖表C顯示了補體Clq結合hu⑶20胞外域肽上捕獲的抗CD20MAb (muB-2a:鼠抗人CD20MAb以及:鼠抗人CD20MAb，表示為具有犬重鏈同種型B (SEQ ID NO:9)的嵌合融合蛋白)的結果。所有補體Clq的結合表示為A450—熱滅活補體背景。
[0156]所有這些數據共同表明了使用HCB但非HCA犬重鏈恒定結構域構建的抗VEGF抗體可以募集補體，且使用犬HCB構建的抗CD20抗體可以結合補體，因此與上面描述的抗NGF抗體同種型對補體的有差別的結合類似?？偟膩碚f，這些數據支持了所述的令人驚奇的發(fā)現，即以HCB和HCC同種型構建的抗原捕獲的抗體結合補體，而HCA和HCD則不是這樣。HCB和HCC同種型結合補體的這種識別對于殺滅腫瘤細胞例如VEGF表達的或⑶20表達的的腫瘤細胞是非常有利的。
`[0157]這些實驗的結果支持了實施例1中所述的出人意料的發(fā)現，即包含犬重鏈恒定結構域HCA、HCD和非糖基化的HCB (HCB*)同種型的抗體導致了不介導CDC活性的免疫球蛋白。因此，
【發(fā)明者】已首次識別出，這種犬衍生重鏈在用于治療方法的免疫球蛋白中具有效用(utility)，該治療方法中不期望CDC介導的免疫反應。這種應用的實例可以在通過細胞因子或趨化因子、生長因子、荷爾蒙和其它細胞外介質，包括體內或例如疼痛、黃斑變性或炎癥的疾病中的補體自身的犬免疫球蛋白的抑制中發(fā)現。
[0158]既然HCA、HCD和HCB*同種型在CDC非活性抗體的設計中是最有用的，
【發(fā)明者】也令人驚奇地識別出，HCB (calgG-B)和HCC (calgG-C)同種型的犬抗體在CDC活性抗體的設計中是有用的。這種抗體例如在癌癥治療中，在將細胞作為靶標進行破壞時是有用的。有許多人腫瘤抗原通過使用⑶C活性抗體、包括⑶20、HER2和EGFR而被作為靶標，因此使用HCB和HCC同種型構建的犬抗體會在犬類中有類似的用途。
[0159]實施例5:在CHO細胞中表達后抗NGF單克隆抗體的純化
[0160]由于HCA和HCD同種型的犬抗NGF單克隆抗體具有期望的不結合補體的特性(圖
2)，但對葡萄球菌蛋白質A弱結合(圖5)，從而發(fā)明了純化的替代方法(圖6)?？谷甆GF單克隆抗體(使用重鏈同種型HCA構建)在CHO細胞中表達，并在經大量實驗后，令人驚奇地發(fā)現，犬抗NGF抗體通過兩種可替換的純化方法可被分級為高純度(>89%單體IgG峰值，如圖6A、6D 所示)。[0161]在第一種方法中，抗犬NGF單克隆抗體通過陰離子交換層析、疏水作用層析和排阻層析(方法1-圖6A和B)進行純化。在第二種方法中，抗犬NGF抗體可以通過Captoadhere親和層析，以及隨后的陰離子交換層析(方法I1-圖6C和D)進行純化。
[0162]通過任何一種方法純化的抗NGF單克隆抗體的主峰對應于約150kDa的分子量。通過SDS-PAGE和ELISA的對比(圖7)說明，方法I和方法II產生了具有類似的純度和生物活性的抗體制劑。通過這些方法產生的純化的抗NGF單克隆抗體在TF-1NGF中和試驗中進行測試(如圖1中所述)，并顯示出具有高效能(IC5013pM抗-NGF中和的37pMNGF，未示出)。
[0163]實施例6:抗犬NGF單克隆抗體可通過靜脈注射安全地施用于犬，且不會導致發(fā)熱
[0164]將來源于含有犬HCA型重鏈的表達載體的抗犬NGF單克隆抗體在CHO細胞中表達，并通過離子交換層析、疏水作用層析和尺寸排阻層析(方法I，圖6A和B)的組合進行純化，且緩沖液更換為磷酸鹽緩沖液。將該抗體以2mg/kg體重靜脈注射入比格犬，并由獸醫(yī)通過目測觀察評價毒性體征、體重變化、體溫以及血漿生化。圖8示出了體重和溫度的測量。在測量的這些和任何血漿生化分析物(包括鈉、鉀、氯化物、鈣、磷酸鹽、尿素、肌酸酐、葡萄糖、膽固醇、膽紅素、丙氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶、淀粉酶、脂肪酶、總蛋白質或白蛋白:未顯示)中沒有觀察到變化。
[0165]實施例7:體內抗犬(HCA同種型)NGF單克隆抗體的血漿藥代動力學i正明了長的血清半排出期且沒有免疫原性
[0166]將來源于表達犬HCA型重鏈的表達載體的抗犬NGF單克隆抗體在CHO細胞中表達，并通過離子交換層析、疏水作用層析和尺寸排阻層析的組合進行純化，并將緩沖液更換為磷酸鹽緩沖液(方法I，圖6A和B)。
[0167]通過靜脈注射以每千克體重2mg將抗體注射入比格犬內，在其次的2周內的不同時間采集血漿樣品。通過ELISA，使用作為靶的NGF和抗犬多克隆抗體_辣根過氧化物酶第二試劑，評價稀釋的血漿樣品的抗犬NGF抗體濃度，并如圖1顯影。圖18示出該結果。測得的血漿濃度與二相動力學一致，具有約33小時的組織分布(α )相半衰期和約9天的出奇長的消除(β)相。
[0168]在100-300小時之間抗犬NGF抗體血漿濃度沒有急劇下降，這表明在狗血液中既沒有已有的中和抗體導致的重組抗NGF單克隆抗體，注入后也沒有生成任何這樣的中和抗體。通過比較,在注入后200小時時，狗血液中的抗體中和了基于蛋白的重組人免疫球蛋白(Richter et al, Drug Metabolism and Disposition27:21，1998)。因此，這些結果表明，本發(fā)明的抗犬NGF抗體在靜脈注射后在體內具有長的血清半衰期(9天)，并且隨時間的過去，不存在中和注射的抗NGF抗體的已有抗體或新產生的抗體。
_9] 實施例14-抗犬NGF單克隆個抗體對降低體內炎性疼痛的影響
[0170]抗體療法
[0171]在CHO細胞中表達衍生自表達SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11 (犬HCA型重鏈)的表達載體的抗犬NGF單克隆抗體，并且通過離子交換層析、疏水作用層析和尺寸排阻層析的組合(方法I)使其純化，并且將緩沖液更換為磷酸鹽緩沖液。
[0172]有炎癥的犬模型:
[0173]在機構倫理委員會(Institutional Ethics Committee,CRL,愛爾蘭)的預先批準下進行所有的實驗。將高嶺土(kaolin)注入(-1天時)比格犬的一條后腿的墊腳中，從而在約24小時后開始自身化解炎癥，這導致狗暫時性跛足。在該模型中，一旦對高嶺土的起初始炎性反應減弱，在約1-2周內該狗的跛足程度將穩(wěn)定地減小，然后全部恢復。
[0174]通過靜脈注射將抗犬NGF單克隆抗體以每千克體重200 μ g或作為媒介對照的磷酸鹽緩沖液注入(O天時)到3只狗的組中。7天后，通過目測評分方法評價狗的跛足程度:O分，沒有跛足(全負重)；1分，輕微跛足(非全負重但行走正常)；2分，中等跛足(輕微負重且行走不正常)；3分，嚴重跛足(無負重)。觀察者不了解哪只狗接受了注射。
[0175]圖19示出了該結果。與對照組相比，注射3天后，接受抗NGF單克隆個抗體的狗的跛足評分減小，這表明與僅用媒介相比，抗NGF單克隆抗體具有降低狗的疼痛的效果。延遲的活性與抗犬NGF單克隆個抗體的血漿藥物動力學一致，這表明約30小時的慢的組織分布相和墊腳區(qū)相對差的血管形成。圖19示出的結果表明，本發(fā)明的抗犬NGF抗體在降低跛足的同時降低了狗的炎性疼痛。
[0176]通過引用將本發(fā)明提及的所有文獻并入本文中。在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，對本發(fā)明的實施方案進行各種修飾和變化對本領域技術人員是顯而易見的。雖然就具體優(yōu)選的實施方案進行了描述本發(fā)明，但是應該理解，請求保護的本發(fā)明不應該不適當地限制為這些具體的實施方案。事實上，本發(fā)明意圖涵蓋對本領域技術人員顯而易見的實施本發(fā)明的方式的各 種修改。
【權利要求】
1.一種用于治療犬的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13的重鏈恒定結構域，其中當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時，所述重鏈的氨基酸序列使下游免疫系統效應子功能的激活最小化。
2.如權利要求1所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述犬的治療涉及疼痛或炎癥或與此相關病癥的治療。
3.如權利要求2所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述犬的治療涉及關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥的治療。
4.如權利要求2所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述疼痛選自神經病理性疼痛、腫瘤疼痛、與風濕性關節(jié)炎相關或由其導致的疼痛、與骨關節(jié)炎相關或由其導致的疼痛、與炎癥相關或由其導致的疼痛以及與瘙癢相關或由其導致的疼痛。
5.如權利要求1-4中任何一項所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述下游免疫系統效應子功能選自補體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和抗體依賴性細胞病理。
6.如權利要求1-5中任何一項所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述靶抗原選自細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞表面受體、病毒和補體級聯的組分。
7.抗體、融合蛋白或其結合片段在 制備用于治療犬個體的疼痛或炎癥的藥物中的用途，所述抗體、融合蛋白或其結合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 13的重鏈恒定結構域，其中當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時，所述重鏈的氨基酸序列使下游免疫系統效應子功能的激活最小化。
8.如權利要求7所述的用途，其中所述疼痛選自神經病理性疼痛、腫瘤疼痛、與風濕性關節(jié)炎相關或由其導致的疼痛、與骨關節(jié)炎相關或由其導致的疼痛、與炎癥相關或由其導致的疼痛以及與瘙癢相關或由其導致的疼痛。
9.如權利要求7或8所述的用途，其中所述下游免疫系統效應子功能選自補體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和抗體依賴性細胞病理。
10.如權利要求7-9中任一項所述的用途，其中所述靶抗原選自細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞表面受體、病毒和補體級聯的組分。
11.一種用于治療、抑制或減輕有需要的犬個體中的疼痛或炎癥的方法，所述方法包括下列步驟: -提供特異性結合在疼痛或炎癥的治療或預防中具有特定功能的靶抗原的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:8, SEQ ID ΝΟ:11或SEQ ID NO: 13的重鏈恒定結構域，且其中所述抗體、融合蛋白或結合片段不激活下游免疫系統效應子功能，以及 -向所述犬個體施用治療有效量的所述抗體、融合蛋白或結合片段。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述疼痛選自神經病理性疼痛、腫瘤疼痛、與風濕性關節(jié)炎相關或由其導致的疼痛、與骨關節(jié)炎相關或由其導致的疼痛、與炎癥相關或由其導致的疼痛以及與瘙癢相關或由其導致的疼痛。
13.如權利要求11或12所述的方法，其中所述下游免疫系統效應子功能選自補體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和抗體依賴細胞病理。
14.如權利要求11-13中任一項所述的方法，其中所述靶抗原選自細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞表面受體、病毒和補體級聯的組分。
15.如權利要求11-14中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括共同施用至少另一種藥劑的步驟，所述藥劑選自鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片類藥物、皮質類固醇和類固醇。
16.用于治療犬的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 14的重鏈恒定結構域，其中當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時，所述重鏈的氨基酸序列介導下游免疫系統效應子功能的激活。
17.如權利要求16所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述治療涉及癌性或惡性病癥的治療。
18.如權利要求16或17所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述下游免疫系統效應子功能選自補體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和抗體依賴細胞病理。
19.如權利要求16-18中任一項所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述靶抗原是癌特異性抗原。
20.如權利要求19所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述癌特異性抗原選自細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞表面受體、病毒和補體級聯的組分。
21.如權利要求19所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述癌特異性抗原選自蛋白質 CD2、CD4、CD8、CD20、EGFR、VEGFR 和 HER2。
22.抗體、融合蛋白或其結合片段在制備用于治療犬個體的癌性或惡性病癥的藥物中的用途，所述抗體、融合蛋白或結合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9, SEQ ID NOilO或SEQ ID NO: 14的重鏈恒定結構域，其中當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時，所述重鏈的氨基酸序列介導下游免疫系統效應子功能的激活。
23.如權利要求22所述的用途，其中所述下游免疫系統效應子功能選自補體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和抗體依賴性細胞病理。
24.如權利要求22或23所述的用途，其中所述靶抗原是癌特異性抗原。
25.如權利要求24所述的用途，其中所述癌特異性抗原選自細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞表面受體、病毒和補體級聯的組分。
26.如權利要求24所述的用途，其中所述癌特異性抗原選自蛋白質CD2、CD4、CD8、CD20、EGFR、VEGFR 和 HER2。
27.用于治療或預防犬個體的癌性或惡性病癥的方法，所述方法包括下列步驟: -提供特異性結合在癌性或惡性病癥的治療中具有特定功能的靶抗原的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 14的重鏈恒定結構域，且其中所述抗體、融合蛋白或結合片段激活下游免疫系統效應子功能，以及 -向需要這種治療的犬個體施用治療有效量的所述抗體、融合蛋白或結合片段。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述下游免疫系統效應子功能選自補體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和抗體依賴細胞病理。
29.如權利要求27或28所述的方法，其中所述靶抗原是癌特異性抗原。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述癌特異性抗原選自細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞表面受體、病毒和補體級聯的組分。
31.如權利要求29所述的方法，其中所述癌特異性抗原選自蛋白質CD2、CD4、CD8、CD20、EGFR、VEGFR 和 HER2。
32.用于治療犬的病癥的抗體、融合蛋白或其結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時不結合Clq的重鏈恒定結構域，且其中所述抗體、融合蛋白或結合片段可以用蛋白質A層析純化。
33.如權利要求32所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述抗體具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的重鏈恒定結構域。
34.如權利要求32所述的抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述抗體具有包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13的重鏈恒定結構域。
35.抗體、融合蛋白或其結合片段在制備治療犬的與疼痛和/或炎癥相關的病癥的藥物中的用途，所述抗體、融合蛋白或結合片段具有當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時不結合Clq的重鏈恒定結構域，并且其中所述抗體、融合蛋白或結合片段可以用蛋白質A層析純化。
36.如權利要求35所述的用途，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的重鏈恒定結構域。
37.如權利要求35所 述的用途，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含選自SEQID NO: 12、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的重鏈恒定結構域。
38.用于治療、抑制或減輕有需要的犬個體的疼痛或炎癥的方法，所述方法包括下列步驟: -提供包含重鏈恒定結構域的抗體、融合蛋白或其結合片段，當所述抗體、融合蛋白或結合片段結合其靶抗原時，所述重鏈恒定結構域不結合Clq，且其中所述抗體、融合蛋白或結合片段可以用蛋白質A層析純化，以及 -向所述犬個體施用治療有效量的所述抗體、融合蛋白或結合片段。
39.如權利要求38所述的方法，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的重鏈恒定結構域。
40.如權利要求38所述的方法，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13的重鏈恒定結構域。
41.重組抗體、融合蛋白或其結合片段，其可以在治療上施用于犬以特異性結合靶抗原，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段的恒定結構域不結合Clq補體，且其中所述恒定結構域的重鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型A、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型D或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的無糖基犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型B。
42.如權利要求41所述的重組抗體、融合蛋白或結合片段，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段具有包含選自 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 15 的氨基酸序列的重鏈恒定結構域。
43.重組抗體、融合蛋白或其結合片段，其可在治療上施用于犬以特異性結合靶抗原，并進一步介導免疫反應，所述免疫反應的特征在于Clq補體結合所述抗體、融合蛋白或結合片段和相關的補體依賴性細胞毒性，其中所述抗體、融合蛋白或結合片段的重鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID N0:9的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型B、具有氨基酸序列SEQID NO: 10的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型C或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14的無糖基犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域同種型C。
44.包含權利要求41-43中任一項所述的抗體、融合蛋白或結合片段以及至少一種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。
45.編碼權利要求41-43中任一項所述的抗體、融合蛋白或結合片段的分離的核酸、包含所述核酸的表達載體或包含所述表達載體的宿主細胞。
46.用于從源混合物純化犬衍生免疫球蛋白或免疫球蛋白或融合蛋白的方法，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的同種型A的犬重鏈恒定結構域或具有氨基酸序列SEQ IDNO: 11的同種型D的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域，所述方法包括下列步驟: (i)提供包含靶免疫球蛋白或融合蛋白的源混合物； (?)使所述源混合物進行陰離子交換層析； (iii)使所述源混合物進行疏水作用層析；以及 (iv)使所述源混合物進行尺寸排阻層析。
47.用于從源混合物純化犬衍生免疫球蛋白或免疫球蛋白或融合蛋白的方法，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的同種型A的犬重鏈恒定結構域或具有氨基酸序列SEQ IDNO: 11的同種型D的犬免疫球蛋白重鏈恒定結構域，所述方法包括下列步驟: (i)提供包含靶免疫球蛋白的源混合物； (?)使所述源混合物進行captoadhere親和層析；以及 (iii)使所述源混合物進行陰離子交換層析。
48.由權利要求46或47的純化方法產生的抗體或融合蛋白，其用于犬的治療。
【文檔編號】C07K16/22GK103732620SQ201280033531
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年5月8日 優(yōu)先權日:2011年8月29日
【發(fā)明者】大衛(wèi)·吉爾芮 申請人:Nvip私人有限公司