專利名稱：靶向破骨細(xì)胞相關(guān)蛋白涎免凝集素-15的抗體的制作方法
靶向破骨細(xì)胞相關(guān)蛋白涎免凝集素-15的抗體[技術(shù)領(lǐng)域]
本發(fā)明涉及可用作用于異常骨代謝的治療和/或預(yù)防劑的物質(zhì)。本發(fā)明還涉及藥物組合物例如抗體和編碼該抗體的多核苷酸。此外，本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防異常骨代謝的方法。[背景技術(shù)]
已經(jīng)知道骨是通過重復(fù)形成和吸收而不斷重建以改變其自身形態(tài)并維持血鈣水平的動態(tài)器官。健康的骨維持通過成骨細(xì)胞的骨形成和通過破骨細(xì)胞的骨吸收之間的平衡，并且骨量維持不變。相比之下，當(dāng)骨形成和骨吸收之間的平衡喪失時(shí)，發(fā)生異常骨代謝例如骨質(zhì)疏松癥(Endocrinological Review (內(nèi)分泌學(xué)綜述)，(1992) 13,第 66-80 頁；Principles of Bone Biology (骨生物學(xué)原理)，Academic Press, New York, (1996)第87-102 頁)。作為調(diào)節(jié)骨代謝的因子，許多全身性激素和局部細(xì)胞因子已經(jīng)被報(bào)道，并且這些因子彼此協(xié)作，以形成和維持骨(Endocrinological Review (內(nèi)分泌學(xué)綜述)，(1992)
13,第 66-80 頁；Endocrinological Review (內(nèi)分泌學(xué)綜述)，(1996) 17,第 308-332頁)。作為由于老化引起的骨組織變化，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生廣為人知，但其發(fā)生機(jī)制包括多種因子，例如性激素分泌的減少和激素受體異常、骨中細(xì)胞因子局部表達(dá)變化、老化基因的表達(dá)以及破骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化失敗或功能異常，因此很難將其視為一種簡單的與年齡相關(guān)的生理現(xiàn)象。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要分為由于雌激素分泌減少引起的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和由于老化引起的老年 性骨質(zhì)疏松癥，但對骨形成和骨吸收調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)研究的進(jìn)步是闡明其發(fā)生機(jī)制和開發(fā)用于其的治療劑所必需的。破骨細(xì)胞是造血干細(xì)胞衍生的多核細(xì)胞，并且通過在破骨細(xì)胞粘附的骨表面上釋放氯離子和氫離子，破骨細(xì)胞酸化骨表面與破骨細(xì)胞之間的間隙，并且還分泌其為酸性蛋白酶的組織蛋白酶K等(American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324)。這引起磷酸鈣的降解、酸性蛋白酶的激活和骨基質(zhì)蛋白的降解，從而造成骨吸收。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞通過用RANKL (NF- κ B配體的受體激活劑)刺激而分化成為破骨細(xì)胞，所述RANKL在存在于骨表面的成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)(Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America(美國國家科學(xué)院院刊)，(1998) 95，第 3597-3602 頁；Cell, (1998) 93，第 165-176頁)。已經(jīng)揭示RANKL是由成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的膜蛋白。其表達(dá)受骨吸收因子調(diào)控，RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為多核的破骨細(xì)胞等(Proceedings of the NationalAcademy of Science of the United States of America (美國國家科學(xué)院院刊)，(1998) 95,第 3597-3602 頁；Journal of Bone and Mineral Research (骨與礦物質(zhì)研究雜志)，(1998) 23，S222)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)無RANKL的基因敲除小鼠出現(xiàn)骨硬化癥樣疾病，因此，已經(jīng)證實(shí)RANKL為生理學(xué)上的破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子(Nature, (1999) 397，第315-323 頁)。作為用于治療骨代謝疾病或縮短治療持續(xù)時(shí)間的藥物，二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素制劑例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮(ipriflavone)、維生素1(2(四烯甲萘醌)、PTH (甲狀旁腺素)制劑、鈣制劑等被使用。然而，這些藥物并不總是呈現(xiàn)令人滿意的治療效果，需要開發(fā)具有更有效的治療效果的藥劑。免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜被多種聚糖(例如唾液酸，其被多種聚糖結(jié)合蛋白識別)的致密包被物覆蓋。唾液酸結(jié)合的免疫球蛋白樣凝集素(后文稱為“涎免凝集素(siglec) ”)為識別唾液酸化的聚糖并與其結(jié)合的I型膜蛋白家族。許多涎免凝集素在免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，識別同樣存在于免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上的唾液酸，并調(diào)節(jié)細(xì)胞相互作用或細(xì)胞功能，且被認(rèn)為參與免疫反應(yīng)(Nature Reviews Immunology, (2007) 7,第 255-266 頁)。然而，還有大量生理功能尚未闡明的涎免凝集素分子。涎免凝集素-15 (唾液酸結(jié)合的免疫球蛋白樣凝集素15)為新近報(bào)道屬于涎免凝集素的分子(Glycobiology，(2007) 17，第838-846頁)，并且與被稱為“CD33抗原樣3，，、“CD33分子樣3，，、“CD33樣3”或“CD33L3”的分子相同。從魚到人該分子在進(jìn)化上高度保守，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在人脾和淋巴結(jié)的樹突細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。此外，作為使用唾液酸探針的結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人涎免凝集素-15與Neu5Ac a 2_6GalNAc結(jié)合，并且除Neu5Ac a 2_6GalNAc外小鼠涎免凝集素-15 還與 Neu5Ac a 2_3Gal β l_4Glc 結(jié)合(Glycobiology, (2007) 17，第 838-846頁)。直到最近，涎免凝集素-15的生理作用還未揭示，然而，已經(jīng)報(bào)道涎免凝集素-15的表達(dá)隨著破骨細(xì)胞的分化和成熟而增加，并且破骨細(xì)胞的分化被通過RNA干擾造成的涎免凝集素-15的表達(dá)減少抑制(W0 2007/093042)。還已經(jīng)報(bào)道涎免凝集素-15基因在巨細(xì)胞瘤中特異性表達(dá)，并且還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)單核細(xì)胞衍生的細(xì)胞系分化為破骨細(xì)胞時(shí)涎免凝集素-15基因的表達(dá)水平上升(W02009/048072)。已經(jīng)公開了可抑制破骨細(xì)胞的分化的兔多克隆和大鼠單克隆抗小鼠涎免凝集素-15抗體(W02009/048072)。可抑制破骨細(xì)胞分化的抗涎免凝集素-15的嵌合單克隆抗體也已經(jīng)公開(US2010/0104575)。然而可給予人的人抗體尚未公開。[本發(fā)明公開內(nèi)容]
[本發(fā)明要解決的問題]
本發(fā)明的目的為提供抑制破骨細(xì)胞分化和成熟及其活性的物質(zhì)，以及用于異常骨代謝的治療和/或預(yù)防劑。[用于解決該問題的方法]
本發(fā)明人進(jìn)行研究以闡明破骨細(xì)胞分化、成熟和激活的機(jī)制，以便發(fā)現(xiàn)對異常骨代謝具有治療和/或預(yù)防效果的物質(zhì)。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)涎免凝集素-15基因的表達(dá)隨著破骨細(xì)胞的分化和成熟而增加，還發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞分化被特異性結(jié)合涎免凝集素-15的抗體抑制，因此，本發(fā)明已經(jīng)完成。在某些情況下，本發(fā)明抗體具有比本領(lǐng)域已知抗體更高的抗破骨細(xì)胞效價(jià)。S卩，本發(fā)明包括下列方面。根據(jù)本發(fā)明第一方面，提供能夠結(jié)合涎免凝集素-15的抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨細(xì)胞的骨吸收的分離抗體，或其功能片段，包含:(a)包含CDRHl、CDRH2和CDRH3的重鏈，所述⑶RHl包含與SEQ ID NO: 71具有至少80%序列同一性的序列，所述⑶RH2包含與SEQ ID NO: 72具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH3包含與SEQ ID NO: 35、45、55或65中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列；和(b)包含⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3的輕鏈，所述⑶RLl包含與SEQ ID NO: 73具有至少80%序列同一性的序列，所述⑶RL2包含與SEQ ID NO: 74具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL3包含與SEQ ID NO: 40,50,60或70中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。根據(jù)本發(fā)明第二方面，提供能夠結(jié)合涎免凝集素-15的抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨細(xì)胞的骨吸收的分離抗體，或其功能片段，包含:(a)包含CDRHl、CDRH2和CDRH3的重鏈，所述⑶RHl包含與SEQ ID NO: 106具有至少80%序列同一性的序列，所述⑶RH2包含與SEQ ID NO: 107具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH3包含與SEQ ID NO: 55、
35、45、65或80中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列；和(b)包含⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3的輕鏈，所述⑶RLl包含與SEQ ID NO: 73或83具有至少80%序列同一性的序列，所述⑶RL2包含與SEQ ID NO: 108具有至少80%序列同一性的序列，所述⑶RL3包含與SEQID NO: 60、40、50、70、90、100或109中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。優(yōu)選⑶RH3包含與SEQ ID NO: 35具有至少80%序列同一性的序列并且⑶RL3包含與SEQ ID NO: 40具有至少80%序列同一性的序列。或者，CDRH3包含與SEQ ID NO: 45具有至少80%序列同一性的序列并且⑶RL3包含與SEQ ID NO: 50具有至少80%序列同一性的序列?；蛘?，⑶RH3包含與SEQ ID NO: 55具有至少80%序列同一性的序列并且⑶RL3包含與SEQ ID NO: 60具有至少80%序列同一性的序列?；蛘?，CDRH3包含與SEQ ID NO:65具有至少80%序列同一性的序列并且⑶RL3包含與SEQ ID NO: 70具有至少80%序列同一性的序列?；蛘撸荝H3包含與SEQ ID NO: 80具有至少80%序列同一性的序列并且CDRL3包含與SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性，優(yōu)選與SEQ ID NO: 90或100中的任一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。方便地，CDRHl包含與SEQ ID NO: 33、43、53、63或78中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。優(yōu)選地， CDRH2包含與SEQ ID NO: 34、44、54、64、79、94或104中的一個(gè)具有至少
80%序列同一性的序列。有利地，CDRLl包含與SEQ ID NO: 38、48、58、68或88中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。方便地，CDRL2包含與SEQ ID NO: 39、49、59、69或89中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。優(yōu)選地，CDRHl、CDRH2、CDRH3、CDHLl、CDRL2和 CDRL3 的序列分別包含與 SEQ.1DNO: 33、34、35、38、39和40具有至少80%序列同一性的序列?；蛘撸珻DRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分別包含與SEQ.ID NO:43、44、45、48、49和50具有至少80%序列同一1丨生的序列?；蛘撸珻DRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分別包含與SEQ.ID NO:53、54、55、58、59和60具有至少80%序列同一性的序列?；蛘?，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分別包含與SEQ.ID NO:63、64、65、68、69和70具有至少80%序列同一性的序列?；蛘?，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分別包含與SEQ.ID NO:78、79、80、88、89和90具有至少80%序列同一性的序列。或者，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分別包含與SEQ.ID NO:93、94、95、98、99和100具有至少80%序列同一性的序列?；蛘撸珻DRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分別包含與SEQ.ID NO:103、104、105、88、89和90具有至少80%序列同一性的序列。特別優(yōu)選的是，抗體或功能片段包含與上述序列具有至少90%或95%序列同一性的 CDRHl、CDRH2、CDRH3、CDRLl、CDRL2 和 / 或 CDRL3 序列。優(yōu)選地，抗體包含:
選自以下的重鏈可變區(qū):
al)包含SEQ ID NO: 32的氨基酸殘基20_136、SEQ ID NO: 42的氨基酸殘基20-135、SEQ ID NO: 52 的氨基酸殘基 20-137、SEQ ID NO: 62 的氨基酸殘基 20-136、SEQ ID NO:77的氨基酸殘基20-138、SEQ ID NO: 92的氨基酸殘基20-138或SEQ ID NO: 102的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列；
a2)與al)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；a3)與al)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和a4)在al)的氨基酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基添加、缺失或取代的氨基酸序列；和
選自以下的輕鏈可變區(qū):
bl)包含SEQ ID NO: 37的氨基酸殘基20_129、SEQ ID NO: 47的氨基酸殘基20-129、SEQ ID NO: 57 的氨基酸殘基 20-129、SEQ ID NO: 67 的氨基酸殘基 20-129、SEQ ID NO:87的氨基酸殘基20-134或SEQ ID NO: 97的氨基酸殘基20-133的氨基酸序列；b2)與bl)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；b3)與bl)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和b4)在bl)的氨基酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基添加、缺失或取代的氨基酸序列。特別優(yōu)選的是，重鏈和輕鏈可變區(qū)與上述序列具有至少99%的序列同一性。有利地，抗體包含:
選自以下的重鏈:
al)包含SEQ ID NO: 32、42、52、62、77、92或102中的一個(gè)的序列的氨基酸序列;
a2)與al)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；a3)與al)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和a4)在al)的氨基酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基添加、缺失或取代的氨基酸序列；和
選自以下的輕鏈:
bl)包含SEQ ID NO: 37、47、57、67、87或97中的一個(gè)的序列的氨基酸序列;
b2)與bl)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
b3)與bl)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和
b4)在bl)的氨基酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基添加、缺失或取代的氨基酸序列。特別優(yōu)選的是，重鏈和輕鏈與上述序列 具有至少99%的序列同一性。方便地，抗體包括由包含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQID NO: 37的氨基酸序列組成的輕鏈?；蛘?，抗體包括由包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ IDNO: 47的氨基酸序列組成的輕鏈。或者，抗體包括由包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ IDNO: 57的氨基酸序列組成的輕鏈?；蛘撸贵w包括由包含SEQ ID NO: 62的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ IDNO: 67的氨基酸序列組成的輕鏈。或者，抗體包括由包含SEQ ID NO: 77的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ IDNO: 87的氨基酸序列組成的輕鏈。或者，抗體包括由包含SEQ ID NO: 92的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ IDNO: 97的氨基酸序列組成的輕鏈?；蛘?，抗體包括由包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ IDNO: 87的氨基酸序列組成的輕鏈。方便地，本發(fā)明抗體的功能片段選自Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv。優(yōu)選地，抗 體為scFv。根據(jù)本發(fā)明第三方面，提供用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝的本發(fā)明第一或第二方面的分離抗體或其功能片段。根據(jù)本發(fā)明第四方面，提供本發(fā)明第一或第二方面的分離抗體或其功能片段用于制造用于治療或預(yù)防異常骨代謝的藥物的用途。根據(jù)本發(fā)明第五方面，提供治療罹患異常骨代謝的患者的方法，其包括給予在治療上有效量的本發(fā)明第一或第二方面的分離抗體或其功能片段。根據(jù)本發(fā)明第六方面，提供包含至少一種本發(fā)明第一或第二方面的抗體或其功能片段的藥物組合物。方便地，藥物組合物為用于異常骨代謝的治療和/或預(yù)防劑。根據(jù)本發(fā)明第七方面，提供用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝的藥物組合物，其特征在于包含至少一種本發(fā)明第一或第二方面的抗體或抗體功能片段，和至少一種選自以下的成員:二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素制劑例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺素)制齊U、非留體抗炎劑S、可溶性TNF受體制劑、抗TNF-α抗體或該抗體的功能片段、抗PTHrP(甲狀旁腺素相關(guān)蛋白)抗體或該抗體的功能片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體的功能片段、抗RANKL抗體或該抗體的功能片段和OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor))。優(yōu)選地，異常骨代謝選自:骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌癥骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、牙周炎引起的牙喪失、假關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、佩吉特氏骨病(Paget’s disease of bone)、腎性骨營養(yǎng)不良和成骨不全癥。有利地，異常骨代謝為骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞或伴隨癌癥骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。方便地，骨質(zhì)疏松癥為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、使用治療劑例如類固醇或免疫抑制劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。根據(jù)本發(fā)明第八方面，提供多核苷酸，其包含:
a)編碼本發(fā)明第一或第二方面的抗體或其功能片段中的一種的核苷酸序列；或
b)與由與a)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列。方便地，編碼CDRHl、CDRH2、CDRH3、CDRLl、CDRL2和CDRL3序列的核苷酸序列包含:
a)分別為SEQ ID NO: 31 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 31 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 31 的核苷酸 352-375、SEQ ID NO: 36 的核苷酸 124_156、SEQ ID NO: 36 的核苷酸202-222 和 SEQ ID NO: 36 的核苷酸 319-348 ；
b)分別為SEQ ID NO: 41 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 41 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 41 的核苷酸 352-372、SEQ ID NO: 46 的核苷酸 124_156、SEQ ID NO: 46 的核苷酸202-222 和 SEQ ID NO: 46 的核苷酸 319-348 ；
c)分別為SEQ ID NO: 51 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 51 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 51 的核苷酸 352-378、SEQ ID NO: 56 的核苷酸 124_156、SEQ ID NO: 56 的核苷酸202-222 和 SEQ ID NO: 56 的核苷酸 319-348 ；
d)分別為SEQ ID NO: 61 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 61 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 61 的核苷酸 352-375、SEQ ID NO: 66 的核苷酸 124_156、SEQ ID NO: 66 的核苷酸202-222 和 SEQ ID NO: 66 的核苷酸 319-348 ；
e)分別為SEQ ID NO: 76 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 76 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 76 的核苷酸 352-381、SEQ ID NO: 86 的核苷酸 124_165、SEQ ID NO: 86 的核苷酸211-231 和 SEQ ID NO: 86 的核苷酸 328-363 ；
f)分別為SEQ ID NO: 91 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 91 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 91 的核苷酸 352-381、SEQ ID NO: 96 的核苷酸 124_165、SEQ ID NO: 96 的核苷酸211-231 和 SEQ ID NO: 96 的核苷酸 328-360 ;或
g)分別為SEQ ID NO: 101 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 101 的核苷酸205_261、SEQID NO: 101 的核苷酸 358-387、SEQ ID NO: 86 的核苷酸 124-165、SEQ ID NO: 86 的核苷酸 211-231 和 SEQ ID NO: 86 的核苷酸 328-363。優(yōu)選地，多核苷酸包含:
選自以下的編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列:
al)包含 SEQ ID NO: 31 的核苷酸 58-408、SEQ ID NO: 41 的核苷酸 58-405、SEQID NO: 51 的核苷酸 58-411、SEQ ID NO: 61 的核苷酸 58-408、SEQ ID NO: 76 的核苷酸58-414,SEQ ID NO: 91的核苷酸58-414或SEQ ID NO: 101的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a2)與由與al)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列；和
a3)在al)的核苷酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列；
和
選自以下的編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列:bl)包含 SEQ ID NO: 36 的核苷酸 58-387、SEQ ID NO: 46 的核苷酸 58-387、SEQ IDNO: 56 的核苷酸58-387、SEQ ID NO: 66 的核苷酸58-387、SEQ ID NO: 86 的核苷酸58-402或SEQ ID NO: 96的核苷酸58-399的核苷酸序列；
b2)與由與bl)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列；和
b3)在bl)的核苷酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列。有利地，多核苷酸包含:
選自以下的編碼重鏈的核苷酸序列:
al)核苷酸序列:SEQ ID NO: 31、41、51、61、76、91或101中的一個(gè)的序列；
a2)與由與al)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列；和 a3)在al)的核苷酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列；
和
選自以下的編碼輕鏈的核苷酸序列:
bl)包含SEQ ID NO: 36、46、56、66、86或96中的一個(gè)的序列的核昔酸序列；b2)與由與bl)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列；和
b3)在bl)的核苷酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸添加、缺失或添加的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明第九方面，提供包含至少一種本發(fā)明第八方面的多核苷酸的載體。根據(jù)本發(fā)明第十方面，提供包含至少一種本發(fā)明第八方面的多核苷酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明第十一方面，提供包含至少一種本發(fā)明第九方面的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明第十二方面，提供生產(chǎn)本發(fā)明第一或第二方面的抗體的方法，其包括培養(yǎng)本發(fā)明第十或第i^一方面的轉(zhuǎn)化細(xì)胞、收集培養(yǎng)物(culturing materials)和從所述培養(yǎng)物中純化所述抗體的步驟。在本說明書中，兩序列之間的百分?jǐn)?shù)“同一性”采用BLASTP算法2.2.2版(Altschul, Stephen F., Thomas L.Madden, Alejandro A.Schaffer, Jinghui Zhang,Zheng Zhang, Webb Miller 和 David J.Lipman (1997), "Gapped BLAST and PS1-BLAST:a new generation of protein database search programs (空位 BLAST 和 PS1-BLAST:新一代的蛋白數(shù)據(jù)庫搜索程序)〃，Nucleic Acids Res.25:3389-3402)使用默認(rèn)參數(shù)確定。具體而言，可在因特網(wǎng)上使用URL www.ncb1.nlm.nih.gov/blast講入BLAST算法。[本發(fā)明的優(yōu)勢]
根據(jù)本發(fā)明，可獲得用于異常骨代謝的治療和/或預(yù)防劑，其作用機(jī)制為抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟及其活性。[附圖簡述]


圖1 為顯示測量抗體 M0R09281、M0R09892、M0R09898、M0R10110、M0R09012、M0R08656、M0R08662和人IgG (陰性對照)與人涎免凝集素_15_Fc、小鼠涎免凝集素-15_Fc和人Fe結(jié)合的ELISA測定結(jié)果的圖示。圖2為顯示在抗體M0R09281存在時(shí)形成的小鼠破骨細(xì)胞的TRAP活性的圖示。
圖3為顯示在抗體M0R09012 (M0R09892的親本抗體)存在時(shí)形成的小鼠破骨細(xì)胞的TRAP活性的圖示。圖4為顯示在抗體M0R09892存在時(shí)形成的小鼠破骨細(xì)胞的TRAP活性的圖示。圖5為顯示在抗體M0R08656 (M0R09898的親本抗體)存在時(shí)形成的小鼠破骨細(xì)胞的TRAP活性的圖示。圖6為顯示在抗體M0R08662 (M0R10110的親本抗體)存在時(shí)形成的小鼠破骨細(xì)胞的TRAP活性的圖示。圖7為顯示在抗體M0R09898存在時(shí)形成的小鼠破骨細(xì)胞的TRAP活性的圖示。圖8為顯示在抗體M0R10110存在時(shí)形成的小鼠破骨細(xì)胞的TRAP活性的圖示。圖9為顯示從板(plate)釋放膠原片段(其被在抗體M0R09281存在時(shí)培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞降解)的圖示。圖10為顯示從板釋放膠原片段(其被在抗體M0R08656 (M0R09898的親本抗體)存在時(shí)培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞降解)的圖示。圖11為顯示從板釋放膠原片段(其被在抗體M0R09898存在時(shí)培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞降解)的圖示。圖12為顯示從板釋放膠原片段(其被在抗體M0R09012 (M0R09892的親本抗體)和M0R09892存在時(shí)培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞降解)的圖示。圖13為顯示從板釋放膠原片段(其被在抗體M0R08662 (M0R10110的親本抗體)和M0R10110存在時(shí)培養(yǎng)·的人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞降解)的圖示。圖14為編碼抗體M0R08656的重鏈的DNA序列(SEQ ID NO:1)。圖15為抗體M0R08656的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。圖16為編碼抗體M0R08656的輕鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 6)。圖17為抗體M0R08656的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 7)。圖18為編碼抗體M0R08662的重鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 11)。圖19為抗體M0R08662的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)。圖20為編碼抗體M0R08662的輕鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 16)。圖21為抗體M0R08662的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 17)。圖22為編碼抗體M0R09012的重鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 21)。圖23為抗體M0R09012的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 22)。圖24為編碼抗體M0R09012的輕鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 26)。圖25為抗體M0R09012的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 27)。圖26為編碼抗體M0R09281的重鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 31)。圖27為抗體M0R09281的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 32)。圖28為編碼抗體M0R09281的輕鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 36)。圖29為抗體M0R09281的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 37)。圖30為編碼抗體M0R09892的重鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 41)。圖31為抗體M0R09892的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 42)。圖32為編碼抗體M0R09892的輕鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 46)。圖33為抗體M0R09892的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 47)。
圖34為編碼抗體M0R09898的重鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 51)。圖35為抗體M0R09898的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 52)。圖36為編碼抗體M0R09898的輕鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 56)。圖37為抗體M0R09898的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 57)。圖38為編碼抗體M0R10110的重鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 61)。圖39為抗體M0R10110的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 62)。圖40為編碼抗體M0R10110的輕鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 66)。圖41為抗體M0R10110的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 67)。圖42為顯示從板釋放膠原片段(其被在抗體M0R09268存在時(shí)培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞降解)的圖示。圖43為顯示從板釋放膠原片段(其被在抗體M0R12574存在時(shí)培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞降解)的圖示。圖44為顯示從板釋放膠原片段(其被在抗體M0R13154存在時(shí)培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞降解)的圖示。圖45為顯示從板釋放膠原片段(其被在抗體M0R13156存在時(shí)培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞降解)的圖示。圖46 為編碼抗體 M0R09268 和 M0R12574 的重鏈的 DNA 序列(SEQ ID NO: 76)。圖47為抗體M0R09268和M0R12574的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 77)。圖48為編碼抗體M0R09268的輕鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 81)。圖49為抗體M0R09268的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 82)。圖50 為編碼抗體 M0R12574 和 M0R13156 的輕鏈的 DNA 序列(SEQ ID NO: 86)。圖51為抗體M0R12574和M0R13156的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 87)。圖52為編碼抗體M0R13154的重鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 91)。圖53為抗體M0R13154的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 92)。圖54為編碼抗體M0R13154的輕鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 96)。圖55為抗體M0R13154的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 97)。圖56為編碼抗體M0R13156的重鏈的DNA序列(SEQ ID NO: 101)。圖57為抗體M0R13156的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 102)。[用于實(shí)施本發(fā)明的最佳方式]
本文使用的術(shù)語“基因”不僅包括DNA，還包括mRNA、cDNA和cRNA。本文使用的術(shù)語“多核苷酸”以與核酸相同的含義使用，并且亦包括DNA、RNA、探針、寡核苷酸和引物。本文使用的術(shù)語“多肽”和“蛋白”無區(qū)別使用。本文使用的術(shù)語“RNA級分”指包含RNA的級分。本文使用的術(shù)語“細(xì)胞”亦包括動物個(gè)體中的細(xì)胞和培養(yǎng)的細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“涎免凝集素-15”以與涎免凝集素-15蛋白相同的含義使用。 本文使用的術(shù)語“破骨細(xì)胞形成”以與“破骨細(xì)胞分化”或“破骨細(xì)胞成熟”相同的含義使用。

本文使用的術(shù)語“抗體的功能片段”指具有抗原結(jié)合活性的部分抗體片段，并且包括Fab、F(ab’)2、scFv等。該術(shù)語還包括Fab’，其為通過在還原條件下處理F (ab’)2獲得的抗體可變區(qū)的單價(jià)片段。然而，該術(shù)語不限于這些分子，只要該片段具有針對抗原的結(jié)合親和力即可。另外，這些功能片段不僅包括通過用適當(dāng)?shù)拿柑幚砜贵w蛋白的全長分子獲得的片段，還包括在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中使用遺傳修飾的抗體基因生產(chǎn)的蛋白。已經(jīng)知道抗體的重鏈或輕鏈具有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)?；パa(bǔ)決定區(qū)也稱為高變結(jié)構(gòu)域，這些區(qū)域在重鏈或輕鏈可變區(qū)的一級結(jié)構(gòu)中為高變的。這些高變結(jié)構(gòu)域在抗體的重鏈或輕鏈多肽中作為三個(gè)散開的部分存在。在本說明書中，按照從重鏈多肽的氨基末端(N-末端)開始的順序，重鏈的⑶R被稱為⑶RH1XDRH2和⑶RH3。按照從輕鏈多肽的氨基末端開始的順序，輕鏈的⑶R被稱為⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3。在抗體的三級結(jié)構(gòu)中這6個(gè)CDR緊密相鄰并且決定與抗原的結(jié)合特異性。本文使用的短語“在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交”指雜交在以下條件下或在與其相當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行:在這樣的條件下，可通過使用DNA固定于其上的濾膜(filter)在市購的雜交溶液例如ExpressHyb雜交溶液(Clontech, Inc.生產(chǎn))中于68°C進(jìn)行雜交或在0.7-1.0M NaCl存在時(shí)于68°C進(jìn)行雜交，接著使用0.1-2 x SSC溶液(I x SSC由150 mM NaCl和15 mM檸檬酸鈉組成)在68°C進(jìn)行洗滌而實(shí)現(xiàn)鑒定。當(dāng)涉及關(guān)于涎免凝集素-15的抗體而使用術(shù)語“能夠結(jié)合”時(shí)，其意指抗體在生理?xiàng)l件下能夠優(yōu)先結(jié)合涎免凝集素15。在一些實(shí)施方案中，其與術(shù)語“對……特異”同義。因此在一些實(shí)施方案中，抗體對涎免凝集素-15具有比對其它相關(guān)多肽更大的親和力，例如
1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍的更大的親和力。本文使用的術(shù)語“數(shù)個(gè)”在一些實(shí)施方案中意指2-4的數(shù)值。1.涎免凝集素-15
若涎免凝集素-15作為免疫原使用，可從人、非人哺乳動物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔、豬、綿羊、牛或猴)或 雞的單核細(xì)胞或骨髓細(xì)胞直接純化和使用，或可制備并且可使用上述細(xì)胞的細(xì)胞膜級分。此外，涎免凝集素-15可通過其體外合成獲得或通過其經(jīng)由基因工程在宿主細(xì)胞中的生產(chǎn)獲得。在這樣的基因工程中，更具體地，將涎免凝集素-15 cDNA整合到能夠表達(dá)涎免凝集素-15 cDNA的載體中，并且在包含酶、底物以及轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的能量物質(zhì)的溶液中合成涎免凝集素-15，或轉(zhuǎn)化另一種原核或真核宿主細(xì)胞以表達(dá)涎免凝集素-15，借此獲得蛋白。人涎免凝集素-15 cDNA的核苷酸序列已經(jīng)以登記號NM_213602在GenBank中登記。小鼠涎免凝集素-15 cDNA的核苷酸序列已經(jīng)以登記號XM_884636在GenBank中登記。2.抗涎免凝集素-15抗體
抗體的一般結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?，在此處將僅簡要概述。免疫球蛋白單體包括通過二硫鍵連接的兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈與一條輕鏈配對，其通過二硫鍵直接與該輕鏈鍵合。每條重鏈包括恒定區(qū)(取決于抗體的同種型而不同)和可變區(qū)。可變區(qū)包含三個(gè)高變區(qū)(或互補(bǔ)決定區(qū))，其被命名為⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3，并且被支撐在框架區(qū)內(nèi)。每條輕鏈包括恒定區(qū)和可變區(qū)，其中可變區(qū)包含被框架區(qū)以與重鏈可變區(qū)類似的方式支撐的三個(gè)高變區(qū)(命名為⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3)。每對重鏈和輕鏈的高變區(qū)互相協(xié)作以提供能夠結(jié)合靶抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)。一對重鏈和輕鏈的結(jié)合特異性由重鏈和輕鏈的⑶RU⑶R2和⑶R3序列確定。因此一旦確定產(chǎn)生特定的結(jié)合特異性的一組⑶R序列(即，重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3序列)，原則上可將該組⑶R序列插入到與任何抗體恒定區(qū)連接的任何其它抗體構(gòu)架區(qū)內(nèi)的適當(dāng)位點(diǎn)，以提供具有相同抗原結(jié)合特異性的不同抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供抗體M0R09281、M0R09892、M0R09898、M0R10110、M0R12574、M0R13154和M0R13156，其氨基酸序列的詳情在表4-7和10-12中闡述。然而，本發(fā)明不限于這些優(yōu)選抗體。一般而言，在本發(fā)明抗涎免凝集素-15抗體中，重鏈和輕鏈的⑶Rl和⑶R2序列與SEQ ID NO: 71-74中所示共有序列一致?；蛘?，重鏈的⑶Rl和⑶R2序列的序列可與SEQID NO: 106和107中所示共有序列一致；輕鏈的⑶R2序列的序列可與SEQ ID NO: 108 —致且輕鏈的⑶Rl序列的序列可與SEQ ID NO: 73或83—致。輕鏈的⑶R3序列的序列可與SEQ ID NO: 109中所示共有序列一致。特別優(yōu)選地是，抗體具有與SEQ ID NO: 109的共有序列一致的輕鏈⑶R3序列并且重鏈的⑶R3序列具有SEQ ID NO: 80的序列。來自本發(fā)明一些優(yōu)選抗體(M0R09281、M0R09892、M0R09898和 M0R10110)的具體CDR1、CDR2和CDR3序列在表8中示出。來自本發(fā)明其它優(yōu)選抗體(M0R12574、M0R13154和M0R13156)的具體⑶R1XDR2和⑶R3序列在表13中示出。因此提供包含具有來自這些優(yōu)選抗體的序列的CDR1-3的抗體。然而，由于本發(fā)明優(yōu)選抗體序列之間有高水平的序列同一性，提供具有來自不同優(yōu)選抗體的CDR序列的抗體也在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，可提供抗體，其包含具有M0R09281的CDR1、M0R09892的CDR2和M0R09898的CDR3序列的重鏈和具有M0R10110 的 CDR1、M0R09281 的 CDR2 和 M0R09892 的 CDR3 序列的輕鏈。還應(yīng)理解的是，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，⑶R1-3的氨基酸序列與表8和13中提供的那些序列不同，但仍保留與其至少80% (或，在一些實(shí)施方案中，至少90%或95%)的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，一種抗體的CDR中一個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基與另一抗體的相同CDR中的相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸殘基交換。例如，可提供包含這樣的重鏈的抗體:其中CDRl序列包含氨基酸序列NYAMS (SEQ ID N0.75)，即M0R09281的重鏈的⑶Rl序列，其第3位的氨基酸被M0R09892的重鏈的⑶Rl的第3位氨基酸取代。在其它實(shí)施方案中，⑶R中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸取代。在同一家族氨基酸內(nèi)的取代的意義上，取代可為“保守的”。天然存在的氨基酸可被分為下列四個(gè)家族，保守取代將在這些家族內(nèi)發(fā)生。1)具有堿性側(cè)鏈的氨基酸:賴氨酸、精氨酸、組氨酸。2)具有酸性側(cè)鏈的氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸。3)具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸:天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。4)具有非極性側(cè)鏈的氨基酸:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸。在又另外的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被添加到抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR中或從一個(gè)或多個(gè)CDR中缺失。這樣的添加或缺失在CDR的N或C末端或在CDR內(nèi)的位點(diǎn)發(fā)生。通過氨基酸的添加、缺失或取代來改變抗體CDR的氨基酸序列，可獲得不同的效果，例如增加對靶抗原的結(jié)合親和力或減少聚集。
應(yīng)理解的是，包含這樣變化的CDR序列的本發(fā)明抗體仍結(jié)合涎免凝集素-15并抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨細(xì)胞骨吸收。這可通過本文實(shí)施例5和6公開的結(jié)合測定和生物學(xué)活性測定來測試?？贵w的恒定區(qū)也可與針對抗體M0R09281、M0R09892、M0R09898、M0R10110、M0R12574、M0R13154和M0R13156所明確公開的那些恒定區(qū)不同。例如，可提供具有任何同種型(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的Fe區(qū)域的抗體。優(yōu)選地是,抗體為人抗體。抗體、其制造和用途是眾所周知的，并公開于例如Harlow, E.和Lane, D.,Antibodies: A Laboratory Manual (抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊),Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999。可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生抗體?？贵w的實(shí)例包括(但不限于)單克隆抗體、單鏈抗體和抗體的功能片段?？贵w的“功能片段”包括能夠結(jié)合靶抗原的任何抗體片段，因此包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段和Fv片段。抗體可在一系列宿主，例如山羊、兔子、大鼠、小鼠、人等中生產(chǎn)?？赏ㄟ^注射具有免疫原性的靶抗原(在本發(fā)明中為涎免凝集素-15)或其片段或寡肽對其進(jìn)行免疫。根據(jù)宿主種類，可使用不同的佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)。這樣的佐劑包括，但不限于，弗氏佐劑(Freund’S)、礦物凝膠例如氫氧化鋁、和表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇(pluronic polyols)、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔 Ji我血藍(lán)蛋白和二硝基苯酹。在用于人的佐劑中，BCG (卡介苗(Bacille Calmette-Guerin))和短棒狀桿菌{Corynebacterium parvum)為 特別有用的?？瓜衙饽?15的單克隆抗體可使用提供抗體分子生產(chǎn)(通過培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系)的任何技術(shù)制備。這些包括，但不限于，雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Koehler 等，1975，Nature, 256: 495-497; Kosbor 等，1983，Immunol.Today 4: 72; Cote 等，1983，PNAS USA, 80: 2026-2030; Cole 等，1985，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy (單克降抗.體與癌癥治療),Alan R.Liss Inc., NewYork,第 77-96 頁)?；蛘?，可使用用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)。單鏈抗體(ScFv)包括由連接肽(通常約5-25個(gè)氨基酸長)連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。scFv可使用重組技術(shù)，例如通過在宿主生物例如大腸桿菌疋.coli)中表達(dá)編碼scFv的載體合成。 抗體還可通過在淋巴細(xì)胞群體中體內(nèi)誘導(dǎo)生產(chǎn)或通過篩選重組免疫球蛋白文庫或高特異性結(jié)合試劑組而生產(chǎn)(Orlandi等，1989，PNAS USA, 86: 3833-3837; Winter,G.等，1991，Nature, M9: 293-299)。還可產(chǎn)生抗原結(jié)合片段，例如可通過胃蛋白酶消化抗體分子生產(chǎn)的F(ab’)2片段和可通過還原F (ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段?；蛘?，可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫以允許快速和容易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段(Huse等，1989，Science, 256:1275-1281)。多種免疫測定可用于篩查以鑒定具有所需特異性的抗體。用于使用具有確定的特異性的多克隆或單克隆抗體的競爭結(jié)合或免疫放射測定的很多實(shí)驗(yàn)方案為本領(lǐng)域所熟知。這樣的免疫測定通常涉及測量涎免凝集素-15或其任何片段或寡肽與其特異性抗體之間的復(fù)合體形成?？墒褂美脤蓚€(gè)互不干擾的涎免凝集素-15表位特異的單克隆抗體的雙位點(diǎn)的、基于單克隆的免疫測定，但亦可使用競爭結(jié)合測定(Maddox等，1983，J.Exp.Med., 158: 1211-1216)。3.包含抗涎免凝集素-15抗體的藥物
上述條目“2.抗涎免凝集素-15抗體”中所述的抗涎免凝集素-15抗體中和涎免凝集素-15的生物學(xué)活性。所述中和涎免凝集素-15的生物學(xué)活性的抗體抑制體內(nèi)涎免凝集素-15的生物學(xué)活性(即，破骨細(xì)胞的分化和/或成熟)，因此可用作由破骨細(xì)胞異常分化和/或成熟導(dǎo)致的異常骨代謝的治療和/或預(yù)防劑。異常骨代謝可為以凈骨丟失(骨質(zhì)減少或骨質(zhì)溶解)為特征的任何病癥。一般而言，抗涎免凝集素-15抗體的治療和/或預(yù)防作用在需要抑制骨吸收的情況下應(yīng)用?？捎每瓜衙饽?15抗體治療和/或預(yù)防的異常骨代謝的實(shí)例包括骨質(zhì)疏松癥(絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由于使用治療劑例如類固醇或免疫抑制劑而引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥)、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌癥骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、牙周炎引起的牙喪失、假關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、佩吉特氏骨病、腎性骨營養(yǎng)不良和成骨不全癥。然而，異常骨代謝不限于這些實(shí)例，只要其為伴隨由破骨細(xì)胞導(dǎo)致的凈骨丟失的疾病即可。抗涎免凝集素-15抗體中和涎免凝集素-15生物學(xué)活性的體外活性可通過例如抑制過表達(dá)涎免凝集素-15的細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的活性來測定。例如，將不同濃度的抗涎免凝集素-15抗體加入小鼠單核細(xì)胞衍生細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞或Raw 264細(xì)胞，可測定通過用RANKL或TNF-α刺激而抑制分化為破骨細(xì)胞的活性。在另一實(shí)施例中，將不同濃度的抗涎免凝集素-15抗體加入骨髓來源的原代培養(yǎng)細(xì)胞中，可測定通過用RANKL、TNF-a或活性維生素D3刺激而抑制分化為破骨細(xì)胞的活性。在另一實(shí)施例中，將不同濃度的抗涎免凝集素-15抗體加入正常的人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(正常的人天然破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，可自 Sanko Junyaku C0.，Ltd.，Cat.N0.2T-110 獲得)，可測定通過用 RANKL 或 M-CSF 刺激而抑制分化為破骨細(xì)胞的活性。對破骨細(xì)胞分化的此種抑制作用可通過使用破骨細(xì)胞的抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(TRAP)活性的`抑制作為指標(biāo)進(jìn)行測定。在另一實(shí)施例中，對破骨細(xì)胞分化的抑制作用還可通過使用對TRAP陽性多核破骨細(xì)胞形成的抑制即對破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合的抑制作為指標(biāo)進(jìn)行測定。在另一實(shí)施例中，在使用股骨和/或脛骨來源的細(xì)胞的坑測定(pit assay)實(shí)驗(yàn)中(Takada 等，Bone and Mineral (骨和礦物質(zhì))，(1992)17，347-359)，抑制破骨細(xì)胞骨吸收的體外活性可通過將不同濃度的抗涎免凝集素-15抗體加入股骨和/或脛骨來源的細(xì)胞中并觀察牙質(zhì)片(dentine slice)上的坑形成來測定。作為用于測定抑制破骨細(xì)胞骨吸收的體外活性的系統(tǒng)，還可使用用綴合銪的人膠原包被的板。抗涎免凝集素-15抗體對實(shí)驗(yàn)動物中異常骨代謝的體內(nèi)治療或預(yù)防作用可通過給予骨質(zhì)疏松癥模型動物或過表達(dá)涎免凝集素-15的轉(zhuǎn)基因動物抗涎免凝集素-15抗體并測量破骨細(xì)胞的變化來確認(rèn)。上述中和涎免凝集素-15生物學(xué)活性的抗體可用作藥物，特別是用作用于治療或預(yù)防異常骨代謝例如骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞或伴隨癌癥骨轉(zhuǎn)移的骨破壞的藥物組合物，或用作用于這類疾病的免疫診斷的抗體。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的治療中，主要問題為伴隨該疾病發(fā)生的骨丟失。已經(jīng)報(bào)道在這樣的伴隨RA的骨丟失中，破骨細(xì)胞發(fā)揮主要作用。認(rèn)為在RA中對破骨細(xì)胞誘導(dǎo)(分化和成熟)和激活以及導(dǎo)致骨破壞最重要的細(xì)胞因子為RANKL和TNF- a (Romas E.等，Bone 30,第 340-346 頁，2002)。RANKL 的誘餌受體(decoy receptor) 0CIF/0PG 可抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成但不抑制TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。另一方面，本發(fā)明的抗涎免凝集素-15抗體有效抑制由RANKL和TNF- α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。因此，預(yù)期本發(fā)明的抗涎免凝集素-15抗體可比RANKL阻滯物(0CIF/0PG、抗RANKL抗體等)更有力地抑制在RA等中由TNF- α誘導(dǎo)的骨丟失和骨破壞。作為一個(gè)實(shí)施例，對于異常骨代謝的治療或預(yù)防，抗涎免凝集素-15抗體單獨(dú)給予或與至少一種其它用于骨相關(guān)疾病的治療劑一起給予。作為另一個(gè)實(shí)施例，抗涎免凝集素-15抗體可與在治療上有效量的用于異常骨代謝的治療劑一起給予?？瓜衙饽?15抗體和治療劑可同時(shí)、分別或序貫給予。可與抗涎免凝集素-15抗體一起給予的治療劑的實(shí)例包括，但不限于，二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素制劑例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺素)制劑、非留體抗炎劑、可溶性TNF受體制劑、抗TNF-α抗體或該抗體的功能片段、抗PTHrP (甲狀旁腺素相關(guān)蛋白)抗體或該抗體的功能片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體的功能片段、抗RANKL抗體或該抗體的功能片段和OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子)。在另一個(gè)實(shí)施例中，治療劑為另一種不同的本發(fā)明的抗涎免凝集素-15抗體。也就是說，給予兩種不同的本發(fā)明的抗涎免凝集素-15抗體。根據(jù)異常骨代謝的狀態(tài)或預(yù)期的治療和/或預(yù)防程度，可給予兩種或三種或更多類型的治療劑，并且這些治療劑可通過將其封裝入同一制劑中一起提供。這些治療劑和抗涎免凝集素-15抗體可通過將其封裝入同一制劑中一起提供。此外，這些治療劑可通過將其封裝為用于治療和/或預(yù)防的藥盒一起提供。此外，這些治療劑和抗涎免凝集素-15抗體可分別提供。在基因治療中給藥的情況下，用于骨疾病的蛋白質(zhì)性治療劑的基因和抗涎免凝集素-15抗體的基因可插入同一啟動子區(qū)域或不同啟動子區(qū)域的下游，且可引入同一載體或不同載體中。通過將用于骨疾病的治療劑與抗涎免凝集素-15抗體或其片段綴合，可生產(chǎn)如M.C.Garnet “Targeted drug conjugates: principles and progress (祀向藥物綴合物:原理和進(jìn)展)”，Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216 中所述的靶向藥物綴合物。為達(dá)到該目的，除抗體分子外，可應(yīng)用任何抗體片段，只要其未完全喪失識別破骨細(xì)胞的能力即可，其實(shí)例包括片段例如Fab、F(ab’)2和Fv。在本發(fā)明中，抗體和片段可以以相同的方式使用?？瓜衙饽?15抗體或其片段與用于骨疾病的治療劑形成的綴合物可為以下文獻(xiàn)中所述多種形式中的任何一種:M.C.Garnet “Targeted drugconjugates: principles and progress (祀向藥物綴合物:原理和進(jìn)展)”，AdvancedDrug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216， G.T.Hermanson “BioconjugateTechniques (生物綴合技術(shù))” Academic Press, California (1996), Putnam and J.Kopecek “Polymer Conjugates with Anticancer Activity (具抗癌活性的多聚體綴合物)” Advances in Polymer S cience (1995) 122, 55-123等。即，可例不其中抗誕免凝集素-15抗體與用于骨疾病的治療劑直接或通過間隔子(spacer)例如寡肽而彼此化學(xué)綴合的綴合物形式和通過適當(dāng)?shù)乃幬镙d體形成的綴合物。藥物載體的實(shí)例包括脂質(zhì)體和水溶性多聚體。通過這樣的藥物載體形成的綴合物的更具體的實(shí)例包括其中抗體與用于骨疾病的治療劑摻入到脂質(zhì)體中且脂質(zhì)體與抗體彼此綴合的綴合物形式，和其中用于骨疾病的治療劑與水溶性多聚體(具有約1000-100000的分子量的化合物)直接或通過間隔子例如寡肽而化學(xué)綴合且抗體與水溶性多聚體綴合的綴合物形式?？贵w(或其片段)與用于骨疾病的治療劑或藥物載體例如脂質(zhì)體或水溶性多聚體的綴合可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法例如 G.T.Hermanson “Bioconjugate Techniques (生物綴合技術(shù))” Academic Press,California (1996), Putnam 和 J.Kopecek “Polymer Conjugates with AnticancerActivity (具抗癌活性的多聚體綴合物)” Advances in Polymer Science (1995) 122,55-123中所述的方法實(shí)現(xiàn)。用于骨疾病的治療劑摻入到脂質(zhì)體中可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法例如D.D.Lasic “Liposomes: From Physics to Applications (脂質(zhì)體:從物理學(xué)到應(yīng)用)” Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1993)等中所述的方法實(shí)現(xiàn)。用于骨疾病的治療劑與水溶性多聚體相綴合可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法例如 D.Putnan^PJ.Kopecek “Polymer Conjugates with Anticancer Activity (具抗癌活性的多聚體綴合物)” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123中所述的方法實(shí)現(xiàn)。除上述方法外，抗體(或其片段)與用于骨疾病的蛋白質(zhì)性治療劑(或其片段)的綴合物可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過基因工程生產(chǎn)。本發(fā)明還提供包含在治療上和/或在預(yù)防上有效量的抗涎免凝集素-15抗體和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的藥物組合物。本發(fā)明還提供藥物組合物，所述藥物組合物包含在治療上和/或在預(yù)防上有效量的抗涎免凝集素-15抗體、至少一種在治療上和/或在預(yù)防上有效量的用于骨疾病的治療劑和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。用于骨疾病的治療劑的實(shí)例包括，但不限于，二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素制劑例如雌二醇、SERM (選擇性雌激 素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH(甲狀旁腺素)制劑、非留體抗炎劑、可溶性TNF受體制劑、抗TNF-α抗體或該抗體的功能片段、抗PTHrP (甲狀旁腺素相關(guān)蛋白)抗體或該抗體的功能片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體的功能片段、抗RANKL抗體或該抗體的功能片段和OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子)。在另一個(gè)實(shí)施例中，治療劑為另一種不同的本發(fā)明的抗涎免凝集素-15抗體。即藥物組合物包含兩種不同的本發(fā)明的抗涎免凝集素-15抗體。就劑量和濃度而言，本發(fā)明藥物組合物可接受的制劑中使用的物質(zhì)優(yōu)選對給予該藥物組合物的人是無毒的。本發(fā)明藥物組合物可包含用于藥學(xué)用途的能夠改變或維持藥物組合物或其組分的pH、滲透壓、粘度、透明度、顏色、等滲性、顏色、無菌條件、穩(wěn)定性、溶解度、釋放速率、吸收速率或通透性的物質(zhì)。用于藥學(xué)用途的物質(zhì)的實(shí)例包括，但不限于:氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和賴氨酸；抗微生物劑；抗氧化劑例如抗壞血酸、硫酸鈉和亞硫酸氫鈉；緩沖液例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽緩沖液、碳酸氫鹽和Tris-HCl溶液；填充劑例如甘露醇和甘氨酸；螯合劑例如乙二胺四乙酸鹽(EDTA);絡(luò)合劑例如咖啡因、聚乙烯基批咯燒、β -環(huán)糊精和輕丙基-β -環(huán)糊精；膨脹劑(expander)例如葡萄糖、甘露糖和糊精；其它碳水化合物例如單糖和二糖；著色劑；調(diào)味劑；稀釋劑；乳化劑；親水多聚體例如聚乙烯基批咯燒；防腐劑例如低分子量多肽、形成堿的反荷離子(base formingcounter ion)、苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸鹽、水楊酸、硫柳萊、苯乙醇、對輕基苯甲酸甲酯、對輕基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸和過氧化氫；溶劑例如甘油、丙二醇、聚乙二醇；糖醇例如甘露醇和山梨醇；懸浮劑；表面活性劑例如脫水山梨醇酯、聚山梨酯包括聚山梨酯20和聚山梨酯80、Triton、氨基丁三醇、卵磷脂和膽固醇；穩(wěn)定性增強(qiáng)劑例如蔗糖和山梨醇；彈性增強(qiáng)劑例如氯化鈉、氯化鉀和甘露醇和山梨醇；運(yùn)輸劑(transport agent);稀釋劑；賦形劑和/或藥用佐劑。用于藥學(xué)用途的這些物質(zhì)的添加量優(yōu)選為抗涎免凝集素-15抗體重量的0.01-100倍，特別優(yōu)選0.1-10倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)應(yīng)用的疾病、應(yīng)用的給予途徑等適當(dāng)確定制劑中藥物組合物的優(yōu)選劑型。藥物組合物中的賦形劑或載體可為液體或固體形式。適當(dāng)?shù)馁x形劑或載體可為注射用水、生理鹽水、人造腦脊液或其它通常用于胃腸外給予的物質(zhì)。另外，中性生理鹽水或包含血清白蛋白的生理鹽水也可用作載體。藥物組合物可包含pH 7.0-8.5的Tris緩沖液或pH 4.0-5.5的醋酸鹽緩沖液(可添加山梨醇或其他化合物)。本發(fā)明的藥物組合物的實(shí)例包括包含抗涎免凝集素-15抗體的藥物組合物和包含抗涎免凝集素-15抗體和至少一種用于骨疾病的治療劑的藥物組合物。本發(fā)明藥物組合物以凍干產(chǎn)品或液體的形式制備為具有所選組成和所需純度的藥劑。還可使用適當(dāng)?shù)馁x形劑例如蔗糖使包含抗涎免凝集素-15抗體的藥物組合物和包含抗涎免凝集素-15和至少一種用于異常骨代謝的治療劑的藥物組合物形成凍干產(chǎn)品。本發(fā)明的藥物組合物可制備為用于胃腸外給予或用于通過口服給予胃腸吸收。可根據(jù)給予方法確定制劑的組成和濃度。至這樣的程度:本發(fā)明的藥物組合物所包含的抗涎免凝集素-15抗體對涎免凝集素-15的親和力較高，即，由于對涎免凝集素-15的解離常數(shù)(Kd值)較低，抗涎免凝集素-15抗體可在較低劑量顯示其對人的藥物功效，因此，也可基于該結(jié)果確定本發(fā)明的藥物組合物用于人的劑量。對于劑量，在將人抗涎免凝集素-15抗體給予人的情況下，該抗體可以以每1-180天一次約0.1-100 mg/kg的劑量給予。

本發(fā)明的藥物組合物的劑型的實(shí)例包括注射劑、浸劑、栓劑、透鼻劑、舌下劑和經(jīng)皮吸收劑。4.本發(fā)明其它產(chǎn)品
還提供包含編碼在上述條目“2.抗涎免凝集素-15抗體”中所述的抗涎免凝集素-15抗體的序列的多核苷酸。編碼優(yōu)選抗體(M0R09281、M0R09892、M0R09898、M0R10110、M0R12574、MORl3154和M0R13156)的核苷酸序列的詳情在表4_7和10-12中提供。然而，應(yīng)理解的是本發(fā)明多核苷酸不限于表4-7和10-12中所示的多核苷酸。具體而言，如上述條目2中所說明的，本發(fā)明的抗涎免凝集素-15抗體包括包含來自不同優(yōu)選抗體的CDR的抗體，且還包括包含含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失或取代的CDR的抗體。本發(fā)明的多核苷酸包括編碼這樣的抗體的多核苷酸。此外，由于核酸密碼的簡并性，除表4-7和10-12所示的核苷酸序列外的核苷酸序列也編碼相同的氨基酸序列。還提供多核苷酸，其包含與由與編碼上述條目2中所述抗體中的一個(gè)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列。在這點(diǎn)上，短語“雜交在嚴(yán)格條件下進(jìn)行”如上所定義。多核苷酸可還包含其它核苷酸序列，例如啟動子和/或其它表達(dá)調(diào)控序列、編碼多腺苷酸化尾巴的序列、最小非翻譯區(qū)域和Kozak共有序列。在一些實(shí)施方案中，提供包含這樣的多核苷酸的載體。示例性載體包括質(zhì)粒、粘粒和病毒載體，包括噬菌體。除多核苷酸本身外，這些載體還可包含序列例如復(fù)制起點(diǎn)、遺傳標(biāo)記、抗生素抗性基因、COS位點(diǎn)、克隆位點(diǎn)和靶序列。在許多實(shí)施方案中，載體包含足夠的元件以在宿主細(xì)胞中復(fù)制并在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼抗涎免凝集素-15抗體的多核苷酸序列。因此在另外的實(shí)施方案中，提供包含上述多核苷酸(例如摻入到細(xì)胞的基因組中)或包含上述載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌和真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞或人細(xì)胞系。這樣的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可用于通過培養(yǎng)細(xì)胞、表達(dá)編碼抗體的核苷酸序列然后從培養(yǎng)基中純化抗體來合成本發(fā)明的涎免凝集素-15抗體。[實(shí)施例]
后文中，將參考實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明，然而，本發(fā)明并不限于此。注意在下列的實(shí)施例中關(guān)于基因操縱的各個(gè)操作按照"Molecular Cloning (分子克隆)"(Sambrook,J., Fritsch, E.F.和Maniatis, T.著，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年出版)中所述的方法進(jìn)行，或在使用可市售獲得的試劑或試劑盒情況下，按照其中附帶的方案進(jìn)行。

實(shí)施例1 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
人胚腎(HEK) 293FreeStyle 細(xì)胞在 Freestyle 293 培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)。對于細(xì)胞淘選，根據(jù)供應(yīng)商的說明書使用293fectin (Invitrogen)用質(zhì)粒DNA例如質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)/人涎免凝集素-15 (編碼人涎免凝集素_15，登記號，Q6ZMC9)、質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)/小鼠涎免凝集素-15 (編碼小鼠涎免凝集素-15，登記號，NP_001094508)或pcDNA3.1 (+)轉(zhuǎn)染 HEK 293FreeStyle 細(xì)胞。培養(yǎng) 2 天后收集轉(zhuǎn)染的 HEK 293FreeStyle 細(xì)胞用于進(jìn)一步的細(xì)胞淘選。重組人涎免凝集素-15-Fc和小鼠涎免凝集素-15-Fc制劑
可溶性人涎免凝集素-15/phIgFc的表達(dá)載體通過Gateway技術(shù)(Invitrogen)構(gòu)建。通過PCR擴(kuò)增編碼人涎免凝集素-15胞外結(jié)構(gòu)域(登記號，Q6ZMC9，l-260)的DNA片段以將入門克隆(entry clone)構(gòu)建到pDN0R221 (Invitrogen)中。然后,在該入門克隆與包含編碼人Fe序列的目的載體之間進(jìn)行LR反應(yīng)。所構(gòu)建的質(zhì)粒中的人涎免凝集素-15-Fc的DNA序列通過DNA序列分析確認(rèn)。人涎免凝集素-15-Fc在含有可溶性人涎免凝集素-15/PhIgFc表達(dá)載體的HEK 293FreeStyleTM中瞬時(shí)表達(dá)。將表達(dá)可溶性人涎免凝集素-15_Fc的 HEK 293FreeStyle 細(xì)胞的 1.5 L 培養(yǎng)液通過 Sterivex-GV 濾器(Millipore)過濾，然后將濾液上樣到預(yù)先用Dulbecco’ s PBS (D-PBS, Invitrogen, Inc.生產(chǎn))平衡好的HiTrap蛋白A柱(Amersham Biosciences)。用0.1 M朽1檬酸鈉緩沖液(pH 3.0)洗脫人涎免凝集素-15-Fc并用I M Tris中和。將2.5 ml等分部分的人涎免凝集素_15_Fc流分上樣到預(yù)先用包含50 mM鹽酸精氨酸的磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.0，Α-PBS)平衡的I3D-1O脫鹽柱(Amersham Biosciences),接著用A-PBS洗脫,借此獲得其溶劑被A-PBS替換的3.5 ml樣品。通過上述程序制備的樣品在_80°C冷藏保存直至使用?？扇苄孕∈笙衙饽?15/phIgFc的表達(dá)載體通過Gateway技術(shù)(Invitrogen)構(gòu)建。通過PCR擴(kuò)增編碼小鼠涎免凝集素-15胞外結(jié)構(gòu)域(登記號，NP_001094508，1-258)的DNA片段以將入門克隆構(gòu)建到pDN0R221 (Invitrogen)中。然后，在該入門克隆與包含編碼人Fe序列的目的載體之間進(jìn)行LR反應(yīng)。在所構(gòu)建的質(zhì)粒中小鼠涎免凝集素-15-Fc的DNA序列通過DNA序列分析確認(rèn)。小鼠涎免凝集素-15-Fc在含有可溶性小鼠涎免凝集素-15/phIgFc的表達(dá)載體的HEK 293FreeStyleTM中瞬時(shí)表達(dá)。將表達(dá)小鼠涎免凝集素-15-Fc 的 HEK 293FreeStyle 細(xì)胞的 1.8 L 培養(yǎng)液通過 Sterivex-GV 濾器(Millipore)過濾，然后將濾液上樣到預(yù)先用Dulbecco’s PBS (D-PBS,, Invitrogen)平衡的HiTrap蛋白A柱(Amersham Biosciences)。用0.1 M朽1檬酸鈉緩沖液(pH 3.0)洗脫小鼠涎免凝集素-15-Fc并用I M Tris中和。使用離心膜濃縮器Amicon Ultra-15 (Millipore)將收集的小鼠涎免凝集素-15-Fc流分濃縮至2.5 ml ο用含有0.01% Tween-20的感染用Otsuka生理鹽水(Otsuka Pharmaceutical)更換緩沖液。樣品在_80°C冷藏保存直至使用?？贵w從HuCAL GOLD文庫的產(chǎn)生 A.嗤囷體展不文庫
對于抗人涎免凝集素-15的治療性抗體的產(chǎn)生，用MorphoSys HuCAL GOLD噬菌體展示文庫進(jìn)行篩選。HuCAL GOLD 為基于HuCAL 概念的Fab文庫(Knappik等(J.Mol.Biol.,296, 57-86,.2000) ; Krebs 等，J.1mmunol.Methods, 254, 67-84，2001; Rothe等，J.Mol.Biol., 376(4):1182-200, 2008)，其中所有六個(gè)CDR為多樣化的，且其使用CysDisplay 技術(shù)將Fab片段與噬菌體表面連接(WO 01/05950)。B.對 HuCAL GOLD 的淘選
如下分離M0R09012、M0R08656和M0R08662。為了篩選，用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)/人涎免凝集素-15或質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) /小鼠涎免凝集素-15的HEK 293FreeStyle 細(xì)胞使用293 fectin (Invitrogen)對HuCAL GOLD 抗體文庫進(jìn)行全細(xì)胞淘選,隨后進(jìn)行pH洗脫和涎免凝集素-15陰性HEK 293FreeStyle 細(xì)胞的吸附后步驟，以耗盡無關(guān)的抗體_噬菌體。最后，用剩余的抗體噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞，然后將該細(xì)胞平鋪于瓊脂板上并孵育過夜。第二天，將細(xì)菌克隆從平·板刮下，拯救曬菌體并擴(kuò)增。在96-孔Max1-sorp板(Nunc, clear)上使用由山羊抗人Fe抗體捕獲的重組人涎免凝集素-15-Fc (Jackson Immuno Research,cat.N0.109-005-098)對HuCAL GOLD 抗體文庫進(jìn)行捕獲淘選。為了除去人Fe和山羊IgG結(jié)合劑，將人 IgG (Jackson Tmmuno Research, cat N0.009-000-003)和山羊 IgG (JacksonTmmuno Research, cat N0.005-000-003)加入到選定的溶液中。用 Tween-20/ PBS和 PBS洗滌后，洗脫所結(jié)合的噬菌體。用洗脫的噬菌體感染對數(shù)中期的大腸桿菌細(xì)胞并鋪于添加葡萄糖和氯霉素的LB-瓊脂板(LB-CG)上。過夜孵育后，將克隆刮下，保持在含有15%甘油的LB-CG中。將M0R09281如下分離。為獲得親和力改善的Fab，對自固相Fe捕獲和差異全細(xì)胞淘選(differential whole cell pannings)得到的卩遼菌體針對IXDR3多樣化進(jìn)行篩選，隨后進(jìn)行另外的篩選循環(huán)。將所有淘選策略的輸出在初級ELISA中對重組人涎免凝集素15-hFc進(jìn)行篩查。陽性克隆經(jīng)受二級ELISA和FACS篩查。將所選克隆合并并純化。C.HuCAL GOLD Fab抗體在大腸桿菌中的微表達(dá)
由pM0RPH x23_Fab編碼的Fab片段在大腸桿菌中的微表達(dá)(micro expression)在圓底96孔培養(yǎng)板(Corning)中進(jìn)行。將大腸桿菌克隆接種到培養(yǎng)基中。孵育培養(yǎng)板直至培養(yǎng)物變得輕微渾濁。然后，加入額外的培養(yǎng)基。培養(yǎng)板進(jìn)一步孵育過夜。第二天，向培養(yǎng)板的各孔中加入包含2.5 mg/ml溶菌酶(Roche)的BEL緩沖液(蛋白酶抑制劑混合物(Roche，cat N0.11873580001))并搖動培養(yǎng)板。大腸桿菌裂解后，加入脫脂牛奶/TBS (TakaraBio)溶液，并進(jìn)一步搖動培養(yǎng)板。制備的大腸桿菌裂解物用于人涎免凝集素-15結(jié)合劑的ELISA篩查。D.涎免凝集素-15結(jié)合劑的ELISA篩查
96-孔MaxiSorp 微量滴定板(Nunc)的各孔用1.25 μ g/ml山羊抗人Fe抗體(JacksonImmuno Research, cat N0.109-005-098)包被過夜。第二天，用PBS洗滌后微量滴定板用脫脂牛奶/PBS封閉。用PBS洗滌后，向微量滴定板中加入I μ g/ml重組人涎免凝集素-15-Fc。各孔用Tween-20/Tris緩沖鹽水(Takara Bio, (TBST))洗滌三次，然后加入如上所述的大腸桿菌裂解物。輕輕搖動板，然后用TBST洗滌。然后，用TBST稀釋堿性磷酸酶綴合的抗人 Fab (Jackson Tmmuno Research, Cat N0.109-035-097)并加入板中。輕輕搖動板，然后用TBST洗漆。通過Attophos Substrate Set (Roche)檢測結(jié)合,用板讀數(shù)器(分子器件，SpectraMax M5)測量熒光(激發(fā):440 nm ;發(fā)射:550 nm)。[實(shí)施例2]
HuCAL IgG2的構(gòu)建、表達(dá)和純化 A.1gG2的轉(zhuǎn)變 為了表達(dá)全長IgG，將重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變結(jié)構(gòu)域片段從pMORPH/9 Fab表達(dá)載體亞克隆至用于IgG2的適當(dāng)pMOPRH^JuIg載體。使用限制酶#辦1和財(cái)將VH結(jié)構(gòu)域片段亞克隆至pM0RP!f2_h_IgG2中，使用&oRV和fciWI將VL結(jié)構(gòu)域片段亞克隆至pM0RP!f2_h_Ig κ中，使用&oRV和Hpal將VL結(jié)構(gòu)域片段亞克隆至pM0RP!f2_h_Ig λ 2中。連接、轉(zhuǎn)化和制備DNA后，所得IgG表達(dá)質(zhì)粒通過限制性分析和測序表征。B.人IgG2的瞬時(shí)表達(dá)和純化。用等量的IgG重鏈和輕鏈表達(dá)載體(pMORPH^)轉(zhuǎn)染真核HKBll細(xì)胞。通常在轉(zhuǎn)染后3-7天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。無菌過濾后，對該溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白A親和色譜(MabSelectSURE, GE Healthcare)。如果沒有另外說明，將緩沖液更換成I X Dulbecco’ s PBS (pH7.2，Invitrogen)或檸檬酸鹽緩沖液(100 mM檸檬酸鹽，150 mM NaCl, pH 5.0)，且樣品進(jìn)行無菌過濾(0.2 Mm孔徑)。通過UV-分光光度法測定蛋白濃度。在變性、還原和非還原條件下用SDS-PAGE或通過使用Agilent BioAnalyzer分析IgG的純度,而在天然狀態(tài)下通過HP-SEC分析IgG的純度。[實(shí)施例3]
篩查和抗體表征
A.涎免凝集素-15-FC的捕獲ELISA
384-孔MaxiSorp 微量滴定板的各孔用山羊抗人IgG (Dianova, Cat#109-005-098,在PBS中1:1，000稀釋)包被。第二天，洗滌各孔然后在微量滴定板搖床上用MPBST封閉。各孔用PBST洗滌，然后加入重組人或小鼠涎免凝集素15-人Fe融合蛋白。孵育后，加入預(yù)封閉的BEL提取物(其制備參考實(shí)施例1C)或純化的Fab/IgG。將板在微量滴定板搖床上孵育，然后用PBST洗滌。為了檢測與所捕獲的Fab結(jié)合的抗原，用PBST洗滌板，并加入抗Fab-AP(Dianova, Cat#109-055-097,在 PBS 中 1:5000 稀釋)。孵育后，用TBST 洗漆板，加入 Attophos (AttoPhos Substrate Set, Roche#11681982001,在TBS中1:10稀釋)，并在TECAN微量滴定板讀數(shù)器(發(fā)射:535nm;激發(fā):430nm)上測量熒光。B.FACS 分析
用Versene (Invitrogen #15040066)分離HEK293T細(xì)胞，洗滌并重懸在FACS緩沖液(PBS / 3% FCS)中。洗滌非粘附的HEK293 FreeStyle 細(xì)胞并重懸在FACS緩沖液中。將IxIO5-1xIO6個(gè)細(xì)胞/孔轉(zhuǎn)移至圓底96孔板中，300x g沉淀5分鐘，并重懸于稀釋的BEL提取物(見實(shí)施例1C)或純化的抗體。將細(xì)胞-抗體混合物在4°C孵育I h。通過300x g離心5分鐘并隨后懸浮于FACS緩沖液來洗滌細(xì)胞兩次(在該項(xiàng)目的過程中，洗滌步驟的數(shù)目增加至5次以防止抗體與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)合)。將細(xì)胞重懸于檢測抗體溶液(在FACS緩沖液中1:100稀釋)。4°C孵育I h后，細(xì)胞用FACS緩沖液洗滌兩次，重懸于FACS緩沖液并通過FACS Array裝置分析。通過FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。M0R03207 (抗溶菌酶)抗體用作陰性對照。用山羊抗人PE (Jackson ImmunoResearch #109-116-097)檢測人抗體。[實(shí)施例4]
候選抗體的親和力成熟 A.親和力成熟文庫的產(chǎn)生
為了增加所選抗體片段的親和力和生物學(xué)活性，通過使用三核苷酸定向誘變的盒式誘變并行優(yōu)化⑶R3L和⑶RH2區(qū)域(Virnekas等1994)，而構(gòu)架區(qū)保持不變。在用于親和力成熟的克隆之前，將所有的親本Fab片段從相應(yīng)的表達(dá)載體(pMORPtfx^FH)通過油al/^boRI轉(zhuǎn)移至CysDisplay 載體pMORPiftSJHC中。CDRL3或CDRH2多樣化后，將所得的七個(gè)不同文庫的連接混合物電穿孔到4 ml大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中，獲得約IO7-1O8個(gè)獨(dú)立克隆/文庫。該文庫大小確保涵蓋了理論上的多樣性。文庫的擴(kuò)增如前文所述進(jìn)行(Rauchenberger等2003)。為了質(zhì)量控制，隨機(jī)挑選單一的克隆并測序。B.固相Fe捕獲淘選
將從如上所述親和力成熟文庫拯救的I X IO12個(gè)噬菌體通過如下文所述的固相FC捕獲淘選引入篩選中。將MaxiSorp 板(F96 MaxiSorp , Nunc #442402)上適當(dāng)數(shù)目的孔用 330M-1 Fe Y 片段特異的抗人 IgG(在 PBS 中 10 M-g/ml; Jackson Tmmuno Research,Cat#109-005-098)包被過夜。第二天，包被的各孔用PBS洗滌，并在微量滴定板搖床上用MPBST封閉。隨后，各孔用PBS洗滌并用330 μ I抗原溶液孵育。噬菌體于包含奶粉、TWeen20和 0.1 mg/ml 山羊 Y 球蛋白(Jackson Tmmuno Research, Cat#009-000_002)的 PBS 溶液中在旋轉(zhuǎn)器上室溫預(yù)封閉2 h。為篩選過程，從MaxiSorp 板除去抗原溶液，并用PBS洗滌孔。向相應(yīng)的各孔中加入預(yù)封閉的噬菌體，并將板在微量滴定板搖床上孵育。孵育后，除去噬菌體溶液，用PBST和PBS洗滌各孔多次。最后一次洗滌步驟后除去PBS，然后繼續(xù)洗脫。通過Tris/HCl中的DTT (pH 8.0)和室溫10分鐘的孵育期，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。洗出液用于感染對數(shù)期的大腸桿菌TGl F+培養(yǎng)物。將感染的大腸桿菌鋪板在添加氯霉素和葡萄糖的LB瓊脂板上，并孵育。第二天，將細(xì)菌克隆刮下并重懸于YT培養(yǎng)基中。在⑶RL3成熟淘選和⑶RH2成熟淘選中應(yīng)用篩選循環(huán)。在各個(gè)篩選循環(huán)中通過降低抗原的濃度和增加洗滌步驟的次數(shù)和強(qiáng)度來增加淘選的嚴(yán)格性。C.差異全細(xì)胞淘選
差異全細(xì)胞成熟淘選(Differential whole cell maturation pannings)基本上如下文所述進(jìn)行。通過對重組抗原的固相Fe捕獲淘選(見實(shí)施例4B)和對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的全細(xì)胞淘選的交替來設(shè)計(jì)差異全細(xì)胞淘選(dWCP)，如下文所述的。使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人涎免凝集素-15的HEK293 FreeStyle 細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞淘選(WCP)。將表達(dá)涎免凝集素-15的細(xì)胞洗滌、重懸并預(yù)封閉。將從各個(gè)成熟文庫拯救的約IX IO12個(gè)噬菌體預(yù)封閉。封閉后，將IxlO6個(gè)表達(dá)涎免凝集素-15的細(xì)胞沉淀，重懸于預(yù)封閉的噬菌體溶液中并孵育。在隨后的篩選循環(huán)中，細(xì)胞數(shù)目減少至5 X IO50通過洗滌步驟除去非特異性噬菌體，其中增加在淘選過程中洗滌的嚴(yán)格性。對于洗滌，細(xì)胞通過離心沉淀、重懸并在旋轉(zhuǎn)器上孵育。洗滌后，從細(xì)胞洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。離心后，將上清液從細(xì)胞沉淀中除去，用2 M Tris堿(未緩沖的)中和其pH。用所選噬菌體對大腸桿菌TGlF+的感染按照對固相淘選(見實(shí)施例4B)所述進(jìn)行。篩選循環(huán)按照Fe捕獲淘選或按照全細(xì)胞淘選進(jìn)行。D.親本抗體
M0R09012.M0R08656 和 M0R08662 分別為皿》09892、1 09898或皿《10110 的親本抗體。選擇M0R09281作為候選物，用于無親和力成熟步驟的進(jìn)一步分析。關(guān)于抗體的氨基酸序列、編碼該抗體的核酸序列及其結(jié)構(gòu)的信息在表1-7中概述。表1- M0R0865權(quán)利要求
1.抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨細(xì)胞的骨吸收的能夠結(jié)合涎免凝集素-15的分離抗體，或其功能片段，包含:(a)包含⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的重鏈，所述⑶RHl包含與SEQID NO: 106具有至少80%序列同一性的序列，所述⑶RH2包含與SEQ ID NO: 107具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH3包含與SEQ ID NO: 80、55、65、35或45中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列；和(b)包含⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3的輕鏈，所述⑶RLl包含與SEQ ID NO: 83或73具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL2包含與SEQ ID NO: 108具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL3包含與SEQ ID NO: 90、60、100、70、40、50或109中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。
2.權(quán)利要求1的分離抗體或其功能片段，其中所述⑶RHl包含與SEQID NO: 78、53、63,33或43中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。
3.權(quán)利要求1或2的分離抗體或其功能片段，其中所述⑶RH2包含與SEQID NO: 104、54、94、64、34、44或79中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述CDRLl包含與SEQIDNO: 88、58、68、38或48中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述CDRL2包含與SEQIDNO: 89、59、69、39或49中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述抗體中的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRLl、CDRL2 和 CDRL3 序列包含: a)分別為SEQ ID NO: 103、104、105、88、89 和 90，或與其具有至少 80%、90% 或 95% 序列同一性的序列； b)分別為SEQID NO: 53、54、55、58、59和60，或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列；· c)分別為SEQID NO: 93、94、95、98、99和100，或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列； d)分別為SEQID NO: 63、64、65、68、69和70，或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列； e)分別為SEQID NO: 33、34、35、38、39和40，或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列； f)分別為SEQID NO: 43、44、45、48、49和50，或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列； g)分別為SEQID NO: 78、79、80、88、89和90，或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述抗體包含: 選自以下的重鏈可變區(qū): al)包含SEQ ID NO: 102的氨基酸殘基20_140、SEQ ID NO: 52的氨基酸殘基20-137、SEQ ID NO: 92 的氨基酸殘基 20-138、SEQ ID NO: 62 的氨基酸殘基 20-136、SEQ ID NO:32的氨基酸殘基20-136、SEQ ID NO: 42的氨基酸殘基20-135或SEQ ID NO: 77的氨基酸殘基20-138的氨基酸序列； a2)與al)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；a3)與al)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和a4)在al)的氨基酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基添加、缺失或取代的氨基酸序列；和 選自以下的輕鏈可變區(qū): bl)包含SEQ ID NO: 87的氨基酸殘基20_134、SEQ ID NO: 57的氨基酸殘基20-129、SEQ ID NO: 97 的氨基酸殘基 20-133、SEQ ID NO: 67 的氨基酸殘基 20-129、SEQ ID NO:37的氨基酸殘基20-129或SEQ ID NO: 47的氨基酸殘基20-129的氨基酸序列；b2)與bl)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；b3)與bl)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和b4)在bl)的氨基酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基添加、缺失或取代的氨基酸序列。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述抗體包含: 選自以下的重鏈: al)包含SEQ ID NO: 102、52、92、62、32、42或77中的一個(gè)的序列的氨基酸序列; a2)與al)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；a3)與al)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和a4)在al)的氨基酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基添加、缺失或取代的氨基酸序列；和 選自以下的輕鏈: bl)包含SEQ ID NO: 87、57、97、67、37或47中的一個(gè)的序列的氨基酸序列； b2)與bl)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列； b3)與bl)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和 b4)在bl)的氨基酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基添加、缺失或取代的氨基酸序列。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述抗體包含由包含SEQID NO: 102的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列組成的輕鏈。
10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述抗體包含由包含SEQID NO: 52的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列組成的輕鏈。
11.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述抗體包含由包含SEQID NO: 92的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ ID NO: 97的氨基酸序列組成的輕鏈。
12.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述抗體包含由包含SEQID NO: 62的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列組成的輕鏈。
13.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述抗體包含由包含SEQID NO: 32的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列組成的輕鏈。
14.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述抗體包含由包含SEQID NO: 42的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列組成的輕鏈。
15.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其中所述抗體包含由包含SEQID NO: 77的氨基酸序列組成的重鏈和由包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列組成的輕鏈。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體的功能片段，其選自Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv。
17.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于為scFv。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段，其用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝。
19.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段在制造用于治療或預(yù)防異常骨代謝的藥物中的用途。
20.治療罹患異常骨代謝的患者的方法，所述方法包括給予在治療上有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的分離抗體或其功能片段。
21.包含至少一種權(quán)利要求1-17的抗體或其功能片段的藥物組合物。
22.權(quán)利要求21的藥物組合物，其特征在于為用于異常骨代謝的治療和/或預(yù)防劑。
23.用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝的藥物組合物，特征在于包含至少一種權(quán)利要求1-17的抗體或所述抗體的功能片段和至少一種選自以下的成員:二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素制劑例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺素)制劑、非甾體抗炎劑、可溶性TNF受體制劑、抗TNF-α抗體或該抗體的功能片段、抗PTHrP (甲狀旁腺素相關(guān)蛋白)抗體或該抗體的功能片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體的功能片段、抗RANKL抗體或該抗體的功能片段和OCIF(破骨細(xì)胞生成抑制因子)。
24.權(quán)利要求18的抗體或功能片段、權(quán)利要求19的用途、權(quán)利要求20的方法或權(quán)利要求22或23的藥物組合物，其中所述異常骨代謝選自:骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌癥骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、牙周炎引起的牙喪失、假關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、佩吉特氏骨病、腎性骨營養(yǎng)不良和成骨不全癥。
25.權(quán)利要求24的抗體、功能片段、用途、方法或藥物組合物，其特征在于異常骨代謝為骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞或伴隨癌癥骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。
26.權(quán)利要求25的抗體、功能片段、用途、方法或藥物組合物，其特征在于所述骨質(zhì)疏松癥為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用治療劑例如類固醇或免疫抑制劑引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
27.多核苷酸，其包含: a)編碼權(quán)利要求1-17的抗體或其功能片段中的一種的核苷酸序列；或 b)與由與a)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列。
28.權(quán)利要求27的多核苷酸，其中編碼CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列的核苷酸序列包含: a)分別為SEQ ID NO: 101 的核苷酸 148_162、SEQ ID NO: 101 的核苷酸205_261、SEQID NO: 101 的核苷酸 358-387、SEQ ID NO: 86 的核苷酸 124-165、SEQ ID NO: 86 的核苷酸 211-231 和 SEQ ID NO: 86 的核苷酸 328-363 ； b)分別為SEQ ID NO: 51 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 51 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 51 的核苷酸 352-378、SEQ ID NO: 56 的核苷酸 124_156、SEQ ID NO: 56 的核苷酸202-222 和 SEQ ID NO: 56 的核苷酸 319-348 ； c)分別為SEQ ID NO: 91 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 91 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 91 的核苷酸 352-381、SEQ ID NO: 96 的核苷酸 124_165、SEQ ID NO: 96 的核苷酸211-231 和 SEQ ID NO: 96 的核苷酸 328-360 ； d)分別為SEQ ID NO: 61 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 61 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 61 的核苷酸 352-375、SEQ ID NO: 66 的核苷酸 124_156、SEQ ID NO: 66 的核苷酸202-222 和 SEQ ID NO: 66 的核苷酸 319-348 ； e)分別為SEQ ID NO: 31 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 31 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 31 的核苷酸 352-375、SEQ ID NO: 36 的核苷酸 124_156、SEQ ID NO: 36 的核苷酸202-222 和 SEQ ID NO: 36 的核苷酸 319-348 ； f)分別為SEQ ID NO: 41 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 41 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 41 的核苷酸 352-372、SEQ ID NO: 46 的核苷酸 124_156、SEQ ID NO: 46 的核苷酸202-222 和 SEQ ID NO: 46 的核苷酸 319-348 ;或 g)分別為SEQ ID NO: 76 的核苷酸 148-162、SEQ ID NO: 76 的核苷酸 205-255、SEQID NO: 76 的核苷酸 352-381、SEQ ID NO: 86 的核苷酸 124_165、SEQ ID NO: 86 的核苷酸211-231 和 SEQ ID NO: 86 的核苷酸 328-363。
29.權(quán)利要求27的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含: 選自以下的編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列: al)包含 SEQ ID NO: 101 的核苷酸 58-420、SEQ ID NO: 51 的核苷酸 58-411、SEQID NO: 91 的核苷酸 58-414、SEQ ID NO: 61 的核苷酸 58-408、SEQ ID NO: 31 的核苷酸58-408、SEQ ID NO: 41的核苷酸58-405或SEQ ID NO: 76的核苷酸58-414的核苷酸序列； a2)與由與al)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列；和 a3)在al)的核苷酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列；和 選自以下的編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列: bl)包含 SEQ ID NO: 86 的核苷酸 58-402、SEQ ID NO: 56 的核苷酸 58-387、SEQ IDNO: 96 的核苷酸58-399、SEQ ID NO: 66 的核苷酸58-387、SEQ ID NO: 36 的核苷酸58-387或SEQ ID NO: 46的核苷酸58-387的核苷酸序列； b2)與由與bl)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列；和 b3)在bl)的核苷酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列。
30.權(quán)利要求29的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含: 選自以下的編碼重鏈的核苷酸序列: al)核苷酸序列:SEQ ID NO: 101、51、91、61、31、41或76中的一個(gè)的序列; a2)與由與al)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列；和 a3)在al)的核苷酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列；和 選自以下的 編碼輕鏈的核苷酸序列:bl)包含SEQ ID NO: 86、56、96、66、36或46中的一個(gè)的序列的核昔酸序列；b2)與由與bl)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸的核苷酸序列；和 b3)在bl)的核苷酸序列中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸添加、缺失或添加的核苷酸序列。
31.包含至少一種權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)的多核苷酸的載體。
32.包含至少一種權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)的多核苷酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
33.包含至少一種權(quán)利要求31的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
34.生產(chǎn)權(quán)利要求1-17的抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求32或33的轉(zhuǎn)化細(xì)胞、收集培養(yǎng)物和從所 述培養(yǎng)物中純化所述抗體的步驟。
全文摘要
抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨細(xì)胞的骨吸收的能夠結(jié)合涎免凝集素-15的分離抗體，或其功能片段?？贵w的重鏈包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述CDRH1包含與SEQIDNO:106具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH2包含與SEQIDNO:107具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH3包含與SEQIDNO:35、45、55、65或80中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列?？贵w的輕鏈包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述CDRL1包含與SEQIDNO:73或83具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL2包含與SEQIDNO:108具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL3包含與SEQIDNO:40、50、60、70、90、100或109中的一個(gè)具有至少80%序列同一性的序列。
文檔編號C07K16/28GK103237813SQ201180058465
公開日2013年8月7日 申請日期2011年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月5日
發(fā)明者I.瓦塔納貝, Y.希魯馬, E.特蘇達(dá), T.馬特蘇奧卡, T.奧特蘇卡, T.塔卡哈斯, T.阿加特蘇馬, S.米勒, R.馬塞克, K-L.巴伊斯, S.倫滋, U.舒伯特, I.舒斯特, D.龐塞 申請人:第一三共株式會社