專利名稱：組合物、抗體、哮喘診斷方法和制備抗體的方法
技術領域：
本發(fā)明的公開內(nèi)容涉及抗體的制備及其用途。公開內(nèi)容的特定實施方案涉及對單鹵代酪氨酸具有親和性的抗體的制備和具有單鹵代酪氨酸部分的蛋白質(zhì)。背景哮喘是一種特征在于氣道短暫變窄的常見病。其是影響了美國約23百萬成人的主要公眾健康問題。認為激活的嗜伊紅粒細胞浸潤至支氣管中是哮喘的主要誘因。痰和肺活體樣本中的嗜伊紅粒細胞計數(shù)和分泌的嗜伊紅粒細胞顆粒蛋白(如，嗜伊紅粒細胞過氧化物酶(EPO))的存在表示哮喘的嚴重性。在哮喘病人中由于ΕΡ0，溴酪氨酸蛋白質(zhì)修飾增加，EPO催化次溴酸鹽的形 成，以及隨后溴酪氨酸的形成。之前使用氣相色譜和質(zhì)譜檢測的研究發(fā)現(xiàn)了在來自哮喘患者的支氣管肺泡灌洗流體和痰樣本中，3-溴酪氨酸和3，5- 二溴酪氨酸各自顯著升高。對溴化蛋白質(zhì)在哮喘中的作用的研究受限于缺乏快速、簡單的方法來監(jiān)控生物流體中的溴酪氨酸水平。公開內(nèi)容概述如下將列出本發(fā)明的其他優(yōu)點和新的特征，并且從在此所列的描述和證明是顯而易見的。因此，本發(fā)明公開內(nèi)容的以下描述應當看作是公開內(nèi)容的說明而不是以任何方式限制。溴酪氨酸修飾的蛋白質(zhì)可以用作用于氣道氧化應激的穩(wěn)定的生物標記。據(jù)信3-溴酪氨酸是體內(nèi)產(chǎn)生的主要溴酪氨酸；然而，之前的嘗試不能產(chǎn)生識別3-溴酪氨酸的有用抗體。例如,在1930年，Wormall報道了產(chǎn)生對抗3，5- 二溴酪氨酸的兔抗血清，但他的嘗試未能產(chǎn)生3-溴酪氨酸抗體。更近一些,Kambayashi等和Kato等產(chǎn)生了針對溴化蛋白質(zhì)的多克隆和單克隆抗體，但他們的抗體還是只能與3，5- 二溴酪氨酸反應。這些產(chǎn)生識別3-溴酪氨酸的抗體的失敗可能源于用于產(chǎn)生抗原的條件。質(zhì)譜和核磁共振分析表明作為體外蛋白質(zhì)溴化的結果，相對于3-溴酪氨酸修飾，優(yōu)先產(chǎn)生二溴酪氨酸修飾。當使用預期模擬體內(nèi)溴化的試劑時，可能難以產(chǎn)生良好的用于3-溴酪氨酸的抗原。本發(fā)明公開內(nèi)容描述了提供可以包括具有3-溴-4-羥基-苯甲酸部分的蛋白質(zhì)的抗原組合物。本發(fā)明公開內(nèi)容還提供了生產(chǎn)這種抗原的方法。從這種抗原，可以鑒定出不僅顯示出識別單溴化的酪氨酸殘基并且還結合其他鹵化的酪氨酸殘基的對鹵代酪氨酸具有親和性的抗體。提供了生產(chǎn)這些對這種抗原以及鹵代酪氨酸(包括單鹵代酪氨酸)具有親和性的抗體的方法。提供了對具有鹵代酪氨酸部分的蛋白質(zhì)具有親和性的抗體以及包括結合鹵代酪氨酸的抗體的組合物。此外，公開內(nèi)容證明了所公開的抗體能夠區(qū)分來自健康對照和哮喘患者之間的人痰蛋白質(zhì)中的鹵代酪氨酸水平。提供了評價哮喘嚴重性的方法以及確定嗜伊紅粒細胞計數(shù)的方法。附圖簡述以下將參照以下的附圖來描述公開內(nèi)容的實施方案。

圖1是用于生產(chǎn)根據(jù)公開內(nèi)容的實施方案的抗原的合成圖解。圖2是根據(jù)公開內(nèi)容的實施方案生產(chǎn)的抗體的試驗描繪。圖3是利用根據(jù)公開內(nèi)容的實施方案生產(chǎn)的抗體獲取的數(shù)據(jù)的描繪。圖4是蛋白質(zhì)的描繪部分，和利用根據(jù)公開內(nèi)容的實施方案生產(chǎn)的抗體獲取的數(shù)據(jù)。圖5是利用根據(jù)公開內(nèi)容的實施方案生產(chǎn)的抗體獲取的數(shù)據(jù)的描述。描述在此將描述本發(fā)明的各種優(yōu)點和新的特征，并且對本領域技術人員而言從以下的詳細描述將變得顯而易見。 在之前和之后的描述中，通過說明和描述來提供公開內(nèi)容的實施方案。如將會認識到的，公開內(nèi)容能夠在各個方面有所改變而沒有脫離公開內(nèi)容。因此，下文中所列的附圖和實施方案的描述應視為本質(zhì)上是說明性的，而不是作為限制。本發(fā)明的公開內(nèi)容提供了組合物、抗體、抗原、生產(chǎn)抗原的方法、生產(chǎn)抗體的方法和評價哮喘的方法，以及確定嗜伊紅粒細胞計數(shù)的方法。提供了制備抗體的方法。該方法可以包括將鹵代酪氨酸類似物(如3-溴-4-羥基-苯甲酸)摻入蛋白質(zhì)中，以形成抗原。該方法可以進一步包括用該抗原免疫哺乳動物宿主，并且從宿主收集對抗原具有親和性的抗體。根據(jù)實施例實施，該蛋白質(zhì)可以是鑰孔血藍蛋白(KLH)。根據(jù)這種方法，組合物包括通過用模擬3-溴酪氨酸的化合物修飾KLH提供的抗原。因此，提供了一種包括具有3-溴-4-羥基-苯甲酸部分的蛋白質(zhì)的組合物，例如，該蛋白質(zhì)是KLH。根據(jù)該公開內(nèi)容的各個方面，這可以避免與體外蛋白質(zhì)溴化和主要生產(chǎn)二溴酪氨酸相關的問題。然后可以在優(yōu)化單溴化的條件下溴化牛血清白蛋白(BSA)，并且隨后用于篩選雜交瘤細胞系和鑒定可能對生理上相關的酪氨酸修飾具有親和性的克隆。這種所得到的BTK-94C抗體對3-溴酪氨酸和3，5- 二溴酪氨酸具有親和性，對3-氯酪氨酸和3，5- 二氯酪氨酸也具有親和性，但對未修飾的酪氨酸、3-硝基酪氨酸或3-羥基酪氨酸不具有親和性(參見，例如，圖2和4)。還提供了使用次氯酸鹽的蛋白質(zhì)的氯酪氨酸修飾，次氯酸鹽是髓過氧化物酶的產(chǎn)物，髓過氧化物酶是在嗜中性粒細胞和巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)的一種酶。因為這種抗體看來似乎結合所有四種生理上相關的鹵化蛋白質(zhì)酪氨酸殘基，因此BTK-94C可以認為是一種通用鹵代酪氨酸抗體。
因此，該公開內(nèi)容的方法提供了一種對蛋白質(zhì)鹵代酪氨酸(并且在特定的實施方案中，單鹵代酪氨酸)具有結合親和性的抗體。鹵代酪氨酸可以是單鹵代酪氨酸和/或二鹵代酪氨酸之一或兩者。單齒代酪氨酸可以是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸之一或兩者。單鹵代酪氨酸也可以是3-溴酪氨酸和/或3-氯酪氨酸之一或兩者。二鹵代酪氨酸也可以是3，5- 二溴酪氨酸和/或3，5- 二氯酪氨酸之一或兩者。還提供了包括與抗原結合的本發(fā)明公開內(nèi)容的抗體的組合物，所述抗原是鹵代酪氨酸和/或鹵代酪氨酸蛋白質(zhì)。使用本發(fā)明公開內(nèi)容的抗體的實施例實施可以克服與之前所用方法相關的各種問題。盡管已經(jīng)存在幾種報道了與溴化蛋白質(zhì)反應的多克隆和單克隆抗體，但那些抗體看來似乎只與二溴酪氨酸反應，而不與3-溴酪氨酸反應。因為3-溴酪氨酸是體內(nèi)觀察到的主要修飾，因此這是重要的限制。本發(fā)明公開內(nèi)容進一步提供了可以包括將抗體暴露于體液以確定例如，一種或多種嗜伊紅粒細胞活性、炎癥和/或具有單鹵代酪氨酸和/或二鹵代酪氨酸部分的蛋白質(zhì)的量的方法。還提供了評價哮喘嚴重性的方法。該方法可以包括使用對單鹵代酪氨酸具有結合親和性的抗體分析病人的痰，并且測量結合蛋白質(zhì)的抗體的量。該方法可以是定性和/或定量中的一種或兩種。該方法可以包括關聯(lián)結合抗體的量，以確定炎癥的量。該方法可以分開或一起包括使用結合抗體的量來監(jiān)控對哮喘發(fā)作的藥物反應。還提供了確定體液中嗜伊紅粒細胞活性的方法。該方法可以包括將體液暴露于對單鹵代酪氨酸具有結合親和性的抗體，并且測量結合抗體的量來確定嗜伊紅粒細胞活性。體液可以是例如痰或灌洗流體。該方法還可以包括關聯(lián)結合抗體的量，例如以確定炎癥和/或藥物反應。因此，用從哮喘患者和健康對照收集的人痰樣品測試了 BTK-94C。ELISA微矩陣分析證明了人痰樣品中的4種蛋白質(zhì)在哮喘患者中的鹵化水平提高。這些數(shù)據(jù)表明溴化是嗜伊紅粒細胞活性的特異性指示 并且這4種特異性蛋白質(zhì)響應哮喘相關的嗜伊紅粒細胞活性而得到修飾。此外，這些蛋白質(zhì)的鹵化水平在監(jiān)控哮喘中是有用的。以下描述了一種新的單克隆抗體(BTK-94C)，其識別溴化和氯化蛋白質(zhì)。這些鹵代酪氨酸蛋白質(zhì)修飾是炎性細胞活性的表示。將這種抗體用作夾層ELISA中的檢測試劑來證明四種痰蛋白質(zhì)的鹵代酪氨酸水平在哮喘患者中是升高的。因此，BTK-94C抗體可以提供哮喘患者中炎癥的指示，并且這些ELISA可以證明對于預測或監(jiān)控哮喘或具有強烈炎性成分的其他疾病中的藥物反應是有用的。實施例材料和方法牛血清白蛋白(BSA)購自Jackson ImmunoResearch實驗室。3_漠_4_輕基苯甲酸購自 Indofine Chemical Company Inc。3，5_ 二漠 _4_ 輕基苯甲醒、3，5_ 二氣 _4_ 輕基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸、3-硝基酪氨酸和L-酪氨酸購自Sigma-Aldrich。鑰孔鐵血藍蛋白(KLH)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、腹水調(diào)節(jié)試劑、Melon單克隆抗體純化試劑盒和生物素化試劑盒EZ-1ink硫-NHS-生物素購自Pierce-Thermo Scientific(Rockford, IL)。次溴酸鈉溶液購自Fisher-Thermo Scientific。如增補數(shù)據(jù)中所述的，購買了用于23個ELISA的捕獲抗體。實施例溴化抗原和相關修飾蛋白質(zhì)的制備
對于抗原的制備，使用了如“A Simple Modified Carbodiimide Method forConjugation of Small-Molecular-Weight Compounds to Immunoglobulin G withMinimal Protein Crosslinking”(使用最小蛋白質(zhì)交聯(lián)將小分子量化合物綴合免疫球蛋白 G 的簡單改進碳二亞胺方法)，Minh-Tam B.Davis and James F.Preston, AnalyticalBiochemistryll6,402-407 (1981)中所述的碳二亞胺方法的改進實驗方案，在此將該篇文獻引入作為參考。簡而言之，將0.12mM3-Br-HBA溶解于2.5ml甲醇中，并且與2.5ml的20mM磷酸鉀緩沖液(pH5.0)中的0.75mM EDC在室溫下混合2分鐘。然后將該5ml溶液與8ml200mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)中的2.5mg/ml KLH混合并且使其在室溫下孵育過夜。通過在4°C下相對120mM PBS的滲析來除去任何剩余的EDC和3_Br_HBA。滲析后，通過在4°C下在50，OOOg下離心2小時來除去沉淀物。通過測量吸光值來定量pH8.0的200mM磷酸鉀緩沖液中的修飾抗原，在280nm處測量蛋白質(zhì)濃度，在310nm處測量溴化。將修飾的KLH 等分，并且存儲在-80 °C。在 Washington State University Monoclonal AntibodyCenter (Pullman)，將小鼠免疫，收集血清以及雜交瘤細胞系及其上清液，產(chǎn)生腹水和測定抗體同種型。根據(jù)制造商的實驗方案，使用EZ-Link硫-NHS-LC-生物素化試劑盒(Pierce,Rockford, IL)，將BTK-94C抗體生物素化。按照之前報道的，使用次溴酸鈉(Fisher Scientif ic, Pittsburg, PA)制備了溴化BSA。為了最大化3-溴酪氨酸相對于3，5- 二溴酪氨酸的含量，按照之前報道的，我們使用了優(yōu)化條件。即，將Iml的lOmgBSA/ml與200 μ I新鮮制備的20mM次溴酸鈉(在ρΗ7.2的PBS中)在25°C下反應15小時。然后將溶液在4°C下相對PBS滲析，以除去未反應的試劑。為了產(chǎn)生氯化BSA和硝基化BSA，按照之前所報道的，分別使用了 6%次氯酸鈉(The CloroxCompany)和過亞硝酸鹽(peroxynitrite) (Millipore Corporation, Boston, MAX實施例，ELISA微矩陣試驗和使用修飾酪氨酸類似物的抑制研究按照之前所述的進行了夾層ELISA微矩陣，除了通過綴合辣根過氧化物酶的山羊-抗-小鼠-1gM (Jackson ImmunoReasearch Laboratories)結合生物素釀胺(biotinyltyramide) 產(chǎn)生了最初的生物素信號。簡而言之，在離心除去任何顆粒后，將痰樣品在PBS中的0.1%BSA中稀釋5倍。在三個芯片上分析了 25 μ I每種稀釋的樣品/芯片。對于每個捕獲抗體，每個芯片含有4個重復斑點，使得對于23個ELISA中的每一個，總共存在12個復制品/樣品(參見，例如，以下的表1)。表S1-選定的血漿生物標記以及將這些蛋白質(zhì)與哮喘相關的參考
權利要求
1.一種抗體，其對單鹵代酪氨酸具有結合親和性。
2.權利要求1的抗體，其中單鹵代酪氨酸是溴酪氨酸。
3.權利要求1的抗體，其中單鹵代酪氨酸是氯酪氨酸。
4.權利要求1的抗體，其中單鹵代酪氨酸是蛋白質(zhì)的一部分。
5.權利要求1的抗體，其中抗體還具有對二鹵代酪氨酸的結合親和性。
6.一種組合物，其包含與單鹵代酪氨酸結合的抗體。
7.權利要求6的組合物，其中單鹵代酪氨酸是蛋白質(zhì)的一部分。
8.權利要求6的組合物，其中單鹵代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一種或兩種。
9.一種組合物，其包含具有3-溴-4-羥基苯甲酸部分的蛋白質(zhì)。
10.權利要求9的組合物，其中蛋白質(zhì)是鑰孔A血藍蛋白(KLH)。
11.一種用于評價哮喘嚴重性的方法，其包括: 使用對單鹵代酪氨酸具有結合親和性的抗體分析病人的痰；和 測量與蛋白質(zhì)結合的抗體的量。
12.權利要求11的方法，其中測量是定性和/或定量中的一種或兩種。
13.權利要求11的方法，其中單鹵代酪氨酸是蛋白質(zhì)的一部分。
14.權利要求11的方法，其中單鹵代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一種或兩種。
15.權利要求11的方法，進一步包括關聯(lián)結合的抗體的量，以確定炎癥的量。
16.權利要求11的方法，進一步包括使用結合的抗體的量來監(jiān)控對哮喘發(fā)作的藥物反應。
17.一種用于確定體液中嗜伊紅粒細胞活性的方法，該方法包括: 將體液暴露于對單鹵代酪氨酸具有結合親和性的抗體；和 測量結合的抗體的量，以確定嗜伊紅粒細胞活性。
18.權利要求17的方法，其中體液是痰。
19.權利要求17的方法，其中單鹵代酪氨酸是蛋白質(zhì)的一部分。
20.權利要求17的方法，其中單鹵代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一種或兩種。
21.權利要求17的方法，進一步包括關聯(lián)結合的抗體的量，以確定炎癥和/或藥物反應。
22.—種用于制備抗體的方法,該方法包括: 將3-溴-4-羥基-苯甲酸摻入蛋白質(zhì)中，以形成抗原； 用該抗原免疫哺乳動物宿主；和 從宿主收集對抗原具有親和性的抗體。
23.權利要求22的方法，其中蛋白質(zhì)是鑰孔鐵血藍蛋白(KLH)。
24.權利要求22的方法，其中抗體對單鹵代酪氨酸具有結合親和性。
25.權利要求24的方法，其中單鹵代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一種或兩種。
26.權利要求22的方法，其中抗體對蛋白質(zhì)鹵代酪氨酸具有結合親和性。
27.權利要求26的方法,其中鹵代酪氨酸是單鹵代酪氨酸和/或二鹵代酪氨酸中的一種或兩種。
28.權利要求27的方法，其中單鹵代酪氨酸是3-溴酪氨酸和/或3-氯酪氨酸中的一種或兩種。
29.權利要求27的方法，其中二鹵代酪氨酸是3，5-二溴酪氨酸和/或3，5-二氯酪氨酸中的一種或兩種。
30.權利要求22的方法，進一步包括將抗體暴露于體液，以確定嗜伊紅粒細胞活性。
31.權利要求22的方法，進一步包括將抗體暴露于體液，以確定炎癥。
32.權利要求22的方法,進一步包括將抗體暴露于體液，以確定具有單鹵代酪氨酸和/或二鹵代酪氨酸部分的蛋白質(zhì)的量。`
全文摘要
本發(fā)明提供了用于制備抗體的方法，該方法包括將3-溴-4-羥基-苯甲酸摻入蛋白質(zhì)中，以形成抗原，用該抗原免疫哺乳動物宿主，和從宿主收集對抗原具有親和性的抗體。提供了對單鹵代酪氨酸具有結合親和性的抗體，以及包含與單鹵代酪氨酸結合的抗體的組合物。還提供了包含具有3-溴-4-羥基-苯甲酸部分的蛋白質(zhì)的組合物。提供了用于評價哮喘嚴重性的方法，該方法包括使用對單鹵代酪氨酸具有結合親和性的抗體分析病人的痰，并測量與蛋白質(zhì)結合的抗體的量。還提供了測定體液中嗜伊紅粒細胞活性的方法，該方法包括將體液暴露于對單鹵代酪氨酸具有結合親和性的抗體，并測量結合的抗體的量，以確定嗜伊紅粒細胞活性。
文檔編號C07K16/44GK103228675SQ201180057478
公開日2013年7月31日 申請日期2011年10月19日 優(yōu)先權日2010年10月19日
發(fā)明者H·金, R·C·贊伽 申請人:巴特勒紀念研究院