專(zhuān)利名稱(chēng)：抑制破骨細(xì)胞形成的融合蛋白、其制備方法及藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及融合蛋白制備的生物技術(shù)，更具體地涉及用
于治療骨質(zhì)疏松癥和腫瘤引起的骨吸收的融合蛋白及其藥物組合物。
背景技術(shù)：
骨形成和骨吸收是正常骨新陳代謝過(guò)程中密切相關(guān)的兩個(gè)過(guò)程。骨質(zhì)疏松癥患 者因破骨細(xì)胞活性增加，骨吸收率超過(guò)骨形成率，導(dǎo)致骨質(zhì)疾病，其中并無(wú)骨礦物質(zhì)缺陷。 骨骼也是通常的腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲部位，多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌都常轉(zhuǎn)移至骨 骼。腫瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞相互作用，從而剌激骨髓內(nèi)前體細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞，因此，骨骼 內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移部位常見(jiàn)破骨細(xì)胞數(shù)量增加，破骨細(xì)胞性的骨吸收也相應(yīng)地增加?？傮w上，破骨 細(xì)胞(Osteoclast)的過(guò)多形成是造成骨質(zhì)疏松和腫瘤引起的骨吸收(Bone resorption) 的主要原因。人體破骨細(xì)胞來(lái)自于分化的單核細(xì)胞(Monocyte)/巨噬細(xì)胞(Macrophage)。 骨質(zhì)疏松容易導(dǎo)致骨折，根據(jù)中國(guó)2000年第五次人口普查骨質(zhì)疏松癥的結(jié)果及預(yù)測(cè)，中國(guó) 60歲以上的老人在2050年將達(dá)到4. 1億，占中國(guó)總?cè)丝诘?7. 4%。隨著老年人口的迅速 增加，骨質(zhì)疏松易患人群也迅速增加。美國(guó)有2，800萬(wàn)骨質(zhì)疏松病人，其中150萬(wàn)人因?yàn)?骨質(zhì)疏松而發(fā)生骨折(70萬(wàn)人脊椎骨折，25萬(wàn)人胯骨骨折)。世界衛(wèi)生組織將2000年至 2010年列為"骨與關(guān)節(jié)疾病十年"。根據(jù)世界衛(wèi)生組織資料，近年來(lái)全世界因?yàn)楣琴|(zhì)疏松而 引起的骨折增加了 4倍，腫瘤轉(zhuǎn)移致使破骨細(xì)胞活躍而引起的溶骨病變也不斷增加。美國(guó) 有50萬(wàn)病人因腫瘤轉(zhuǎn)移引起骨吸收而造成骨折，最常見(jiàn)的是多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、前列 腺癌、肺癌等引起的骨破壞。不管是婦女停經(jīng)后引起的絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松，還是腫瘤轉(zhuǎn)移引起 的骨吸收，原因都是人體內(nèi)的破骨細(xì)胞過(guò)多而形成骨質(zhì)疏松。為了解決骨質(zhì)疏松的病理狀 況，全世界生物醫(yī)學(xué)界都在尋找一種有效的方法去抑制破骨細(xì)胞形成和其活性。美國(guó)輝瑞 (Pfizer Inc.)正在申求美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)其用以治療絕經(jīng)后女性患者骨質(zhì)疏松 癥新藥Fablyn的上市，F(xiàn)ablyn工作機(jī)理與荷爾蒙雌性激素類(lèi)似，這類(lèi)藥物被稱(chēng)作選擇性雌 激素受體調(diào)節(jié)劑。2005、2006年，美國(guó)食品和藥品管理局兩次拒絕輝瑞申求的理由都是擔(dān)心 該藥存在導(dǎo)致患者罹患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)。輝瑞在2007年底再次遞交了 Fablyn作為骨質(zhì) 疏松癥治療藥物的上市請(qǐng)求，并提交了全新的數(shù)據(jù)。美國(guó)Amgen生物醫(yī)藥公司正在開(kāi)發(fā)骨 保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)的蛋白藥物來(lái)抑制核因子k B受體配體活化劑(Rec印tor Activator forNuclear Factor k B Ligand) (RANKL)的活性，以期控制破骨細(xì)胞的過(guò)量形 成。同時(shí)，美國(guó)洛杉磯的骨髓瘤/骨腫瘤研究所也正在研究發(fā)展一種減少破骨細(xì)胞形成的 生物制齊U _月中瘤壞死因子受體關(guān)聯(lián)因子6 (tumor necrosis factorrec印tor—associated factor (TRAF) 6)抑制性多肽(TRAF6dn)。 RANKL屬于TNF家族。它的晶體結(jié)構(gòu)顯示其分子結(jié)構(gòu)中含有一獨(dú)特部分，可激活破 骨前體細(xì)胞表面的受體RANK。 RANKL是破骨細(xì)胞分化所必需的。當(dāng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至骨骼部 位后，RANKL是破骨細(xì)胞形成的主要生理調(diào)節(jié)子，可由腫瘤細(xì)胞直接分泌，無(wú)需基質(zhì)細(xì)胞支 持直接剌激破骨細(xì)胞形成。RANK受體表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體，它是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的主要受體。 自從發(fā)現(xiàn)RANKL/RANK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成和激活的分子機(jī)理研究取得 了快速進(jìn)展。RANKL與RANK受體結(jié)合，使ITAM酪氨酸磷酸化，從而激活DAP12或FcR y ，以 及共受體TREM2和OSCAR介導(dǎo)共激活通路。酪氨酸激酶ZAP70或Syk的磷酸化導(dǎo)致PLC y 和鈣離子移動(dòng)，進(jìn)一步激活NFATcl促使破骨細(xì)胞分化。 破骨細(xì)胞是由多個(gè)單核前體細(xì)胞通過(guò)胞漿融合而形成的骨吸收細(xì)胞。破骨細(xì)胞的 形成需要RANKL和M-CSF共剌激以及ITAM信號(hào)。但是，人單核巨噬細(xì)胞也表達(dá)一個(gè)IgG的 抑制受體Fc y RIIb，該受體胞漿末端含有ITIM結(jié)構(gòu)，屬于抑制性受體超級(jí)家族，通過(guò)上調(diào) 胞漿內(nèi)去磷酸化酶SHP-1， SHP-1進(jìn)一步下調(diào)Syc-BCR阻斷PI3K信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)下調(diào)節(jié)ITAM 和抑制骨吸收。 交聯(lián)Fc y RIIb與含有ITAM的受體可抑制ITAM激活鈣離子移動(dòng)和細(xì)胞增生?；?信號(hào)傳導(dǎo)通路中ITAM和ITIM平衡，本發(fā)明者設(shè)計(jì)一個(gè)RANKL-Fc y融合蛋白用于交聯(lián)RANK 和Fc YRIIb受體，誘導(dǎo)ITIM信號(hào)，從而抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收。 RANKL作為一種細(xì)胞因子結(jié)合到單核/巨噬細(xì)胞上的RANKL受體(RANK)從而激 活基于免疫受體酪氨酸的激活基序(Imm皿orec印tor tyrosine-based activationmotif， ITAM)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。該系統(tǒng)經(jīng)過(guò)一系列活性蛋白的磷酸化，使單核/巨噬細(xì)胞分 化成破骨細(xì)胞。然而，ITAM的信息傳導(dǎo)系統(tǒng)受到了基于免疫受體酪氨酸的抑制基序 (I匪norec印tor tyrosine-based inhibitory motif ， ITM)的抑制。ITM作為抑制性 信息傳導(dǎo)系統(tǒng)通過(guò)含SH2域的肌醇多磷酸5'磷酸酶(SHIP)1(SH2 domain-containing inositol polyphosphate 5'phosphatase)和含SH2域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP1/2) (SH2 domain-containing proteintyrosine phosphatase)的激活來(lái)平衡ITAM的信息傳導(dǎo)系統(tǒng)。 本發(fā)明者通過(guò)基因克隆技術(shù)來(lái)合成一種RANKL-Fc y融合蛋白，稱(chēng)之為RIG，該融合蛋白R(shí)IG 通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)ITIM的信息傳導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)抑制ITAM的信息傳導(dǎo)，達(dá)到減少破骨細(xì)胞形成的 目的。 因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種抑制破骨細(xì)胞形成的融合蛋白R(shí)IG的編碼 基因。 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供抑制破骨細(xì)胞形成的融合蛋白R(shí)IG。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供構(gòu)建所述編碼基因用的合成引物。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供制備融合蛋白R(shí)IG用的表達(dá)質(zhì)粒。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供含上述表達(dá)質(zhì)?；蚬こ讨亟M細(xì)胞。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供融合蛋白R(shí)IG的制備方法。
本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供包含融合蛋白R(shí)IG的藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的抑制破骨細(xì)胞形成的融合蛋白R(shí)IG的編碼基因具有由1656bp組成 的如下核苷酸序列(SEQ ID N0:1): 1 ATGCGCCGCG CCAGCAGAGA CTACACCAAG TACCTGCGTG GCTCGGAGGA GATGGGCGGC
61 GGCCCCGGAG CCCCGCACGA GGGCCCCCTG CACGCCCCGC CGCCGCCTGC GCCGCACCAG
121 CCCCCCGCCG CCTCCCGCTC CATGTTCGTG GCCCTCCTGG GGCTGGGGCT GGGCCAGGTT

本發(fā)明所提供的融合蛋白具有如下氨基酸序列(SEQ ID NO :2):
1 MRRASRDYTK YLRGSEEMGG GPGAPHEGPL HAPPPPAPHQ PPAASRSMFV ALLGLGLGQV
61 VCSVALFFYF RAQMDPNRIS EDGTHCIYRI LRLHENADFQ DTTLESQDTK LIPDSCRRIK
121 QAFQGAVQKE LQHIVGSQHI RAEKAMVDGS WLDLAKRSKL EAQPFAHLTI NATDIPSGSH
181 KVSLSSWYHD RGWAKISNMT FSNGKLIVNQ DGFYYLYANI CFRHHETSGD LATEYLQLMV
241 YVTKTSIKIP SSHTLMKGGS TKYWSGNSEF HFYS頂VGGF FKLRSGEEIS IEVSNPSLLD
RIG的氨基酸殘基序列是由551個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。RIG的結(jié)構(gòu)如

圖1所示，它由三部分組成A區(qū)(RANKL)(自氨基端第1-317位氨基酸殘基)，B區(qū)(Fc-y )(自氨基端第335-551位氨基酸殘基)和C區(qū)(hinge)(自氨基端第318-334位氨基酸殘基)。
181 GTCTGCAGCG TCGCCCTGTT CTTCTATTTC AGAGCGCAGA TGGATCCTAA TAGAATATCA241 GAAGATGGCA CTCACTGCAT TTATAGAATT TTGAGACTCC ATGAAAATGC AGATTTTCAA301 GACACAACTC TGGAGAGTCA AGATACAAAA TTAATACCTG ATTCATGTAG GAGAATTAAA361 CAGGCCTTTC AAGGAGCTGT GCAAAAGGAA TTACAACATA TCGTTGGATC ACAGCACATC421 AGAGCAGAGA AAGCGATGGT GGATGGCTCA TGGTTAGATC TGGCCAAGAG GAGCAAGCTT481 GAAGCTCAGC CTTTTGCTCA TCTCACTATT AATGCCACCG ACATCCCATC TGGTTCCCAT541 AAAGTGAGTC TGTCCTCTTG GTACCATGAT CGGGGTTGGG CCAAGATCTC CAACATGACT601 TTTAGCAATG GAAAACTAAT AGTTAATCAG GATGGCTTTT ATTACCTGTA TGCCAACATT661 TGCTTTCGAC ATCATGAAAC TTCAGGAGAC CTAGCTACAG AGTATCTTCA ACTAATGGTG721 TACGTCACTA MACCAGCAT CAAAATCCCA AGTTCTCATA CCCTGATGAA AGGAGGAAGCGGTCAGGGAA TTCTGAATTCGGTCTGGAGA GGAAATCAGCATGCAACATA CTTTGGGGCTTGACAAMCT CACACATGCCTCTTCCTCTT CCCCCCAAAACATGCGTGGT GGTGGACGTGACGGCGTGGA GGTGCATAATACCGTGTGGT CAGCGTCCTCAGTGCAAGGT CTCCAACAAAMGGGCAGCC CCGAGMCCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCAGTGGGAGAG CAATGGGCAGCCGACGGCTC CTTCTTCCTCGGAACGTCTT CTCATGCTCC
78184190196110211081114112011261132113811441150115611621
ACCAAGTATTTTTAAGTTACCCGGATCAGGCCCAATATTGGGACCGTCAGCCTGAGGTCATGGTACGTGGAACAGCACGTAAGGAGTACATCCAAAGCCAGAGCTGACCAATCGCCGTGGGTGCTGGACTTGGCAGCAGGACGCAGAAGA
CATTTTTATTATCGAGGTCTTTTAMGTTCCACCGCTGCCCCCAAGGACAAGCCACGAAGGCCAAGACAAACCGTCCTGCGCCCTCCCAGCAGGTGTACATGCCTGGTCACCGGAGAACATACAGCAAGCGTGATGCATG
CCATAMCGTCCAACCCCTCGAGATATAGACAGCACCTGACCCTCATGATACCCTGAGGTAGCCGCGGGAACCAGGACTGCCCCCATCGACCCTGCCCCCAAGGCTTCTAACTACAAGACTCACCGTGGAAGGCTCTGCA
TGGTGGATTTCTTACTGGATTGGATCCGAGACTCCTGGGGCTCCCGGACCCAAGTTCAACGGAGCAGTACGCTGAATGGCGAAMCCATCATCCCGGGATTCCCAGCGACCACGCCTCCCCAAGAGCAGGCAACCACTAC
GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATAA
1MRRASRDYTK
61VCSVALFFYF
121QAFQGAVQKE
181KVSLSSWYHD
241YVTKTSIKIP
301PDQDATYFGA
361PEVTCVV麗
421KEYKCKVSNK
481IAVEWESNGQ
541TQKSLSLSPG其中，A區(qū)來(lái)源于人的RANKL，具有與RANK結(jié)合的部位；B區(qū)來(lái)源于人的IgG免疫球蛋白，具有與IgG受體Fc,RII結(jié)合的部位；C區(qū)來(lái)源于人的免疫球蛋白的絞鏈區(qū)序列，為絞連結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明所提供的融合蛋白R(shí)IG的制備方法包括如下步驟(l)構(gòu)建融合蛋白R(shí)IG的編碼基因(SEQ ID N0:1) ;(2)構(gòu)建質(zhì)粒pSecTagRIG ;(3)將質(zhì)粒pSecTagRIG轉(zhuǎn)化到SP2/0細(xì)胞中；(4)培養(yǎng)陽(yáng)性克隆并分離純化RIG蛋白。 本發(fā)明首先合成了如下特異性引物(SEQ ID N0:3-SEQ ID NO :6):RANKL (Sfi I) :5' -GGCCCCGAGGGCCATGCGCCGCGCCAGCAGAGAC-3';RANKL2(BamH I) :5， -GGATCCGATCTATATCTCGAACTTTAAAAGC_3，；P3(FcyBamH I) :5' -GGATCCGAGCCCAAATCTTGTGAC-3';P4(Fc y Not I) :5' -GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG—3'。 選用上述引物對(duì)RANKL和Fcy基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物分別克隆至
pCR4-T0P0質(zhì)粒(INVITROGEN， CA)，得到pRANKL和pFc- y ，經(jīng)序列測(cè)定后將RANKL和Fc y
連接到表達(dá)載體pSecTag得到質(zhì)粒pSecTagRIG,將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞，篩
選得到高表達(dá)RIG(其氨基酸序列如序列表中的序列2)的克隆，培養(yǎng)陽(yáng)性克隆并分離純化
RIG蛋白。 本發(fā)明還提供一種抑制破骨細(xì)胞形成的藥物組合物，包含治療有效量的融合蛋白R(shí)IG，及藥學(xué)上可接受的載體。 所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物組合物可以制成用于靜脈注射等的注射劑，用于皮下注射、表皮外敷等的經(jīng)皮吸收劑，用于噴鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的噴霧劑，用于滴鼻、眼、耳等的滴劑，用于肛腸等的栓劑，片劑，粉劑，粒劑，膠囊，口服液，膏劑，霜?jiǎng)┑榷喾N形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。 上述藥物的用量一般為0. l-5mg/kg體重/周，療程一般為10至30天。 附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明 圖1為RIG的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2為RIG的克隆和表達(dá)過(guò)程示意圖。 圖3為Fc y 1禾P RANKL DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。 圖4為RIG與RANKL的受體(RANK)結(jié)合能力鑒定結(jié)果。 圖5為RIG與Fc y RII受體結(jié)合能力鑒定結(jié)果。 圖6為RIG抑制破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 圖7為RIG抑制破骨細(xì)胞生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)施例 下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說(shuō)明書(shū)的啟示下對(duì)本發(fā)明實(shí)施中所作的任
何變動(dòng)都將落在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1融合蛋白R(shí)IG的表達(dá) 融合蛋白R(shí)IG的表達(dá)過(guò)程如圖l所示，具體包括以下步驟按照常規(guī)方法進(jìn)行以下操作從人外周血中分離、純化T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，提取mRNA。 用特異性引物進(jìn)行RANKL(T淋巴細(xì)胞)和Fc y (B淋巴細(xì)胞)基因的RT-PCR擴(kuò)增，引物選自 SEQ ID NO :35， -GGCCCCGAGGGCCATGCGCCGCGCCAGCAGAGAC-3';
SEQ ID NO :45， -GGATCCGATCTATATCTCGAACTTTAAAAGC-3';
SEQ ID NO :55， -GGATCCGAGCCCAAATCTTGTGAC-3';
SEQ ID NO :65， -GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG—3，。 將RANKL和Fc Y基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖3所示，RANKL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為970bp ;FcYDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為714bp。將PCR產(chǎn)物分別克隆至CR4-T0P0質(zhì)粒(INVITROGEN， CA)，經(jīng)連接后，得到pRANKL和pFc- y ，進(jìn)行核苷酸序列分析；在得到了 100%正確的核苷酸序列后，將RANKL和Fcy基因分別利用Sf i I-BamH I和BamHI-Not I限制性?xún)?nèi)切酶(NEW ENGLAND BIOLABS)進(jìn)行酶切，并用相同的限制性?xún)?nèi)切酶SfiI-Not I酶切pSecTag(INVITROGEN，CA)表達(dá)載體，然后進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pSecTagRIG，對(duì)質(zhì)粒pSecTag RIG進(jìn)行核苷酸序列分析，表明插入的(三個(gè))外源基因序列如序列表中的序列l(wèi)所示。然后將此質(zhì)粒利用常規(guī)電穿孔法轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞，經(jīng)ZE0CIN抗藥性篩選及ELISA鑒定(用鼠抗人RANKL抗體包備ELISA平板，加入標(biāo)本上清，然后加入羊抗人IgG酶標(biāo)抗體)，得到高表達(dá)RIG(其氨基酸序列如序列表中的序列2)的克隆。
利用RPMI1640 (INVITROGEN， CA)培養(yǎng)基，在37°C ， 5% C02培養(yǎng)上述陽(yáng)性克隆(含有質(zhì)粒pSecTag RIG的小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞)15天，2000rpm離心后，收集上清，再用蛋白A親和層析柱(PHARMACIA)分離純化RIG蛋白。
實(shí)施例2RIG與RANKL的受體(RANK)結(jié)合實(shí)驗(yàn) 將1 X 106單核細(xì)胞分別培養(yǎng)于MCSF和RANKL培養(yǎng)基，72小時(shí)后與5微克實(shí)施例1中純化的RIG蛋白在4。C反應(yīng)1小時(shí)，加入5微升FITC標(biāo)記的抗人RANKL抗體(CALTAG，CA)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞。結(jié)果如圖4所示，表明RIG蛋白可與RANK結(jié)合，THP1細(xì)胞呈FITC陽(yáng)性。圖4中，SSC-H為細(xì)胞內(nèi)顆粒數(shù)，F(xiàn)SC-H為細(xì)胞大小，F(xiàn)L2-H為PE，F(xiàn)L1-H為FITC。
實(shí)施例3RIG與Fc y RII受體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 將IX 106HMC_1細(xì)胞與5微克實(shí)施例1中純化的RIG蛋白在4"反應(yīng)1小時(shí)，加入5微升FITC標(biāo)記的抗人IgG FITC標(biāo)記抗體(CALTAG， CA)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞。結(jié)果如圖5所示，表明RIG蛋白可與FcyRII受體結(jié)合，HMC-1細(xì)胞呈FITC陽(yáng)性。圖5中，SSC-H為細(xì)胞內(nèi)顆粒數(shù)，F(xiàn)SC-H為細(xì)胞大小，F(xiàn)L2-H為PE， FL1-H為FITC。
實(shí)施例4RIG抑制破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn) 利用抗CD14微球(Miltenyi Biotec， Auburn, CA)從多發(fā)性骨髓瘤病人的骨髓或PBMC中分離出CD14+細(xì)胞。用含有50ng/ml RANKL和20ng/ml M-CSF培養(yǎng)基細(xì)胞。三天后，將RIG融合蛋白和對(duì)照試劑加入到培養(yǎng)基中，14天培養(yǎng)后，收獲細(xì)胞并固定，進(jìn)行TRAP染色分析(TRAP-staining kit ;Sigma，St Louis，MO，USA)鑒定多核破骨細(xì)胞的數(shù)量，根據(jù)融合指數(shù)評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞的頻率。 本實(shí)施例證明RIG可阻斷RANKL介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，并存在劑量依賴(lài)性。
實(shí)施例5RIG抑制破骨細(xì)胞的生物學(xué)活性 通過(guò)破骨細(xì)胞的骨吸收分析，我們進(jìn)一步考察RIG對(duì)破骨細(xì)胞的生物學(xué)活性的抑制作用。簡(jiǎn)要地，用無(wú)菌水和超聲波清洗直徑為6mm、厚度為150um的猛犸象長(zhǎng)牙牙質(zhì)薄片，然后，在70%的乙醇中消毒，紫外照射過(guò)夜。從正常人的PBMC或骨髓分離得到CD14+細(xì)胞，將分別培養(yǎng)于MCSF和RANKL培養(yǎng)基的CD14+單核細(xì)胞(5X104)在上述牙質(zhì)薄片上利用RIG融合蛋白剌激21天。為了考察骨吸收面積，首先使用蒸餾水洗去薄片上的分化細(xì)胞，然后對(duì)薄片脫水和風(fēng)干。用Toluidine藍(lán)染色，利用光學(xué)顯微鏡鑒別吸收坑和圖象分析測(cè)量每個(gè)薄片上的腔隙性吸收面積。
工業(yè)實(shí)用性 破骨細(xì)胞是由多個(gè)前體單核細(xì)胞融合后得到的骨吸收多核細(xì)胞，對(duì)骨的再造具有重要意義。RANK是破骨細(xì)胞形成、存活和發(fā)揮生理功能的主要調(diào)節(jié)因子。RANKL的產(chǎn)生導(dǎo)致RANK的激活和單核細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞。在RANK誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成中，需要激活I(lǐng)TAM信號(hào)。在人的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面表達(dá)有抑制性IgG受體FcrRII，該受體的胞內(nèi)部分含有ITIM基序，ITIM可以通過(guò)SHIP來(lái)平衡ITAM的活化。本發(fā)明的RIG融合蛋白是一個(gè)新的RANK抑制劑，通過(guò)ITIM信號(hào)的激活來(lái)抑制破骨細(xì)胞的形成和骨損傷的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明的融合蛋白R(shí)IG組成成份全部來(lái)源于人源(human)性免疫球蛋白和RANKL，因此，作為一種藥物進(jìn)入人體，沒(méi)有任何異體蛋白的免疫源性。該融合蛋白的C區(qū)(hinge)靈活，可轉(zhuǎn)動(dòng)，可將RANKL和FcY交聯(lián)在一起，從而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的抑制信號(hào)，抑制RANK-ITAM反應(yīng)的發(fā)生。本發(fā)明的RIG融合蛋白通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)抑制信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)ITIM，從而強(qiáng)有力地抑制了
破骨細(xì)胞形成，將在骨質(zhì)疏松和腫瘤引起的骨吸收的治療中發(fā)揮重要作用。 SEQUENCE LISTING 〈110〉上海富莼科芯生物技術(shù)有限公司 〈120〉抑制破骨細(xì)胞形成的融合蛋白、其制備方法及藥物組合物 〈130>CN081119 〈160>6 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>1656 〈212>DNA 〈213>人工合成 〈400>1atgcgccgcgCC3gC3g3g3ctecaccaagtecctgcgtggctcgg郷agatgggcggc60ggccccggagccccgcacgagggccccctgcacgccccgccgccgcctgcgccgcaccag120ccccccgccgcctcccgctccatgttcgtggccctcctggggctggggctgggccaggtt180gtctgcagcgtcgccctgttcttctetttc3g3gCgC3g3tggatccteateg皿tetca240g^gatggcactcactgcatttetegaattttgagactccagattttcaa300gacacaactctgg卿gtratteatecctgattcatgteg360caggcctttc皿ggagctgtgc皿皿gg皿tcgttggatcacagcacatc420皿gcgatggtggatggctratggttegatctggcc皿gaggagc皿gctt■g皿gctcagccttttgctcatctcactettaatgccaccgacatcccatctggttcccat540tgtcctcttggteccatgatcggggttgggccaagatctccaacatgact600
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tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca C33CC3Ct3C 1620
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaataa1656
<210>2
<211>55l
<212>PRT
<213>人工合成
<400>2
Glu Met gly gly gly Pro gly Ala Pro HiS Glu gly Pro Leu HiS Ala
202530
Pro Pro Pro Pro Ala Pro HiS Gln Pro Pro Ala Ala Set Arg Set Met
354045
Phe Val Ala Leu Leu gly Leu gly Leu gly Gin Val Val Cys Set Val
505560
Ala Leu Phe Phe／yr Phe Arg Ala Gin Met Asp Pro Asn Arg Ile Set
65707580
Ala Asp Phe Gln Asp／hr／hr Leu Glu Set Gln Asp／hr Lys Leu Ile
100105110
Pro Asp Set Cys Arg Arg Ile hys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln
1151201250156]LysGluLeuGinHislieValGlySerGinHislieArgAlaGluLys
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0158]AlaMetValAspGlySerTrpLeuAspLeuAlaLysArgSerLysLeu
0159]145150155160
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0169]225230235240
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0188]GlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProAlaGluGluGinTyr
0189]385390395400
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0191]405410415
0192]TrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeu
0193]420425430
0194]ProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinProAla435 440 445
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Tyr
450 455 460
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp465 470 475 ■
lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
485 490 495
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
500 505 510
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser
515 520 525
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
530 535 540
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys545 550〈210>3〈211>34〈212>DNA〈213〉人工合成〈400>3
ggccccgagg gccatgcgcc gcgccagcag agac
〈210>4
〈211>31
〈212>DNA
〈213〉人工合成
〈400>4
ggatccgatc tatatctcga actttaa肌g c
〈210>5
〈211>24
〈212>DNA
〈213〉人工合成
〈400>5
ggatccg3gc ccaaatcttg tgac
〈210>6
〈211>32
〈212>DNA
〈213〉人工合成
〈400>6
gcggccgctc atttacccgg agacagggag ag
34
31
24
3權(quán)利要求
一種抑制破骨細(xì)胞形成的融合蛋白R(shí)IG的編碼基因，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO1所示序列。
2. —種抑制破骨細(xì)胞形成的融合蛋白R(shí)IG，其氨基酸序列是序列表中SEQIDNO :2所示 序列。
3. 合成引物，其核苷酸序列選自序列表中SEQ ID N0:3-SEQ ID N0:6所示序列。
4. 一種質(zhì)粒pSecTagRIG，包含權(quán)利要求1所述基因。
5. —種基因工程重組細(xì)胞，包含權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒。質(zhì)粒或整合于細(xì)胞的染色體 中，或游離于染色體外。
6. 權(quán)利要求2所述融合蛋白的制備方法，包括以下步驟(1) 克隆融合蛋白R(shí)IG的編碼基因(SEQ ID NO :1);(2) 構(gòu)建質(zhì)粒pSecTagRIG ;(3) 將質(zhì)粒pSecTagRIG轉(zhuǎn)化到SP2/0細(xì)胞中；(4) 培養(yǎng)陽(yáng)性克隆并分離純化RIG蛋白。
7. —種抑制破骨細(xì)胞形成的藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求2所述融合蛋白 RIG和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供SEQ ID NO1所示核苷酸序列的編碼基因、所述基因編碼的抑制破骨細(xì)胞形成的融合蛋白R(shí)IG(SEQ ID NO2)及其制備方法，并提供所述方法中涉及的合成引物、質(zhì)粒和宿主細(xì)胞，及包含所述融合蛋白R(shí)IG的藥物組合物。本發(fā)明的融合蛋白R(shí)IG組成成份全部來(lái)源于人源性免疫球蛋白和RANKL，因此沒(méi)有任何異體蛋白的免疫源性。該融合蛋白的C區(qū)可靈活轉(zhuǎn)動(dòng)，可將RANKL和Fcγ1交聯(lián)在一起，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的抑制信號(hào)，抑制破骨細(xì)胞的形成。本發(fā)明提供的融合蛋白R(shí)IG能夠在骨質(zhì)疏松和腫瘤引起的骨吸收疾病的治療中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101712964SQ20081020086
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日
發(fā)明者包駿, 祝道成, 陳海明 申請(qǐng)人:上海富莼科芯生物技術(shù)股份有限公司