專(zhuān)利名稱：17-aag在制備眼部rpe細(xì)胞vegf抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于眼科學(xué)及基因工程領(lǐng)域，涉及17-AAG在制備眼部RPE細(xì)胞 VEGF抑制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
17-AAG (17-丙烯胺基，17-去甲氧基格爾德霉素)作為一種新的熱休克 蛋白90抑制劑，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明其有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，而且毒性 較小[1。最近已經(jīng)進(jìn)入臨床II/m期實(shí)驗(yàn)。17-AAG不僅可以抑制腫瘤細(xì)胞增 殖，也可以抑制供應(yīng)腫瘤的血管形成[2。17-AAG抑制新生血管的機(jī)制已經(jīng)有 了一定的研究，初步研究發(fā)現(xiàn)其不僅可以抑制VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)， 還可以抑制多種與新生血管相關(guān)的分子，如Akt， HIF-lci (低氧誘導(dǎo)因子一 1 a )等,。
VEGF是目前已知在脈絡(luò)膜新生血管(choroidal noevascularization，CNV) 生成的微環(huán)境中最重要的促血管生成因子之一,大量研究證實(shí)，VEGF在 AMD、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等病理性新 生血管形成過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[5]。 VEGF既能破壞正常眼的血4見(jiàn)網(wǎng)膜屏 障，造成視網(wǎng)膜的滲出、出血和水腫，也能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增生， 并促使內(nèi)皮細(xì)胞遷移，增強(qiáng)了毛細(xì)血管通透性,使血漿外滲，有利于新生血管以 出芽的方式促成大量血管形成，還可以使非內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，再通過(guò)旁 分泌機(jī)制作用于其他細(xì)胞。此外，VEGF還可增加視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏 附分子的蛋白質(zhì)水平，促進(jìn)白細(xì)胞瘀滯，破壞血管壁,激活血小板，引起血流緩 慢和血栓形成,導(dǎo)致局部視網(wǎng)膜缺血缺氧，最終形成新生血管[6]-[7]。靈長(zhǎng)類(lèi)及轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也已證實(shí)其促CNV發(fā)生的作用。用可溶性VEGFR1或VEGF抗體抑制VEGF可減少CNV的形成和發(fā)展。因此,針對(duì)VEGF的藥物治療成 為當(dāng)前新生血管研究的重點(diǎn)[8]。雖然Avastin等抗VEGF的一類(lèi)藥物給視網(wǎng)膜 和脈絡(luò)膜新生血管的治療帶來(lái)了希望，也取得了一定的治療效果，但這類(lèi)藥 物作用位點(diǎn)單一，治療效果有限，有一定的并發(fā)癥。所以抑制視網(wǎng)膜和脈絡(luò) 膜新生血管的藥物仍在不斷的研發(fā)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供17-AAG在制備眼部RPE細(xì)胞VEGF抑制劑中的應(yīng) 用以及17-AAG在制備眼部RPE細(xì)胞VEGF受體抑制劑中的應(yīng)用，本發(fā)明還 提供17-AAG在制備脈絡(luò)膜新生血管抑制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)17-AAG對(duì)RPE細(xì)胞中的VEGF及其 受體有抑制作用，尤其對(duì)VEGFA的抑制作用較強(qiáng)。具體情況為低濃度的 17-AAG只能抑制RPE細(xì)胞中的VEGFA，隨著17—AAG濃度的增加，VEGFB 和VEGFR1的表達(dá)水平也下調(diào)，呈劑量依賴型。其中VEGFA下調(diào)較明顯,而 VEGFR2只有在高濃度17-AAG時(shí)才能被抑制，這些結(jié)果說(shuō)明，17-AAG對(duì) 于脈絡(luò)膜新生新生血管疾病的治療很有價(jià)值。故提出17-AAG在制備眼部RPE 細(xì)胞VEGF抑制劑中的應(yīng)用、17-MG在制備眼部RPE細(xì)胞VEGF受體抑制 劑中的應(yīng)用以及17-AAG在制備脈絡(luò)膜新生血管抑劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果l、現(xiàn)有技術(shù)雖然公開(kāi)了 17-MG可抑制VEGF及其受 體，但研究的是其它組織或器官中的VEGF及其受體，本發(fā)明通過(guò)研究首次 發(fā)現(xiàn)了 17-AAG對(duì)眼部RPE細(xì)胞VEGF及其受體具有抑制作用。2、 17-AAG 與現(xiàn)有的抗VEGF的藥物在治療眼病方面相比優(yōu)點(diǎn)是作用靶點(diǎn)不僅局限在 VEGF和VEGFR， 17-AAG對(duì)新生血管相關(guān)因子Akt也有明顯的抑制作用。


圖1 RT-PCR反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。 圖2熔解曲線分析。
A圖為VEGFA基因的熔解曲線，B為VEGFB基因的熔解曲線，C為VEGFR1基因的熔解曲線，D為VEGFR2基因的熔解曲線，E為AKT基因的熔解曲線，F(xiàn)為Act in 基因的熔解曲線
圖3 17-AAG對(duì)VEGF、 VEGF受體及Akt的作用。
A: 17-MG濃度對(duì)VEGF、 VEGF受體及Akt的作用
B: 17-AAG作用時(shí)間對(duì)VEGF、 VEGF受體及Akt的作用
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例l給藥組和對(duì)照組細(xì)胞制備
人RPE細(xì)胞株ARPE-19細(xì)胞(ATCC公司)，培養(yǎng)基為DMEM/F12 (Hyclone 公司)和100ml/L胎牛血清(Gibco公司)，加100mg/L青霉素和100mg/L鏈 霉素(Gibco公司)，置于37-C含有50ml/L C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中。等細(xì) 胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入n-AAG(Sigma公司)，按給藥濃度2， 5， 1Oumol/L 將細(xì)胞分為3組濃度梯度組，對(duì)照組加入等體積DMSO，作用24h后收集4組 細(xì)胞。另按3umol/L的17-AAG處理時(shí)間16， 24， 48h將細(xì)胞分為3組時(shí)間 梯度組，對(duì)照組加入DMSO。
實(shí)施例2 cDNA的制備(所用試劑盒為美國(guó)Invitrogen公司的Superscript III First-Strand合成試劑盒)
收集處理組和對(duì)照組的細(xì)胞(約IX 107)，分別加入lml Trizol(INVITROGEN公司)，按試劑說(shuō)明書(shū)中的操作步驟進(jìn)行RNA提取，加 DEPC水，-8(TC保存。然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)抽提 RNA的質(zhì)量和濃度；最后用MO-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ，其25 U 1的反應(yīng)體系包括KNA 2 P 1 ，反轉(zhuǎn)錄酶2 P 1， RNase抑制劑2 u 1，隨機(jī)引 物(0. 5 u g) 1 u 1， 5 X buf fer5 u 1以及2mmo1 dNTP 6. 25 u 1,合成的cDNA 置于-20 'C保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3利用RT-PCR擴(kuò)增目的基因片段根據(jù)VEGFA (Genbank編號(hào)NM—001025368)， VEGFB (Genbank編號(hào)NM—003377)， VEGFR1 (Genbank編號(hào)NM—002019) ， VEGFR2 (Genbank編號(hào)NM—002253) ，Akt (Genbank 編號(hào)NM—001014431.1)和P-actin (購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司)的mRNA基因序列, 用Primer Premier引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)6對(duì)引物(VEGFA上游引物序列為SEQ IDNO.l， VEGFA下游引物序列為SEQ ID NO.2; VEGFB上游引物序列為SEQ IDN0.3, VEGFB下游引物序列為SEQIDNO.4; VEGFR1上游引物序列為SEQ IDN0.5，VEGFR1下游引物序列為SEQ IDNO.6; VEGFR2上游引物序列為SEQ ID NO.7 ， VEGFR2下游弓|物序列為SEQ ID NO.8; Akt上游引物序列為SEQ ID N0.9，Akt下游引物序列為SEQIDNO.10; P -actin上游引物序列為SEQID NO.ll， 0-actin下游引物序列為SEQ IDNO.12)。然后每次加入一對(duì)引物 分別進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)條件如下95°C30s變性，55°C40s退火，72°C90s 延伸。循環(huán)25次。1%瓊脂糖凝膠電泳分析引物的特異性。瓊脂糖凝膠電泳結(jié) 果顯示RT-PCR反應(yīng)所得的產(chǎn)物條帶為單一條帶，并且與預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 度一致(圖1)。
實(shí)施例4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)17-AAG的作用
1) 實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用SYBRGreenABI 7300熒光PCR儀和配套的美國(guó)應(yīng)用生物 技術(shù)公司的POWER SYBRGreen PCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
20 u 1反應(yīng)體系中包括cDNA 5 u 1 ， 2 XPOWER SYBRGreen PCR Master Mix lOul，上下游引物5ul。反應(yīng)在96孔板上進(jìn)行，用透明膜覆蓋于板上，使 反應(yīng)體系密閉于反應(yīng)孔中，設(shè)置PCR反應(yīng)程序50 °C 2min激活UNG酶去 除殘余的產(chǎn)物污染，95°C 10 min激活Taq Gold酶，開(kāi)始擴(kuò)增，95°C15s變 性，60°C lmin退火及延伸，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。在60 °C lmin收集熒光信號(hào)， 循環(huán)結(jié)束后執(zhí)行融解曲線程序。為進(jìn)一步確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，反應(yīng)結(jié)束 后每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
2) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果以Ct值表示。相對(duì)定量采用比較Ct法，根 據(jù)等式Fold = rMet來(lái)計(jì)算處理組和對(duì)照組之間目的基因的相對(duì)表達(dá)差異， △△Ct值表示處理組和對(duì)照組間的ACt值差異。17-AAG處理組和對(duì)照組間的目的基因比較采用REST2005統(tǒng)計(jì)軟件分析標(biāo)準(zhǔn)誤，95%可信區(qū)間，p值， 變化倍數(shù)等。
運(yùn)用上述建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,分析17-AAG對(duì)人RPE細(xì)胞基因表達(dá) 的影響作用，所有樣本均重復(fù)3次檢測(cè)。 3)結(jié)果
熔解曲線分析顯示，6對(duì)引物都擴(kuò)增出了特異性的產(chǎn)物，其峰值所對(duì)應(yīng) 的溫度與預(yù)期產(chǎn)物的Tm值一致，未出現(xiàn)其它異常波形,波的形狀也較銳利(圖 2)。表明實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)能分別擴(kuò)增出各自特異性的產(chǎn)物。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量結(jié)果表明，與對(duì)照組相比,低濃度的17-AAG 只能抑制RPE細(xì)胞中的VEGFA，隨著17—AAG濃度的增加，VEGFB和VEGFR1 的表達(dá)水平也下調(diào)，呈劑量依賴型。其中VEGFA下調(diào)較明顯，而VEGFR2只有在 高濃度17-AAG時(shí)才能被抑制(圖3A)。與對(duì)照組相比，時(shí)間梯度組中的VEGFA， VEGFB和VEGFR1的表達(dá)水平下調(diào)，呈時(shí)間依賴型。而VEGFA在48h時(shí)已有部 分恢復(fù)(圖3B)。 17-AAG對(duì)新生血管相關(guān)因子Akt的抑制較明顯。
本發(fā)明未涉及部分均與現(xiàn)有技術(shù)相同或可采用現(xiàn)有技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。 參考文獻(xiàn)姜新宇，陳道楨，劉璐。17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素研究進(jìn)展.國(guó)際腫瘤學(xué)雜志 2006;33(9): 646—650. Powers MV，Workman P.Targeting of multiple signalling pathways by heat shock protein 90
molecular chaperone inhibitors.五"ctocr / e/fl/ Cawce 2006; 13 Suppl 1:125-135. Sanderson S， Valenti M, Gowan S，" a/. Benzoquinone咖amycin heat shock protein 90
inhibitors modulate multiple functions required for tumor angiogenesis. Mo/ Cfl"cer 7Tie/"
2006;5(3):522-532. Lang SA, Klein D, Moser a/. Inhibition of heat shock protein 90 impairs epidermal growth factor—mediated signaling in gastric cancer cells and reduces tumor growth and vascularization /" v/vo. M / Qwcer 7%er 2007;6(3):1123—1132. JS Penn， A Madan， RB Caldwell,"Vascular endothelial growth factor in eye disease. /Vogmw /"及"!'"a/ flwd五ye及"earc/z 2008; 27 (4) :331—371. Suhardja A， Hoffinan H. Role of growth factors and their receptors in proliferation ofmicrovascular endothelial cell. M'cmsr及ey 7"ec/ 2003; 60 (1): 70-75 Joussen AM, Poulaki V， Qin W，W fl/. Retinal vascular endothelial growth factor induces
intercellular adhesion molecule-1 and endothelial nitic oxidesynthase expression and initiates
early diabetic retinal leukocyte adhesion in vivo.爿w J尸a,/jo/ 2002; 160 (2): 501-509.許建華，李若溪,張薇,等.眼內(nèi)新生血管發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展.國(guó)際眼科雜志2008;8
(12): 2496-2498. Schlingemann RO. Role of growth factors and the wound healing response in age-related macular degeneration. Graeyfe爿rc/z Cftw五:r/ CJpMia/wo/ 2004; 242 (1) :91-101.〈110〉江蘇省人民醫(yī)院
<120> 17-AAG在制備眼部RPE細(xì)胞VEGF抑制劑中的應(yīng)用 <腸12
〈210> 1 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 〈220〉
〈223> VEGFA基因上游引物 <400〉 1
gaatcatcac gaagtggtga agt 23
<210> 2 〈211> 20 <212> ■ <213>人工序列 <220>
〈223〉 VEGFA基因下游引物 <400〉 2
gcacacagga tggcttgaag 20
<210〉 3 〈211> 22 〈212〉 DNA 〈213>人工序列 <220>
<223> VEGFB基因上游引物 〈400> 3
aaaaaaggac agtgctgtga ag 22
<210> 4 <211〉 19 <212> DNA <213>人工序列 <220>
〈223> VEGFB基因下游引物 <400> 4
ggagtgggat gggtgatgt 19〈210〉 5 <211> 23 〈212〉薩 〈213>人工序列 <220〉
<223〉 VEGFR1基因上游引物 <400> 5
ccaagactag atagcgtcac cag
<210> 6
<211> 21
<212〉 ■ 〈213〉人工序列 〈220〉
<223〉 VEGFR1基因下游引物
<400> 6
gaaaccgtca gaatcctcct c
<210> 7 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220>
〈223〉 VEGFR2基因上游引物 <400> 7
ggactctctc tgcctacctc a
<210> 8 〈211〉 20 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220>
<223> VEGFR2基因下游引物 <400> 8
cggctctttc gcttactgtt
<210> 9 <211> 18 〈212〉 DNA〈213>人工序列 <220>
<223〉 Akt基因上游引物 <400> 9
ctttccagac ccacgacc 18
<210〉 10 〈211〉 19 〈212> DNA <213>人工序列 <220>
〈223> Akt基因下游引物 〈400〉 10
ctccgagtgc aggtagtcc 19
<210> 11 <211> 18 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉 e-actin基因上游引物 〈400〉 11
ggcacccagc acaatgaa 18
<210> 12 <211〉 18 <212>薩 <213>人工序列 <220>
<223> actin基因下游引物 〈400> 12
gga鄉(xiāng)tgga cagcgagg 18
權(quán)利要求
1、17-AAG在制備眼部RPE細(xì)胞VEGF抑制劑中的應(yīng)用。
2、 17-AAG在制備眼部RPE細(xì)胞VEGF受體抑制劑中的應(yīng)用。
3、 17-AAG在制備脈絡(luò)膜新生血管抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于眼科學(xué)及基因工程領(lǐng)域，公開(kāi)了17-AAG在制備眼部RPE細(xì)胞VEGF抑制劑中的應(yīng)用。發(fā)明者研究發(fā)現(xiàn)17-AAG對(duì)RPE細(xì)胞中的VEGF及其受體有抑制作用，尤其對(duì)VEGFA的抑制作用較強(qiáng)，這些結(jié)果說(shuō)明，17-AAG對(duì)于脈絡(luò)膜新生新生血管疾病的治療很有價(jià)值。故提出17-AAG在制備眼部RPE細(xì)胞VEGF抑制劑中的應(yīng)用、17-AAG在制備眼部RPE細(xì)胞VEGF受體抑制劑中的應(yīng)用以及17-AAG在制備脈絡(luò)膜新生血管抑劑中的應(yīng)用。17-AAG與現(xiàn)有的抗VEGF的藥物在治療眼病方面相比優(yōu)點(diǎn)是作用靶點(diǎn)不僅局限在VEGF和VEGFR，17-AAG對(duì)新生血管相關(guān)因子Akt也有明顯的抑制作用。
文檔編號(hào)A61P27/02GK101606932SQ20091003386
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者姚家奇, 張薇瑋, 徐慶淮, 平 謝 申請(qǐng)人:江蘇省人民醫(yī)院