專利名稱：：一種絨毛膜促性腺激素的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種促性腺激素的純化方法，特別是涉及一種從孕婦尿液中提取的絨毛膜促性腺激素的純化方法。
背景技術(shù)：
：促性腺激素(gonadotropin,gonadotropichormone)是指能夠促進(jìn)雌雄兩種性腺的發(fā)育，增加性激素分泌的一類激素，如腦垂體前葉分泌的黃體生成激素(LH)和卵泡剌激素(FSH)，人胎盤絨毛膜分泌的絨毛膜促性腺激素(HCG)。其中HCG能剌激女性或男性的性腺活力，有促進(jìn)體內(nèi)性腺發(fā)育的作用，使性機(jī)能得到維持或興奮，適量服用HCG后能使已衰退的或已出現(xiàn)病理性障礙的性分泌機(jī)能逐漸恢復(fù)正常。HCG由人類胎盤絨毛膜的合胞體滋層細(xì)胞合成和分泌，其大量存在于孕婦的尿液中。HCG的制備方法多以孕婦尿液作為原料，通過苯甲酸鈉吸附、酒精抽提等過程得到大于120單位/mg的HCG粗品。而國內(nèi)多采用一步陽離子交換樹脂進(jìn)行純化得到單位效價(jià)大于2500iu/mg的精品，這些方法收率一般都小于80%，同時(shí)精品的效價(jià)在3000iu/mg左右。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種從孕婦尿液中提取的絨毛膜促性腺激素的純化方法。與現(xiàn)有技術(shù)中已有的HCG的提取純化方法相比，本方法收率可以達(dá)到90%以上，同時(shí)單位效價(jià)可以達(dá)到5000iu/mg以上。本發(fā)明提出的從孕婦尿液中提取的絨毛膜促性腺激素的純化方法，包括以下步驟(1)用溶液A對HCG粗品進(jìn)行提取，提取液流經(jīng)陰離子交換樹脂進(jìn)行吸附，再用溶液B洗脫，得到洗脫液即為中間體I。(2)中間體I經(jīng)陰離子交換凝膠層析，用溶液C洗脫，向洗脫液中加入乙醇進(jìn)行沉淀，干燥沉淀得中間體II。(3)將中間體II用溶液D溶解，先后加入溶液E和溶液F除熱原，再加入乙醇進(jìn)行沉淀，干燥沉淀，分裝得成品。其中所述溶液A為0.05-0.08mol/L醋酸鈉溶液，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5-5.5;溶液B為0.08-0.12mol/L醋酸鈉溶液，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5-5.5;溶液C含有0.05-0.15mol/L醋酸鈉和0.05-0.15mol/L氯化鈉，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5-5.5;溶液D為含有8-12重量％乙酸銨的20-60體積％乙醇溶液；溶液E為O.1-0.3mol/L磷酸鈉溶液；溶液F為0.2-0.4mol/L醋酸鈣溶液。例如，在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述溶液A為0.06mol/L醋酸鈉溶液，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0;溶液B為0.lmol/L醋酸鈉溶液，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.8;溶液C含有0.lmol/L醋酸鈉和0.lmol/L氯化鈉，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5;溶液D為含有10%乙酸銨的40%乙醇溶液；溶液E為0.2mol/L磷酸鈉溶液；溶液F為0.3mol/L醋酸f丐溶液。下面對步驟(1)中的操作進(jìn)行詳細(xì)的說明所述提取的方式優(yōu)選采用攪拌提?。粌?yōu)選情況下，提取液在吸附前先用3-8mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至4.5_5.0;所述陰離子交換樹脂優(yōu)選為DE-23陰離子交換樹脂和/或DEAE陰離子交換樹脂。下面對步驟(2)的操作進(jìn)行詳細(xì)的說明所述陰離子交換凝膠優(yōu)選為CMs印hadaxc_50;優(yōu)選情況下，所述中間體I在經(jīng)陰離子交換凝膠層析前調(diào)節(jié)其電導(dǎo)值，使中間體I的電導(dǎo)值比溶液B的電導(dǎo)值略低，pH值與溶液B相同；沉淀用乙醇可以為濃度為75-100體積％的乙醇，優(yōu)選使用95體積％的藥用級乙醇；優(yōu)選情況下，為了節(jié)約干燥時(shí)間，可以在干燥前先用無水乙醇對沉淀進(jìn)行脫水；干燥操作優(yōu)選采用真空干燥，進(jìn)一步優(yōu)選在五氧化二磷存在條件下的真空干燥。下面對步驟(3)中的操作進(jìn)行詳細(xì)的說明除熱原操作可以為在中速攪拌下，緩慢加入溶液E，攪拌后再滴加溶液F，用5-12mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.5_8.5，攪拌后離心，上清液再緩慢加入溶液E，攪拌后再滴加溶液F，攪拌后用5-12mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.5-8.O，離心后上清液用冰醋酸調(diào)整pH至6.5-7.5;例如，在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，除熱原操作為在中速攪拌下，緩慢加入溶液E，攪拌后再滴加溶液F，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至8.0，攪拌后離心，上清液再緩慢加入溶液E，攪拌后再滴加溶液F，攪拌后用10mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至8.0，離心得到的上清液用冰醋酸調(diào)整pH至7.0;所述沉淀用乙醇可以為濃度為75-100體積％的乙醇，優(yōu)選使用為95體積％的藥用級乙醇；優(yōu)選情況下，為了節(jié)約干燥時(shí)間，可以在干燥前先用無水乙醇對沉淀進(jìn)行脫水；干燥操作優(yōu)選采用真空干燥，進(jìn)一步優(yōu)選在五氧化二磷存在條件下的真空干燥。優(yōu)選地，所述除熱原和分裝均在十萬級精烘包區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明提供的純化方法與現(xiàn)有技術(shù)中已有的HCG的提取純化方法相比，本方法收率可以達(dá)到90%以上，同時(shí)單位效價(jià)可以達(dá)到5000iu/mg以上。以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施例，其中圖1本發(fā)明提供的從孕婦尿液中提取的絨毛膜促性腺激素的純化工藝流程圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例工藝操作過程實(shí)施例使用的純化工藝流程圖如圖1所示，具體的操作方法如下1混合、提取、吸附、洗脫1.l混合、提取精確稱取絨毛膜促性腺激素粗品加入不銹鋼桶內(nèi)，再加入20倍量體積的溶液A攪拌提取，攪拌速度200-400轉(zhuǎn)/分，控制溫度0-15t:，提取1-1.5小時(shí)。在4000轉(zhuǎn)/分、機(jī)內(nèi)溫度2-6t:條件下離心30分鐘，取上清液，渣子再用IO倍量體積溶液A攪拌提取I小時(shí)，在離心4000轉(zhuǎn)/分、機(jī)內(nèi)溫度2-6t:條件下離心30分鐘，取上清液。合并兩部分上清液，用5mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至4.5-5.0。1.2吸附洗脫將上述溶液放置高位，流經(jīng)一根DEAE填料柱(10L)，流速為80-100ml/min。控制溫度0-15°C，用溶液B洗脫，洗脫速率為80-100ml/min，0D280明顯上升時(shí)開始收集，0D280明顯下降時(shí)停止收集，收集洗脫液(即中間體I)。調(diào)節(jié)洗脫液電導(dǎo)值比溶液B的電導(dǎo)值略低，PH值與B溶液一致，待上樣。2層析、洗脫、沉淀、干燥2.1層析將上樣液放置高位，溫度0-l(TC，流入一根CMs印hadaxc_50柱，流速50-lOOml/分鐘，柱體積10L，上樣完畢用B溶液洗滌(流速50-100ml/分鐘)至流出液OD值在280nm處小于0.l/ml，同步觀察色帶是否均衡、平整，洗滌體積約2-3柱體積。2.2洗脫洗滌完畢即用溶液C進(jìn)行洗脫，流速50-100ml/分，用相應(yīng)容器收集活性部分(紫外分光度計(jì)測定OD值，當(dāng)OD值升至0.3/ml時(shí)開始收集，當(dāng)OD值明顯下移即停止收集)，收集液合并，量取體積，測定計(jì)算并記錄其總OD值，得洗脫液。2.3沉淀將洗脫液放置于不銹鋼桶內(nèi)，在攪拌下緩慢地加入5倍體積的-IO-(TC的95%藥用級乙醇，繼續(xù)攪拌至沉淀物出現(xiàn)，移入冷庫O-l(TC高位存放過夜。2.4干燥次日在冷庫內(nèi)虹吸去除上清液，沉淀部分移入離心室，用廣口離心杯在天平上平衡后離心(4-6°C、4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，將上清液傾入規(guī)定收集桶內(nèi)(回收)，沉淀物加入4-8倍量的-l(TC的無水乙醇，用油畫筆充分?jǐn)囁?、攪勻，洗滌、脫水后，再在天平上平衡離心(4_6°C、4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，反復(fù)三次，棄去上清液后，沉淀連離心杯用潔凈多孔濾紙加蓋后，在真空干燥箱內(nèi)室溫減壓干燥(在不銹鋼盤內(nèi)放有五氧化二磷)，真空度控制在-O.lMpa，干燥24小時(shí)，其間更換5次五氧化二磷，得中間體I1。將其保存于潔凈的玻璃藥瓶內(nèi)，4t:冰箱內(nèi)保存，并取樣20mg置于潔凈西林瓶內(nèi)，加蓋后貼上標(biāo)簽、測定生物效價(jià)。3混和、除熱原、沉淀、干燥、分裝3.1混和精確稱取14g中間體II(約2000萬單位)放入相應(yīng)不銹鋼容器內(nèi)，加入200ml的0-15t:的溶液D，以臺式無級調(diào)速攪拌機(jī)，中速攪拌至完全溶解。將溶解液倒入潔凈廣口離心杯內(nèi)，在天平上平衡后離心(4-6°C、4000轉(zhuǎn)/分鐘)30-45分鐘，棄渣，上清液倒入相應(yīng)不銹鋼容器內(nèi)，補(bǔ)加溶液D至400ml，環(huán)境溫度4-10°C。3.2除熱原在機(jī)械攪拌器中速攪拌下，向上述上清液中緩慢加入40ml溶液E，攪拌1小時(shí)，再滴加40ml溶液F，用1Omol/L氫氧化鈉調(diào)pH至8.0(用精密試紙測定)，攪拌30分鐘，倒入潔凈無熱原帶蓋離心杯內(nèi)，在天平上平衡后離心(4-6°C、4000轉(zhuǎn)/分鐘)1小時(shí)，棄渣，上清液中再緩慢加入40ml溶液E，攪拌1小時(shí)，再滴加40ml溶液F，攪拌30分鐘，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至8.0(用精密試紙測定)，倒入潔凈無熱原帶蓋離心杯內(nèi)，在天平上平衡后離心(4-6。C、4000轉(zhuǎn)/分鐘)1小時(shí)，棄渣，上清液用冰醋酸調(diào)整pH至7.0。3.3沉淀根據(jù)上清液體積放入相應(yīng)不銹鋼桶內(nèi)，加4倍量-IO-(TC的95%藥用乙醇沉淀過夜。3.4干燥次日傾去上清液，沉淀部分連同不銹鋼桶移入離心室，沉淀部分傾入帶蓋無熱原離心杯中，經(jīng)天平平衡后，離心(4-6°C，4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，上清液傾入規(guī)定收集桶內(nèi)(回收)。向沉淀中加入4-8倍量-l(TC無水乙醇，用不銹鋼藥勺攪勻、攪拌研碎。洗滌脫水后再在天平上平衡，離心(4_6°C，4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，反復(fù)三次，棄去上清液后，裝有沉淀物的離心杯用潔凈多孔濾紙加蓋后，在真空干燥箱內(nèi)室溫減壓干燥(在不銹鋼盤內(nèi)放有五氧化二磷的條件下)，真空度控制在-0.1Mpa，更換4-5次五氧化二磷，干燥時(shí)間約30小時(shí)后，得無熱原干燥品，在精密天平上稱量后，保存于玻璃藥瓶內(nèi)，4t:冰箱保存。3.5分裝將無熱原塊狀成品放入無熱原60目不銹鋼篩網(wǎng)中，用玻璃研頭研碎，放入相應(yīng)無熱原玻璃藥瓶中，用潔凈多孔濾紙加蓋后，在真空干燥箱內(nèi)，室溫減壓干燥(在放有五氧化二磷的條件下)，真空度控制在-0.1Mpa，更換l-2次五氧化二磷，干燥時(shí)間約10小時(shí)，取樣150mg，根據(jù)藥典標(biāo)準(zhǔn)作全項(xiàng)測定。成品加蓋、密閉封口后保存于4t:冰箱內(nèi)，待化驗(yàn)合格，辦理入庫手續(xù)。以上除熱原，分裝操作均在10萬級精烘包區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。其中在不同的實(shí)施例中使用的溶液的配方如表1所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>二、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢驗(yàn)方法1.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尿促性素粗品每mgHCG效價(jià)3.7-5.0單位，干燥失重《10%;成品每mgHCG效價(jià)>150單位；粗品一成品收率>90%。2.檢驗(yàn)方法a.用溶媒(pH7.0±0.2的每lml含有l(wèi)mg牛血清蛋白的生理鹽水溶液)將標(biāo)準(zhǔn)品和待測品分別配制成含HCG高、中、低三種濃度的溶液，相鄰兩個(gè)劑量的比值(r)為0.5，所有標(biāo)準(zhǔn)品和待測品溶液的高劑量濃度相同。b.每次實(shí)驗(yàn)(同時(shí)安排2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和8個(gè)待測品進(jìn)行實(shí)驗(yàn))將41-60g雌性大鼠按體重隨機(jī)分成31組，每組8只，第1-30組為給藥組，按順序在每日基本相同的時(shí)間內(nèi)，每鼠背部皮下注射HCG溶液0.5ml，連續(xù)給藥3日，低、中、高劑量組每鼠接受的HCG劑量分別為1.0、2.0、4.OIU，第31組為空白對照組，僅注射溶媒，注射體積與給藥組相同。c.第4日上午按上述給藥順序處死動(dòng)物，稱取每鼠體重，解剖，取出卵巢，小心剝離隨著的脂肪等組織，用濾紙吸干卵巢周圍的水分并立即稱重(精確到O.lmg)，計(jì)算每只大鼠的卵巢重(mg)與體重(g)的比值。用bs2000生物統(tǒng)計(jì)軟件中量反應(yīng)平等線3.3法計(jì)算生物效價(jià)。參考"尿促性素第三批國家標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定"，中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2007年第8巻第4期第50-52頁；《中國藥典》[S]二部，2005，附錄XIIN。三、檢驗(yàn)結(jié)果檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表2實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4每mg粗品的HCG效價(jià)4.14.54.84.9每mg成品的HCG效價(jià)159174168182粗品一成品收率90.5%94%92%95%通過表2中的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明提供的絨毛膜促性腺激素的純化方法收率可以達(dá)到90%以上，同時(shí)單位效價(jià)可以達(dá)到5000iu/mg以上。權(quán)利要求一種從孕婦尿液中提取的絨毛膜促性腺激素的純化方法，其特征在于包括以下步驟(1)用溶液A對絨毛膜促性腺激素粗品進(jìn)行提取，提取液流經(jīng)陰離子交換樹脂柱進(jìn)行吸附，再用溶液B洗脫，得到洗脫液即為中間體I；(2)中間體I經(jīng)陰離子交換凝膠層析，用溶液C洗脫，向洗脫液中加入乙醇進(jìn)行沉淀，干燥沉淀得中間體II；(3)將中間體II用溶液D溶解，加入溶液E和溶液F除熱原，再加入乙醇進(jìn)行沉淀，干燥沉淀，分裝得成品；其中所述溶液A為0.05-0.08mol/L醋酸鈉溶液，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5-5.5；溶液B為0.08-0.12mol/L醋酸鈉溶液，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5-5.5；溶液C含有0.05-0.15mol/L醋酸鈉和0.05-0.15mol/L氯化鈉，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5-5.5；溶液D為含有8-10重量％乙酸銨的20-60體積％乙醇溶液；溶液E為0.1-0.3mol/L磷酸鈉溶液；溶液F為0.2-0.4mol/L醋酸鈣溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的純化方法，其中，在步驟(1)中，所述提取操作采用攪拌提取。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的純化方法，其中，在步驟(1)中，所述提取液在吸附前用4-5mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至4.5-5.0。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的純化方法，其中，在步驟(2)中，在經(jīng)陰離子交換凝膠柱層析前用調(diào)節(jié)所述中間體I的電導(dǎo)值，使中間體I的電導(dǎo)值比溶液B的電導(dǎo)值略低，pH值與溶液B相同。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的純化方法，其中，步驟(1)中所述陰離子交換樹脂為DE-23陰離子交換樹脂和/或DEAE陰離子交換樹脂；步驟(2)中所述陰離子交換凝膠為CMsephadaxc_50。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的純化方法，其中，在步驟(3)中，所述除熱原操作為在攪拌下，緩慢加入溶液E，攪拌后再滴加溶液F，用5-12mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5-8.5，攪拌后離心，上清液再緩慢加入溶液E，攪拌后再滴加溶液F，攪拌后用5-12mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5-8.5，離心得到的上清液用冰醋酸調(diào)整pH至6.5_7.5。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的純化方法，其中，在步驟(3)中，所述除熱原和分裝均在十萬級精烘包區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的純化方法，其中，在步驟(1)至(3)中，所述沉淀用乙醇為95體積％的藥用級乙醇。9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的純化方法，其中，在步驟(1)至(3)中，所述干燥前以無水乙醇對沉淀進(jìn)行脫水。10.根據(jù)權(quán)利要求l-9中任一項(xiàng)所述的純化方法，其中，在步驟(1)至(3)中，所述干燥操作采用真空干燥，優(yōu)選在五氧化二磷存在條件下的真空干燥。全文摘要本發(fā)明提供一種從孕婦尿液中提取的絨毛膜促性腺激素的純化方法。與現(xiàn)有技術(shù)中已有的HCG的提取純化方法相比，本方法具有收率更高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)單位效價(jià)可以達(dá)到5000iu/mg以上。文檔編號C07K1/36GK101792481SQ201010132780公開日2010年8月4日申請日期2010年3月12日優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日發(fā)明者萬龍巖,阮振興,陳輝申請人:麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司;上海麗珠制藥有限公司